CN111918551A

CN111918551A - 香柱菌属内生菌

Info

Publication number: CN111918551A
Application number: CN201980014021.XA
Authority: CN
Inventors: 大卫·爱德华·休姆; 韦恩·罗伊登·辛普森; 理查德·大卫·约翰逊
Original assignee: Grains Research and Development Corp; Grasslanz Technology Ltd
Current assignee: Grains Research and Development Corp; Grasslanz Technology Ltd
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2020-11-10
Also published as: AU2019224738A1; EP3740063A4; EP3740063A1; UY38105A; CA3089560A1; RU2020130389A; WO2019162816A1; WO2019162816A8; US11839187B2; US20210068364A1

Abstract

本发明涉及与宿主植物形成稳定共生体的香柱菌属内生菌的分离菌株，其中共生体是并非天然存在的内生菌和宿主植物的组合。本发明还涉及并非天然存在的宿主植物和香柱菌属内生菌的组合，制备此类组合的方法，以及使用此类内生菌赋予宿主至少一定水平的害虫抗性的方法。

Description

香柱菌属内生菌

技术领域

本发明通常涉及与宿主植物形成共生体的产生具有杀虫活性的次级代谢物的香柱菌属

内生菌，使用内生菌赋予宿主植物害虫抗性的方法，及包含内生菌和植物或其部分(包括种子)的组合。

背景技术

禾谷植物生长在世界各地，是最古老且最重要的作物之一。禾谷植物被广泛用于为牲畜青贮饲料和谷粒，以饲喂诸如绵羊、牛、猪和家禽的农场动物。

禾谷黑麦(Secale cereale)，俗称黑麦，生长在世界各地，通常用于谷物生产。谷物主要用于制作面粉、面包和直接食用，特别是在那些有黑麦面包食用史的国家。禾谷黑麦的营养部分可以用作秸秆，或转化为青贮饲料，用作动物饲料，包括用于就地放牧。

另一种重要的禾谷植物是小麦。小麦谷粒被广泛用于生产用于各种烘焙食品和制作面食的面粉。小麦还用于生产淀粉、麦芽、右旋糖、面筋、酒精和其他商业产品。小麦植株的营养部分可以用作秸秆，或转化为青贮饲料，或用于动物饲料，包括用于就地放牧。

全球用于小麦生产的可耕地比任何其他粮食作物都多，据估计， 2014年产量约为2.2亿公顷的播种小麦(联合国粮食和农业组织，2014)。在谷物中，小麦产量仅次于玉米，2016年小麦产量约为7.5亿吨(联合国粮食和农业组织，2016)。小麦的蛋白含量约为13％，并且是人体植物蛋白的主要来源。全麦是必需营养素和膳食纤维的来源。

正如从此类广泛种植的农作物所预期的那样，禾谷植物受到许多害虫的攻击，其活动可严重降低总产量。已知害虫包括但不限于许多鳞翅目(Lepidoptera)(蛾和蝶)，包括大螟和粘虫；蚜虫，包括谷物蚜虫 (同翅目(Homoptera))；蓟马(缨翅目(Thysanoptera))；线虫、步甲(玉米距步甲(Zabrus tenebrioides))、谷叶甲虫(黑甲负泥虫(Oulemamelanopus)、齿负泥虫(O.gallaeciana))和白蛴螬(鞘翅目(Coleoptera))；双翅目(Diptera)，包括单角革鲀(大蚊属某些种(Tipula spp.))、小麦根害虫(麦地种蝇(Deliacoarctata))、潜叶虫(潜蝇属某些种(Agromyza spp.))、麦秆蝇(瑞典麦秆蝇(Oscinellafrit))、小麦瘿蚊(黑森麦瘿蚊 (Mayetiola destructor))、鞍瘿蚊(Haplodiplosismarginata)；蝗虫 (Orthoptera)；白蚁(等翅目(Isoptera))；线虫类和蛞蝓。

为了克服生产力的损失，需要在培养期间进行有效的害虫保护，以确保生产出大量合格品质的谷粒。

已知的禾谷植物害虫控制方法包括以下一些或全部实践：使用抗害虫栽培种、优化播种时间和使用健康种子进行播种、有效的轮作、破坏和/或埋葬或去除农作物碎片(残株)。可能需要的其他害虫控制方法包括在植物和/或种子上使用各种杀虫剂。有时，可能需要同时施加两种或多种活性物质以控制害虫。

然而，由于与经常用于此类目的的化学品有关的已知问题，许多杀虫剂的使用可能会成问题。许多杀虫剂是有毒的，并且可能对经处理的农作物的人和动物消费者构成危险(Casida和Quistad，1998)。特别地，在人和动物中积累有毒杀虫剂可给个人带来严重的健康问题，尤其是在早期发育期间。例如，杀虫剂暴露已与呼吸系统病症、发展性癌症有关，并已显示出对心理能力发育的持久影响(Zejda等人 1993)。许多杀虫剂还杀死了有益的生物体，其有助于控制害虫并进行必要的生态系统服务，诸如授粉和养分循环。

在可变的环境条件下，可能难以控制杀虫剂的使用，例如通过喷雾剂的漂移或通过土壤淋洗，导致有毒化合物的不希望的扩散。此外，害虫可能由于多种原因而发展出抗虫剂耐受性，包括不当实践和处理，这可能对作物(谷粒)的产量构成真正的威胁。因此，需要不施加杀虫剂的害虫控制措施。

本发明的一个目标是提供至少一种香柱菌属内生菌菌株，其当与宿主植物组合时赋予宿主植物至少一定水平的害虫保护/或疾病保护而不需要施加杀虫剂和/或向公众至少提供一种可用的选择。

在已经参考专利说明书、其他外部文件或其他信息源的本说明书中，这通常是为了提供讨论本发明的特征的上下文的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文件的引用不应视为承认此类文件或此类信息源在任何司法管辖范围内均为现有技术，或构成本领域公知常识的一部分。

发明内容

在第一方面，本发明涉及香柱菌属内生菌的分离菌株，其中内生菌包含188±0.8碱基对(bp)的B10等位基因尺寸和112±0.8bp的B11 等位基因尺寸。

在另一方面，本发明涉及选自以下的香柱菌属内生菌的分离菌株： AR3002(NRRL50579)、AR3005(NRRL 50580)、AR3007(NRRL# 67556)和AR3042(NRRL#67560)或它们的组合。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合，其中该组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在另一方面，本发明涉及感染了本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物。

在另一方面，本发明涉及制备产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法，其包括用本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染宿主植物，其中该组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在另一方面，本发明涉及赋予宿主植物至少一定水平的害虫保护的方法，其包括用本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染所述宿主植物以形成宿主植物/香柱菌属内生菌组合，其中宿主植物/香柱菌属内生菌组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在另一方面，本发明涉及感染了本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株的植物种子。

在另一方面，本发明涉及本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的用途。

在另一方面，本发明涉及阻止或减少对土地区域中的植物的害虫损伤的方法，其包括用以下种植土地区域：感染了本发明的香柱菌属内生菌的宿主植物、本发明的组合或本发明的经感染的植物种子。

在另一方面，本发明涉及增加宿主植物的产量的方法，其包括用本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染宿主植物以形成宿主植物/香柱菌属内生菌组合，其中宿主植物/香柱菌属内生菌组合比未感染内生菌的宿主植物产生更高的产量。

通过仅以实例的方式并参考附图给出的以下描述，本发明的其他方面将变得显而易见。

本发明也可以广义地包括在本申请的说明书中所指或指出的部分、要素和特征，或由在本申请的说明书中所指或指出的部分、要素和特征组成，其单独或共同地以所述部分、要素或特征中的两个或多个的任何或全部组合，并且在本文中提及具有与本发明相关的领域中的已知等同物的特定整数时，此类已知等同方案被视为并入本文中，如同单独阐述一样。

附图说明

现在将仅通过实例的方式并参考附图来描述本发明，其中：

图1.用不同内生菌菌株感染或无内生菌(Nil)的禾谷黑麦(黑麦或黑麦玉米)栽培种Rahu(A)和栽培种Amilo(B)中具有所有水平的阿根廷茎象甲(listronotusbonariensis)幼虫损伤(总)和具有中度和重度损伤 (重度)的分蘖的百分比。误差条＝SED。

图2.显示出基本上正常表型的禾谷黑麦和香柱菌属内生菌的共生体。

发明详述

定义

提出以下定义以更好地定义本发明，并作为本领域普通技术人员在实施本发明时的指导。

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语应理解为具有与本公开所属的相关领域的普通技术人员所理解的含义相同的含义。在植物学、微生物学、分子生物学和生物化学中常用术语的定义的实例可以见于：Biology of Plants,Raven等人(编辑),W.H.Freeman and Company,(2005)；Plant Physiology,Taiz等人(编辑),SinauerAssociates,Incorporated,(2010)；Botany:An Introduction to Plant Biology,J.D.Mauseth,Jones&Bartlett Learning,(2003)；Methods for General and MolecularMicrobiology,第3版,C.A.Reddy,等人(编辑), ASM Press,(2008)；Encyclopedia ofMicrobiology,第2版,Joshua Lederburg,(编辑),Academic Press,(2000)；MicrobiologyBy Cliffs Notes, I.Edward Alcamo,Wiley,(1996)；Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,Singleton等人(第2版)(1994)；Biology of Microorganisms第11版,Brock等人,Pearson Prentice Hall,(2006)； Biodiversity of Fungi:Inventory andMonitoring Methods,Mueller等人, Academic Press,(2004)；Genes IX,BenjaminLewin,Jones&Bartlett Publishing,(2007)；The Encyclopedia of Molecular Biology,Kendrew等人(编辑),Blackwell Science Ltd.,(1994)；Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,Robert A.Meyers(ed.), VCHPublishers,Inc.,(1995)；Symbioses of grasses with seedborne fungalendophytes.Schardl CL等人(2004)Annual Review of Plant Biology 55: 315-340；和Chemotype diversity of

fungal symbionts of grasses, Schardl CL,Young CA,Faulkner JR,Florea S,Pan J(2012)Fungal Ecology 331-344(Schardl等人,2012)。

还据信，可以使用如本领域已知和如以下所述的标准植物学、微生物学、分子生物学和生物化学方案和程序来进行本发明的实践： Methods of Studying Root Systems,第33卷,Wolfgang Bahm, Springer-Verlag,(1979)；Root methods:A Handbook,AlbertL.Smit Springer,(2000)；Biodiversity of Fungi:Inventory and MonitoringMethods,Mueller等人,Academic Press,(2004)；Environmental Microbiology:Methodsand Protocols,J.F.T.Spencer等人,Humana Press,(2004)；EnvironmentalMicrobiology,P.D.Sharma,ΑScience International,(2005)；EnvironmentalMicrobiology,J.R.Leadbetter,Gulf Professional Publishing,(2005),MolecularCloning:A Laboratory Manual, Maniatis等人,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,(1982)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)，Sambrook等人,ColdSpring Harbor Laboratory Press,(1989)；Guide to Molecular Cloning Techniques第152卷,S.L.Berger和A.R.Kimmerl(编辑),Academic Press Inc., (1987)；Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses.1994Bacon和 White(编辑)，以及本公开涉及和其全部内容通过引用整体并入本文的本领域相关的其他通常可获得的参考材料。

如本文所用的术语“植物”涵盖了植物生命周期所有阶段的整个植物和植物的所有部分，其包括但不限于营养和生殖细胞以及组织、繁殖体、种子、胚、芽、茎、叶、叶鞘和叶片、花序、根、花药、舌叶、木栅、叶肉、表皮、叶耳、托苞、外稃和分蘖。

如本文所用的术语"正常生命周期"是指宿主植物、优选小麦或黑麦植物、优选六倍体小麦植株的正常繁殖周期，其包括第一代植物的生长以产生种子，所述种子当发芽时即生长为第二代植物。

如本文所用的宿主植物的术语“正常表型”是指如在宿主植物的生命周期期间展示的宿主植物的典型形态、生长和其他表型特征，包括对此宿主植物(当不含内生菌时)已知和本领域通常接受的宿主植物繁殖周期和宿主植物种子。

如本文所用的提及宿主植物的术语“异常表型”是指在宿主植物生命周期(包括宿主繁殖周期和宿主植物种子)的任何阶段的宿主植物的形态、生长或其他表型特征，其不同于本领域已知和广泛接受的对于此宿主植物是典型的或在通常观察到的范围内的形态、生长或其他表型特征。如本文所用的提及宿主植物的术语“异常表型”可包括矮小植物或矮化植物，或具有明显的内生菌感染的视觉外部证据的植物，或不能通过种子完成正常繁殖的植物，但不限于此。

如本文所用的术语“香柱菌属”是指内生菌真菌的香柱菌属，其包含来自两个先前命名的属的真菌内生菌：无性型成员内生真菌属 (Neotyphodium)和有性型成员香柱菌属(Leuchtmann A,等人,2014)。

如本文所用的术语“香柱菌属内生菌”是指本领域已知的或本文所示的与宿主植物形成共生体的香柱菌属的内生菌。

如本文所用的术语“赋予至少一定水平的害虫保护”涵盖了与缺乏真菌内生菌的宿主植物(对照植物)或具有不同真菌内生菌的宿主植物相比，害虫对小麦植株的作用的发生率、严重性和/或持续时间的可测量减少。在一些实施方案中，宿主植物是感染了根据本发明的香柱菌属真菌内生菌的宿主植物，黑麦属某些种(Secale spp.)(黑麦)或小麦属某些种(Triticum spp.)(小麦)植物，优选禾谷黑麦或普通小麦(T. aestivum)。优选地，可测量的减少是统计上显著的减少，其P值为0.05 或更小。

如本文就生物碱水平而言所用的术语“足以赋予害虫保护的水平”和“足以赋予害虫抗性的水平”及其语法变体意指由宿主植物-内生菌共生产生的任何水平的生物碱，其足以产生与缺乏真菌内生菌的宿主植物(对照植物)或具有不同真菌内生菌的宿主植物相比，害虫对宿主植物的侵扰、感染或有害作用的发生率、严重性或持续时间的可测量减少。在一些实施方案中，宿主植物是昆虫害虫。在一些实施方案中，宿主植物是感染了根据本发明的香柱菌属真菌内生菌的宿主植物，黑麦属某些种(黑麦)或小麦属某些种(小麦)植物，优选禾谷黑麦或普通小麦。在一些实施方案中，生物碱是裸麦角碱、雀稗灵(paspaline)或terpendole E。优选地，可测量的减少是统计上显著的减少，其P值为 0.05或更小。

如本文所用的术语“具有增加的对植物疾病的抗性”及其语法变体涵盖了与缺乏真菌内生菌的宿主植物(对照植物)或具有不同真菌内生菌的宿主植物相比，可测量地降低了植物疾病对宿主植物的作用的发生率、严重性和/或持续时间。在一些实施方案中，宿主植物是感染了根据本发明的香柱菌属真菌内生菌的宿主植物，黑麦属某些种(黑麦) 或小麦属某些种(小麦)植物，优选禾谷黑麦或普通小麦。优选地，可测量的减少是统计上显著的减少，其P值为0.05或更小。

如本文就生物碱水平而言所用的术语“足以赋予针对植物疾病的保护的水平”和“足以赋予对植物疾病的抗性的水平”及其语法变体意指由宿主植物-内生菌共生产生的任何水平的生物碱，其足以产生与缺乏真菌内生菌的宿主植物(对照植物)和/或具有不同真菌内生菌的宿主植物相比，对宿主植物的植物疾病侵扰、感染或有害作用的发生率、严重性和/或持续时间的可测量的减少。在一些实施方案中，植物疾病是真菌疾病。在一些实施方案中，宿主植物是感染了根据本发明的香柱菌属真菌内生菌的宿主植物，黑麦属某些种(黑麦)或小麦属某些种 (小麦)植物，优选禾谷黑麦或普通小麦。在一些实施方案中，生物碱是裸麦角碱、雀稗灵或terpendole E。优选地，可测量的减少是统计上显著的减少，其P值为0.05或更小。

如本文所用的术语“统计上显著的”是指结果或关系是由随机机率以外的其他因素引起的可能性。使用本领域已知和使用的统计假设检验可以发现结果是统计上显著的。统计假设检验提供了如本领域已知的“P值”，它表示测量结果仅是由于随机机率引起的概率。相信在本领域中普遍认为5％(0.05)或更低的显著性水平是统计学上显著的。

如本文所用的术语“增强的害虫保护”是指赋予香柱菌属真菌内生菌的共生体中的宿主植株的害虫保护的水平，其与对缺乏真菌内生菌的植物(对照植物)(优选草类植物、优选黑麦属某些种(黑麦)或小麦属某些种(小麦)植物、优选禾谷黑麦或普通小麦)和/或具有不同真菌内生菌的宿主植物的相同害虫侵扰、感染和/或有害作用的发生率、严重性和/或持续时间相比，减少了由于给定害虫的存在和/或活性导致的对植株的害虫侵扰、感染或有害作用的发生率、严重性和/或持续时间。

如本文所用的术语“人工感染”和“人工接种”涵盖了对植物、特别是优选具有AR3002的植物、优选草类植物、优选黑麦属某些种(黑麦) 或小麦属某些种(小麦)植物、优选禾谷黑麦或普通小麦进行任何接种，以形成自然界未知的植物/真菌共生体。

如本文就与宿主植物组合或结合的内生菌而言，所用的术语“非内源性”意指内生菌并非内源性地存在于宿主植物中；即，内生菌对于此组合是“非内源性”内生菌。优选地，组合或结合是稳定的共生组合或结合。要清楚一点，如本文所述的宿主植物和非内源性内生菌的组合是并非天然存在的人工组合。在一些实施方案中，宿主植物小麦植物，优选地，其中小麦植物是六倍体小麦的种、品系或菌株，优选小麦属某些种，优选普通小麦或其变体或栽培种。

如本文就与香柱菌属内生菌组合或结合的宿主植物而言，所用的术语“非内源性”意指宿主植物并非内生菌的内源性宿主；即，宿主植物对于此组合是“非内源性”植物。优选地，组合或结合是稳定的内生组合或结合。要清楚一点，如本文所述的非内源性宿主植物和香柱菌属内生菌的组合是并非天然存在的人工组合。

如本文在真菌内生菌的上下文中所用的术语“在植物原位”意指本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合，其中内生菌在宿主植物内是有共生活性，并且优选地，其中内生菌与宿主植物形成稳定的植物/真菌内生。

如本文所用的术语“稳定的植物/真菌共生”和“稳定的宿主植物 /香柱菌属内生菌组合”是指在植物的整个生命周期中持续的共生体，其中植物未显示出感染内生菌的外部症状。在“稳定的宿主植物/香柱菌属内生菌组合”中，使宿主植物在第一代中用内生菌感染并产生种子，其发芽时生长为也感染了内生菌的宿主植物的第二代。除非另外明确说明，否则如本文所用的指代如本文所述的经分离的香柱菌属内生菌和宿主植物的术语“组合”意指稳定的宿主植物/香柱菌属内生菌组合。

当与参考数字指示结合使用时，术语"约"意指参考数字指示±最大该参考数字指示的10％。例如，"约100"意指90至110，并且"约6" 意指5.4至6.6。

术语“碱基对”意指如本领域已知的典型的核酸碱基对。

如本文就香柱菌属真菌内生菌而言，所用的术语“AR3002型”意指具有表2所述的22种相同的SSR标记的内生菌，特别是AR3002、 AR3005、AR3007和AR3042。

如本文所用的术语ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、egs031、 ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、 ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095 特别是指具有如表1所述的这些标记的等位基因。

如本说明书中的术语“包含”意指“至少部分由……组成”。在解释说明书中包含此术语的陈述时，每个陈述中以此术语开头的特征都必须存在，但其他特征也可以存在。相关术语诸如“包括”和“包含”应以相同的方式解释。

如本文所用的术语"基本上由……组成"意指所指定的材料或步骤以及不会实质性地影响所要求保护的发明的基本特征和新特征的那些材料或步骤。

如本文所用的术语“由……组成”意指所要求保护的发明的指定材料或步骤，不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。

对本文公开的一定范围的数字(例如，1至10)的引用还意在涵盖对此范围内的所有有理数(例如、1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、 7、8、9和10)以及还有此范围内的任何范围的有理数(例如，2至8、 1.5至5.5和3.1至4.7)的引用，并因此本文中明确公开的所有范围的所有子范围在此明确公开。这些仅是特定意图的实例，并且在所列举的最小值和最大值之间的所有可能的数值组合应被认为在本申请中以类似的方式明确陈述。

发明详述

许多凉季的草(早熟禾科(Poaceae)，早熟禾亚科(subfam.Pooideae)) 具有种子传播的香柱菌属真菌内生菌，其以其生物保护性质而著称并且尤其以抗害虫生物碱诸如黑麦草碱(Zhang等人,2010)和波胺 (Koulman等人,2007)产生而著称。无性香柱菌属(之前称为内生真菌属物种)主要或全部垂直传播，而相关香柱菌属物种的有性结构(子座)可产生水平传播的孢子(子囊孢子)(Zhang等人,2010)。

香柱菌属真菌和宿主草类之间的共生体是常见的，并且分子系统发育证据表明，在这些共生体中观察到的物种特异性是由于这些植物群与真菌内生菌共同进化而来(Schardl等人,2008)。

通常，在宿主植物与其香柱菌属真菌内生菌之间形成的共生体基于复杂和紧密的生物相互作用，这导致对内生菌和宿主两者的高度物种特异性(Simpson和Mace，2012)。

尽管可能有一些野生型亲缘种，但没有现代的驯化谷物被香柱菌属内生菌自然感染(Marshall等人，1999)。不希望受到理论的束缚，发明人认为，在现代谷物的进化过程中，农业实践诸如储存种子可能导致失去历史关联(如果存在的话)(Welty等人，1987)。

因此，在香柱菌属内生菌和宿主植物(其不是真菌的天然宿主)之间建立稳定植物/真菌共生是有问题且不可预测的(Simpson和Mace, 2012)。

据认为，这是由于在此类共生的形成中，需要伙伴之间成功整合多个生物变量，其可包括生态、生化和/或分子的不相容性(Christensen 等人,2000)。本公开详述了开发成功的方案和程序所需的大量研究，包括大量的试验和错误实验，通过所述方案和程序，已经建立了香柱菌属内生菌的某种菌株和不是此类真菌内生菌的天然宿主的禾谷植物 (包括小麦和黑麦)之间的稳定共生体。

令人惊讶的是，本发明人已经确定，可以使用人工接种在一些香柱菌属内生菌和黑麦或小麦植株(特别是六倍体小麦植株)之间建立稳定共生。通过使用本文所述的本发明主题，本发明人能够产生与感染真菌内生菌一起形成稳定共生体的经感染的宿主植物、特别是小麦和 rye植物，从而使经感染的植物发展经过正常生命周期，特别是产生高大植物表型，其发展经过正常生命周期，包括产生能够发芽以形成宿主植物的经感染下一代的含内生菌的种子。

值得注意的是，现代小麦和黑麦栽培种并不天然地带有香柱菌属真菌内生菌。如技术人员理解，香柱菌属真菌内生菌是宿主特异性的，并且很难在不同宿主物种之间移动香柱菌属真菌内生菌。

另外地，由于一项长期研究计划，申请人已经鉴定了香柱菌属内生菌，其与未感染的对照植物相比，与宿主植物(即，“在植物原位”) 组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。在一个实施方案中，吲哚二萜生物碱可以是雀稗灵或terpendole E，并且麦角生物碱可以是裸麦角碱。

因此，在第一方面，本发明涉及香柱菌属内生菌的分离菌株，其中内生菌包含188±0.8碱基对(bp)的B10等位基因尺寸和112±0.8bp 的B11等位基因尺寸。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含选自以下的至少一种另外的SSR等位基因：ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、 egs031、ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、 ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095，其中至少一种另外的SSR等位基因具有如表2所述的碱基对(bp)数± 0.8bp。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含至少两种另外的SSR等位基因，优选至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少 18种、至少19种另外的SSR等位基因，优选20种另外的SSR等位基因，其中另外的SSR等位基因中的每一种具有如表2所述的碱基对 (bp)数±0.8bp。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含以下22种 SSR等位基因：B10、B11、ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、 egs031、ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、 ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095，其中22种SSR等位基因具有如表2所示的碱基对(bp)数，±0.8bp。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株在植物原位产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。在一个实施方案中，吲哚二萜生物碱是雀稗灵或terpendole E。在一个实施方案中，麦角生物碱是裸麦角碱。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株在植物原位不产生多于约0.1mg/kg麦角缬氨酸或多于约0.1mg/kg黑麦震颤素B或两者，其中mg/kg是以内生菌和被内生菌感染的宿主植物的干重计。

在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自禾草族大麦族(Triticeace)内的属。在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自野生禾谷植物，优选披碱草属某些种(Elymus spp.)的草和/或大麦属(Hordeum)的草。在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自披碱草属某些种，优选达乌里披碱草(E.dahuricus)、达乌里披碱草肥亚种(E.dahuricus sub species excelsus)和/或甘草披碱草(E. uralensis)。

在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌是雀麦生香柱菌 (

bromicola)的种或菌株，或者雀麦生香柱菌和另一种香柱菌的杂合菌株。

在另一方面，本发明涉及选自以下的香柱菌属内生菌的分离菌株： AR3002(NRRL50579)、AR3005(NRRL 50580)、AR3007(NRRL# 67556)和AR3042(NRRL#67569)或它们的组合。

本文所述的香柱菌属内生菌菌株分离自来源于中国的披碱草属某些种或达乌里披碱草，并根据布达佩斯条约出于专利程序目的在以下所示的菌株日期储存在美国农业部，中西部地区农业研究服务所，国家农业利用研究中心，北大学街1815，皮奥瑞亚，伊利诺伊州， 61604-3902，美国(The United States Department of Agriculture,Agricultural Research Service Midwest Area,National Center for AgriculturalUtilization Research,1815North University Street,Peoria, Illinois,61604-3902,USA)：

AR3002(NRRL 50579)，于2011年10月13日

AR3005(NRRL 50580)，于2011年10月13日

AR3007(NRRL#67556)，于2018年2月5日，和

AR3042(NRRL#67560)，于2018年2月5日。

如Christensen等人(2002)所述，在对植物组织进行表面灭菌后，从感染内生菌的植物中分离出如本文所述的香柱菌属内生菌。

一旦分离，就可以使用如本领域已知的并且如本文(包括实施例) 中公开的标准技术来培养经分离的和/或生物纯的真菌内生菌。

在一个实施方案中，将香柱菌属内生菌在20℃至25℃、优选21℃至23℃的抗生素马铃薯葡萄糖琼脂(ABPDA)上培养。真菌内生菌的最佳生长温度为22℃。尽管可减少或可完全停止生长，但真菌内生菌在高于或低于该范围的温度下仍可能生长。在一个实施方案中，将真菌内生菌在黑暗中培养。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含188±0.8碱基对(bp)的B10等位基因尺寸和112±0.8bp的B11等位基因尺寸。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含选自以下的至少一种另外的SSR等位基因：ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、 egs031、ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、 ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095，其中至少一种另外的SSR等位基因具有如表2所示的碱基对(bp)数，± 0.8bp。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株包含至少两种另外的SSR等位基因，优选至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少 18种、至少19种另外的SSR等位基因，优选20种另外的SSR等位基因，其中另外的SSR等位基因中的每一种具有如表2所示的碱基对 (bp)数，±0.8bp。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株在植物原位产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。在一个实施方案中，至少一种吲哚二萜生物碱是雀稗灵或terpendole E。在一个实施方案中，至少一种麦角生物碱是裸麦角碱。

在一个实施方案中，在植物原位产生是在非内源性植物宿主中。

在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自禾草族大麦族(Triticeace)内的属。在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自野生禾谷植物，优选披碱草属某些种的草和/或大麦属的草。在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌分离自披碱草属某些种，优选达乌里披碱草、达乌里披碱草肥亚种和/或甘草披碱草。

在一个实施方案中，经分离的香柱菌属内生菌是雀麦生香柱菌的种或菌株，或者雀麦生香柱菌和另一种香柱菌的杂合菌株。

在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合，其中该组合产生至少吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在一个实施方案中，宿主植物是非内源性宿主植物。

在一些实施方案中，可以使用发芽约两周的幼苗进行至宿主植物中的接种。优选地，幼苗已经发芽4天至9天。在一个实施方案中，幼苗已经发芽小于4天。

超出该范围，幼苗可能仍然形成有效的结合，但在某些情况下，可能太年轻或太老而无法建立香柱菌属内生菌。种子必须不含非目标真菌和细菌，以确保幼苗不会被微生物污染。

在一个实施方案中，可以使用宿主植物幼苗的基础接种进行人工接种。为了有效地建立香柱菌属共生体/宿主植物结合，应通过切开植物并插入培养的真菌菌丝体，将内生菌接种到宿主植物的分生组织中。

在一个实施方案中，宿主植物是草类植物或其部分，优选黑麦属某些种的植物，优选禾谷黑麦或其栽培种，优选禾谷黑麦栽培种Rahu (S.cereale cultivar Rahu)或禾谷黑麦栽培种Amilo(S.cereale cultivar Amilo)。在一个实施方案中，草类植物是小麦植物，优选小麦属某些种的植物或其栽培种，优选普通小麦或其栽培种。

在一个实施方案中，宿主植物的其部分是植物细胞系或植物愈伤组织。

在一个实施方案中，至少一种吲哚二萜生物碱是雀稗灵或 terpendole E。在一个实施方案中，至少一种麦角生物碱是裸麦角碱。

在一个实施方案中，与未感染香柱菌属内生菌的宿主植物相比，该组合具有增加的对害虫的抗性或增加的对植物疾病的抗性或两者。

在一个实施方案中，该组合具有增加的对昆虫害虫的抗性。

在一个实施方案中，宿主植物/内生菌组合对害虫具有增加的抗性，其中害虫选自：(1)蚜虫类物种，其选自：禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)、麦无网长管蚜(Metopolophiumdirhodum)、长管蚜属某些种 (Sitobion spp.)、麦长管蚜(Sitobion avenae)、悬钩子长管蚜(Sitobion fragariae)和俄罗斯小麦蚜虫(Diuraphis noxia)；(2)禾草和谷物苍蝇的物种，其选自：欧洲麦秆蝇(Oscinella frit)、黑麦秆蝇(Oscinella pusilla)、黑森麦瘿蚊(Mayetiola destructor)、角潜蝇属某些种(Cerodontha spp.)、澳洲角潜蝇(Cerodonthaaustralis)、螳螂角潜蝇(Cerodontha angustipennis)、Formia fumigata、苹果麦杆绳(Meromyze americana)、鞍瘿蚊(Haplodiplosis marginata)、稻杆潜蝇(Chloropspumilionis)、大蚊属某些种(Tipula spp.)、豌豆潜叶绳(Chromatomyia fuscula)、欧洲麦茎蜂(Cephus pygmaeus)、豌豆潜叶绳(Chromatomyia fuscula)和麦黄吸浆虫(Contariniatritici)；(3)蓟马物种，其选自：谷泥蓟马(Limothrips cerealium)、齿角刺鬃蓟马(Limothrips denticornis)、芒缺翅蓟马 (Aptinothrips rufus)和禾生枝抱稻蓟马(Stenothrips graminum)；(4)草跳虫和蟋蟀的物种，其选自：东亚飞蝗(Locustamigratoria)、澳洲蝗 (Phaulacridium marginale)、卵翅蝗(Phaulacridium vittatum)、黑蝗属某些种(Melanoplus spp.)和澳洲黑蟋蟀(Teleogryllus commodus)；(5)臭虫物种，麦小长蝽(Nysius huttoni)或麦长蝽(Blissus leucopertus leucopertus)；(6)尖隐喙象属某些种(Sphenophorus spp.)或卜象属某些种(Listronotus spp.)的象鼻虫，包括Listronotus bonariensis(阿根廷茎象甲(Argentine stem weevil))；(7)粘虫、切根虫和卷叶蛾的物种，其选自：一星黏虫(Pseudaletia unipuncta)、灰翅夜蛾属某些种(Spodoptera spp.)、东方粘虫(Mythimna separata)；Persectania aversa、球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)和苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)；(8)黑角负泥虫 (Oulemamelanopus)叶虫；(9)白蛴螬物种，其选自：日本弧丽金龟 (Popillia japonica)、Costelytra giveni(原名新西兰肋翅鳃角金龟(C. zealandica))、叶丽蛂属某些种(Phyllopertha spp.)、欧洲切根鳃金龟 (Rhizotrogus majalis)和锚纹麦穗金龟甲(Anisoplia segetum)；(10)水蜡虫物种，其选自：Phenacoccus hordei、Balanococcuspoae、Ripersella rumicis和Porphyrophora tritici；(11)金针虫物种，宽胸叩头虫属某些种(Conoderus spp.)或金针虫属某些种(Limonius spp.)；(12)玉米距步甲 (Zabrustenebrioides)虫；(13)螨物种，其选自：麦圆蜘蛛属某些种 (Penthaleus spp.)、红足海镰螯螨(Halotydeus destructor)和瘤节蜱属某些种(Aceria spp.)；(14)积谷害虫物种，其选自：米象鼻虫(Sitophilus oryzae)、小麦象鼻虫(Sitophilus granarius)、麦蛾(Sitotroga cerealella)、谷蠹(Rhyzopertha dominica)、扁谷盗属某些种(Cryptolestesspp.)、苏里南锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、干果斑螟(Cadra cautella)、印度谷斑螟(Plodia interpunctella)、杂拟谷盗(Tribolium confusum)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)和烟草甲(Lasioderma erricorne)；(15)黄头长沫蝉(Philaenus spumarius)吹泡虫；(16)线虫类物种，其选自：短体线虫属某些种(Pratylenchus spp.)的根腐线虫类，其选自：索氏短体线虫 (P.thornei)、刻痕短体线虫(P.crenatus)、落选短体线虫(P.neglectus)和穿刺短体线虫(P.penetrans)，异皮线虫属某些种(Heterodera spp.)和刻点孢囊线虫属某些种(Punctodera spp.)的禾谷胞囊线虫类，其选自：燕麦异皮线虫(H.avenae)、小麦异皮线虫(H.latipons)、H.hordecalis、菲利普异皮线虫(H.filipjevi)、H.mani、H.bifenestra、巴基斯坦异皮线虫 (H.pakistanensis)和点异皮线虫(P.punctata)，根结线虫属某些种 (Meloidogyne spp.)的根瘤线虫类，其选自：奇特伍德根结线虫(M. chitwoodi)、纳西根结线虫(M.naasi)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、小突根结线虫(M.microtyla)、虉草根结线虫(M.ottersoni)、拟禾本科根结线虫(M.graminicola)、禾本科根结线虫(M.graminis)、吉库尤根结线虫 (M.kikuyensis)和M.spartinae，茎线虫属某些种(Ditylenchus spp.)的茎线虫类，其选自：D.dipsicai和D.radicicola；和种子瘿线虫小麦粒线虫(Anguina tritici)；(17)蛞蝓物种，其选自：网纹野蛞蝓(Deroceras reticulatum)、花园蛞蝓(Arion hortensis agg.)和微纺锤形蛞蝓(A.subfuscus)。

在一个实施方案中，害虫是象甲，优选阿根廷茎象甲(ASW) (Listronotusbonariensis)。在一个实施方案中，害虫是澳洲角潜蝇。

在一个实施方案中，害虫是线虫类，优选根腐线虫类(短体线虫属某些种)。

在一个实施方案中，宿主植物/内生菌组合对植物疾病具有增加的抗性，其中植物疾病由选自以下的植物病原体引起：大麦黄矮病毒 (Leteovirus)、小麦土传花叶病毒(真菌传杆状病毒属(Furovirus))和小麦条纹花叶病毒(花叶病毒属(Tritimovirus))、野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、禾生小丛壳(Glomerella graminicola)[有性型]、链格孢属某些种(Alternaria spp.)、草本枝孢菌 (Cladosporium herbarum)、塔森球腔菌(Mycosphaerella tassiana)[有性型]、附球菌属某些种(Epicoccum spp.)、掷孢酵母属某些种 (Sporobolomyces spp.)、匍柄霉属某些种(Stemphylium spp.)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)[有性型]、镰刀菌属某些种(Fusarium spp.)、小麦网腥黑粉菌(Tilletia caries)、小麦光腥黑粉菌(Tilletiatritici)、亚腥黑粉菌(Tilletia laevis)、Tilletia foetida、禾谷黑膜座菌(Hymenulacerealis)、禾条斑头孢霉 (Cephalosporium gramineum)、小麦长蠕孢菌(Helminthosporium sativum)、禾旋孢腔菌[有性型]、胡和鬼伞菌(Coprinussychromorbidus)、看麦娘双极毛孢(Dilophospora alopecuri)、小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、麦角蜜孢菌(Sphaceliasegetum)[无性型]、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、假冰草壳孢 (Pseudoseptoriadonacis)、唐氏壳月孢(Selenophoma donacis)、印度尾孢黑粉菌(Neovossia indica)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)、铁线莲锈孢锈菌(Aecidium clematidis)[无性型]、 Cercosporidium graminis、Scolicotrichumgraminis、禾谷角担菌 (Phaeosphaeria herpotrichoides)、卷毛状小球腔菌(Leptosphaeria herpotrichoides)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)、雪腐微座孢(Microdochium nivale)、雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、雪腐小画线壳 (Monographellanivalis)[有性型]、禾白粉菌(Erysiphe graminis)、瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)、强雄腐霉菌(Pythium arrhenomanes)、德氏腐霉菌(Pythiumdebaryanum)、禾生腐霉菌(Pythium graminicola)、终极腐霉菌(Pythium ultimum)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)[无性型]、黑麦壳针孢菌(Septoria secalis)、小麦壳针孢菌(Septoria tritici)、禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola) [有性型]、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)、布氏白粉属某些种(Blumeria spp.)、禾谷角担菌(Ceratobasidium cereale)[有性型]、Myriosclerotinia borealis、北方核盘菌(Sclerotinia borealis)、爱达荷核瑚菌(Typhula idahoensis)、肉孢核瑚菌(Typhulaincarnate)、雪腐病核瑚菌(Typhula ishikariensis)、雪腐病核瑚菌加拿大变种(Typhulaishikariensis var. canadensis)、颖枯壳多孢(Stagonospora nodorum)、颖枯壳针孢(Septoria nodorum)、颖枯暗球腔菌(Phaeosphaeria nodorum)[有性型]、颖枯小球腔霉(Leptosphaeria nodorum)、隐条黑粉菌(Urocystis occulta)、禾柄锈菌(Pucciniagraminis)、曲霉属某些种(Aspergillus spp.)、黑孢属某些种 (Nigrospora spp.)、青霉菌属某些种(Penicillium spp.)、根霉属某些种 (Rhizopus spp.)、铺毛假小尾孢(Pseudocercosporella herpotrichoides)、 Tapesia acuformis[有性型]、条锈菌(Uredoglumarum)[无性型]、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、偃麦草内脐蠕孢(Drechslera tritici-repentis)[无性型]、偃麦草长蠕孢菌(Helminthosporiumtritici-repentis)、小麦柄锈菌(Puccinia triticina)、腐霉属某些种(Pythium spp.)、黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)、禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)、稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)和假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)。

优选地，植物病原体是隐匿柄锈菌、小麦柄锈菌、禾柄锈菌、镰刀菌属某些种、腐霉属某些种、黑麦喙孢、条形柄锈菌、禾顶囊壳或假禾谷镰刀菌。

在一个实施方案中，组合中经分离的香柱菌属内生菌是非内源性内生菌。

在一些实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株如本发明的任何其他方面所述，包括但不限于SSR等位基因、SSR等位基因尺寸、根据布达佩斯条约保藏的分离菌株、产生生物碱(特别是吲哚二萜生物碱和麦角生物碱)、分离出内生菌的原始植物宿主、分离条件、培养条件、接种条件、增强的害虫保护，及产生或不产生麦角缬氨酸和/或黑麦震颤素B。

在另一方面，本发明涉及感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物，其中内生菌包含188±0.8bp的B10等位基因尺寸和112±0.8 bp的B11等位基因尺寸。在一个实施方案中，宿主植物是非内源性宿主植物。在一个实施方案中，内生菌是非内源性内生菌。

在本文中考虑作为涉及感染了香柱菌属内生菌的宿主植物的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、害虫及包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合所示的具体实施方案。

在另一方面，本发明涉及制备产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法，其包括用根据本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染宿主植物，其中该组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在一个实施方案中，宿主植物是非内源性宿主植物。

在一个实施方案中，内生菌是非内源性内生菌。

在一些实施方案中，该方法还包括繁殖宿主植物/香柱菌属内生菌组合。

在一些实施方案中，该方法还包括从经繁殖的组合中获得种子。

在一些实施方案中，该方法还包括鉴定种子中内生菌的存在。

在一些实施方案中，该方法还包括宿主植物/香柱菌属组合的代谢谱分析。

考虑到本说明书的公开内容和公知常识，对宿主植物/香柱菌属组合进行代谢谱分析，尤其用以鉴定在组合中产生的生物碱，是在本领域技术人员的能力范围之内的。

在一些实施方案中，该方法还包括选择产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的宿主植物/香柱菌属组合。在一个实施方案中，至少一种吲哚二萜生物碱是雀稗灵或terpendole E。在一个实施方案中，至少一种麦角生物碱是裸麦角碱。

在本文中考虑作为涉及制备稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，其包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合及感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物所示的具体实施方案。

在另一方面，本发明涉及赋予宿主植物至少一定水平的害虫保护的方法，其包括用本发明的香柱菌属内生菌的分离菌株人工接种宿主植物以形成宿主植物/香柱菌属内生菌组合，其中宿主植物/香柱菌属内生菌组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

在一个实施方案中，至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱赋予一定水平的害虫保护。在一个实施方案中，至少一种吲哚二萜生物碱是雀稗灵或terpendole E。在一个实施方案中，至少一种麦角生物碱是裸麦角碱。

在一个实施方案中，与未感染香柱菌属内生菌的宿主植物的相同物种相比，害虫保护的水平将对宿主植物/香柱菌属内生菌组合的害虫损伤减少至少0.5％，优选至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，优选至少99％。

在本文中考虑作为涉及赋予宿主植物至少一定水平的害虫保护的方法的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，其包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、害虫、包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物及制备稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法所示的具体实施方案。

在另一方面，本发明涉及感染了如本文所述的香柱菌属内生菌的分离菌株的植物种子。

在一个实施方案中，植物种子是黑麦属某些种的种子，优选禾谷黑麦或其栽培种的种子，优选禾谷黑麦栽培种Rahu或禾谷黑麦栽培种Amilo的种子。在一个实施方案中，草类种子是小麦植物的种子，优选小麦属某些种或其栽培种的种子，优选普通小麦或其栽培种的种子。

在一个实施方案中，香柱菌属内生菌的分离菌株如本发明的任何其他方面所述，包括但不限于SSR等位基因、SSR等位基因尺寸、根据布达佩斯条约保藏的分离菌株、产生生物碱(特别是吲哚二萜生物碱和麦角生物碱)、分离出内生菌的原始植物宿主、分离条件、培养条件、接种条件、增强的害虫保护，及产生或不产生麦角缬氨酸和/或黑麦震颤素B。

在另一方面，本发明涉及如本文所述的香柱菌属内生菌的分离菌株产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的用途。

在一个实施方案中，用途包括以下或基本上由以下组成：用香柱菌属内生菌的分离菌株感染宿主植物。

在本文中考虑作为涉及香柱菌属内生菌的分离菌株的用途的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，其包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、害虫、包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物、制备稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法及感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的植物种子所示的具体实施方案。

在另一方面，本发明涉及阻止或减少对土地区域中的植物的害虫损伤的方法，其包括感染了本发明的香柱菌属内生菌的宿主植物、本发明的组合或本发明的经感染的植物种子种植土地区域。

在一个实施方案中，害虫损伤是昆虫害虫损伤。

在一个实施方案中，土地区域是其上需要阻止或减少害虫损伤的预定土地区域。在一个实施方案中，土地区域或预定土地区域是绿地、隔离带、空地、田野、草地、牧场或围场。

在一个实施方案中，土地区域用于农业中。

在一个实施方案中，种植至少10％、优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、优选约99％、优选所有的土地区域。

在一个实施方案中，与相同尺寸但未种植感染香柱菌属内生菌的宿主植物、组合或经感染的植物种子的土地区域相比，害虫损伤减少至少1％，优选至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，优选至少99％。

在本文中考虑作为涉及阻止或减少对土地区域中的昆虫食草性的方法的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，其包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、害虫、包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物、制备稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的植物种子及香柱菌属内生菌的分离菌株的用途所示的具体实施方案。

在一个实施方案中，产量是饲草产量。在一个实施方案中，饲草产量是全谷类青贮饲料。在一个实施方案中，饲草产量是总产量。

在一个实施方案中，饲草产量增加约0.5％，优选约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、优选约50％。

在一个实施方案中，饲草产量增加至少0.5％，优选至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％，优选至少50％。

在一个实施方案中，产量是谷粒产量。

在一个实施方案中，谷粒产量增加约0.5％至约50％，优选约1％至约45％、约5％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约 20％至约40％、约20％至约30％，优选约20％至约25％，优选约46％，优选约23％。

在一个实施方案中，谷粒产量增加至少0.5％，优选至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％，优选至少40％。在一个实施方案中，谷粒产量增加至少20％，优选至少21％，优选至少22％。在一个实施方案中，谷粒产量增加至少40％，优选至少45％。

在一个实施方案中，产量是秸秆产量。

在一个实施方案中，秸秆产量增加约0.5％，优选约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％，优选约50％、约54％、约55％，优选约56％。

在一个实施方案中，秸秆产量增加至少0.5％，优选至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少54％、至少55％，优选至少56％。

在本文中考虑作为涉及增加宿主植物的产量的方法的本发明的该方面的具体实施方案是以上涉及本发明的前述方面的所有实施方案，其包括涉及香柱菌属内生菌的分离菌株、宿主植物、害虫、包含香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物、制备稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法、感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的植物种子、香柱菌属内生菌的分离菌株的用途及在土地区域中阻止或减少昆虫食草性的方法所示的具体实施方案。

在本文中考虑作为以上所示的本发明的所有方面的具体实施方案是其中内生菌是非内源性内生菌的实施方案。

在本文中考虑作为以上所示的本发明的所有方面的具体实施方案是其中宿主植物是非内源性宿主植物的实施方案。

现在将参考以下实施例以非限制性方式说明本发明的各个方面。

实施例

实施例1

检测真菌内生菌菌株

从各种来源获得了580份披碱草属某些种的登录种，并且在种子数目允许的情况下，检查了高达大约50株单独的种子或幼苗是否感染了内生菌。用Simpson等人(2012)的方法确定了生长到两个或更多个分蘖的阶段的幼苗的叶鞘中的活内生菌。已显示约6％的登录种产生至少一种含有活内生菌的幼苗，其可作为以下实施例的一部分进行进一步检查。

实施例2

检测真菌内生菌菌株的遗传变化

内生菌菌株AR3002、AR3005、AR3007和AR3042通过基于来源于高达22个选定的单序列重复(SSR)标记基因座的基因型数据的DNA ‘指纹分析’使用表1的引物序列进行表征和区分遗传变异。当内生菌处于植物原位时，这些引物序列先前已显示出通常扩增香柱菌属内生菌多态性DNA序列(Moon等人1999；Kirkby等人2011；Simpson等人2012；Card等人2014)。

根据制造商(MP Biomedicals,Solon,Ohio,USA)推荐用于植物样品的FastDNA试剂盒的植物DNA分离程序，使用约100mg鲜重的基部分蘖样品提取总基因组DNA(植物+内生菌)。

使用两个聚合酶链反应(PCR)方案之一，用寡核苷酸引物对进行 SSR扩增(表1)。在这两种方案中，都使用iCycler热循环仪(BioRad, Hercules,California,USA)进行PCR。

方案1如Moon(Moon等人,1999)所述，所不同的是使用60℃的退火温度。在该方案中，正向引物在5’末端标记有荧光团6-FAM^TM (Applied Biosystems,Foster City,California,USA)。

在方案2中，合成了在5’-末端具有21个核苷酸的M13尾部序列的正向引物(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)(SEQ ID NO:1)，以促进通过6-FAMTM-标记的M13引物对PCR产物进行广泛标记(Schuelke， 2000)。合成了在5’-末端具有序列5’-GTTTCTT-3’(SEQ ID NO:2)的反向引物，以促进PCR产物的3’-末端处的非模板化腺苷酸化(Brownstein 等人,1996)。使用了10μL的PCR反应体积，其含有约10ng的总基因组DNA、2.5mM氯化镁、1x PCR缓冲液、0.05mM的各种dNTP、 0.0375μM正向引物、0.15μM反向引物、0.15μM的荧光标记的M13引物及0.75U的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad, California)。使用以下概述进行PCR：(1)94℃，4:00分钟，(2)30个循环：94℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒，(3)8个循环：94℃ 30 秒、53℃ 30秒和72℃ 30秒，(4)72℃ 30分钟(在Schuelke 2000之后)。

通过使用带有POP-7TM聚合物的22cm毛细管阵列(Applied Biosystems)在ABI3130xl Genetic Analyser上通过毛细管电泳来分析 PCR产物。GS500 LIZ(AppliedBiosystems)用作内部尺寸标准。使用 ABI Prism GeneScan(v 3.7,Applied Biosystems)分析电泳图，并使用基因标记分析软件(SoftGenetics LLC,Pennsylvania,USA)对基因型数据进行评分。

本发明人在此注意到，根据他们的经验，等位基因尺寸将在一些分析中根据许多因素而变化。例如，基于毛细管电泳的片段(等位基因) 尺寸的估值受以下因素影响，这些因素包括但不限于仪器的类型、毛细管阵列的长度、所用聚合物的类型以及包括环境温度在内的环境变量。因此，本文所报道的SSR等位基因尺寸(以bp计，包括下表2中的那些)与所述分析平台相关，并且还包括±0.8bp的置信区间。

然后通过进行化学分析进一步表征以上检查的植物。进一步检查了六株受感染的幼苗中是否存在生物碱，这归因于内生菌，诸如吲哚二萜、麦角生物碱、波胺和黑麦草碱的存在。

表1.SSR引物序列

表2.以碱基对(bp)计的菌株AR3002、AR3005、AR3007和AR3042 的SSR等位基因尺寸±0.8

SSR	等位基因尺寸
		B10	188
B11	112
		ans016	282
ans019	204
		ans033	181
ans036	286
		egs027	359
egs031	259
		ces0004	185
ces0022	209
		ces0041	261
ces0054	261
		ces0060	238
ces0061	162
		ces0067	277
ces0075	243
		ces0076	157
ces0078	310
		ces0089	165
ces0093	145
		ces0094	329
ces0095	360

实施例3

分离真菌内生菌菌株

如本领域通常已知的，特别是如Christensen等人(2002)所述，在对植物组织进行表面灭菌之后，从内生菌感染的披碱草属某些种植物(包括达乌里披碱草植物)中分离出AR3002、AR3005、AR3007和 AR3042。在表面灭菌之前，将分蘖通过在基部切开并修剪至约5cm，从植物去除。通过用96％乙醇快速冲洗并在10％漂白剂溶液中浸泡1 分钟，然后在无菌水中冲洗两次，对切片的分蘖进行表面灭菌。将分蘖横向切片；分离鞘环并将其置于5μg/ml四环素抗生素马铃薯葡萄糖琼脂ABPDA)上。将Petri平皿在黑暗中于22-25℃下孵育3-5周。可以在同一培养基上对培养物进行传代培养。

检查培养物的菌落生长速率、菌落形态、产分生孢子的能力、分生孢子的尺寸范围、SSR等位基因尺寸以及其他描述性特征(表3)。

选择AR3002、AR3005、AR3007和AR3042用于进一步检查基于其基因型和次级代谢物谱。

按照本实施例的方式制备并有时传代培养的AR3002、AR3005、 AR3007和AR3042培养物用于测试如下所述的禾谷黑麦幼苗的接种和可能的持久感染。

实施例4

内生菌描述

在PDA上生长时的体外特性与内生真菌属的描述一致 (Christensen等人，1993；Glenn等人，1996)，在PDA上4周后，从生长缓慢至中度缓慢生长。菌落从琼脂上升起，白色，棉质，稍微至强烈回旋，毛毡，有大量气生菌丝。菌落反面棕褐色至边缘奶油色。产分生孢子细胞是单生的，从菌丝垂直升起，在基部变宽并在尖端变细。瓶梗分生孢子透明，光滑，舟状到新月状，长2.05-14.96μm×宽1.37-8.19μm。没有分离物是无菌的。表3列出了每种菌株的个体特征。

表3.分生孢子和菌落尺寸

实施例5

接种香柱菌属真菌内生菌至禾谷黑麦中

使用如Latch和Christensen(1985)所述的方法，对禾谷黑麦栽培种Rahu或Amilo的种子进行表面灭菌，并用如本文所述的经分离的香柱菌属内生菌接种。通过将种子浸入50％硫酸溶液中15分钟，然后用自来水冲洗5次，并浸入10％家用漂白剂(Janola)溶液中15分钟，然后在无菌水中冲洗2次来对种子进行表面灭菌。将种子在层流柜内的无菌Whatmann滤纸上干燥，然后将其布置在4％水琼脂Petri平皿上。将平皿上的种子在黑暗中于22-25℃下发芽4-9天，并接种所得的黄化幼苗，然后放回黑暗孵育箱中7天。在这一孵育后，将平皿放在白色荧光灯下至少7天，然后取出幼苗并将其种植在商业灌装混合物中，并使其在温室中生长。使植物生长约6周，之后鉴定经感染的个体。通过Simpson等人(2012)的方法鉴定了经感染的植物。使植物在温室中进一步生长，以与典型的未感染植物相比检查受感染植物的植物表型，并特别确定是否将形成花序和种球。

对于其中至少一些经接种的植物具有基本正常的表型并且能够进展通过正常的生命周期的那些内生菌菌株，在表4中包括了标有“是”的成功接种的概述(图2)。如表4所示，从植物中收集种子。

表4.接种至禾谷黑麦中并感染禾谷黑麦的菌株及禾谷黑麦中种子产生的实例

实施例6

内生菌感染的天然宿主植物中的生物碱产生

通过对既定方法进行少量修改，检查了一系列宿主植物中是否存在黑麦草碱生物碱、波胺、麦角生物碱和吲哚二萜(Kennedy和Bush, 1983；Yates等人，1989:Rasmussen等人，2012)。表5是具有检测到的归类在生物碱类别下的那些内生菌生物碱的本研究的选定内生菌的结果。这些结果表明，如本文所述的香柱菌属内生菌的多个分离菌株并且特别是如本文其他地方所提供的SSR数据所定义的AR3002型的那些，当在植物原位时，可赋予共生组合以产生可测量数量的裸麦角碱、雀稗灵、terpendole E或其组合的能力。

表5.检测内生菌感染的亲本披碱草属植物的内生菌生物碱

脚注：1 NFL＝N-甲酰基黑麦草碱

实施例7

来自披碱草属某些种的选定内生菌的来源和地理起源

表6显示了获得如本文所述的香柱菌属内生菌的分离菌株的来源登录号、天然宿主植物登录种的物种以及登录的区域来源。

表6.按AR编码号计的经分离的内生菌菌株、原始推定宿主物种、区域来源及来源登录号

内生菌	披碱草属宿主	区域	来源登录
				AR3002	达乌里披碱草	中国	BZ2155
AR3005	披碱草属某些种	中国	BZ2159
				AR3007	达乌里披碱草	中国	BZ2162
AR3042	达乌里披碱草	中国	BZ2162

实施例8

禾谷黑麦植物中的生物碱产生

将禾谷黑麦栽培种Rahu的幼苗用AR3002、AR3005、AR3007和 AR3042接种，使其成熟，并收集含有所有内生菌的组合的种子。种子增加后，有足够的种子可用于在新西兰坎特伯雷林肯市(Lincoln, Canterbury,New Zealand)进行重复试验。该试验被设计为允许在一系列常见管理措施下评估感染了如本文所述的一系列香柱菌属内生菌的分离菌株的禾谷黑麦(栽培种Rahu)。在不同阶段对青贮饲料或谷粒进行采样，并通过对既定方法的少量修改来分析生物碱含量(Kennedy 和Bush,1983；Yates等人，1989；Rasmussen等人，2012)(如表7所示)。

表7.用AR3002型内生菌感染的禾谷黑麦植物的生物碱分析观察结果(4个地块的平均值，SEM提供于括号中)。AR3002混合样品和 AR3002优良样品是指本表中分析的禾谷黑麦植物样品，其含有AR3002、AR3005、AR3007和AR3042内生菌的组合。术语“优良”和“混合(bulk)”是指为改善的内生菌传播和表型而选择的禾谷黑麦植物的两个不同的连续世代。裸麦角碱的结果以μg/g表示，而雀稗灵和 terpendole E以针对样品重量归一化的峰面积表示。

表7.

实施例9

对谷物害虫具有生物活性的禾谷黑麦/AR3002/内生菌组合

方法：

通过用阿根廷茎象甲(ASW)(Listronotus bonariensis)和用自然侵染的两种蝇类物种：澳洲角潜蝇(小麦鞘潜叶虫)和黑森麦瘿蚊(麦瘿蝇) 刺激用AR3002感染的禾谷黑麦栽培种Rahu和禾谷黑麦栽培种Amilo 来测试香柱菌属内生菌AR3002赋予宿主植物至少一定水平的害虫抗性的能力。如图1所示，在盆栽实验中测试了受感染的植物。

使用ASW和受AR3002感染的Rahu或Amilo进行了两项实验。

在第一项实验中，处理是：无内生菌(Nil)的Rahu；感染了菌株 AR3002的Rahu，及感染了产生黑麦草碱的内生菌的Rahu。在该比较实施例中使用了这种产黑麦草碱的内生菌，以证明在植物/内生菌共生酶中产生的已知阻止昆虫食草性的生物碱(即黑麦草碱)的作用。将感染了AR3002(15个重复)、Nil(15个重复)和产黑麦草碱的内生菌(13 个重复)的Rahu植物以随机区组设计布置在筛房地板上的盆(直径12 cm)中。在每株植物上放置了六个田间采集的成年ASW。整个试验都用细小的尼龙材料覆盖，以包含ASW。

两周后，取下覆盖物，并对每株植物上10个分蘖上成年摄食疤痕的数量以及每株植物上卵的数量进行计数。然后将植物裸露18天，之后通过在植物地上部分的底部以下切割以从每株植物中去除所有分蘖。对于每株植物，对活和死分蘖的数量进行计数，以确定活:死分蘖比。然后，通过解剖检查相同的活:死分蘖比的20个分蘖的幼虫损伤。对 ASW幼虫损伤评分如下：仅在外部摄食的情况下为轻度；在幼虫穿透并部分采掘分蘖的情况下为中度；和在分蘖被广泛采掘或分蘖上钻了一个洞穿过分生组织的情况下为重度。

在第二项实验中，处理是：无内生菌(Nil)的Amilo；感染了菌株 AR3002的Amilo；及无内生菌(Nil)的Rahu。包含Rahu Nil来作为与先前实验的比较。该实验以与Rahu实验相同的方式进行，使用了相同数量的重复实验和盆布置，但有一处不同-使用细尼龙网将成年ASW关在每个盆中。所有测量均与Rahu实验相同，不同之处在于，在6个分蘖/植物上3周后评估成年摄食和产卵，和在另外4周后评估幼虫损伤。

在这两项实验中，当从每株植物检查的20个分蘖中发现幼虫、蛹或症状(蛀屑)存在时，记录了自然蝇侵扰。在Rahu实验中，发现的所有蝇幼虫都是澳洲角潜蝇，而在Amilo实验中，发现了澳洲角潜蝇和黑森麦瘿蚊两者。

统计学分析：

对于阿根廷茎象甲，通过ANOVA分析了的成虫摄食和每株植物的卵数，以及幼虫损伤的分蘖的总百分比和具有中度或重度损伤的百分比。由于活分蘖/植物的数量存在显著差异，因此，使用分蘖总数/ 植物作为协变量，对从分蘖评估计算的成年摄食疤痕数/植物进行了分析。还通过ANOVA分析了蝇侵染的分蘖的数量。对于Amilo试验，将两种蝇物种的幼虫的数据合并在一起，因为数据太稀疏而无法单独分析，并且进行了对数转换，之后通过ANOVA分析。由于感染了不存在蝇的内生菌的某些植物的比例很高，因此也进行了是否存在蝇的二项式分析。

结果：

在使用Rahu进行的实验中，在被产黑麦草碱的内生菌感染的植物上的阿根廷茎象甲成年摄食疤痕显著少于未感染的植物(Nil)和 AR3002(P＝0.016)(表8)。处理之间卵数/植物没有显著差异P>0.05)。与未感染的植物(Nil)相比，AR3002和产黑麦草碱的内生菌感染的植物中的总幼虫摄食损伤和中度和重度摄食损伤均显著减少(分别为 P＝0.014&P＝0.004)(图1的A和图1的B)。

在栽培种Amilo中，AR3002感染的植物上的成年摄食显著少于未感染的Amilo(Nil)和Rahu(Nil)(P＝0.016)(表8)。在不同处理之间，卵数/植物没有差异。与未感染的Rahu(Nil)和未感染的Amilo(Nil)相比，用AR3002感染的植物上具有任何水平的阿根廷茎象甲损伤的分蘖的百分率均显著更小(图1的B)。仅取受到中度和重度损伤的那些分蘖，AR3002感染的植物具有的损伤分蘖百分比要比两次Nil处理低 (分别为P＝0.012和P＝0.002)。

表8：禾谷黑麦栽培种Rahu和栽培种Amilo中成年阿根廷茎象甲(ASW)摄食疤痕(FS)数和产卵数，及茎生蝇数和感染了蝇的植物的百分比。

小麦鞘潜叶虫(澳洲角潜蝇)是Rahu试验中存在的唯一蝇物种，而 Amilo试验中还存在麦瘿蝇(黑森麦瘿蚊)。将Amilo试验中两种蝇物种的数据合并，得出了幼虫和蛹的总数。蝇数/植物是每株植物检测到的分蘖中的数目计算得出的，并发现与未感染(Nil)植物相比，在所有内生菌感染的植物中显著更低。

在AR3002感染的植物和用产黑麦草碱的内生菌感染的植物之间，蝇的数量没有显著差异(表8)。有蝇存在的Nil植物的百分比非常高，并且与受内生菌感染的植物有很大差异，而与菌株无关。在Amilo试验中受蝇侵染的Rahu Nil比例相对低，可能反映了植物的年龄以及它们在季节较早时被植物侵染的概率。根据形态学，在Amilo试验中发现的56个蝇幼虫和蛹中，有31个被鉴定为澳洲角潜蝇，并且25个被鉴定为黑森麦瘿蚊。通过基因分型确认每种物种的一个标本。这两个物种均未发现受AR3002感染的侵染植物，而Amilo Nil上的平均数/ 植物对于澳洲角潜蝇为3.19，并且对于黑森麦瘿蚊为3.12。由此我们可以得出结论，AR3002对两种蝇物种都提供了抗性。

实施例10

对蓟马具有生物活性的禾谷黑麦/AR3002/内生菌组合

方法：

通过用天然侵染的蓟马(花蓟马属某种(Frankliniella sp.)、目缨翅目(Thysanoptera))刺激被AR3002感染的禾谷黑麦栽培种Rahu来测试香柱菌属内生菌AR3002赋予宿主植物至少一定水平的害虫抗性的能力。

使用蓟马和AR3002感染的黑麦进行一项实验。

处理为：无内生菌(Nil)的黑麦；被AR3002(优良和混合)感染的2 个黑麦系；和被产黑麦草碱-内生菌菌株感染的黑麦。在该比较实施例中使用了产黑麦草碱的内生菌，以证明在植物/内生菌共生中产生的生物碱(即黑麦草碱)的已知阻止昆虫食草性的作用。将每种处理的黑麦植株布置成一个盆(10cm直径)三个，每个处理六个重复盆以随机块设计布置在受控的生长室内(22℃-24℃，60-70％相对湿度)。

六周后，将来自每株植物的四片叶子(来自三株植物的每盆总共有十二片叶子)通过使用解剖刀片在叶舌处切割，从分开的分蘖中去除。使用少量聚丙烯基压敏胶带(Sellotape)将这些叶子在叶子的每端处附着在空白A4纸张上。然后借助解剖显微镜和镊子在每片叶子的顶面上对蓟马数进行计数。然后使用直尺根据每片叶子的长度和最大宽度的测量值(大约)计算每片叶子的面积。然后计算蓟马密度/叶组织cm²。然后使用标准的组织印迹免疫印迹技术，评估单独组的四个分蘖/植物 (每盆12)的内生菌存在。

统计分析：

蓟马数据通过ANOVA、然后Fisher保护的最小显著差异(LSD)测试来分析，以确定处理平均值之间的显著(P≤0.05)差异。

结果：

用AR3002(优良和混合)感染的植物上的蓟马显著少于未感染的植物(Nil)和用产黑麦草碱的内生菌感染的那些植物(P<0.001)(表9)。由此我们可以得出结论，AR3002提供对花蓟马属物种的抗性。

表9：在禾谷黑麦栽培种Rahu上观察到的蓟马平均数(根据 Fisher保护的LSD测试，列中后跟相同字母的平均值无显著差异， P≤0.05)。

	蓟马平均数/cm<sup>2</sup>叶子组织	分组
			未感染(Nil)	0.55	A
产黑麦草碱的内生菌	0.45	A
			AR3002(优良)	0.22	B
AR3002(混合)	0.13	B
			P-值	<0.001

实施例11

禾谷黑麦/内生菌组合中的疾病抗性

使用了总共7种饲料黑麦(禾谷黑麦栽培种“Rahu”)品系，在新西兰的AgResearch林肯研究农场(AgResearch Lincoln Research Farm, New Zealand)进行了田间试验，其中包括两个AR3002系(优良和混合) 以及三个nil内生菌(无内生菌)系(表10)。该试验于2016年5月13日在行距为15cm的地块(8m x 1.35m)中播种。土壤类型是邓普顿粉砂壤土。

未施加蛞蝓/蜗牛诱饵、杀真菌剂或杀虫剂至试验。该试验接受了肥料、除草剂和植物生长调节剂的最佳实践施加。为避免水分压力，对试验区进行了定期灌溉，并于11月8日覆盖了鸟网。

使用单向ANOVA模型通过

(18版,VSN International Ltd, UK)完成统计分析。使用最小显著差异(LSD)测试将显著差异分开 (P＝0.05)。

表10. 2016年10月上旬的地块的Rahu处理名称、发芽测试、季前种子系的活内生菌和内生菌感染的分蘖测试(免疫印迹)。

^a发芽测试(100个谷粒/系，保持7天发芽)

^b计数为500粒种子/处理

^c通过挤压种子连同一些分离测试

^d通过温室田间种植测试中幼苗的分蘖印迹

疾病发病率：

在2016年春季，在两个不同的场合评估了疾病发病率。该实验总共包括7个系(处理)，其包括两个AR3002(优良和混合)系以及三个nil 内生菌(无内生菌)系。

根据主茎叶上受影响的叶面积百分比进行的视觉疾病评估显示出叶条斑Cercosporidium graminis和叶锈隐匿柄锈菌进行的感染(James, 1971)。PlantDiagnostics Limited的Mark Braithwaite确认了诊断。在黑麦中发现了叶条斑(Braithwaite等人1998)。

在每次评估时，每个地块随机选择10个主茎(分蘖)，并在显示感染迹象的前三片叶子上记录病害感染百分比。

评估1，在生长阶段45-55，2016年10月17日。

在该评估中，在叶子3、4和5上均识别出了叶片的叶条斑病和叶锈病(表11a和表11b)。

对于所有三片叶子，平均而言，用AR3002感染的系的叶条斑病显著少于nil系(表11a)(P<0.05)。叶锈也是如此(表11b)(P<0.05)。

表11a.2016年10月17日评估的内生菌对黑麦栽培种Rahu上叶条斑(Cercosporidium graminis)所致的严重性(受感染的叶面积百分比) 的影响。AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

进行对数变换后的逆变换平均值(将0.5的常数值添加到所有值以允许对零值进行零变换)。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

表11b.2016年10月17日评估的内生菌对黑麦栽培种Rahu上叶锈(隐匿柄锈菌)所致的严重性(受感染的叶面积百分比)的影响。 AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

评估2，在生长阶段65(开花)，2016年11月7日。

在该评估中，在叶子1、2和3上观察到叶条斑和叶锈。与评估1 一样，除叶子1的叶条斑外，在所有情况下，与nil系相比，在含有 AR3002内生菌的黑麦系中观察到的疾病显著更少(表12a和表12b) (P<0.05)。

表12a.2016年11月7日评估的内生菌对黑麦栽培种Rahu上叶条斑(Cercosporidium graminis)所致的严重性(受感染的叶面积百分比) 的影响。AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

进行对数变换后的逆变换平均值(将0.5的常数值添加到所有值以允许对零值进行对数变换)。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

表12b.2016年11月7日评估的内生菌对黑麦栽培种Rahu上叶锈(隐匿柄锈菌)所致的严重性(受感染的叶面积百分比)的影响。 AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

实施例12

禾谷黑麦/内生菌组合中的产量

在以上实施例11中详述的同一实验中，还评估了农艺性状。该实验总共包括7个系(处理)，其包括两个AR3002(优良和混合)系以及三个nil内生菌(无内生菌)系。

每个地块的一半长度(4m)用于评估饲草产量(连同一些谷粒产量)，并且其余一半(4m)仅用于评估谷粒产量。表13概述了饲草切割和谷粒收获管理的顺序。样方切割用于子采样和评估地块。

表13.在AgResearch Lincoln的田间在2016-17年度的饲草和谷粒产生处理的图形表示。

早春青剁碎青贮饲料、随后的全谷类青贮饲料(管理‘1A饲草’)的产量

AR3002和Nil在早春的第一次收获时的饲草产量在统计学上相似 (表14)。然而，当在初夏以全谷类青贮饲料收获再生植被时，AR3002 的产量在统计上高于Nil，并且这也反映在该饲草管理处理的2016-17 年整体总产量中(表14)。

表14.在Lincoln作为早春青剁碎青贮饲料、随后的早夏全谷类青贮饲料收获的管理处理‘1A饲草’的饲草产量，及整体总产量。 AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

平方根变换后的逆变换平均值。

早春青剁碎青贮饲料(管理‘1B饲草’)的产量

在早春作为青剁碎青贮饲料收获时，AR3002和Nil地块产生统计学上类似的量(表15)。

表15. 2016年9月5日在Lincoln作为早春青剁碎青贮饲料收获的管理处理‘1B饲草’的饲草产量。AR3002是两个系的平均值和Nil 是3个系的平均值。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

平方根变换后的逆变换平均值。

谷粒和秸秆产量(管理1B饲草和2仅谷粒)

表18列出了两种谷粒管理处理的谷粒和秸秆产量结果：

-1B(饲草+谷粒)：早春饲草收获，随后是晚夏谷粒收获；和

-2(仅谷粒)：晚夏谷粒收获(即，无饲草收获)。

在两种管理制度下，AR3002地块产生的谷粒和秸秆均显著多于无内生菌(Nil)(表18)(P<0.05)。

表18. 2017年2月20日在林肯收获的管理处理1B和2的谷粒和秸秆产量。AR3002是两个系的平均值和Nil是3个系的平均值。

列中不共用字母的平均值以5％的概率显著差异。

以上详述的实验的结果非常出乎意料地表明，某些香柱菌属内生菌具有赋予宿主植物至少一定水平的害虫和/或疾病保护和/或抗性的能力。而且，非常令人惊讶的是，本发明人发现某些香柱菌属内生菌也具有改善宿主植物、特别是谷类植物且最特别是黑麦属的农艺性状的能力。

实施例13

用内生菌AR3002感染的“Rahu”黑麦属对锯谷盗的作用

这项研究评估了内生菌感染的“Rahu”黑麦相对于无内生菌“Rahu”黑麦用作锯谷盗的摄食威慑的能力。

背景：

锯谷盗苏里南锯谷盗(Linnaeus)是新西兰储存谷粒中常见的次生害虫。当前的昆虫控制策略主要基于有机磷酸酯甲基嘧啶磷。随着国际上和新西兰对有机磷酸酯的长期使用进行审查，以及对甲基嘧啶磷具有抗性的传闻报道，开发替代性控制策略对于持续成功地谷粒储存至关重要。

将300g谷粒轻轻研磨，然后将40只活的混合性别的成年锯谷盗添加到每个盆中。在试验期间，将盆保持在23℃，65％相对湿度下。通过筛网筛分昆虫以将昆虫与谷粒分开来对昆虫计数。填充后2个月对昆虫计数。该实验是一个随机完整的区组，包含5个重复实验和4 个处理。结果示于表19中。

表19.谷粒贮藏2个月之后活的锯谷盗

两个月后，在产黑麦草碱的内生菌盆中，甲虫群从40种活昆虫增加到121-264种活昆虫。相对于产黑麦草碱的内生菌和nil内生菌Rahu 系，AR3002系中的活昆虫(P＝0.037)和总昆虫(P＝0.003)更少。

结论

填补于AR3002感染系中后两个月，活昆虫和总昆虫更少，其与 nil内生菌系相比显著不同。

尽管已经通过实例的方式并且参考特定的实施方案描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离本发明的范围的情况下做出修改和/或改进。

此外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也以马库什组的任何单个成员或成员子组描述了本发明。

工业应用

如本文公开的经分离的香柱菌属内生菌菌株、植物/香柱菌属内生菌组合、用香柱菌属内生菌感染的种子及根据本发明制备和使用此类组合的方法均具有产生用于人类或动物食用的植物的工业应用。

参考文献

Bacetty AA,Snook ME,Glenn AE,Noe JP,Hill N,Culbreath A, Timper P,Bacon CW(2009a)Toxicity of endophyte-infected tall fescue alkaloids and grassmetabolites on Pratylenchus scribneri. Phytopathology 99:1336-1345

Bacetty AA,Snook ME,Glenn AE,Noe JP,Nagabhyru P,Bacon CW(2009b)Chemotaxis disruption in Pratylenchus Scribneri by tall fescue root extractsand alkaloids.Journal of Chemical Ecology 35: 844-850

Blankenship JD,Spiering MJ,Wilkinson HH,Fannin FF,Bush LP,Schardl CL(2001).Production of loline alkaloids by the grass endophyte,Neotyphodiumuncinatum,in defined media.Phytochemistry 58:395–401

Brownstein MJ,Carpten JD,Smith JR(1996)Modulation of non-templatednucleotide addition by Taq DNA polymerase:Primer modifications thatfacilitate genotyping.BioTechniques 20:1004-1010

Bush LP,Wilkinson HH,Schardl CL(1997)Bioprotective Alkaloids ofGrass-Fungal Endophyte Symbioses.Plant Physiology 114: 1-7

Card SD,Faville MJ,Simpson WR,Johnson RD,Voisey CR,De Bonth ACM andDE Hume.(2014)Mutualistic fungal endophytes in the Triticeae—survey anddescription.FEMS Microbiology Ecology 88: 94-106

Casida JE,Quistad GB(1998)Golden Age of Insecticide Research: Past,Present,or Future？Annual Review of Entomology 43:1-16.

Christensen MJ(1995)Variation in the ability of Acremonium endophytesof Lolium perenne,Festuca arundinacea and F.pratensis to form compatibleassociations in the 3grasses.Mycological Research 99: 466-470

Christensen MJ,Bennett RJ,Schmid J(2002)Growth of

and p-endophytes in leaves of Lolium and Festucagrasses.Mycological Research 106:93-106

Christensen MJ,Bennett RJ,Schmid J(2001)Vascular bundle colonisationby Neotyphodium endophytes in natural and novel associations withgrasses.Mycological Research 105:1239-1245

Christensen MJ,Leuchtmann A,Rowan DD,Tapper BA(1993) Taxonomy ofAcremonium Endophytes of Tall Fescue(Festuca- Arundinacea),Meadow Fescue(F-Pratensis)and Perennial Rye-Grass (Lolium-Perenne).Mycological Research 97:1083-1092

Christensen MJ,Simpson WR,Al Samarrai T(2000)Infection of tall fescueand perennial ryegrass plants by combinations of different Neotyphodiumendophytes.Mycological Research 104:974-978

Christensen MJ,Saulsbury K,Simpson WR(2012)Conspicuous epiphyticgrowth of an interspecific hybrid Neotyphodium sp.endophyte on distorted hostinflorescences.Fungal Biology 116:42-48

Felsenstein,J.(2005)PHYLIP(Phylogeny Inference Package) version3.6.Distributed by the author.Department of Genome Sciences, University ofWashington,Seattle

Glenn AE,Bacon CW,Price R,Hanlin RT(1996)Molecular phylogeny ofAcremonium and its taxonomic implications.Mycologia 88: 369-383

Huson D,Richter D,Rausch C,Dezulian T,Franz M,Rupp R (2007)Dendroscope:An interactive viewer for large phylogenetic trees. BMCbioinformatics 8:460

Kennedy CW,Bush LP(1983)Effect of environment and management factorson the accumulation of N-acetyl and N-formyl loline alkaloids in tallfescue.Crop Science 23:547–552

Kirkby K A,Pratley JE,Hume DE,Faville MJ,An M and H Wu. (2011)Incidence of endophyte Neotyphodium occultans in Lolium rigidum fromAustralia.Weed Research 51:261-272

Koulman A,Lane GA,Christensen MJ,Fraser K,Tapper BA (2007)Peramineand other fungal alkaloids are exuded in the guttation fluid of endophyte-infected grasses.Phytochemistry 68:355-360

Latch GCM,Christensen MJ(1985)Artificial Infection of Grasses withEndophytes.Annals of Applied Biology 107:17-24

Leuchtmann A,CW Bacon,CL Schardl,JF White and M Tadych.2014.Nomenclatural realignment of Neotyphodium species with genus

Mycologia 106:202-215.

Malinowski DP,Belesky DP(2000)Adaptations of endophyte-infected cool-season grasses to environmental stresses: Mechanisms of drought and mineralstress tolerance.Crop Science:40: 923-940

Marshall D,Tunali B,Nelson LR(1999)Occurrence of fungal endophytes inspecies of wild triticum.Crop Science 39:1507-1512

Miller JS,Funk VA,Wagner WL,Barrie F,Hoch PC,Herendeen P(2011)Outcomes of the 2011 botanical nomenclature section at the XVIIIInternational Botanical Congress.PhytoKeys 5:1-3

Moon CD,Tapper BA,Scott B(1999)Identification of

endophytesin planta by a microsatellite-based PCR fingerprinting assay with automatedanalysis.Applied and Environmental Microbiology 65: 1268-1279

Moon CD,Craven KD,Leuchtmann A,Clements SL,Schardl CL (2004).Prevalence of interspecific hybrids amongst asexual fungal endophytes ofgrasses.Molecular Ecology 13(6):1455–1467

Porter JK(1994).Chemical constituents of grass endophytes.In: Bacon,C.W.,White Jr.,J.F(Eds),Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses.CRC,BocaRaton,FL,pp.103-123

Rasmussen S,Lane GA,Mace W,Parsons AJ,Fraser K,Xue H (2012)The use ofgenomics and metabolomics methods to quantify fungal endosymbionts andalkaloids in grasses.Methods in Molecular Biology 860:213-226

Rowan DD(1993)Lolitrems,peramine and paxilline:mycotoxins of theryegrass/endophyte interaction.Agriculture,Ecosystems and Environment 44:,103-122

Rowan DD,Latch GCM(1994)Utilization of endophyte-infected perennialryegrasses for increased insect resistance.In:Bacon CW,White Jr.JF(eds),Biotechnology of Endophyte Fungi of Grasses.CRC Press, Boca Raton,Forida,pp.169-183

Sanger F,Nicklen S,Coulson AR(1977),DNA sequencing with chain-terminating inhibitors,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74(12):5463–5467

Schardl CL,Craven KD,Speakman S,Stromberg A,Lindstrom A,Yoshida R(2008).A novel test for host-symbiont codivergence indicates ancient originof fungal endophytes in grasses.Syst Biol.57: 483–498

Schardl CL,Grossman RB,Nagabhyru P,Faulkner JR,Mallik UP(2007)Lolinealkaloids:Currencies of mutualism.Phytochemistry 68: 980-996

Schardl CL,Young CA,Faulkner JR,Florea S,Pan J(2012) Chemotypicdiversity of

fungal symbionts of grasses.Fungal Ecology 5:331-344

Schuelke M(2000)An economic method for the fluorescent labelling ofPCR fragments.Nature Biotechnology 18:233-234

Simpson WR,Mace WJ(2012)Novel associations between

endophytes and grasses:Possibilities and outcomes.In

endophytesof cool season grasses:Implications,utilization and biology.'(Eds CA Young,GEAiken,RL McCulley,JR Strickland,CL Schardl.)pp.35-39.(The Samuel RobertsNoble Foundation:Ardmore, Oklahoma)

Simpson WR,Schmid J,Singh J,Faville MJ,Johnson RD(2012) Amorphological change in the fungal symbiont Neotyphodium lolii inducesdwarfing in its host plant Lolium perenne.Fungal Biology 116: 234-240

Subramanian AR,Kaufmann M,Morgenstern B(2008) DIALIGN-TX:greedy andprogressive approaches for segment-based multiple sequencealignment.Algorithms for Molecular Biology 3:article 6

Tanaka A,Tapper BA,Popay A,Parker EJ,Scott B(2005)A symbiosisexpressed non-ribosomal peptide synthetase from a mutualistic fungalendophyte of perennial ryegrass confers protection to the symbiotum frominsect herbivory.Molecular Microbiology 57:1036-1050

Tsai HF,Liu JS,Staben C,Christensen MJ,Latch GC,Siegel MR, Schardl CL(1994).Evolutionary diversification of fungal endophytes of tall fescue grassby hybridization with

species.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 91(7):2542–2546

Welty RE,Azevedo MD,Cooper TM(1987)Influence of moisture content,temperature,and length of storage on seed germination and survival ofendophytic fungi in seeds of tall fescue and perennial ryegrass.Phytopathology 77:893-900

Wilkinson HH,Siegel MR,Blankenship JD,Mallory AC,Bush LP,Schardl CL(2000).Contribution of fungal loline alkaloids to protection from aphids in agrass-endophyte mutualism.Molecular Plant Microbe Interactions 13:1027-1033

Yates SG,Fenster JC,Bartelt RJ(1989)Assay of tall fescue seedextracts,fractions and alkaloids using the large milkweed bug.Journal ofAgriculture and Food Chemistry 37:354-357

Zejda JE,McDuffie HH,Dosman JA(1993)Epidemiology of health and safetyrisks in agriculture and related industries-Practical applications for ruralphysicians.Western Journal of Medicine 158:56-63

Zhang,DX,Nagabhyru P,Blankenship JD,Schardl CL(2010) Are lolinealkaloid levels regulated in grass endophytes by gene expression or substrateavailability？Plant Signaling and Behavior 5(11): 1419–22

布达佩斯条约下进行的微生物保藏的描述

根据《布达佩斯条约下国际承认的用于专利程序的微生物保藏》的条款，已进行了以下生物保藏。

保藏鉴定参考号	国际保藏指定	保藏日期
			AR 3002	NRRL 50579	2011年10月13日
AR 3005	NRRL 50580	2011年10月13日
			AR 3007	NRRL 67556	2018年2月5日
AR 3042	NRRL 67560	2018年2月5日

上面保藏的微生物的保藏证明和存活证明附在以下。

序列表

<110> 格拉斯兰兹技术有限公司 (GRASSLANZ TECHNOLOGY LIMITED)

粮食研究发展公司 (THE GRAINS RESEARCH AND DEVELOPMENT CORPORATION)

<120> 香柱菌属内生菌

<130> 858439 TVG

<150> NZ 740056

<151> 2018-02-21

<150> NZ 743525

<151> 2018-06-15

<160> 46

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 1

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 2

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 2

gtttctt 7

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 3

cgctcagggc tacatacacc atgg 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 4

ctcatcgagt aacgcaggcg acg 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 5

catggatgga caagagattg cacg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 6

ttcactgcta caattctgtc cagc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 7

cacaaagaca aacgccaaaa g 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 8

gcaaagctca cagacaaagg tc 22

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 9

tacctctgca cggtgtattc c 21

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 10

tgcataacac tcaccttata gtcg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcgttgagga ggctagatag aa 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 12

ttccaagctg aacaaaagtc aa 22

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 13

atttgcagca gagatgatgt gt 22

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctgcaccgg actgttagta at 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 15

gatgacgtat cttgatgcta ccac 24

<210> 16

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<212> DNA

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<223> 引物

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cgtgtataaa gttcgggatc ctat 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 17

gagatatccc gtctcctgat ctaa 24

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<212> DNA

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<223> 引物

<400> 18

cacagcgtta cactatcaac ttcc 24

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

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cactaaacac acccaagaac aaga 24

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<212> DNA

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<223> 引物

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agacaggtaa gaagttttcc cctt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agctttccaa tgacgacata cata 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

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taatttaggg tagcattttc tccg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 23

ggtccctatt ctaatgcagg tatg 24

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

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cagtgtacgg gactttgtca atac 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 引物

<400> 25

tgtataataa acatggcgtg ctct 24

<210> 26

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<212> DNA

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gtgttgaaag ttgttggatc actc 24

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<212> DNA

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cgaaattgta gactatgttg gagc 24

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<212> DNA

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gtagatgtat tttgagcagg gctt 24

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<212> DNA

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gagtgagacc cggtgtagta agtc 24

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gagtcattct tcgtccattg tctt 24

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<212> DNA

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gaaatgaggc gtctatctta aagc 24

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tttcttgatt tccaaagaac aaca 24

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cagtcatcga ttaaaagtga gcat 24

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atgtcatctg cttcaacaag agtc 24

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tcttccatac aatttcttcc cttc 24

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actagtcaat agcacaaatt gcca 24

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agccctagcc tatacatctt tcct 24

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aatgggcttt tccattcaat aata 24

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cagaatttct cccatatata cgcc 24

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tcatctcttc aagactttcc tcct 24

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<223> 引物

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tttagtgtca cttcttcatc tcgc 24

Claims

1.香柱菌属

内生菌的分离菌株，其中所述内生菌包含188±0.8碱基对(bp)的B10等位基因尺寸和112±0.8bp的B11等位基因尺寸。

2.如权利要求1所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌包含选自以下的至少一种另外的SSR等位基因：ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、egs031、ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095，其中所述至少一种另外的SSR等位基因具有如表2所示的碱基对(bp)数±0.8bp。

3.如权利要求1或权利要求2所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌包含至少两种另外的SSR等位基因，优选至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种另外的SSR等位基因，优选20种另外的SSR等位基因，其中所述另外的SSR等位基因中的每一种具有如表2所示的碱基对(bp)数±0.8bp。

4.如权利要求1至3中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌包含以下22种SSR等位基因：B10、B11、ans016、ans019、ans033、ans036、egs027、egs031、ces0004、ces0022、ces0041、ces0054、ces0060、ces0061、ces0067、ces0075、ces0076、ces0078、ces0089、ces0093、ces0094和ces0095，其中所述22种SSR等位基因具有如表2所示的碱基对(bp)数±0.8bp。

5.如权利要求1至4中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌在植物原位产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱，优选地其中所述吲哚二萜生物碱是雀稗灵或Terpendole E，优选地其中所述麦角生物碱是裸麦角碱。

6.如权利要求1至5中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌在植物原位不产生大于约0.1mg/kg的麦角缬氨酸或大于约0.1mg/kg的黑麦震颤素B或两者，其中mg/kg是以所述内生菌和被所述内生菌感染的所述宿主植物的干重计。

7.如权利要求1至6中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌分离自禾草族大麦族(Triticeace)内的属，优选分离自野生禾谷植物，优选分离自披碱草属的草和/或大麦属的草，优选分离自披碱草，优选达乌里披碱草(E.dahuricus)、达乌里披碱草肥亚种(E.dahuricus sub species excelsus)和/或甘草披碱草(E.uralensis)。

8.如权利要求1至7中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌是雀麦生香柱菌

的种或菌株，或者雀麦生香柱菌和另一种香柱菌的杂合菌株。

9.如权利要求1至8中任一项所述的分离菌株，其中所述香柱菌属内生菌选自：AR3002(NRRL 50579)、AR3005(NRRL 50580)、AR3007(NRRL#67556)和AR3042(NRRL#67569)或它们的组合。

10.包含权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株和宿主植物的组合，其中所述组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

11.如权利要求10所述的组合，其中将所述内生菌接种至所述宿主植物是人工接种。

12.如权利要求10或权利要求11所述的组合，其中所述宿主植物是非内源性宿主植物。

13.如权利要求11或权利要求12所述的组合，其中所述宿主植物是草类植物或其部分。

14.如权利要求12或权利要求13所述的组合，其中所述宿主植物是黑麦属的植物或其部分，优选禾谷黑麦(S.cereale)或其栽培种，优选禾谷黑麦栽培种Rahu或禾谷黑麦栽培种Amilo。

15.如权利要求12或权利要求13所述的组合，其中所述宿主植物是小麦植物或其部分，优选小麦属的植物或其栽培种，优选普通小麦或其栽培种。

16.如权利要求10至15中任一项所述的组合，其中所述宿主植物的其部分是植物细胞系或植物愈伤组织。

17.如权利要求10至16中任一项所述的组合，其中所述至少一种吲哚二萜生物碱是雀稗灵或Terpendole E，或其中所述至少一种麦角生物碱是裸麦角碱。

18.如权利要求10至17中任一项所述的组合，其中所述组合与未被所述香柱菌属内生菌感染的宿主植物相比具有增加的对害虫的抗性或增加的对植物疾病的抗性或两者，优选地其中所述害虫是昆虫害虫。

19.感染了香柱菌属内生菌的分离菌株的宿主植物，其中所述内生菌是所述宿主植物的非内源性内生菌并包含188±0.8bp的B10等位基因尺寸和112±0.8bp的B11等位基因尺寸。

20.制备产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的稳定宿主植物/香柱菌属内生菌组合的方法，其包括用权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染宿主植物，其中所述组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

21.赋予宿主植物至少一定水平的害虫保护的方法，其包括用权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染所述宿主植物以形成宿主植物/香柱菌属内生菌组合，其中所述宿主植物/香柱菌属内生菌组合产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱。

22.植物种子，其感染了权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株。

23.权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株产生至少一种吲哚二萜生物碱或至少一种麦角生物碱的用途。

24.如权利要求23所述的用途，其包括以下或基本上由以下组成：用所述香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染宿主植物。

25.阻止或减少对土地区域中的植物的害虫损伤的方法，其包括用以下种植所述土地区域：感染了权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的宿主植物、权利要求10至18中任一项所述的组合、权利要求19所述的宿主植物或权利要求22所述的种子。

26.增加宿主植物的产量的方法，其包括用权利要求1至9中任一项所述的香柱菌属内生菌的分离菌株人工感染所述宿主植物以形成宿主植物/香柱菌属内生菌组合，其中所述宿主植物/香柱菌属内生菌组合比未感染所述内生菌的宿主植物产生更高的产量。

27.经分离的内生菌菌株，其选自：AR3002(NRRL 50579)、AR3005(NRRL 50580)、AR3007(NRRL#67556)和AR3042(NRRL#67569)或它们的组合。