JP6469016B2 - 新規微生物およびその利用 - Google Patents
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Description
また、特許第5198690号(特許文献2)には、バチルス・アミロリクフエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に属する細菌を用いた植物病害防除剤が開示されているが、本発明の菌株とは分類上異なっている。
また、特開2009−247302号公報(特許文献3)には、糸状菌性病害と細菌性病害を同時に防除でき、生菌体自体が有効である微生物農薬が開示されているが、植物の成長促進や線虫の防除に関しては記載されていない。
また、特許第4071036号明細書(特許文献5,US2004/265292)には、植物病害防除と害虫防除に利用できるバチルス・エスピーD747株が開示されているが、植物の成長促進や線虫の防除に関する記載はない。
また、特許第4359653号明細書(特許文献7,WO1997/012980)にはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)の新規株が産生する抗線虫性毒素による線虫制御方法が開示されているが、植物の成長促進や植物病害防除に関しては記載されていない。
本発明の他の目的は、前記の微生物を有効菌として含有し、生物農薬(微生物製剤)として使用できる植物病害防除剤、線虫防除剤及び植物成長促進剤を提供することにある。
[1]Bacillus sp. ITB090株(NITE BP-01725)、Bacillus sp. ITB100株(NITE BP-01726)、およびBacillus sp. ITB105株(NITE BP-01727)からなる群より選択される微生物またはそれらの株から誘導される変異株。
[2]Bacillus sp. ITB090株(NITE BP-01725)は配列番号1の塩基配列で示される16S rDNAを有し、Bacillus sp. ITB090株(NITE BP-01725)の変異株は配列番号1の塩基配列と99.5%以上の同一性を有する塩基配列で示される16S rDNAを有し、Bacillus sp. ITB100株(NITE BP-01726)は配列番号2の塩基配列で示される16S rDNAを有し、Bacillus sp. ITB100株(NITE BP-01726)の変異株は配列番号2の塩基配列と99.5%以上の同一性を有する塩基配列で示される16S rDNAを有し、Bacillus sp. ITB105株(NITE BP-01727)は配列番号3の塩基配列で示される16S rDNAを有し、Bacillus sp. ITB105株(NITE BP-01727)の変異株は配列番号3の塩基配列と99.5%以上の同一性を有する塩基配列で示される16S rDNAを有する、[1]に記載の微生物またはそれらの株から誘導される変異株。
[3][1]または[2]に記載の微生物もしくはその変異株の菌体またはその培養物。
[4][1]または[2]に記載の微生物もしくはその変異株あるいは[3]に記載の菌体またはその培養物を含有する、微生物製剤。
[5]植物成長促進剤である[4]に記載の微生物製剤。
[6]植物病害防除剤である[4]に記載の微生物製剤。
[7]線虫防除剤である[4]に記載の微生物製剤。
[8][3]に記載の菌体またはその培養物あるいは[5]に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、植物成長促進方法。
[9][3]に記載の菌体またはその培養物あるいは[6]に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、植物病害防除方法。
[10][3]に記載の菌体またはその培養物あるいは[7]に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、線虫防除方法。
[11][3]に記載の菌体またはその培養物あるいは[4]〜[7]のいずれかに記載の微生物製剤で植物を処理する工程を含む、植物の栽培方法。
この菌株は以下に示す細菌学的性質を有する。
(1)形態学的性質
形態: 桿菌
大きさ:幅1.0μm、長さ1.5〜2.5μm
運動性:+
胞子の有無:+
(2)培養的性質
培地:ニュートリエント・アガー(nutrient agar)培地(30℃)
形:円形
色調:クリーム色
(3)生理学的性質
グラム染色:+
この菌株は以下に示す細菌学的性質を有する。
(1)形態学的性質 形態: 桿菌
大きさ:幅0.8〜0.9μm、長さ1.5〜2.0μm
運動性:+
胞子の有無:+
(2)培養的性質
培地:ニュートリエント・アガー(nutrient agar)培地(30℃)
形:円形
色調:クリーム色
(3)生理学的性質
グラム染色:+
この菌株は以下に示す細菌学的性質を有する。
(1)形態学的性質
形態: 桿菌
大きさ:幅0.8〜0.9μm、長さ1.5〜2.0μm
運動性:+
胞子の有無:+
(2)培養的性質
培地:ニュートリエント・アガー(nutrient agar)培地(30℃)
形:円形
色調:クリーム色
(3)生理学的性質
グラム染色:+
この菌株は以下に示す細菌学的性質を有する。
(1)形態学的性質
形態: 桿菌
大きさ:幅0.8〜0.9μm、長さ1.5〜2.5μm
運動性:+
胞子の有無:+
(2)培養的性質
培地:ニュートリエント・アガー(nutrient agar)培地(30℃)
形:円形
色調:クリーム色
(3)生理学的性質
グラム染色:+
培地の炭素源としては、上記菌株が資化し得るあらゆるものが利用可能であるが、具体的にはグルコース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、麦芽エキス、廃糖蜜、水あめ、澱粉加水分解物などが挙げられる。
培地の窒素源としても、同様に、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、コーンスティープリカーなどの有機窒素含有物をはじめ、該菌株が利用し得る各種の合成または天然物を利用可能である。
また、微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの金属の塩類、ビタミン、アミノ酸などの微量栄養源も必要に応じて添加することができる。
培養は、振とう培養、通気培養などの好気的条件下で行なうことができる。培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃、pHは5〜8、好ましくは6〜7、培養期間は1〜4日、好ましくは2〜3日である。
ここでいう「植物病害を予防する」とは、土壌病害の場合には、病原菌を含む土壌でそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。また、茎葉病害の場合には、病原菌を接種してそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。さらに、「植物病害を治癒する」とは、病害に感染した植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用した植物の病気の程度が防除剤を施用しなかった植物における病気の程度より低下することをいう。
本発明において防除の対象となる茎葉病害としては、苗立枯病、斑点落葉病、炭疽病、いもち病、灰色かび病、うどんこ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において防除の対象となる土壌病害とは、好ましくは、土壌伝染性病害であり、より詳細には、フザリウム属菌、ゴイマノマイセス属菌、リゾクトニア属菌、ピシウム属菌、バーティシリウム属菌、フィトフトラ属菌、スクレロチウム属菌、コルティシウム属、プラスモディオフォラ属菌、リゾプス属菌、トリコデルマ属菌、ミクロドチウム属菌、スクレロチニア属菌のいずれか1種以上に起因する土壌病害であるが、これらに限定されない。これらの土壌病害の具体例としては、芝ピシウム病害、レタス根腐れ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
これらの植物病害に罹る前に植物に適用して病害を予防することが好ましいが、これらの植物病害に罹った植物に適用して病害を除去してもよい。
これらの線虫が植物に付着する前に植物に適用して病害を予防することが好ましいが、これらの線虫が付着した植物に適用して線虫を除去してもよい。
液体担体としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられる。また、界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖などが挙げられる。
また、本発明の微生物製剤は、上記の物質の他に、本発明の効果を妨げない限り、本発明の微生物の培養に用いた培地等の任意の物質を含んでいてもよい。
本発明の微生物製剤は、好ましくは、茎葉病害を防除するために、茎葉に噴霧される。本発明の微生物製剤は、好ましくは、土壌病害を防除するために、噴霧または潅注される。
これらの微生物について、以下の手順にて、植物病害防除活性、殺線虫活性および植物に対する成長促進効果について評価を行った。
植物病害防除効果 in vitro試験
(1)各種細菌の培養方法
ITB090(NITE BP-01725)、ITB100(NITE BP-01726)、ITB105(NITE BP-01727)、ITB117(NITE P-01728)株について、それぞれの保存菌の一白金耳をフラスコ当たり60mlの普通ブイヨン培地(栄研化学(株))を含むバッフル付き500ml三角フラスコに植菌後、回転振とう機で回転数180rpm、28℃、2日間培養した。得られた培養液を滅菌水にて5×107 cfu/mLとなるように希釈して、対峙培養に供試した。
各種病原菌に対して、拮抗作用もしくは阻止帯の形成が観察された場合「+」、観察されなった場合を「−」とした。
調査結果を表1に示す。本発明の新規菌株はともに供試した病原菌に対して防除活性を有していることが分かった。
キュウリ灰色かび病(Botrytis cinerea)に対する防除効果試験
(1)各種細菌の培養方法
ITB090(NITE BP-01725)、ITB100(NITE BP-01726)、ITB105(NITE BP-01727)、ITB117(NITE P-01728)株について、それぞれの保存菌の一白金耳をフラスコ当たり60mlの普通ブイヨン培地(栄研化学(株))を含むバッフル付き500ml三角フラスコに植菌後、回転振とう機で回転数180rpm、28℃、2日間培養した。得られた培養液を滅菌水にて5×107 cfu/mLとなるように希釈して、後の試験に供試した。対照としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MBI600(ボトキラー水和剤(出光興産株式会社)から購入し分離)を同様に培養した。
完全展開したキュウリ子葉(ときわ光3号P型)を胚軸部分で切り取り、湿らせたペーパータオルに切り口を接触させた。接種菌はPSA培地で培養した灰色かび病の胞子をPS培地5mLに懸濁して調製した。子葉の中心部に灰色かび病菌胞子懸濁液を50μL滴下した。滴下により形成された水滴にPAPER DISK(抗生物質検定用ペーパーディスク、厚手8mm 東洋ろ紙)をのせ、供試薬剤(濃度5x107cfu/mLの細胞懸濁液、を50μL滴下し、湿室に入れ25℃下で管理した。
接種後3日目にキュウリ葉上に現れた病斑面積を調査し、下記の式(1)にて防除価を求めた。
防除価={1-(処理区の病斑面積/無処理区の病斑面積)}×100・・・式(1)
線虫防除効果
(1)各種細菌の培養方法
ITB090(NITE BP-01725)、ITB100(NITE BP-01726)、ITB105(NITE BP-01727)、ITB117(NITE P-01728)株について、それぞれの保存菌の一白金耳をフラスコ当たり60mlの普通ブイヨン培地(栄研化学(株))を含むバッフル付き500ml三角フラスコに植菌後、回転振とう機で回転数180rpm、28℃、2日間培養した。得られた培養液を滅菌水にて5×107 cfu/mLとなるように希釈して試験に供試した。
対照区としてバチルス・ズブチリス MBI600株(ボトキラー水和剤(出光興産株式会社)から購入し分離)を同様に培養し試験に供試した。
トマトの根より採集した卵嚢より24時間以内に孵化したサツマイモネコブセンチュウ2期幼虫に対する殺線虫活性を試験した。マイクロプレートに各種菌の希釈培養液及び当量のネコブセンチュウ2期幼虫懸濁液(約50頭)を添加した。比較剤としてバチルス・ズブチリス MBI600株(ボトキラー水和剤(出光興産株式会社)から購入し分離)を同様に希釈したものを供試した。プレートを密封して、28℃、相対湿度約50%のインキュベーター内に配置した。
72時間後に、実体顕微鏡下での観察により線虫の死亡率を調べた。その際、不動の線虫は死亡したものとみなした。殺線虫率は以下の式(2)により算出した。
殺線虫率(%)=(死亡線虫数÷供試線虫数)×100・・・式(2)
表3に示すように、本発明に関わる微生物を処理することにより、サツマイモネコブセンチュウ2期幼虫に対して、バチルス・ズブチリス MBI600株に比べて極めて高い殺線虫活性が得られた。
サツマイモネコブセンチュウに対する防除効果試験
(1)各種細菌の培養方法
ITB090(NITE BP-01725)、ITB100(NITE BP-01726)、ITB105(NITE BP-01727)、ITB117(NITE P-01728)株について、それぞれの保存菌の一白金耳をフラスコ当たり60mlの普通ブイヨン培地(栄研化学(株))を含むバッフル付き500ml三角フラスコに植菌後、回転振とう機で回転数180rpm、28℃、2日間培養した。得られた培養液を滅菌水にて5×107 cfu/mLとなるように希釈して、後の試験に供試した。対照としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MBI600株(ボトキラー水和剤(出光興産株式会社)から購入し分離)を同様に培養した。
得られた培養液を滅菌水にて1×107 cfu/mLとなるように希釈した液にキュウリ種子(ときわ光3号P型)を30分間浸漬した後、ネコブセンチュウの密度が約3.3頭/乾土20gになるようにネコブセンチュウ汚染土壌を充てんした1/10000aワグネルポットに播種した。
定植1ヵ月後に根の被害度(ネコブ程度)をZeck(Zeck,W.M.(1971):Pflanzenschutz-Nachichten. Bayer AG, 24, 141-144.)の方法に従い、以下の階級値によって根こぶ着生程度を評価した。
0:根こぶが全く認められない。
1:注意深い観察によって、数個の小さな根こぶを認めることができる。
2:1と同様の数個の小さな根こぶがが容易に確認できる。
3:多くの小さな根こぶがあり、そのいくつかは融合している。根の機能はほとんど損なわれていない。
4:多数の小さな根こぶがあり、大きな根こぶもいくつかある。根の多くは機能している。
5:根の25%に著しく根こぶが着生し、機能していない。
6:根の50%に著しく根こぶが着生し、機能していない。
7:根の75%に著しく根こぶが着生し、根の再生能力も失われている。
8:健全な根は皆無であり、植物の養分吸収は阻害されている。茎葉部はまだ青い。
9:完全に根こぶに被われた根系が腐敗しつつある。植物は枯死しつつある。
10:植物も根も枯死。
ネコブ指数=Σ(被害度×個体数)/(全調査個体数×10)×100・・・式(3)
評価した根こぶ着生程度を元に、下記の式(4)により、防除価を算出した。
防除価=100-(処理区のネコブ指数/無処理区のネコブ指数)×100・・・式(4)
植物の成長促進効果
(1)各種細菌の培養方法
ITB090(NITE BP-01725)、ITB100(NITE BP-01726)、ITB105(NITE BP-01727)、ITB117(NITE P-01728)株について、それぞれの保存菌の一白金耳をフラスコ当たり60mlの普通ブイヨン培地(栄研化学(株))を含むバッフル付き500ml三角フラスコに植菌後、回転振とう機で回転数180rpm、28℃、2日間培養した。対照としてバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MBI600(ボトキラー水和剤(出光興産株式会社)から購入し分離)を同様に培養した。
コムギへの処理方法:
得られた培養液を滅菌水にて1×107 cfu/mLとなるように希釈した液にコムギの種子を30分間浸漬した後、育苗培土を充填したポットに播種した。
シロイヌナズナへの処理方法:
育苗培土を充填したポットにシロイヌナズナを播種した後、得られた培養液を滅菌水にて1×107 cfu/mLとなるように希釈し、これを5mL潅注処理した。
トウモロコシへの処理方法:
得られた培養液とトウモロコシの種子を種子重量1g当たり1×108cfuになるように混和し、各培養液を種子に塗沫した。処理した種子は、育苗培土を充填したポットに播種した。
ダイズへの処理方法:
得られた培養液とダイズの種子を種子重量1g当たり1×107 cfuになるように混和し、各培養液を種子に塗沫した。処理した種子は、育苗培土を充填したポットに播種した。
コムギ:播種後3週間後に個体当りの地上部重量を測定した。
シロイヌナズナ:播種後3週間後に個体当りの葉面積を測定した。
トウモロコシ:播種後4週間後に個体当りの地上部重量を測定した。
ダイズ:播種後4週間後に個体当りの地上部重量を測定した。
それぞれ、無処理区に対して増加量を算出した。
以下の表5に結果を示す。どの植物体においても各菌株を処理することで無処理区と比べて、植物の生育が著しく促進され、バチルス・ズブチリス MBI600株に比べて極めて高い生育促進効果を示した。
Claims (11)
- Bacillus sp. ITB105株(NITE BP-01727)である微生物。
- Bacillus sp. ITB105株(NITE BP-01727)は配列番号3の塩基配列で示される16S rDNAを有する、請求項1に記載の微生物。
- 請求項1または2に記載の微生物の菌体またはその培養物。
- 請求項1または2に記載の微生物あるいは請求項3に記載の菌体またはその培養物を含有する、微生物製剤。
- 植物成長促進剤である請求項4に記載の微生物製剤。
- 植物病害防除剤である請求項4に記載の微生物製剤。
- 線虫防除剤である請求項4に記載の微生物製剤。
- 請求項3に記載の菌体またはその培養物あるいは請求項5に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、植物成長促進方法。
- 請求項3に記載の菌体またはその培養物あるいは請求項6に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、植物病害防除方法。
- 請求項3に記載の菌体またはその培養物あるいは請求項7に記載の微生物製剤で植物または土壌を処理する工程を含む、線虫防除方法。
- 請求項3に記載の菌体またはその培養物あるいは請求項4〜7のいずれか一項に記載の微生物製剤で植物を処理する工程を含む、植物の栽培方法。
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