CN110923188B - 一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：(1)挑取茄子褐纹病菌菌丝或孢子液，接种到液体培养基中，透气膜封口；(2)摇床培养：将接种后的液体培养基放入28℃‑32℃恒温摇床中以130‑170r/min培养，使孢子充分萌发生长；再将温度降至21‑24℃继续培养，使菌丝产孢，每天光照8‑24h；(3)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。本发明方法中使用液体培养基对茄子褐纹病菌进行培养，步骤更加简单，操作容易，减少污染可能性；使用本发明方法可以使得继代产孢的过程呈指数级，因而可在短时间内获得大量孢子液，培养效率高。

Description

一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法
技术领域
本发明属于植物病原菌诱导产孢领域，具体涉及一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法。
背景技术
茄子(Solanum melongena L.)是我国重要蔬菜作物。茄子褐纹病(Phomopsisblight of eggplant)，是由茄褐纹拟茎点霉(Phomopsis vexans)引起的危害茄子的重要病害之一。近年来，随着全球气候变暖和茄子的规模化栽培，褐纹病开始频繁爆发，发病严重处可导致减产30％-50％。严重影响了茄子产业的绿色健康发展。
茄褐纹病菌属于半知菌亚门球壳孢目拟茎点霉属，于1892年在美国首次发现，目前该病已在所有茄子种植国家普遍发生。在发病时，植株表面会产生水渍状病斑，病斑上出现黑色点状的分生孢子器，内含分生孢子。分生孢子为单胞、无色，有α型(纺锤形，内含2-3个油球)和β型(细长线状，一端弯曲呈钩状)两种类型。人工培养下，影响病菌产孢的主要因素为温度，产孢最适培养基为燕麦加苜宿浸出液。而根据田间调查研究，植株上的分生孢子器主要产生α型孢子，β型孢子较为少见，偶见于枝条或果实上且不能萌发。褐纹病菌菌丝适应性非常强，在10-35℃的PDA平板上都能生长，最适生长温度为25-30℃，在40℃以上和5℃一下时几乎停止生长，致死温度为55℃(25min)。
褐纹病菌的孢子是对其发育过程研究及其与植物互作机理研究的物质基础。因此，简单高效的产α型孢子的技术对于茄子褐纹病的机理研究十分重要。而现有技术依然存在缺点。如，操作过程略复杂，需要扫刷菌苔、无菌水冲洗、干燥及恒温光照培养。步骤越多，污染的可能性越大。同时，固体培养基产生大量孢子囊后，需要再次冲洗平板后过滤，以获得孢子液用于下一步研究。再次，一个平板所取包子量有限，需要大量孢子时，工作量会增加很多。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)挑取茄子褐纹病菌菌丝或孢子液，接种到液体培养基中，透气膜封口；
(2)摇床培养：将接种后的液体培养基放入28℃-32℃恒温摇床中以130-170r/min培养，使孢子充分萌发生长；再将温度降至21-24℃继续培养，使菌丝产孢，每天光照8-24h；
(3)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
作为优选的，所述液体培养基选自马铃薯液体培养基、苜蓿煎汁培养基或燕麦液体培养基的任意一种。
作为优选的，液体培养基的配制方法为：马铃薯、苜蓿杆或燕麦任意一种在水中煮沸，充分溶解其营养，过滤去除杂质，得滤液，灭菌。
作为优选的，液体培养基的组成为：所述马铃薯液体培养基中马铃薯与水的质量比为1:10-1:2.5，优选为马铃薯与水的质量比为1:5；所述苜蓿煎汁培养基中苜蓿与水的质量比为1:20-1:5，优选为苜蓿与水的质量比为1:10；所述燕麦液体培养基中燕麦与水的质量比为1:10-1:5，优选为燕麦与水的质量比为1:5。
作为优选的，液体培养基的配置方法还包括加入碳源。
作为优选的，液体培养基的配置方法中所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或果糖的至少一种，优选为葡萄糖。
作为优选的，上述葡萄糖的加入量为：葡萄糖与水的质量比小于等于1:50，优选为葡萄糖与水的质量比为1:200。
作为优选的，上述液体培养基的配制方法中，过滤为用纱布过滤。
作为优选的，步骤(1)中所述孢子液的加入量为：每200mL所述液体培养基加入0.005mL-0.1mL浓度为1×108g/L-1×1010g/L的孢子液，优选为每200mL所述液体培养基加入0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液。
作为优选的，步骤(2)中所述摇床培养为：将液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1-2天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3-4天，使菌丝产孢，每天光照12h。
本发明的有益效果是：使用液体培养基对茄子褐纹病菌进行培养，步骤更加简单，操作容易，减少污染可能性；使用本发明方法可以使得继代产孢的过程呈指数级，因而可在短时间内获得大量孢子液，培养效率高。
附图说明
图1为实施例2褐纹病菌α型孢子显微观察图。
图2为实施例1-6产孢图示(A：实施例1；B：实施例2；C：实施例3；D：实施例4；E：实施例5；F：实施例6)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)200g马铃薯在1000mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，灭菌。
(2)挑取两个茄子褐纹病菌菌饼，接种到200mL马铃薯液体培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的马铃薯液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
实施例2：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)200g马铃薯在500mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，加入5g葡萄糖，定容至1L后灭菌。
(2)取0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液加入至200mL马铃薯液体培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的马铃薯液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
实施例3：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)200g马铃薯在500mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，加入10g葡萄糖，定容至1L后灭菌。
(2)取0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液加入至200mL马铃薯液体培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的马铃薯液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
实施例4：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)200g马铃薯在500mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，加入20g葡萄糖，定容至1L后灭菌。
(2)取0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液加入至的孢子液加入至200mL马铃薯液体培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的马铃薯液体培养基放入30℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
实施例5：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)200g燕麦在500mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，加入5g葡萄糖，定容至1L后灭菌。
(2)取0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液加入至200mL燕麦液体培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的马铃薯液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
实施例6：一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，包括如下步骤：
(1)100g苜蓿杆在500mL水中煮沸20分钟，充分溶解其营养，用四层纱布过滤，去除杂质，得滤液，加入5g葡萄糖，定容至1L后灭菌。
(2)取0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液加入至200mL苜蓿煎汁培养基中，透气膜封口；
(3)摇床培养：将接种后的苜蓿煎汁培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养3天，使菌丝产孢，每天光照12h。
(4)培养液过滤，去除菌丝，得孢子液。
对实施例1-6培养过程的不同时期孢子数量进行测定，得表1：
表1不同液体培养基在最优培养条件下各时期的孢子数量
从表1可看出，当葡萄糖的加入量小于等于1:50时，茄子褐纹病菌仍能实现高效产孢，但在葡萄糖与水的质量比为1:200的马铃薯液体培养基中，其产孢效率最高。而从不同时期茄子褐纹病菌的产孢数量来看，孢子产孢已使得继代产孢的过程呈指数级增长，因此本发明可在短时间内获得大量孢子液，培养效率高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）挑取茄子褐纹病菌菌丝或孢子液，接种到液体培养基中，透气膜封口；
（2）摇床培养：将接种后的液体培养基放入28℃-32℃恒温摇床中以130-170r/min培养，使孢子充分萌发生长；再将温度降至21-24℃继续培养，使菌丝产孢，每天光照8-24h；
（3）培养液过滤，去除菌丝，得孢子液;
步骤（1）中所述孢子液的加入量为：每200mL所述液体培养基加入0.005mL-0.1mL浓度为1×108g/L-1×1010g/L的孢子液;
所述液体培养基为马铃薯液体培养基；其中，葡萄糖与水的质量比为1：200；
或所述液体培养基为苜蓿煎汁培养基。
2.根据权利要求1所述的一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：所述液体培养基的配制方法为：马铃薯或苜蓿杆在水中煮沸，充分溶解其营养，过滤去除杂质，得滤液，灭菌；所述液体培养基为马铃薯液体培养基时，还包括加入葡萄糖，葡萄糖与水的质量比为1：200。
3.根据权利要求1或2所述的一种茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：所述液体培养基的组成为：所述马铃薯液体培养基中马铃薯与水的质量比为1:10-1:2.5；所述苜蓿煎汁培养基中苜蓿与水的质量比为1:20-1:5。
4.根据权利要求2所述的一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：所述过滤为用纱布过滤。
5.根据权利要求1所述的一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：步骤（1）中所述孢子液的加入量为：每200mL所述液体培养基加入0.01mL浓度为1×109g/L的孢子液。
6.根据权利要求1所述的一种诱导茄子褐纹病菌高效产孢的方法，其特征在于：步骤（2）中所述摇床培养为：将液体培养基放入28℃恒温摇床中以150r/min培养1-2天，使孢子充分萌发生长；再将温度降至23℃继续培养2-4天，使菌丝产孢，每天光照12h。
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