CN105349429B - 一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株y4及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用，本发明提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4；该菌株已于2015年10月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）Y4，保藏编号：CCTCC NO：M2015592。同时围绕这个菌株研究并建立了一套高效稳定的稻瘟菌根部接种方法，使得水稻根部的发病率达到了68%，为进一步研究稻瘟菌根部侵染机制提供条件，在理论上可在病害循环、发病因素方面深入认识稻瘟病，在实践应用上，可为稻瘟病防控措施的正确实施提供指导。

Description

一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用。

背景技术

稻瘟病是一种在水稻上发生的世界性真菌病害，严重影响水稻生产和粮食安全。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占总产量的10～15％，经济损失达数十亿美元；在我国，稻瘟病每年都有不同程度发生，特别是近几年，在西南、长江中游和东北等稻作区持续大发生，年发病面积达330～570万公顷，损失稻谷数亿公斤，给我国水稻安全生产带来了巨大隐患(刘占领等，2007；郑钊等，2009)。目前在大多数情况，仍然依靠传统的化学药剂和种植抗病品种来控制该病害，但效果并不是很理想。加之人们对食品安全的日益重视及环保意识的逐渐加强，化学药剂的使用已不再是现代农业生产上首推的防治措施；受病原菌小种遗传的复杂性、致病多样性及极易变异性三方面因素影响，导致新的抗病品种常常推广数年后便失去抗性(Skamnioti&Gurr,2009)。因此，发展稻瘟病持续、环境友好的防治措施需要对稻瘟病的病害侵染、发生和成灾过程有一个更加深入系统的了解。

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)作为一种传统的“气传”病原真菌，被划归于巨座壳科(Magnaporthaceae)，而巨座壳科真菌除稻瘟菌外还包括典型的土传病原真菌，如小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis、草坪夏季斑枯病菌M.poae和小麦根部侵染病原M.rhizophila(Cannon,1994)。18S和28S rDNA等聚类分析结果表明，稻瘟病菌与以上土传病菌均可聚为一类，亲缘关系较为接近(Cannon,1994；Thongkantha et al.,2009)。Sesma和Osbourn(2004)报道稻瘟病菌可在菌丝上形成简单的膨大附着枝侵入水稻根部，2～4周后在根、茎、叶、穗部位可观察到典型的稻瘟病斑，虽然症状出现时间与分生孢子侵入地上组织相比较慢，但这已说明M.oryzae可通过根部系统侵染水稻引起全株发病。因此稻瘟菌除经气传侵染外，在田间还可能由水稻根部侵染，在植株地上部分引起典型的稻瘟病症状。由此，推测稻瘟病可能在田间也兼顾土传病害的侵染、流行特点。尽管如此，在已有研究中，研究者在室内对稻瘟病菌根部接种发病率很低，平均发病率仅10％左右，这极大的限制了关于稻瘟病菌对水稻根部侵染机制的深入研究。鉴于此，有必要弄清不同条件对稻瘟病根部侵染发病的影响，建立稻瘟病菌根部接种体系，打破制约稻瘟病致病机制深入研究的技术瓶颈。

因此在室内完善稻瘟病的人工接种条件，建立起一套稳定高效的稻瘟病根部接种技术体系，已成为现今研究的一项重要任务。而植物病原真菌侵染寄主的关键在于其本身的致病力以及侵染的环境条件，所以本发明以一株强致病力的稻瘟菌株作为出发菌株，构建稳定地稻瘟菌绿色荧光标记菌株作为研究对象；围绕这个菌株研究并建立了一套高效稳定的稻瘟菌根部接种体系。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4,该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)Y4，保藏编号：CCTCC NO：M2015592，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应用，利用该病菌选择合适的环境参数对水稻进行侵染，解决了目前稻瘟病根部接种发病率不稳定这一难题。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的获得：

将稻瘟菌野生型菌株和含有质粒pCAMsgfp农杆菌的IM培养液混合培养，挑取单菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28℃下培养5d(重复3次)，对转化子进行生理生化特性的鉴定，最终获得了一株高效稳定的稻瘟病菌Y4，在普通光学显微镜和荧光显微镜下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或倒棍棒形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚胞，与野生型菌株相比，在孢子形态上没有差异，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。每平方厘米的产孢量可达到9.43×10⁵个/ml，孢子萌发率为98％。

该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)Y4，保藏编号：CCTCC NO：M2015592，地址：中国武汉武汉大学。一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应用，包括利用该菌株侵染水稻，具体包括以下步骤：

采用菌丝块根部接种法，水稻种子置于0.7％的水琼脂培养基上，黑暗28℃保湿催芽生长，直至幼根生长至5-6cm，将幼根生长健壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻璃管中，4个菌块放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆盖，再加水至蛭石水势为-2Kp，接种后的水稻植株放置在32℃、16h光照/8h黑暗条件的培养箱中生长。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1.通过农杆菌介导(ATMT)遗传转化方法，获得携带GFP标记的抗潮霉素转化子。对转化子进行致病力、荧光强度以及荧光稳定性的筛选，得到一株致病力强、荧光信号强且稳定的荧光标记菌株。由于转化子可发绿色荧光，便于跟踪稻瘟菌的侵染过程。

2.提供了一种适用于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Y4的稳定高效的稻瘟菌根部侵染方法，为进一步研究稻瘟菌根部侵染机制提供条件，在理论上可在病害循环、发病因素方面深入认识稻瘟病，在实践应用上，可为稻瘟病防控措施的正确实施提供指导。

附图说明

图1为培养7天的稻瘟病菌菌株Y4菌落形态示意图；

其中图1中a为菌落形态反面，图1中b为菌落形态正面。

图2为培养7天的稻瘟菌菌株Y4分生孢子；

其中图2中a为明场下观察形态，图2中b为荧光下观察形态。

图3为菌丝块接种根部方法示意图。

图4为稻瘟病菌根部侵染发病示意图；

其中图4中a为发病植株整体形态,b为叶部发病部位在明场、荧光条件下观察侵染情况,c为茎部发病部位在明场、荧光条件下观察侵染情况,d为根部发病部位在明场、荧光条件下观察侵染情况。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料，如未特别说明均为公众可获得的。

实施例1：

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Y4的获得及鉴定:

将稻瘟菌野生型菌株和含有质粒pCAMsgfp农杆菌的IM培养液混合培养，挑取单菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28℃下培养5d(重复3次)，共筛选出243个转化子，对转化子进行生理生化特性的鉴定，最终获得了一株高效稳定的稻瘟病菌Y4。将稻瘟病菌Y4菌丝块，置于PDA平板上，28℃光照条件下培养7天，观察其菌落形态，菌落从中间到边缘依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，气生菌丝不发达，呈典型稻瘟病菌菌落特征(图1)。在普通光学显微镜和荧光显微镜下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或倒棍棒形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚胞，与野生型菌株相比，在孢子形态上没有差异，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征(图2)。每平方厘米的产孢量可达到9.43×10⁵个/ml，孢子萌发率为98％。

该菌株已于2015年10月8号送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)Y4，保藏编号：CCTCC NO：M2015592，地址：中国武汉武汉大学。

稻瘟病菌GFP荧光菌株Y4分子鉴定：采用CTAB法(刘少华，2005)提取分离物的培养7天后的菌丝总DNA，运用稻瘟菌特异性引物(见序列表SEQ ID NO：2-3所示)进行PCR扩增。菌株均能扩增得到一条长度约为702bp的特异性条带，进一步对PCR产物进行测序，经NCBI网站blast比对，发现所有比对结果均为稻瘟菌。

本实施例所用的特异引物Phf2a/Phf2b由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。

1)特异性引物的核苷酸序列如下所示：

Phf2a：cgtcacacgttcttcaacc(见序列表SEQ ID NO：2所示)：

Phf2b：cgtttcacgcttctccg(见序列表SEQ ID NO：3所示),

2)扩增的特异性条带的核苷酸序列如下(SEQ ID NO：1所示)：

上述扩增的特异性条带(序列长度为702bp)由武汉擎科创新生物科技有限公司完成测序。

稻瘟病菌GFP荧光菌株Y4的保存

打取菌株Y4直径为6mm菌丝块，置于铺有灭菌滤纸片(1cm×1cm)的PDA平板上，于28℃，光照条件下培养，待7天后菌丝长满滤纸片，再将滤纸片揭下，放入硫酸纸袋中并封口，置于28℃烘箱中干燥20天，然后放置于-20℃条件下作为长期保存的菌株，需要时进行按常规方法活化。

实施例2：

稻瘟病菌荧光转化子的生物学表型分析

打取直径为6mm(菌株Y4)菌丝块，置于PDA平板上，3个重复，28℃恒温光照培养箱中培养，自接种之日起，隔天以十字交叉法测量菌落直径，7d后菌落照相。结果如表1所示。观察其菌落形态，其菌落从中间到边缘依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，气生菌丝不发达，菌落形态呈典型稻瘟病菌菌落特征。

将Y4直径为6mm的菌丝块接种于OMA培养基上，3个重复，光照黑暗交替28℃恒温培养箱中培养7d，刮掉全部气生菌丝，再诱导产孢，48h后用ddH₂O洗涤菌丝并过滤收集分生孢子，光学和荧光显微镜下观测分生孢子形态，分生孢子发绿色荧光，洋梨形或倒棍棒形，顶端钝尖，基部钝圆，有脚胞，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。以血球计数板统计分生孢子浓度。结果如表2所示，菌株Y4产孢量每平方厘米的产孢量可达到9.43×10⁵个/ml。

将Y4直径为6mm的菌丝块接种于OMA培养基上，3个重复，光照黑暗交替28℃恒温培养箱中培养5d，刮掉全部气生菌丝，再诱导产孢，48h后用ddH₂O洗涤菌丝并过滤收集分生孢子，将获得的孢子液点接在疏水塑料玻片上，黑暗保湿12h后，用镊子把玻片反盖在载玻片上，在光学显微镜下观察，孢子顶端萌发产生菌丝，菌丝末端膨大，产生近圆形附着胞，并统计孢子萌发率。结果如表3所示。

根据生物学表型分析，转化子Y4的生物学特性在菌落形态、生长，产孢，孢子萌发等方面均具有较好的稳定性，因此选用该菌株作为稻瘟病菌根部接种菌株。

表1稻瘟病菌Y4菌落生长速率测定

实施例3：

一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4的应用：

采用水稻根部贴接菌块的方法进行接种(图3)。水稻种子先在0.1％的高锰酸钾中浸泡1d，然后换成清水浸泡两天，待水稻种子漏出白芽后，置于0.7％的水琼脂培养基(水琼脂培养基成分：按g/L计，琼脂粉7g；补充蒸馏水至1000ml)上，黑暗条件、28℃保湿催芽生长，直至幼根生长至5cm左右，将幼根生长健壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻璃管中，将PDA上培养7d的直径为6mm的菌丝块贴接在幼根上，每个根上放4个菌块，其上再加15ml的蛭石，根据设置水势的不同(分别设置五个不同的水势培养条件，培养条件一：-2Kp，加11.26ml水；培养条件二：-10Kp,加6.91ml水；培养条件三：-20Kp,加5.30ml水；培养条件四：-30Kp,加4.56ml水；培养条件五：-40Kp,加4.12ml水。)，加不同量的水。用保鲜膜封口后分别置于5个不同温度条件下培养，即24、26、28、32和36℃。接种后，在第7天、第9天、第11天、第13天统计叶部发病率(％)(表4)，在第13天洗根，统计根部发病率(％)(表5)。

结果表明，接种后不同温度培养条件对稻瘟病根部发病的影响存在显著差异。在5个水势处理中，-2Kp条件下，各温度环境下的植株发病率均为最高(图4)。培养条件一(即温度24℃)，地上发病率和根部发病率分别为35％和46％；培养条件二(即温度26℃)，地上发病率和根部发病率分别为37％和53％；培养条件三(即温度28℃)，地上发病率和根部发病率分别为43％和52％；培养条件四(即温度32℃)，地上发病率和根部发病率分别可达到60％和68％；培养条件五(即温度36℃)，地上发病率和根部发病率分别为21％和25％。

在5个温度处理中，32℃环境下，各水势的植株发病率都是最高的。培养条件一(即水势-2Kp)，地上发病率和根部发病率分别可达到60％和68％；培养条件二(即水势-10Kp)，地上发病率和根部发病率分别为33％和50％；培养条件三(即水势-20Kp)，地上发病率和根部发病率分别为28％和50％；培养条件四(即水势-30Kp)，地上发病率和根部发病率分别为23％和40％；培养条件五(即水势-40Kp)，地上发病率和根部发病率分别为23％和35％。

因此，根部接种后将水稻放置在土壤水势为-2Kp、温度为32℃的环境中，可获得较好 的发病效果。

表4 根部接种后不同温度和土壤湿度对水稻根部发病的影响

表5 根部接种后不同温度和土壤湿度对水稻地上部发病的影响

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用

<130> 一种适用于根部接种的稻瘟病菌菌株Y4及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatccgtcac acccgttttc aaccattgga tctatcggtt tttgggccgt taaaagaagc 60

ttatcgacgt caacttggat ttgttagcca attttgctgt tcaacagtta ttggaaaacg 120

aaatttccta ctttgttatc gaaaggccag attaaaagca tttatagcaa aaaccattca 180

atctggttgg cgtacaacgg ggttatggcc ggtaaacttg gttaaaccac ttttaagccc 240

ttttttgtta gaaaatagca acgccaacgt tataaaagat aaaaacaacg gtttgcaaag 300

ggataaaaca ccggaaagcc cagcccaaaa aattaacgac ccgtctttac ttatttggaa 360

aacccctaaa acgacccgag atatccgact tcaactgcaa aaactttccc aatccaacaa 420

aaccaacgct acttcacgtc ttttatttgc aaaagtccaa aaaagcttcg aagccaaaga 480

tacccttttg gctagcgccc agcaaaaaat cagcttattg gaagcacaac tggaggcaat 540

acggccggtt aaaaggagga gggtggttcc ggatccaaac gagcttttgg ttaacaaaca 600

gaacattatt ggattgcagg aaaatgatat agaaaatttg gaacctttag ctgatgaaga 660

agaggttaat gaaccggaaa agggggaaaa agggggagaa gg 702

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtcacacgt tcttcaacc 19

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtttcacgc ttctccg 17

Claims (1)

1.稻瘟病菌菌株Y4在侵染水稻根部中的应用，其应用过程包括：采用菌丝块根部接种法，水稻种子置于0.7％的水琼脂培养基上，黑暗28℃保湿催芽生长，直至幼根生长至5-6cm，将幼根生长健壮的幼苗移至装有35ml蛭石的玻璃管中，4个菌块放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆盖，再加水至蛭石水势为-2Kp，接种后的水稻植株放置在32℃、16h光照/8h黑暗条件的培养箱中生长；

所述的菌块为保藏号为CCTCC NO：M2015592的稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Y4的菌块。