TW201309803A - 真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防除劑、植物病害防除方法及植物病害真菌減毒化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明對植物病害真菌發揮更加優異之防除效果。本發明之特徵在於：具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中之四種雙鏈RNA分別相對於序列編號1~4所示之鹼基序列具有81%、75%、72%及73%以上之同源性。作為一例，利用新穎之真菌病毒MoCV3。

Description

真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防除劑、植物病害防除方法及植物病害真菌減毒化方法
本發明係關於一種抑制植物病害真菌對植物之感染力之新穎真菌病毒、感染該真菌病毒之植物病害真菌、利用該真菌病毒之植物病害防除劑以及植物病害防除方法、及使用該真菌病毒之植物病害真菌減毒化方法。
植物病害存在：因氣象、土壤等環境因素而產生者，因病毒、細菌、真菌(絲狀真菌)等感染性因素而產生者，因生理障礙而產生者，因該等之複合因素而產生者等。目前，植物病害之中仍包含許多對糧食、花卉、開花樹(flowering trees)、樹木等之生產成為抑制因素者，經濟上之影響較大者亦較多。
於植物病害之中，真菌為最重要之病害因子之一。據稱植物病害之約80%係由真菌所引起。
例如，稻熱病係發生於世界各地之最重要之植物病害之一。病原菌為作為黴菌(絲狀真菌(filamentous fungi))之一種的稻熱病菌(學名「Magnaporthe oryzae」)。稻熱病菌之發育、孢子形成、感染之適宜溫度為25℃左右，又，喜濕潤環境。因此，會因夏季之低溫、多雨、日照不足等氣象因素而爆發，導致水稻之歉收、品質降低，對經濟較大衝擊。
此外，紋枯病、銹病、白粉病、炭疽病、菌核病、霜黴病、灰黴病等由真菌引起且經濟上之影響亦較大的植物病 害大量存在。因此，目前業界仍在嘗試新農藥之開發、或品種改良等(關於稻熱病之防除，例如參照專利文獻1、2)。
此處，針對作為與本發明關聯之事項的真菌病毒說明如下。
真菌類(Fungi，以下相同)中所感染之病毒稱為真菌病毒。其中，報告有以雙鏈RNA為基因組之真菌病毒。此等真菌病毒多於宿主菌中潛伏性地感染，而對宿主之性狀(character)幾乎不產生影響。
目前，以雙鏈RNA為基因組之真菌病毒分為分體病毒科(學名「Partitiviridae」，以下相同)、整體病毒科(學名「Totiviridae」，以下相同)、金色病毒科(學名「Chrysoviridae」，以下相同)等5科。分體病毒科病毒於其病毒粒子中具有兩個大小幾乎相同之直鏈狀雙鏈RNA，且基因總量為4~6 kbp。整體病毒科病毒於其病毒粒子中具有4~7 kbp之一條直鏈狀雙鏈RNA。另外，於栗枝枯病菌(學名「Cryphonectria parasitica」)中，發現了菌內源性地存在且具有9~13 kbp之雙鏈RNA的病毒(低毒病毒(hypovirus)等)。
金色病毒科病毒具有球形之病毒樣粒子，具有四元組之雙鏈RNA。又，已知有與分體病毒科及整體病毒科之病毒同樣地具有編碼RdRP(RNA-dependent RNA polymerase，RNA依賴性RNA聚合酶)之區域。作為屬於金色病毒科之病毒，例如已知有Hv145SV(「Helminthosprium victoriae 145S virus，燕麥立枯病菌145S病毒」以下相同)、PcV(「Pencillium chrysogenum virus，產毒青黴病毒」以下相同)、AbV1(「Agaricus bisporus virus 1，雙孢蘑菇病毒1」以下相同)等(參照非專利文獻1等)。
近年來，業界研究了針對特定之植物病害，將其病原菌利用真菌病毒等減毒化，並使用其減毒菌防除其病害之方法，目前一部分已實用化。例如揭示有如下方法：使用抑制栗枝枯病菌之毒性之病毒性雙鏈RNA之全長cDNA將該菌減毒化，並應用於栗枝枯病之防除之方法(參照非專利文獻1等)；或發現抑制紫紋羽病菌(學名「Helicobasidium mompa」)之雙鏈RNA病毒，使用內源性地存在該雙鏈RNA之紫紋羽病菌減毒菌株來防除紫紋羽病之方法(參照非專利文獻2、專利文獻3等)等。
又，專利文獻4中揭示有於稻熱病菌中感染而使稻熱病菌之感染力降低之真菌病毒，及感染該真菌病毒之植物病害真菌減毒株。據稱藉由使用專利文獻4中所揭示之真菌病毒，可使植物病害真菌減毒化，可提供一種植物病害之新穎防除方法。
[先前技術文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2004-143045號公報
[專利文獻2]日本專利特開2003-250370號公報
[專利文獻3] 日本專利特開2001-78752號公報
[專利文獻4]國際專利公開WO/2009/093409號公報
[非專利文獻1]C.M.Fauquet,Mary Ann Mayo,J.Maniloff,U.Desselberger,L.A.Ball,「Virus Taxonomy：Classification and Nomenclature of Viruses；Eighth Report Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses」,Elsevier Academic Press：p591-595
[非專利文獻2]Gil H.Choi and Donald L.Nuss,「Hypovirulence of chestnut blight fungus conferred by an infectious viral cDNA.」Science.1992 Aug 7；257(5071)：800-3
[非專利文獻3]H.Osaki et al,「Detection of Double-Stranded RNA Virus from a Strain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka」Virus Genes 25：2,139-145,2002
雖然於上述專利文獻4中揭示有將植物病害真菌減毒化之真菌病毒，但使用該真菌病毒、及感染該真菌病毒之植物病害真菌減毒株時之防除率(preventive value)並不充分，要求實現更高之防除率。因此，本發明之目的在於提 供一種對植物病害真菌具有更優異之防除效果之真菌病毒、感染該真菌病毒之植物病害真菌、含有該真菌病毒及/或該植物病害真菌之植物病害防除劑、利用該真菌病毒及/或該植物病害真菌之植物病害防除方法、及植物病害真菌之減毒化方法。
實現上述目的之本發明包含如下內容：
(1)一種真菌病毒，其特徵在於：具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中之四種雙鏈RNA分別相對於序列編號1~4所示之鹼基序列具有81%、75%、72%及73%以上之同源性。
(2)如上述(1)之真菌病毒，其中該五種雙鏈RNA為分別包含序列編號1~5所示之鹼基序列之聚核苷酸。
(3)一種植物病害真菌，其係如上述(1)或上述(2)之真菌病毒感染宿主而獲得者。
(4)如上述(3)之植物病害真菌，其中上述宿主為稻熱病菌。
(5)一種植物病害防除劑，其含有如上述(1)或上述(2)之真菌病毒或者如上述(3)或(4)之植物病害真菌。
(6)一種植物病害真菌防除方法，其包括使如上述(5)之植物病害防除劑與植物接觸之步驟。
(7)一種植物病害真菌減毒化方法，其包括使植物病害真菌感染如上述(1)或上述(2)之真菌病毒之步驟。
(8)如上述(7)之植物病害真菌減毒化方法，其中上述植 物病害真菌為稻熱病菌。
本說明書包含作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請案2011-38951號之說明書及/或圖式所記載之內容。
與先前之真菌病毒相比，本發明之真菌病毒對植物病害真菌之防除率非常優異。因此，藉由使用本發明之真菌病毒及感染該真菌病毒之植物病害真菌，可以與先前相比更優異之效率防除植物病害。
以下，詳細說明本發明。本發明之真菌病毒具有五種雙鏈RNA。該等五種雙鏈RNA中之四種雙鏈RNA包含分別相對於序列編號1~4所示之鹼基序列具有81%、75%、72%及73%以上之同源性的鹼基序列。本發明之真菌病毒具有感染稻熱病菌(學名「Magnaporthe oryzae」)，而將稻熱病菌等植物病害真菌減毒化之功能。
關於本發明之真菌病毒，作為其一例，有包含序列編號1~5所示之鹼基序列之五種雙鏈RNA。再者，序列表中之序列編號1~5之鹼基序列均記載為DNA序列，該等均包含RNA之情形時之序列(將胸腺嘧啶置換為尿嘧啶而成者)。
本發明之真菌病毒可以內源性地存在於稻熱病菌中之方式保存。關於本發明之真菌病毒，作為其一例，可列舉本發明者等人鑑定、並命名之MoCV3(Magnaporthe oryzae chrysovirus 3，稻熱病菌金色病毒屬3)。該MoCV3具有包含序列編號1~5所示之鹼基序列之五種雙鏈RNA，並以內 源性地存在於稻熱病菌中之方式保存。
內源性地存在該MoCV3之稻熱病菌S-0412-II 2a株於獨立行政法人製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心，被證明因內源性地存在病毒而應拒絕寄存。又，本菌保存於國立大學法人東京農工大學農學部植物病理學研究室，在遵守各項法令之條件下，可向第三者出售。又，用以將本菌寄存於American Type Culture Collection(美國標準菌種中心)之手續正在辦理。
再者，本菌株之原產地為越南。於雙鏈RNA之中序列編號1所示之鹼基序列中包含編碼RdRp(RNA依賴性RNA合成酶)之保存結構之區域，且該區域之鹼基序列與金色病毒科病毒具有同源性。因此，推測該真菌病毒係分類為金色病毒科之新品種之病毒。
該MoCV3雖然與國際專利公開WO/2009/093409號公報中所公開之MoCV1非常類似，但就稻熱病菌之減毒化能優異方面而言與MoCV1相比有所不同。又，於MoCV3中之五種雙鏈RNA之中，序列編號1~4所示之四種雙鏈RNA分別相對於MoCV1之四種雙鏈RNA顯示出80.5%、74.5%、71.3%及72.5%之同源性。即，含有下述四種雙鏈RNA之真菌病毒係作為新穎之真菌病毒而包含於本發明之技術範圍內，上述四種雙鏈RNA係包含分別相對於序列編號1~4所示之四種雙鏈RNA具有81%、75%、72%及73%以上之同源性之鹼基序列者。
又，本發明之真菌病毒亦可為含有五種雙鏈RNA，且可 將稻熱病菌等植物病害真菌減毒化之真菌病毒，上述五種雙鏈RNA係分別相對於序列編號1~5所示之鹼基序列具有例如85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、最佳為97%以上之同源性者。此處，所謂「同源性」係指鹼基序列完全一致，所謂「類似性」係指藉由對腺嘌呤及鳥嘌呤、或胸腺嘧啶(尿嘧啶)及胞嘧啶進行置換而使鹼基序列完全一致。
再者，本發明之真菌病毒並不限定於該MoCV3，亦包含對MoCV3人工或者自然地導入有變異之真菌病毒。即，本發明之真菌病毒亦可為如下變異體：為相對於序列編號1~5所示之鹼基序列，有1個或複數個(例如2~100個，較佳為2~50個，更佳為2~25個，最佳為2~10個)鹼基經取代、缺失、附加或插入之鹼基序列，且可將稻熱病菌等植物病害真菌減毒化的變異體。
又，於序列編號1至5所示之鹼基序列中分別包含蛋白質之編碼區域。將由序列編號1至5中所含之編碼區域編碼之推定蛋白質之胺基酸序列分別示於序列編號6~10。
本發明之真菌病毒具有抑制植物病害真菌之生長等作用。因此，例如可藉由使該真菌病毒感染特定植物病害真菌等，使其內源性地存在於該植物病害真菌中，而製作該植物病害真菌之減毒菌株。
又，例如藉由將含有本發明之真菌病毒、及/或所製作之植物病害真菌之減毒菌株的植物病害防除劑附加(散佈、塗佈等)於植物(水稻等)上，具有可防除此植物病害之 可能性。此外，本發明之真菌病毒有如下特徵。先前，認為真菌病毒係藉由菌絲融合而自宿主菌之細胞向細胞垂直傳播(vertical transmission)，可認為於真菌病毒之生命循環(life cycle)之中，沒有存在於宿主菌之細胞外之階段。相對於此，依據本發明者等人之研究可知本發明之真菌病毒亦可存在於細胞外。
因此，由於可不依賴菌絲融合而自細胞外感染宿主菌，故而亦可使本發明之真菌病毒廣泛地於接合型不同之菌主-菌株間感染，且可以高效率對宿主菌進行感染。即，藉此可簡易且高效率地進行植物病害真菌之減毒化或植物病害之防除之可能性較高。
又，由於本發明之真菌病毒亦存在於細胞外，故而例如可藉由於液體培養基中培養宿主菌，並自該培養上清液回收真菌病毒，而簡易且相對大量地生產真菌病毒。
本發明之真菌病毒於內源性地存在於特定之稻熱病菌中之情形時，例如可藉由公知之方法自該稻熱病菌株進行分離、回收。再者，內源性地存在本發明之真菌病毒之稻熱病菌可利用與通常之稻熱病菌相同之培養基、培養條件進行培養。
<關於本發明之基因、核酸、蛋白質等>
本發明者等人針對本發明之真菌病毒之一進行序列分析而獲得全長之鹼基序列(序列編號1~5)。因此，本發明包含該真菌病毒基因、具有該鹼基序列或其一部分之核酸、該等鹼基序列所編碼之蛋白質等之全部。
又，本發明亦包含所有具有該等鹼基序列之全部或一部分之核酸。核酸可為雙鏈、單鏈中之任一者，又，包含DNA、cDNA、RNA等之全部。
本發明中亦包含：例如序列編號1~5之全部或任一序列、該序列中具有特定功能之特定部分之序列、具有與該等相同之鹼基序列之cDNA、組入與該等相同之鹼基序列的重組載體(recombinant vector)(質粒、病毒等)等。
由序列分析之結果可知：於序列編號1之序列部分存在RdRp(RNA依賴性RNA合成酶)之保存結構，及序列編號4之序列部分與法國蘑菇病(La France disease)病毒之雙鏈RNA片段具有同源性。因此，亦可根據目標、用途，而製作例如至少具有該等序列部分作為具有特定功能之特定部分之核酸、重組載體等而使用。
再者，於本發明之核酸(或基因)中廣泛包含如下者：與和上述鹼基序列具有同源性之核酸、例如由與該鹼基序列互補之鹼基序列所構成之核酸，在嚴格之條件下雜交，且具有稻熱病菌抑制作用。此處，嚴格之條件可藉由雙鏈核酸之Tm(melting temperature，解鏈溫度)值等公知技術獲得。
又，本發明亦包含上述真菌病毒基因及核酸所編碼之所有蛋白質。將本發明之蛋白質之胺基酸序列示於序列編號6~10。
分別為：序列編號6係序列編號1所記載之鹼基序列中之開放讀碼區之胺基酸序列，序列編號7係序列編號2所記載 之鹼基序列中之開放讀碼區之胺基酸序列，序列編號8係序列編號3所記載之鹼基序列中之開放讀碼區之胺基酸序列，序列編號9係序列編號4所記載之鹼基序列中之開放讀碼區之胺基酸序列，序列編號10係序列編號5所記載之鹼基序列中之開放讀碼區之胺基酸序列。
再者，本發明之蛋白質包含具有序列編號6~10中任一之胺基酸序列者，以及所有與該等具有同源性且保持其功能者。
例如，將上述核酸組入重組載體中，而於此宿主中強制表現，藉此具有可大量製備此等之蛋白質之可能性。認為作為宿主，可利用大腸桿菌類、酵母類、培養細胞等公知者。若考慮真菌病毒對真菌進行感染，酵母類具有高增殖性且利用亦相對簡便，則具有宿主可最適宜使用酵母類之可能性。對於重組載體，認為亦可使用公知者。
又，例如使用複數個組入有序列編號1~5中之任一者之載體，使該五種基因之複數個共表現(coexpression)，藉此可重構真菌病毒。於該情形時，亦可使用公知之宿主及公知之重組載體，就可同時導入複數個載體之方面而言，酵母類為最佳宿主。再者，序列編號1~5所示之五種核酸片段可藉由以自真菌病毒萃取之dsRNA為模板之RT-PCR法(reverse transcription polymerase chain reaction method，反轉錄聚合酶鏈反應法)取得。又，序列編號1~5所示之五種核酸片段亦可基於其序列資訊(sequence information)而進行全合成(total synthesis)。換言之，本發明之真菌病毒 本身及/或內源性地存在該真菌病毒之稻熱病菌S-0412-II 2a株即便不寄存於寄存機構，本技藝者亦可利用上述重組載體來製造該真菌病毒。
<關於植物病害真菌減毒菌株>
本發明之植物病害真菌減毒菌株包含所有內源性地存在本發明之真菌病毒者。即，例如包含已內源性地存在該真菌病毒之稻熱病菌等之菌株、及感染該真菌病毒之植物病害真菌之菌株兩者。
作為使真菌病毒感染植物病害真菌等之方法，例如有如先前般於菌絲融合時使其感染宿主菌之方法。又，如上所述，由於本發明之真菌病毒即便於細胞外亦可存在，故而例如可使其自細胞外直接感染宿主菌。
作為該植物病害真菌減毒菌株之例，可列舉上述S-0412-II 2a株。該菌株為感染本發明之真菌病毒的稻熱病菌之菌株。因此，形態性質、培養性質、孢子形成、生理學及化學分類學性質基本上與公知之稻熱病菌相同。但是，與通常之稻熱病菌相比，生長緩慢，菌絲以非同心圓狀生長，色素沈積亦不均勻。又，可見氣生菌絲(aerial mycelia)之異常發達，且觀察到扇形形成或溶菌。
<關於植物病害防除劑>
本發明之植物病害防除劑包含所有至少含有本發明之真菌病毒或本發明之植物病害真菌減毒菌株中之任意一方者。又，可含有該真菌病毒及其植物病害真菌減毒菌株兩者，亦可含有其他成分。
作為其他成分，例如亦可含有：特定之載體、黏結劑、增黏劑、固著劑、防腐防黴劑、溶劑、穩定劑、抗氧化劑、紫外光抑制劑、結晶析出防止劑、消泡劑、物性提昇劑、著色劑等。又，亦可含有其他農藥成分，例如：殺蟎劑、殺線蟲劑、殺菌劑、抗病毒劑、引誘劑、除草劑、植物生長調節劑、增效劑(synergist)等。
作為載體，例如可使用固體載體、液體載體中之任一者或兩者。作為固體載體，例如可列舉：澱粉、活性碳、大豆粉、麵粉、木粉、魚粉、奶粉等動植物性粉末，滑石、高嶺土、膨潤土、沸石、矽藻土、白碳、黏土、氧化鋁、碳酸鈣、氯化鉀、硫酸銨等礦物性粉末。作為液體載體，例如可列舉：水，異丙醇、乙二醇等醇類，環己酮、甲基乙基酮等酮類，丙二醇單甲基醚、二乙二醇單正丁基醚等醚類，煤油、柴油等脂肪族烴類，二甲苯、三甲基苯、四甲基苯、甲基萘、溶劑石腦油等芳香族烴類，N-甲基-2-吡咯烷酮等醯胺類，脂肪酸之甘油酯等酯類，大豆油、菜籽油等植物油。
作為黏結劑、增黏劑、固著劑，例如可列舉：澱粉、糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基澱粉、支鏈澱粉、海藻酸鈉、海藻酸銨、丙二醇海藻酸酯、瓜爾膠、刺槐豆膠、阿拉伯膠、三仙膠、明膠、酪蛋白、聚乙烯醇、聚環氧乙烷、聚乙二醇、乙烯-丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮等。
本防除劑之劑型無特別限定。例如可使用：乳劑、懸浮劑、粉劑、粒劑、錠劑、水合劑、水溶劑、液劑、水懸劑、顆粒水合劑、霧劑、糊劑、油劑、乳濁劑等形態。
<關於植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法>
本發明之植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法包含所有至少包括如下程序者：將含有真菌病毒之植物病害真菌於液體培養基等中培養，並自其培養上清液回收真菌病毒。
如上所述，本發明之真菌病毒即便於宿主菌之細胞外亦可存在。因此，例如於將感染有真菌病毒之植物病害真菌於液體培養基等中培養，並藉由離心分離將菌體分離之後，將病毒自其培養上清液分離、回收，藉此可簡易且相對大量地回收病毒。
但是，本發明之真菌病毒並不狹隘地限定於藉由該生產方法所獲得者。即，本發明亦廣泛地包含例如自內源性地存在真菌病毒之稻熱病菌分離、回收而取得者。
另一方面，作為本發明之植物病害真菌抑制性真菌病毒生產方法，如上述亦包含如下方法：利用複數個組入有序列編號1~5中之任一核酸片段的載體，並使該五種基因之複數於宿主細胞內共表現，並回收在該宿主細胞內再構建之真菌病毒。作為宿主細胞可使用酵母。作為用以組入上述五種基因之載體，若為可使所組入之基因於宿主細胞內表現者則無特別限定，可使用任何載體。又，組入載體之核酸片段可基於序列編號1~5所示之鹼基序列進行全合 成。
<關於植物病害真菌減毒化方法>
如上所述，例如可藉由使本發明之真菌病毒感染特定植物病害真菌等，抑制該宿主菌之生長等，而將該菌減毒化。關於真菌病毒之感染方法，可採用與上述相同之方法。
<關於植物病害防除方法>
本發明之植物病害防除方法包含所有至少包括將上述稻熱病防除劑附加於特定植物(水稻等)上之步驟者。
作為將防除劑附加於植物上之方法，例如可列舉：將防除劑塗佈於葉之表面或背面之方法、使用特定之載體等使防除劑附著於葉之表面或背面之方法、將防除劑散佈或供給於葉上之方法等。
防除劑之塗佈量或散佈量根據如下各種條件適當選擇即可：有效成分之濃度、製劑之形態、對象病害或作物之種類、病害造成之受害程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用或併用之藥劑或肥料等之使用量及種類等。
例如，以每一片葉1~1,000 mL之方式噴霧或供給製備為1×103~1×1010個/mL之稻熱病菌減毒菌株之分生孢子(conidiospore)含有液，又，以每1 mm2之葉為1×103~1×1010個之方式將稻熱病菌減毒菌株之分生孢子塗佈或附著於葉表面或背面，藉此具有可抑制植物病害之可能性。
又，藉由適度稀釋培養上清液中所存在之MoCV3而得之病毒溶液(原液之10倍~100倍左右)、或適度稀釋自稻熱病 菌S-0412-II 2a株之菌體萃取之MoCV3病毒粒子成分，並對水稻葉實施直接散佈，使利用對稻熱病菌之防除效果、或治癒效果的稻熱病菌之防除法成為可能。作為實際之防除率，於使用MoCV3作為病毒散佈劑時，獲得63.6以上之防除率之結果，可獲得與國際專利公開WO/2009/093409號公報中所公開之MoCV1之防除率56.8以上更優異之結果。
本發明有能夠適用於以真菌為主要病因之所有植物病害之可能性。作為有適用可能性之植物病害，例如可列舉如下者(並不限定於該等)。
作為對於禾本科植物之植物病害，例如有：稻熱病(病原菌「Magnaporthe oryzae，稻熱病菌」)、稻胡麻葉枯病(病原菌「Cochliobolus miyabeanus，宮部氏旋孢腔菌」)、紋枯病(病原菌「Thanatephorus cucumeris，稻紋枯病菌」)、稻苗徒長病(病原菌「Gibberella fujikuroi，藤倉赤黴菌」)、苗立枯病(病原菌「Fusarium菌，鐮胞菌」、「Rhizopus菌，根黴菌」、「Pythium菌，腐黴菌」、「Trichoderma viride，木黴菌」)、稻麴病(病原菌「Claviceps virens，稻麥角菌」)，麥類之赤黴病(病原菌「Gibberella zeae，玉蜀黍赤黴菌」、「Fusarium avenaceum，燕麥鐮刀菌」、「Fusarium culmorum，黃色鐮刀菌」、「Monographella nivale，小麥雪黴葉枯菌」)、雪腐病(病原菌「Pythium菌，腐黴菌」、「Typhula菌，核瑚菌」、「Monographella nivalis，雪黴葉枯菌」、「Myriosclerotinia borealis，北方貝核盤黴(擬)」)、散黑穗病(病原菌 「Ustilago nuda，裸黑粉菌」)、腥黑穗病(病原菌「Tilletia controversa，小麥矮腥黑穗病菌」)、眼紋病(病原菌「Pseudocercosporella herpotrichoides，小麥基腐病菌」)、葉枯病(病原菌「Septoria tritici，小麥殼針孢菌」)、穎枯病(病原菌「Phaeosphaeria nodorum，小麥葉枯病菌」)、白粉病(病原菌「Blumeria graminis，布氏白粉菌」)。
作為其他植物病害，例如有：柑橘類之黑點病(病原菌「Diaporthe citri，柑橘間座殼菌」)、小黑點病(病原菌「Diaporthe medusa、Alternaria citri，柑橘鏈格孢菌」)、瘡痂病(病原菌「Elsinoe fawcettii，痂囊腔菌」)、褐腐病(病原菌「Phytophthora citrophthra，柑橘褐腐疫黴菌」)、綠黴病(病原菌「Penicillium digitatum，柑橘綠黴菌」)、青黴病(病原菌「Penicillium italicum，義大利青黴菌」)，蘋果之花腐病(病原菌「Monilinia mali，蘋果鏈核盤菌」)、黑星病(病原菌「Venturia inaequalis，蘋果黑星菌」)、斑點落葉病(病原菌「Alternaria mali，蘋果鏈格孢菌」)、黑點病(病原菌「Mycosphaerella pomi，蘋果斑點小球殼菌」)、煤污病(病原菌「Gloeodes pomigena，仁果黏殼孢菌」)、蠅斑病(病原菌「Zygophiala jamaicensis，細盾黴菌」)、輪紋病(病原菌「Botryosphaeria berengeriana，蘋果輪紋病菌」)、褐斑病(病原菌「Diplocarpon mali，蘋果褐斑病菌」)、赤星病(病原菌「Gymnosporangium yamadae，蘋果赤星病菌」)、腐爛病(病原菌「Valsa ceratosperma，黑腐皮殼菌」)，梨之黑星病(病原菌「Venturia nashicola，梨黑星菌」)、赤星病(病原菌「Gymnosporangium asiaticum，膠鏽菌」)、輪紋病(病原菌「Botryosphaeria berengeriana，梨輪紋病菌」)、胴枯病(病原菌「Phomopsis fukushii，梨胴枯病菌」)，桃之縮葉病(病原菌「Taphrina deformans，桃縮葉病菌」)、灰星病(病原菌「Monilinia fructicola、Monilinia fructigena，桃褐腐菌」)、黑星病(病原菌「Cladosporium carpophilum，嗜果枝孢菌」)、蒂枯病(病原菌「Phomopsis sp.，擬莖點黴菌」)，櫻桃之褐腐病(病原菌「Monilinia fructicola，櫻桃褐腐菌」、「Monilinia fructigena，櫻桃褐腐菌」)、幼果菌核病(病原菌「Monilinia kusanoi，李類花腐病菌」)，梅之黑星病(病原菌「Cladosporium carpophilum，嗜果枝孢菌」)，葡萄之黑痘病(病原菌「Elsinoe ampelina，痂囊腔菌」)、晚腐病(病原菌「Colletotrichum acutatum，急尖炭疽刺盤孢菌」、「Glomerella cingulata，圍小叢殼菌」)、褐斑病(病原菌「Pseudocercospora vitis，葡萄擬尾孢菌」)、莖腐病(病原菌「Phomopsis viticola，葡萄擬莖點黴菌」)，柿之角斑病(病原菌「Cercospora kaki，柿尾孢菌」)、圓斑病(病原菌「Mycosphaerella nawae，柿葉球腔菌」)，茶之輪斑病(病原菌「Pestalotiopsis longiseta，長剛毛擬盤多毛孢」、「Pestalotiopsis theae，茶輪斑病菌」)、褐色圓星病(病原菌「Pseudocercospora ocellata，褐色圓星病菌」、「Cercospora chaae，褐色圓星病 菌」)、餅病(病原菌「Exobasidium vexans，壞損外擔菌」)、網餅病(病原菌「Exobasidium reticulatum，網狀外擔菌」)，瓜類之蔓枯病(病原菌「Mycosphaerella melonis，甜瓜球腔菌」)、莖腐病(病原菌「Fusarium oxysporum，尖孢鐮刀菌」)、黑星病(病原菌「Cladosporium cucumerinum，瓜枝孢菌」)、褐斑病(病原菌「Corynespora cassiicola，多主棒孢黴」)，番茄之葉黴病(病原菌「Fulvia fulva，番茄葉黴病褐孢黴」)、輪紋病(病原菌「Alternaria solani，早疫病菌」)，茄之褐紋病(病原菌「Phomopsis vexans，茄褐紋擬莖點黴」)、煤黴病(病原菌「Mycovellosiella nattrassii，灰毛茄菌絨孢」)，十字花科蔬菜之白銹病(病原菌「Albugo macrospora，大孢白銹菌」)、白斑病(病原菌「Cercosporella brassicae，白斑小尾孢」、「Pseudocercosporella capsellae，薺假小尾孢黴」)，洋蔥之灰腐病(病原菌「Botrytis allii，蔥葡萄孢菌」)，草莓之蛇眼病(病原菌「Mycosphaerella fragariae，草莓球腔菌」)，馬鈴薯之早疫病(病原菌「Alternaria solani，交鏈孢黴」)，大豆之疫黴病(病原菌「Phytophthora sojae，大豆疫黴菌」)、紫斑病(病原菌「Cercospora kikuchii，紫斑病菌」)，小豆之疫黴莖腐病(病原菌「Phytophthora vignae，小豆疫黴菌」)，花生之褐斑病(病原菌「Mycosphaerella arachidis，落花生球腔菌」)，甜菜之褐斑病(病原菌「Cercospora beticola，甜菜生尾孢」)、葉腐病(病原菌「Thanatephorus cucumeris，瓜亡革菌」)，結 縷草之彎孢菌葉枯病(病原菌「Curvularia菌，彎孢菌」)、幣斑病(病原菌「Sclerotinia homoeocarpa，幣斑病菌」)、蠕孢菌葉枯病(病原菌「Cochliobolus菌，蠕孢菌」)，薔薇之黑星病(病原菌「Diplocarpon rosae，薔薇雙殼菌」)，菊花之白銹病(病原菌「Puccinia horiana，堀柄銹菌」)，各種作物之霜黴病(病原菌「Peronospora菌，霜黴菌」、「Pseudoperonospora菌，霜黴菌」、「Plasmopara菌，霜黴菌」、「Bremia菌，盤霜黴菌」)、疫病(病原菌「Phytophthora菌，疫病菌」)、白粉病(病原菌「Erysiphe菌，白粉菌」、「Blumeria菌，白粉菌」、「Sphaerotheca菌，單囊殼菌」、「Podosphaerea菌，叉絲單囊殼菌」、「Phyllactinia菌，球針殼菌」、「Uncinula菌，鉤絲殼菌」、「Oidiopsis菌，擬粉孢菌」)、銹病(病原菌「Puccinia菌，銹病菌」、「Uromyces菌，單胞銹菌」、「Physopella菌，囊銹菌」)、黑斑病(病原菌「Alternaria菌，鏈隔孢菌」)、灰黴病(病原菌「Botrytis cinerea，灰色葡萄孢菌」)、菌核病(病原菌「Sclerotinia sclerotiorum，核盤菌」)、白紋羽病(病原菌「Rosellinia necatrix，棕墊炭豆菌」)、紫紋羽病(病原菌「Helicobasidium mompa，桑捲擔菌」)、白絹病(病原菌「Sclerotium rolfsii，白絹菌」)，其他各種土壤病害(病原菌「Fusarium菌，鐮胞菌」、「Rhizoctonia菌，絲核菌」、「Pythium菌，腐黴菌」、「Aphanomyces菌，絲囊黴菌」、「Phoma菌，莖點黴菌」、「Verticillium菌，輪刺孢菌」、「Plasmodiophora brassicae，蕓苔根腫菌」等)。
[實施例]
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。
[實施例1]
於本實施例中，依據國際專利公開WO/2009/093409號公報中所公開之方法，對內源性地存在新穎之真菌病毒之稻熱病菌株S-0412-II 2a株進行單離鑑定。具體而言，分別培養本實施例中單離鑑定之稻熱病菌S-0412-II 2a株、與國際專利公開WO/2009/093409號公報中所鑑定之內源性地存在真菌病毒之稻熱病菌S-0412-II 1a株，並觀察菌落。於該等稻熱病菌之培養中使用PDA培養基(Potato Dextrose Agar Medium，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)。將結果示於圖1中。
如圖1所示，本實施例中所鑑定之稻熱病菌株S-0412-II 2a株顯示出白化(albinism)之菌群，且觀察到生長抑制。又，亦完全未觀察到分生孢子形成。又，與稻熱病菌株S-0412-II 1a株不同，稻熱病菌株S-0412-II 2a株於PDA培養基上不引起色素沈積(黑色素化)，而形成顯示出氣生菌絲之生長抑制、濕化等異常之生長不良的特徵性菌落。
又，製作該等稻熱病菌株S-0412-II 2a株及稻熱病菌株S-0412-II 1a株之病毒治癒株，以相同之方式進行菌落觀察。將結果示於圖2中。再者，病毒之治癒方法係依據國際專利公開WO/2009/093409號公報中所公開之方法進行。 如圖2所示，兩菌株均藉由病毒治癒而形成與通常之稻熱病菌相同之菌落。
進而，針對稻熱病菌株S-0412-II 2a株及稻熱病菌株S-0412-II 1a株以及該等之病毒治癒株，比較生長速度。作為比較之方法，進行自培養基之中心至菌絲之前端之距離的測定。再者，所有菌株之生長條件如下：使用PDA培養基，以光期12小時及暗期12小時為循環，將培養天數設為9天。將結果示於圖3A及3B中。圖3A係針對稻熱病菌株S-0412-II 2a株及其病毒治癒株之測定結果。圖3B係針對稻熱病菌株S-0412-II 1a株及其病毒治癒株之測定結果。如圖3A及3B所示，得知稻熱病菌株S-0412-II 1a株藉由病毒治癒於生長速度方面未見顯著差異，但稻熱病菌株S-0412-II 2a株中於生長速度方面存在顯著差異，病毒感染株之生長速度降低。
由該等圖1及圖2之結果可明確：兩菌株均由於內源性地存在真菌病毒而受到生長抑制。又，如圖3所示，於本實施例中，與內源性地存在於稻熱病菌株S-0412-II 1a株中之真菌病毒(MoCV1)相比，內源性地存在於稻熱病菌株S-0412-II 2a株中之真菌病毒顯示出對稻熱病菌具有更強力之生長抑制能力。
將內源性地存在於本實施例中所單離鑑定之稻熱病菌株S-0412-II 2a株中之真菌病毒命名為MoCV3。結論為：該MoCV3係稻熱病菌之強力生長抑制因子(減毒化因子)。
[實施例2]
於本實施例中，調查內源性地存在於實施例1中所單離鑑定之稻熱病菌株S-0412-II 2a株中的MoCV3是否亦存在於菌體外。
於實施例1中，於2.8~3.6 kbp範圍內檢測出五元組之內源性雙鏈RNA之條帶的菌株之中，將3株移植於液體培養基中進行培養，其後對培養液進行離心，並回收其培養上清液。繼而，將所獲得之培養上清液於1%之瓊脂糖凝膠中以20 V進行電泳18小時，並利用溴化乙錠染色。
其結果為，於該等菌株之培養上清液中，在與菌內源性雙鏈RNA相同之位置亦檢測出雙鏈RNA之條帶。該結果顯示：本發明之真菌病毒不僅存在於稻熱病菌之菌體內，亦存在於菌體外。
[實施例3]
於本實施例中，調查存在於菌體外之真菌病毒MoCV3是否具有對正常之菌株(未保持有真菌病毒之菌株)之感染能力。
首先，將稻熱病菌株S-0412-II 2a株移植於液體培養基中培養4週之後，對培養液進行離心，並回收其培養上清液。針對該培養上清液，以與實施例2相同之程序於1%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，結果可確認雙鏈RNA之條帶。針對所獲得之培養上清液，利用0.22 μL之過濾器進行過濾殺菌。
繼而，於100 ml之燒瓶中放入YG培養基50 ml，並於其中接種稻熱病菌之正常菌株(未保持有真菌病毒之菌株)， 於培養3天之後，添加所獲得之培養上清液500 μL，觀察菌體之生長。
其結果為，於觀察第3天，於未添加培養上清液之菌株中菌絲之前端筆直伸展，顯示出正常之生長，相對於此，於添加有培養上清液之菌株中菌絲之前端成為未充分伸展且纏繞之狀態。
認為該結果之原因在於：存在於培養上清液中之真菌病毒感染稻熱病菌正常菌株，而抑制其生長。即，本實驗結果顯示：存在於菌體外之真菌病毒具有對正常之菌株之感染能力。
[實施例4]
於本實施例中，測定感染真菌病毒之稻熱病菌株之分生孢子數。
將稻熱病菌株S-0412-II 2a株移植於YG培養板上，於培養2週之後，利用直徑為4 mm之木塞鑽孔器抽出並採集菌體。繼而，於1.5 ml之試管中放入5%之甘油，放入所採集之菌體，並混合、懸浮5分鐘。並且，使用血球計計測存在於懸浮液中之分生孢子數。
其結果為，於稻熱病菌之正常菌株(對照未保持有真菌病毒之菌株)中分生孢子數為33×104個/mL，相對於此，於稻熱病菌株S-0412-II 2a株中分生孢子數為1×104個/mL以下。
該結果顯示：本發明之真菌病毒抑制宿主菌之分生孢子形成。即，MoCV3顯示出抑制植物病害菌之增殖，並且亦 抑制其傳播、感染擴大等。
[實施例5]
於本實施例中，分析自稻熱病菌株S-0412-II 2a株提取之雙鏈RNA之鹼基序列。依據國際專利公開WO/2009/093409號公報中所公開之方法進行如下內容：自稻熱病菌株S-0412-II 2a株之雙鏈RNA之萃取、純化，以所獲得之雙鏈RNA為模板之cDNA之合成，繼而藉由5'RACE法之兩末端序列之分析。
其結果明確：MoCV3中含有五種雙鏈RNA。將該等五種雙鏈RNA之鹼基序列示於序列編號1~5中。再者，由於將雙鏈RNA置換為cDNA而進行序列測定，故而於序列表中「尿嘧啶」被置換為「胸腺嘧啶」。
再者，對所獲得之鹼基序列進行分析，結果序列編號1所示之RNA序列中包含存在於整體病毒及其相關病毒等中之RdRp(RNA依賴性RNA合成酶)之保存結構。又，於序列編號4所示之RNA序列中包含與法國蘑菇病病毒之L3雙鏈RNA片段具有同源性之區域。
該結果顯示：本發明之五種雙鏈RNA為新穎真菌病毒之基因資訊。
[實施例6]
於本實施例中，藉由噴霧接種法研究稻熱病菌株S-0412-II 2a株對植物病害真菌之防除是否有效。
將稻熱病菌株S-0412-II 2a株接種於燕麥培養基培養板上，並於25℃之室內培養。於接種後第15天未充分形成分 生孢子之情形時，於培養板中注入殺菌蒸餾水2 mL左右，用筆刮開培養基表面去除氣生菌絲，將該培養板於黑光燈下放置3天誘導分生孢子形成，並注入殺菌蒸餾水1 mL左右，再次用筆刮開培養基表面對每個氣生菌絲回收分生孢子，獲得分生孢子含有液。於接種後第15天未充分形成分生孢子之情形時，於培養板中注入殺菌蒸餾水2 mL左右，用筆刮開培養基表面對每個氣生菌絲回收分生孢子，獲得分生孢子含有液。又，作為對照，以與實施例1相同之程序製作稻熱病菌之真菌病毒完全治癒株，並以相同之程序自該菌獲得分生孢子含有液。
繼而，以擦拭紙(Kimwipe)或紗布過濾該等分生孢子含有液，將分生孢子濃度調整為2×106個/mL，並添加0.02%(v/v)之Tween20，製成分生孢子懸浮液。
繼而，使用噴嘴對水稻苗(考慮稻熱病真性抵抗性基因型及菌之品種(race)而適當選擇之品種，且為播種後第2週~第3週者)均勻地噴霧分生孢子懸浮液，於將植物體於26℃且相對濕度為100%之接種箱中靜置24小時之後，將器皿移至溫室中並將室溫維持為23~30℃，於噴霧接種後培養7天。並且，於噴霧接種後第7天，計測一定葉面積之形成3~4 mm之罹病性病斑之數。
將結果示於圖4中。圖4係表示接種有稻熱病菌之葉中之病斑數之圖表。圖中，縱軸表示接種有稻熱病菌之葉中之病斑數。圖中，「混合感染株」表示噴霧由感染有本發明之真菌病毒之稻熱病菌所製備的分生孢子懸浮液之情形時 之病斑數，「完全治癒株」表示噴霧由稻熱病菌之真菌病毒完全治癒株所製備的分生孢子懸浮液之情形時之病斑數(對照)。
如圖4所示，於噴霧由感染有本發明之真菌病毒之稻熱病菌所製備的分生孢子懸浮液之情形時，與對照相比，病斑數明顯減少。該結果顯示：稻熱病菌株S-0412-II 2a株對於植物病害真菌之防除有效。
[實施例7]
於本實施例中，利用打孔器(punch)傷痕接種法研究稻熱病菌株S-0412-II 2a株對植物病害真菌之防除是否有效。
以與實施例6相同之程序製備分生孢子懸浮液，並使該液附著於3%之水瓊脂膜上，自瓊脂膜切取約2 mm見方，製作瓊脂片。利用接種用打孔器夾住於23~30℃之溫室下栽培之水稻之第4葉，使其產生浸潤狀傷痕，將瓊脂片放置於該傷痕部分，將植物體於26℃、相對濕度100%之接種箱中靜置24小時之後，將器皿移至溫室中並將室溫維持為23~30℃，於接種後培養14天。繼而，於接種後第14天計測病斑之大小。
其結果為，於接種由稻熱病菌株S-0412-II 2a株所製備之分生孢子懸浮液之情形時，與對照相比，病斑之大小明顯較小。該結果顯示：與實施例6相同，本發明對植物病害真菌之防除有效。
[實施例8]
於本實施例中，利用電子顯微鏡鑑定存在於菌體外之 MoCV3粒子。與在此之前所揭示之方法同樣地，對MoCV3之病毒粒子進行生物化學特性之分析。其結果為，藉由SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)可確認病毒蛋白質之主要成分(鞘蛋白)之分子量約為70 kDa之尺寸。即，可確認MoCV3粒子之存在。
於電子顯微鏡觀察中，首先將稻熱病菌株S-0412-II 2a株於YG培養基(Yeast Extract(酵母抽提物)0.5%，葡萄糖2%)中培養，自該培養上清液單離病毒粒子。對該培養上清液進行離心(10,000×g，5分鐘)，進而對其上清液進行超離心(100,000×g，30分鐘)，獲得含有病毒粒子之沈澱物。將該沈澱物溶解於0.05 M之磷酸緩衝液(pH值為7.0)中，使用磷鎢酸或乙酸鈾進行負染色，並利用電子顯微鏡(倍率：×20,000~40,000)進行觀察。
將結果示於圖5中。圖5係自稻熱病菌株S-0412-II 2a株之培養上清液所獲得之病毒粒子之電子顯微鏡照片。圖5如所示，利用電子顯微鏡可鑑定本發明之真菌病毒之病毒粒子。該病毒粒子為約30~40 nm之正六邊形樣，包含於包膜樣之構造中。
[實施例9]
於本實施例中，將所單離之MoCV3於水稻葉上直接作為散佈劑，研究對稻熱病菌之防除效果及治癒效果。
具體而言，準備適度稀釋培養上清液中所存在之MoCV3而成之病毒溶液(原液之10倍~100倍左右)作為病毒噴霧 液。繼而，對自發芽經過2週~3週之水稻苗噴霧源自經稀釋之培養上清液之病毒溶液，接著使其感染稻熱病菌，並且針對各試驗區算出防除率。防除率係依據關於用以指定特定防除材料(特定農藥)之評價之準則而算出：防除率=100-(處理區之受害/無處理區之受害)×100。
其結果為，於將MoCV3用作病毒散佈劑時，可獲得63.6以上之防除率之結果。又，藉由相同之方法，算出國際專利公開WO/2009/093409號公報中所揭示之MoCV1之防除率，結果為56.8。由該結果可明確：與先前公知之真菌病毒相比，內源性地存在於稻熱病菌株S-0412-II 2a株中之MoCV3對稻熱病菌之防除效果、或因治癒效果而產生之稻熱病菌之防除效果極為優異。
[實施例10]
於本實施例中，研究酵母細胞內之MoCV3病毒粒子之再構建。即，使MoCV3病毒於麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae)之細胞內再構建，因此製作以MoCV3所具有之5個dsRNA基因組為模板之全長cDNA純系，分別連接於5種具有標記基因之穿梭載體(shuttle vector)(參照以下)上，使MoCV3基因產物於麵包酵母細胞內獲得表現，進行MoCV3病毒粒子之再構建。
<酵母基因表現用穿梭載體之構建>
形成基本載體之pRS313、pRS314、pRS315、pRS316係自National BioResource(http：//yeast.lab.nig.ac.jp/nig/index.html)購入，且自ATCC(http：//www.atcc.org/)購入pRS317、 pRS412、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426。
ADH1(Alcohol dehydrogenase 1，乙醇去氫酶)卡夾(ADH1啟動子+MCS+ADH1終止基因)係使用BamHI自pAUR123(TaKaRa Bio公司製造)切取，於pUC19上次選殖。為了構建TDH3(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸去氫酶)卡夾，首先藉由以麵包酵母株W303-1A(Mat a ura3 leu2 his3 trp1 ade2 can1)之基因組DNA為模板之PCR，對於TDH3上游600 bp之3'側附加有MCS(Malti Cloning Site，多重選殖位)之一半的擴增產物、及於TDH3下游350 bp之5'側附加有MCS之剩餘一半的擴增產物進行次選殖。將所獲得之2個構建物以成為TDH3上游600 bp+MCS+TDH3下游350 bp之方式連接，製成TDH3卡夾。
除去上述基本載體之MCS，並於此部位重新插入ADH1卡夾或TDH3卡夾。將插入有ADH1之pRS313、pRS314、pRS315、pRS316及pRS317分別設為pRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316及pRSA317。將插入有TDH3之pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS317、pRS423、pRS424、pRS425及pRS426分別設為pRST313、pRST314、pRST315、pRST316、pRST317、pRST423、pRST424、pRST425及pRST426。
<表現源自MoCV3之基因(dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及dsRNA5)之穿梭載體構建物之製作>
以MoCV3全長cDNA純系dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及dsRNA5為模板，利用PCR擴增全長序列。於將 所獲得之DNA片段於pUC19上次選殖之後，進行序列分析，選拔正確之純系(圖6)。自所獲得之純系利用限制酶切出目標區域，並純化，進而插入至上述穿梭載體上。最後，根據序列確認插入序列及其周邊序列是否有變化。
<MoCV3全長cDNA之製作> <dsRNA1>
利用native PAGE(非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳)對每種成分進行以所分離之dsRNA1或純化MoCV3 dsRNA為模板之RT-PCR，獲得全長之DNA片段。向溶解於蒸餾水中之模板雙鏈RNA(約50 ng-100 ng)中添加dsRNA1特異性引子(MoCV3-cDNA-dsRNA1-5end-SmaI及MoCV3-cDNA-dsRNA1-3end-XbaI)各20 pmol，於98℃下培養5分鐘之後，於冰上急冷3分鐘。其後，於40 μl之反應系中，於1×first strand synthesis buffer(第一鏈合成緩衝液)(invitrogen公司製造)、1 mM之CH3HgOH、10 mM之DDT、1 mM之dNTPmix、40 U之RNase OUT Recombinant(invitrogen公司製造)、200 U之Super Script III反轉錄酶之條件下，於42℃下培養30分鐘，其後於70℃下培養15分鐘，其後添加5 U之RNase H。於37℃下培養10分鐘，其後於70℃下培養15分鐘，其後使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)對cDNA進行純化、濃縮。以該cDNA溶液為模板，於PCR中使用2 U之Pfu-x(Greiner公司製造)及其隨附緩衝液、磷酸化引子(MoCV3-cDNA-dsRNA1-5end-SmaI：GCC CCG GGG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C(序列編號11)及 MoCV3-cDNA-dsRNA1-3end-XbaI：GTT CTA GAG GTA CTT ACA CCT CAC AGC GTA AGA A(序列編號12))。反應條件設為如下：於95℃下進行2分鐘之後，以於95℃下進行30秒鐘、於55℃下進行30秒鐘及於68℃下進行3.5分鐘為1個循環而進行30個循環，其後於68℃下進行7分鐘。於瓊脂糖凝膠電泳後，將目標cDNA擴增片段自凝膠萃取、純化，使用DNA連接試劑盒Ver.2.1(TaKaRa Bio公司製造)組入質粒載體(plasmid vector)pUC19 DNA SmaI(MBI Fermentas公司製造)中。根據序列獲得藉由藍白篩選所得之純系之插入片段之全長序列，選擇與MoCV3 dsRNA1之序列完全一致之純系。
<dsRNA2>
使用dsRNA2特異性引子(MoCV3-cDNA-dsRNA2-5end-SacI：GCG AGC TCG CAA AAA AGA GAA TAA AGC ATT CCC T(序列編號13)及MoCV3-cDNA-dsRNA2-3end-Hpa1：GTG TTA ACG GTA CTT ACG TTG TCA CGT AAG AAG T(序列編號14))，藉由與dsRNA1之全長cDNA製作相同之方法獲得與MoCV13dsRNA4之序列完全一致的純系。
<dsRNA3>
使用dsRNA3特異性引子(MoCV3-cDNA-dsRNA3-5end-Sal1：GCG TCG ACG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C(序列編號15)及MoCV3-cDNA-dsRNA3-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT GTT GGG ACC CTA CGT CCG A(序列編號16))，藉由與dsRNA1之全長cDNA製作相同之方法獲得與MoCV13dsRNA4之序列完全一致的純系。
<dsRNA4>
使用dsRNA4特異性引子(MoCV3-cDNA-dsRNA4-5end-Sal1：GCG TCG ACG CAA AAA AGA GAA TAA AGC TTT CTC C(序列編號17)及MoCV3-cDNA-dsRNA4-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT GTT GAA GCC CCA TGC TCA A(序列編號18))，藉由與dsRNA1之全長cDNA製作相同之方法獲得與MoCV13dsRNA4之序列完全一致的純系。
<dsRNA5>
使用dsRNA5特異性引子(MoCV3-cDNA-dsRNA5-5end-Sma1：GCC CCG GGG CAA AAA AGA GAA TAA AGC ATT CTC C(序列編號19)及MoCV3-cDNA-dsRNA5-3end-Xba1：GTT CTA GAG GTA CTT ACG TCA TCA CGT AAG AAG T(序列編號20))，藉由與dsRNA1之全長cDNA製作相同之方法獲得與MoCV13dsRNA5之序列完全一致的純系。
<於酵母中之質粒DNA轉形> <乙酸鋰法>
依據乙酸鋰法之轉形係以如下方式進行。首先，將酵母植菌於5 ml之液體培養基中，於30℃下預培養10~16小時。於培養後，測定吸光度(OD600)，以成為OD600=0.1~0.2之方式植菌於50 ml之液體培養基中。於30℃下以100 rpm進行培養直至OD600=0.8為止，藉由離心分離回收細胞並 於蒸餾水中懸浮、洗淨。將沈澱之細胞藉由Sol A(0.1 M之乙酸鋰，10 mM之Tris-HCl pH值7.8，1 mM之EDTA(乙二胺四乙酸))懸浮並進行離心分離，再次於沈澱物中添加Sol A使其懸浮而製成酵母溶液。於將其於30℃下培養50分鐘之後，依序加入經熱處理之ssDNA(1 mg/ml，源自鮭精巢)10 μl、酵母溶液50 μl、穿梭載體10 μl、Sol A 20 μl、50%之聚乙二醇750 μl，其後於30℃下培養30分鐘，其後於42℃下培養15分鐘。於離心分離後，於沈澱物中加入蒸餾水並塗佈於SC瓊脂(Sulfite Cycloserine Agar，環絲胺酸瓊脂)平板培養基(配合穿梭載體之選擇標記選擇脫落培養基)上，於30℃下進行培養。
<原生質體法>
利用原生質體法之轉形係如以下方式進行。首先，以與上述之乙酸鋰法相同之方式培養及回收酵母細胞，使細胞懸浮於1.2 M之山梨糖醇溶液中，並藉由離心分離(2500 rpm，5分鐘)回收細胞。將沈澱之細胞再次懸浮於1.2 M之山梨糖醇溶液中，並添加酶解酶(Zymorase)(20 T，1/10量1)。於30℃下進行培養直至大多數之細胞原生質體化。利用1.2 M之山梨糖醇溶液對細胞洗淨3次，並使其懸浮於STC(sod ium taurocholate，牛磺膽酸鈉)溶液中。對該原生質體懸浮液100 μl加入質粒溶液23 μul及經熱處理之ssDNA(1 mg/ml，源自鮭精巢)1 μl、PEG溶液4 ml，並溫和地進行混合。於靜置10分鐘之後，藉由離心分離(1200 rpm，5分鐘)使原生質體沈澱，並使其懸浮於SOS溶液150 μl中。於30℃下培養1小時之後，與5 ml之SD山梨糖醇-低熔點瓊脂糖溶液進行混合，並塗佈於SD山梨糖醇培養板上。
<電穿孔法>
利用電穿孔法之轉形係如以下方式進行。首先，以與乙酸鋰法相同之方式培養及回收酵母細胞，於藉由離心分離回收細胞後使其於蒸餾水中懸浮並洗淨。於12.5 ml之LiAC/DTT/TE溶液中懸浮，並於室溫下靜置1小時之後，藉由離心分離(6,000 rpm，5分鐘)使細胞沈澱。將該沈澱於12.5 ml之冰水中懸浮，並洗淨2次。將細胞懸浮於1 M之山梨糖醇溶液5 ml中，並藉由離心分離(6,000 rpm，5分鐘)使細胞沈澱。使該沈澱懸浮於1 M之山梨糖醇溶液50 μl中，製成細胞懸浮液。對細胞懸浮液70 μl加入質粒溶液5 μl，並於冰上靜置5分鐘。將其放入0.2 cm之比色管中，以1.5 kV、25 μFD、200 ohms進行電穿孔。直接添加1 M之山梨糖醇溶液1 ml，並塗佈於1 M之山梨糖醇培養板培養基上。
<藉由MoCV3 dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及dsRNA5-導入之酵母內MoCV3再構建>
為了製作用於表現MoCV3 dsRNA1~5之pRSAA313-dsRNA1、pRSA314-dsRNA2、pRSA315-dsRNA3、pRSA316-dsRNA4及pRSA317-dsRNA5，構建將藉由上述方法所製作之自dsRNA1至dsRNA5之全長cDNA純系分別連接於pRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316、 pRSA317之限制酶位點而成之穿梭載體(圖7及8)。於將dsRNA1之cDNA全長連接於pRSA313上時使用限制酶位點SmaI及XbaI(圖7a)，於將dsRNA2之全長cDNA連接於pRSA314上時使用限制酶位點SacI及HpaI位點(圖7b)，於將dsRNA3之全長cDNA連接於pRSA315上時使用限制酶位點SalI及XbaI(圖7c)，於將dsRNA4之全長cDNA連接於pRSA316上時使用限制酶位點SalI及XbaI(圖8a)，於將dsRNA5之全長cDNA連接於pRSA317上時使用限制酶位點SmaI及XbaI(圖8b)。藉由連接而獲得之表現dsRNA1至dsRNA5之基因的各穿梭載體係利用乙酸鋰法而導入麵包酵母YPH499株(Mat a ura3 lys2 ade2 leu2 his3 trp1)中。
將所獲得之轉形菌落於微生物培養裝置中進行培養，嘗試病毒樣粒子之純化。於使用法式細胞破碎機(French press)使酵母細胞破碎後，以與MoCV3病毒粒子純化法相同之方法進行純化，並藉由蔗糖濃度梯度離心進行區分。對所獲得之組份，進行使用抗MoCV3抗血清之西方墨點分析(Western analysis)(圖9a)。其結果為，於導入有MoCV3 dsRNA1-5之酵母樣品之蔗糖濃度24%附近，檢測出認為源自MoCV3蛋白質之訊號。進行電子顯微鏡觀察，結果觀察到MoCV3病毒樣粒子(圖9b)。
本說明書中所引用之所有出版物、專利及專利申請直接作為參考而併入本說明書中。
圖1係表示觀察PDA培養基中之稻熱病菌S-0412-II 2a株 及稻熱病菌S-0412-II 1a株之菌落而獲得之結果的照片。
圖2係表示利用PDA培養基對稻熱病菌S-0412-II 2a株及稻熱病菌S-0412-II 1a株之病毒治癒株進行菌落觀察而獲得之結果的照片。
圖3(A)係表示稻熱病菌S-0412-II 2a株及其病毒治癒株之菌絲生產量的特性圖，圖3(B)係表示稻熱病菌S-0412-II 1a株及其病毒治癒株之菌絲生產量的特性圖。
圖4係表示對稻熱病菌株S-0412-II 2a株進行噴霧接種時之病斑數之圖表。
圖5係MoCV3粒子之電子顯微鏡照片。
圖6係表示於將MoCV3全長cDNA純系dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4及dsRNA5藉由PCR擴增之後，於pUC19上次選殖而獲得之質粒之構成的圖。
圖7(a)~圖7(c)係表示用於構建穿梭載體之pRSA313、pRSA314及pRSA315之構成的圖。
圖8(a)、圖8(b)係表示用於構建穿梭載體之pRSA316及pRSA317之構成的圖。
圖9(a)係表示藉由蔗糖濃度梯度離心對再構建之MoCV3進行區分，並針對所獲得之組份進行使用抗MoCV3抗血清之西方墨點分析而獲得之結果的圖，圖9(b)係利用電子顯微鏡觀察MoCV3病毒樣粒子而獲得之結果的圖。
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20

Claims (8)

  1. 一種真菌病毒，其特徵在於：具有五種雙鏈RNA，該五種雙鏈RNA中之四種雙鏈RNA分別相對於序列編號1~4所示之鹼基序列具有81%、75%、72%及73%以上之同源性。
  2. 如請求項1之真菌病毒，其中該五種雙鏈RNA為分別包含序列編號1~5所示之鹼基序列之聚核苷酸。
  3. 一種植物病害真菌，其係將如請求項1或2真菌病毒感染宿主而獲得者。
  4. 如請求項3之植物病害真菌，其中上述宿主為稻熱病菌。
  5. 一種植物病害防除劑，其含有如請求項1或2之真菌病毒或者如請求項3或4之植物病害真菌。
  6. 一種植物病害真菌防除方法，其包括使如請求項5之植物病害防除劑與植物接觸之步驟。
  7. 一種植物病害真菌減毒化方法，其包括使如請求項1或2之真菌病毒感染植物病害真菌之步驟。
  8. 如請求項7之植物病害真菌減毒化方法，其中上述植物病害真菌為稻熱病菌。
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