KR101227714B1

KR101227714B1 - 신규 페니바실러스 속 균주 및 이들 균주 또는 이의 배양물질을 이용한 식물 병해 방제

Info

Publication number: KR101227714B1
Application number: KR1020077003227A
Authority: KR
Inventors: 신이치로 고치; 츠카사 후지마키; 요시노리 가나이; 가츠유키 후타마타; 유조 기오카; 가츠노리 노구치
Original assignee: 가켄 세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2005-08-08
Publication date: 2013-01-29
Also published as: CN101018854A; US20070248583A1; EP1788074B1; EP1788074A4; CA2575769A1; CA2575769C; ES2379178T3; JP4359619B2; BRPI0514200B1; MX2007001335A; ATE546517T1; BRPI0514200A; US7935335B2; JPWO2006016558A1; CN101018854B; EP1788074A1; KR20070052752A; WO2006016558A1

Abstract

신규 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS-0277 및 그것으로부터 생성되는 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B 및 신규 화합물 3 및 4 는 식물 병해 저항성 유도 활성을 가진다. 따라서, 이는 균류, 세균류, 바이러스 등의 감염으로부터 식물을 방어할 수 있고, 그 결과 식물의 병해를 효과적으로 방제할 수 있다.

Description

신규 페니바실러스 속 균주 및 이들 균주 또는 이의 배양 물질을 이용한 식물 병해 방제 {NOVEL STRAINS BELONGING TO THE GENUS PAENIBACILLUS AND METHOD OF CONTROLLING PLANT DISEASE BY USING THESE STRAINS OR CULTURE THEREOF}

본 발명은 신규 페니바실러스 속 균주 및 이들 균 혹은 이들 균의 배양 물질을 이용한 식물 병해 방제에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 식물내에서 병해 저항성을 유도할 수 있는 물질을 생성하여 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타냄으로써 식물 병해 방제 효과를 발휘할 수 있는 페니바실러스 속 균주, 더 구체적으로는, 예를 들어 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사(polymyxa) BS-0105, 페니바실러스 종 BS-0277 등의 신규 페니바실러스 속 균주; 이들 페니바실러스 속 균주에 의한 식물 병해 방제; 및 이들 페니바실러스 속 균주의 배양물로부터 얻어지는 화합물의 신규한 식물 병해 저항성 유도 활성을 이용한 식물 병해 방제에 관한 것이다.

농업 분야에 있어서, 모든 식물 병해의 발생은 작물 수확량의 대폭적인 감소를 일으키므로, 식물 병해의 방제는 농업기술상 필수적 수단이다. 이러한 병해를 막는 수단으로는, 예를 들어 재배 환경의 제어, 병해 저항성 품종의 육성, 농원예용 살진균제 또는 살균제의 살포에 의한 방제, 및 유기 물질 등을 이용한 생물적 병해 방제 수치 있다. 그 중에서 농원예용 살진균제 또는 살균제에 의한 방제가 직접적면서 가장 효과가 높다. 그러나, 환경 오염 및 환경 생물에 미치는 영향 등과 같은 문제 때문에, 살진균제 또는 살균제를 대량으로 살포함에 의한 직접적 병해 방제를 포함하는 수단에 크게 의존하는 것은 분명히 바람직하지 못하다.

이와 같은 상황에서, 병원성 진균 및 세균에 대해 각각 특이적으로 효과를 나타내고, 선택적 독성의 면에서 매우 뛰어난 살진균 또는 살균 작용을 갖는 농원예용 살진균제 및 살균제가 개발되었다. 그러나, 그와 같은 약제는 병원성 진균 또는 세균의 약제 내성을 일으키기 쉽다는 점에서 불리하다. 상기 문제에 대한 대책으로, 작용성이 상이한 복수의 약제가 혼합물로서 또는 차례로 살포되고 있다.

이러한 화학 농약에 대한 과도한 의존 문제를 해결하기 위해, 최근 자연계에 보편적으로 존재하는 미생물이나 천적을 이용하여 각종 작물 병해나 해충을 방제하는 방법이 실용화되고 있고 방제 체계도 개선되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 1 에는, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) FR-2, 바실러스 폴리믹사 KT-8 등의 미생물 세포를 식물 진균 감염에 대한 방제제로서 사용하는 것이 제안되어 있다. 그러나 그러한 방제제의 효능 및 종류는 아직 충분하지 않으므로 더 우수한 생물 방제제가 요구되고 있다.

약제 내성 진균 및 세균의 출현 문제를 해결하기 위해서는, 식물의 병해 저항성을 유도할 수 있는 물질 또는 미생물을 이용하는 것이 가장 효과적이라고 여겨진다.

현재까지, 식물 병해에 대한 저항성을 유도할 수 있는 물질은 살리실산 등 몇 가지 알려져 있지만, S-메틸 1,2,3-벤조티아졸-7-카르복실레이트 (일반명: 아시벤졸라(acibenzolar)-S-메틸) (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2) 및 3-(2-프로필렌옥시)-1,2-벤즈이소티아졸-1,1-디옥사이드 (일반명: 프로베나졸) (비특허문헌 3) 등 그 중 일부만이 실제로 식물 병해 방제 약제로서 사용된다. 따라서, 상기 물질로는 만족스럽지 못하다.

특허문헌 2 에는, 식물 병해에 대한 저항성을 유도할 수 있는 세균 및 유기 토양 개량제를 사용하여, 식물 병해에 대한 내성을 부여하는 것이 기재되어 있다. 그러나 이 방법도 충분하지는 못하다.

한편 특허문헌 3 에는, 바실러스 종 KB-291 에 의해 생성되는 항균 활성 물질 KT-6291A (푸사리시딘 A) 가 각종 식물 병해를 방제하는 것이 보고되어 있다. 그러나, 특허문헌 3 에 기재된 항균 활성 물질 KT-6291A 는, 그람 음성 세균인 오이 반점 세균에 대해 활성을 나타내지 않는 것뿐만 아니라 그 밖의 그람 음성 세균에 대해서도 활성을 나타내지 않는다는 것이 밝혀졌다. 특허 문헌 3 은 그람 음성 세균에 의해 일어나는 식물 병해를 방제하는 방법의 기재가 없다. 또한 KT-6291A 물질이 푸사리움(Fusarium) 속 균주인 오이 덩굴쪼김병균에 대해서도 항균 활성을 나타내지 않음이 밝혀졌다. 특허 문헌 3 은 몇 가지 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 다른 물질에 대해 기술하고 있지만, 식물 병해 저항성 유도 활성에 관한 정보는 전혀 없다.

비특허문헌 4 에도, 마찬가지로 바실러스 폴리믹사 KT-8 로부터 항균 활성 물질 푸사리시딘(Fusaricidin) A 가 생성되지만, 이 물질은 그람 음성 세균에 대해 활성을 나타내지 않는다는 것이 밝혀졌다.

또한, 비특허문헌 5 에는, 바실러스 폴리믹사 KT-8 로부터 푸사리시딘 A 와 함께 푸사리시딘 B 등이 생성되지만, 이들 물질도 그람 음성 세균에 대해 활성을 나타내지 않는다는 것이 밝혀졌다.

특허문헌 1 : JP-A-6-253827

특허문헌 2 : JP-T-2003-529539

특허문헌3 : JP-A-2-275898

비특허문헌 1 : Plant Physiol. 117, p.1333-1339 (1998)

비특허문헌 2 : Brighton crop protection conference - pests & diseases - 1996, 8A-4, CGA2455704

비특허문헌 3 : Annu. Rev. Phytopathol. 32, p.439-59, (1994)

비특허문헌 4 : The Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129-135 (1996)

비특허문헌 5 : The Journal of Antibiotics VOL.50, No.3, p.220-228 (1997)

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

따라서 본 발명의 과제는, 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타낼 수 있는 페니바실러스 속 균주를 제공하는 것, 나아가 식물 병해 저항성을 유도할 수 있는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는, 상술한 균주 또는 물질을 이용한 식물 병해 방제제 및 식물 병해 방제 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 상기의 상황을 감안하여 더 우수한 식물 병해 방제 방법을 찾아내기 위해 집중 연구한 결과, 균주의 형태학적 및 생리-성상학적(characterological) 시험에 의해 동정한 경우에는 바실러스 속에 속하고, 16S rDNA 핵산서열 분석에 의해 동정한 경우에는 페니바실러스 속에 속하는 어떤 종류의 세균이 뛰어난 식물 병해 방제 효과를 갖는다는 것을 찾아냈다. 또, 이들 바실러스 혹은 페니바실러스 속에 속하는 어떤 종류의 세균의 배양물 중에 식물 병해 저항성 유도 활성을 갖는 화합물이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명은 이러한 발견을 토대로 완성되었다.

따라서, 본 발명은 식물 병해 방제 작용을 갖는 신규 페니바실러스 속 균주에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 식물 병해 저항성 유도 물질을 생성하여 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써 식물 병해 방제 작용을 나타낼 수 있는 페니바실러스 속 균주에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 페니바실러스 속 균주를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 페니바실러스 속 균주의 배양물로부터 얻어지는 하나의 식물 병해 저항성 유도 물질 혹은 그 2 이상의 조합을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 식물 병해 방제제에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 하기 구조를 갖는 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 식물 병해 방제제에 관한 것이다:

[화학식 1]

화합물 1 (푸사리시딘 A)

[화학식 2]

화합물 2 (푸사리시딘 B)

[화학식 3]

화합물 3

[화학식 4]

화합물 4

또한 본 발명은, 상기 페니바실러스 속 균주, 조성물 또는 식물 병해 방제제를 식물에 적용하여 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어하는 것을 특징으로 하는 식물 병해 방제 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 구조식을 갖는 신규 화합물 3 및 4 에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "페니바실러스 속 균주" 란 균주의 형태학적 및 생리성상학적 시험에 의해 동정한 경우에는 바실러스 속에 속하고, 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 동정한 경우에는 페니바실러스 속에 속하는 균주를 의미한다.

발명의 효과

본 발명의 페니바실러스 속 균주는, 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써 그람-음성 세균 (예, 수도모나스(Pseudomonas) 속 균주) 및 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 발견된 신규 미생물, 즉 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS-0277 은, 그람 음성 세균 및 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있고, 나아가 통상의 식물 병원성 진균, 예를 들어 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속 균주 및 글로메렐라(Glomerella) 속 균주 등의 각종 식물 병원성 진균에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있다. 여기서, 예를 들어 "페니바실러스 종 BS-0048" 은, 균주의 형태학적 및 생리-성상학적 시험에 의해 동정한 경우에는 바실러스 종 BS-0048 로 명명할 수 있고, 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 동정한 경우에는 페니바실러스 종 BS-0048 로 명명할 수 있는 동일한 균주를 의미한다. "페니바실러스 폴리믹사 BS-0105" 란 용어는, 균주의 형태학적 및 생리-성상학적 시험에 의해 동정한 경우에는 바실러스 속에 속하는 바실러스 종 BS-0105 로 명명할 수 있고, 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 동정한 경우에는 페니바실러스 속의 폴리믹사 종에 속하는 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 로 명명할 수 있는 동일한 균주를 의미한다.

또한, 페니바실러스 속 균주에 의해 생성되는 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 는, 식물 병해 저항성 유도 활성을 가지며, 따라서 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어하는 작용을 가지므로, 식물 병해 방제에 유효하다.

도면의 간단한 설명

[도 1] 본 발명의 신규 화합물 3 의 양성자 핵자기공명 스펙트럼 (DMSO-d6).

[도 2] 본 발명의 신규 화합물 4 의 양성자 핵자기공명 스펙트럼 (DMSO-d6).

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 의해, 식물 병해 방제 작용을 갖는 신규 페니바실러스 속 균주가 제공되고, 식물 병해 저항성 유도 물질을 생성하여 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써 식물 병해 방제 작용을 나타낼 수 있는 페니바실러스 속 균주가 제공된다. 본 발명의 식물 병해 저항성 유도 물질로는, 상기 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 를 예로 들 수 있다.

본원에서 사용되는 "식물 병해 저항성 유도 활성" 이란, 식물 병해에 대해 소위 "유도된 병해 저항성 (induced disease resistance)" 을 부여하는 활성을 의미한다. 이러한 활성을 갖는 물질을 생성할 수 있는 페니바실러스 속 균주, 및 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 등의 식물 병해 저항성 유도 물질은, 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어할 수 있다. 따라서, 직접 항균 활성을 나타내지 않고, 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘하여 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어함으로써, 식물 병해를 방제할 수 있다.

이러한 페니바실러스 속 균주의 구체적 예로는, 본 발명에 의해 발견된 신규 균주인 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS-0277 및 이의 변이체를 들 수 있다. 변이체로는, 예를 들어 자연 돌연변이, 물리적 원인 (예, 자외선) 또는 화학적 변이원 (예, 염기 화합물) 에 의해 생기는 변이체로서, 본 발명이 의도하는 기능, 즉 식물 병해 저항성 유도 물질, 예컨대 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 생성하여 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써 식물 병해 방제 효과를 나타낼 수 있는 변이체라면 어떤 변이체라도 가능하다.

본 발명에 사용되는 페니바실러스 속 균주로는, 균주의 형태학적 및 생리-성상학적 시험에 의해 동정한 경우에는 바실러스 속에 속한다고 할 수 있는 균주라 하더라도, 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 동정하였을 때 페니바실러스 속에 속하는 균주라면 사용가능하다.

본 발명의 페니바실러스 속 균주는 식물 병해 저항성 유도 물질을 생성하여 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써, 그람 음성 세균 및 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있다. 또한, 상기와 같은 식물 병해 저항성 유도 물질인, 예컨대 상기 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 자체도 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘함으로써, 그람 음성 세균 및 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있다.

그람 음성 세균에 의해 일어나는 식물 병해로는, 수도모나스 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 예로 들 수 있다. 식물 병해의 구체적 예로는 오이 및 멜론의 반점세균병 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 등의 박과 식물의 반점세균병, 벼의 엽초갈변병 (Pseudomonas fuscovaginae) 등을 들 수 있다. 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해로는, 예를 들어 보리, 밀, 귀리 및 호밀의 붉은곰팡이병 (scab) (Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum), 오이의 덩굴쪼김병 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium), 멜론의 덩굴쪼김병 (Fusarium oxysporum f. sp. melonis), 및 토마토의 덩굴쪼김병 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 를 들 수 있다.

본 발명의 페니바실러스 속 균주, 예컨대 신규한 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS-0277 은, 상기 예로든 그람 음성 세균 및 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있고, 나아가 통상의 식물 병원성 진균, 예를 들어 콜레토트리쿰 속 균주 및 글로메렐라 속 균주 등의 각종 식물 병원성 진균에 의해 일어나는 식물 병해를 방제할 수 있다. 콜레토트리쿰 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해로는, 예를 들어 오이의 탄저병 (Colletotrichum orbiculare) 등의 박과 식물의 탄저병, 및 딸기의 탄저병 (Colletotrichum acutatum) 등이 포함된다. 글로메렐라 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해로는, 예를 들어 포도의 만부병 (Glomerella cingulata) 및 딸기의 탄저병 (Glomerella cingulata) 가 포함된다.

상기 예로든 식물 병해 외에도, 본 발명의 페니바실러스 속 균주는 예컨대 하기 식물 병해에 유효하다: 각종 작물의 회색곰팡이병 (Botrytis cinerea) 및 줄기썩음병 (Sclerotinia sclerotiorum); 벼의 도열병 (Pyricularia oryzae), 잎집무늬마름병 (Thanatephorus cucumeris) 및 깨씨무늬병 (Cochliobolus miyabeanus); 사과의 검은별무늬병 (Venturia inaequalis), 반점낙엽병 (Alternaria mali) 및 부란병 (Valsa ceratosperma); 배의 검은무늬병 (Alternaria kikuchiana) 및 검은별무늬병 (Venturia nashicola); 감귤의 검은점병 (Diaporthe citri), 푸른곰팡이병 (Penicillium italicum) 및 근류병 (Xanthomonas campestris pv. citri); 복숭아의 포몹시스 부패병 (Phomopsis sp.) 및 잿빛무늬병 (Monilinia fructicola); 일본감의 탄저병 (Gloeosporium kaki) 및 모무늬낙엽병 (Cercospora kaki); 보리, 밀, 귀리 및 호밀의 흰가루병 (Erysiphe graminis), 녹병 (Puccinia graminis, P. striformis, P. recondita), 보리겉깜부기병 (Ustilago nuda) 및 붉은곰팡이병 (Gibberella zeae, Monographella nivalis); 오이의 흰가루병 (Sphaerotheca cucurbitae), 덩굴마름병 (Didymella bryoniae) 및 노균병 (Pseudoperonospora cubensis); 토마토의 잎곰팡이병 (Fulvia fulva); 가지나무의 시들음병 (Verticillium dahliae), 잿빛무늬병 (Phytophthora capsici) 및 풋마름병 (Ralstonia solanacearum); 담배의 갈색무늬병 (Alternaria alternata); 사탕무의 점무늬병 (Cercospora beticola); 감자 역병 (Phytophthora infestans); 대두의 자반병 (Cercospora kikuchii); 일본무의 노균병 (Pernospora brassicae); 시금치의 노균병 (Peronospora spinaciae); 양상추의 반점세균병 (Xanthomonas campestris pv. vitians) 및 무름병 (Erwinia carotovora subsp. carotovora); 양배추의 검은썩음병 (Xanthomonas campestris pv. campestris); 유채과 야채의 뿌리혹병 (Plasmodiophora brassicae); 각종 작물의 모입고병 (Pyythium sp); 과수의 자주무늬날개병 (Helicobasidium mompa); 잔디의 라지패치 (Rhizoctonia solani) 및 커불라리아 잎마름병 (Curvularia sp.) 등.

또한, 본 발명의 페니바실러스 속 균주 혹은 식물 병해 저항성 유도 물질인, 예를 들어 상기 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3, 화합물 4 자체는, 식물 병해 저항성 유도 활성을 발휘하기 때문에, 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어하여, 그 결과 식물 병해를 방제할 수 있다. 식물 병원체로는, 상기 예로든 각종 세균 및 균류뿐만 아니라, 바이러스류를 예로 들 수 있다.

균류로는, 하기 식물 병해를 유발할 수 있는 균류를 예로 들 수 있다: 각종 작물의 회색곰팡이병 (Botrytis cinerea) 및 줄기썩음병 (Sclerotinia sclerotiorum); 벼의 도열병 (Pyricularia oryzae), 잎집무늬마름병 (Thanatephorus cucumeris) 및 깨씨무늬병 (Cochliobolus miyabeanus); 사과의 검은별무늬병 (Venturia inaequalis), 반점낙엽병 (Alternaria mali) 및 근류병 (Valsa ceratosperma); 배의 검은무늬병 (Alternaria kikuchiana) 및 검은별무늬병 (Venturia nashicola); 감귤의 검은점병 (Diaporthe citri) 및 푸른곰팡이병 (Penicillium italicum); 복숭아의 포몹시스 부패병 (Phomopsis sp.) 및 잿빛무늬병 (Monilinia fructicola), 일본감의 탄저병 (Gloeosporium kaki) 및 모무늬낙엽병 (Cercospora kaki); 포도의 만부병 (Glomerella cingulata); 보리, 밀, 귀리 및 호밀의 흰가루병 (Erysiphe graminis), 녹병 (Puccinia graminis, P. striformis, P. recondita), 보리겉깜부기병 (Ustilago nuda) 및 붉은곰팡이병 (Monographella nivalis); 오이의 흰가루병 (Sphaerotheca cucurbitae), 덩굴마름병 (Didymella bryoniae), 탄저병 (Colletotrichum orbiculare) 및 노균병 (Pseudoperonospora cubensis); 토마토의 잎곰팡이병 (Fulvia fulva); 가지나무의 시들음병 (Verticillium dahliae) 및 갈색부패병 (Phytophthora capsici); 딸기의 탄저병 (Colletotrichum acutatum, Glomerella cingulata); 담배의 갈색무늬병 (Alternaria alternata); 사탕무의 점무늬병 (Cercospora beticola); 감자 역병 (Phytophthora infestans); 대두의 자반병 (Cercospora kikuchii); 일본무의 노균병 (Pernospora brassicae); 시금치의 노균병 (Peronospora spinaciae); 유채과 야채의 뿌리혹병 (Plasmodiophora brassicae); 각종 작물의 모입고병 (Pythium sp); 과수의 자주무늬날개병 (Helicobasidium mompa); 잔디의 라지패치 (Rhizoctonia solani) 및 커불라리아 잎마름병 (Curvularia sp.) 등.

상기 예로든 균류 이외의 세균류로는 하기 식물 병해를 일으킬 수 있는 세균을 예로 들 수 있다: 감귤의 근류병 (Xanthomonas campestris pv.citri); 가지나무의 풋마름병 (Ralstonia solanacearum); 양상추의 반점세균병 (Xanthomonas campestris pv. vitians) 및 무름병 (Erwinia carotovora subsp. carotovora); 및 양배추의 검은썩음병 (Xanthomonas campestris pv. campestris) 등.

바이러스류로는 하기 식물 병해를 일으킬 수 있는 바이러스를 예로 들 수 있다: 오이 모자이크병 (cucumber mosaic cucumovirus, watermelon mosaic2 potyvirus, zucchini yellow mosaic poryvirus), 토마토 바이러스병 (tobacco necrosis necrovirus), 딸기 바이러스병 (strawberry crincle cytorhabdovirus, strawberry latent C virus, soybean dwarf luteovirus, strawberry mottle virus, strawberry pseudo mild yellow edge carlavirus, strawberry vein banding caulimovirus, tabocco mosaics tobamovirus, tobacco necrosis necrovirus), 양배추 모자이크병 (cauliflower mosaic caulimovirus, cucumber mosaic cucumovirus, turnip mosaic poryvirus), 대두 바이러스병 (southern bean mosaic sobemovirus, peanut stunt cucumovirus, bean common mosaic poryvirus, broad bean wilt fabavirus) 및 감자 잎말림병 (potato leafroll luteovirus) 등.

본 발명의 페니바실러스 속 균주를 식물 병해 방제에 사용하기 위해서는, 통상 페니바실러스 속 균주의 포자, 영양 균체, 전체 배양물 등을 사용할 수 있다. 이들은, 통상의 방법에 의해 페니바실러스 속 균주를 배양하여 그 배양물로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 수득된 전체 배양물을 그대로 동결 건조함으로써, 전체 배양물 분말로서 전체 배양물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 배양후 전체 배양물을 원심분리하여 불순물을 제거하고, 수득된 상청액을 더욱 원심분리한 후 침전된 균체를 세정하여, 균체 침전물로서 영양 균체를 제조할 수 있다. 또한 예를 들어, 상기 수득된 균체 침전물을 증류수에 현탁하고 얻은 현탁액을 동결 건조함으로써, 동결 건조 균체 분말로서 포자를 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 페니바실러스 속 균주는 통상 생균이지만, 열처리 등에 의해 사멸시킨 균일 수 있다. 여기서 생균이란 상기한 바와 같이, 배양물로부터 얻어진 생균, 생균으로부터 얻어진 건조균, 배양물로부터 여과, 원심분리 등의 통상의 방법에 의해 분리된 균 및 분리 및 채취 후에 건조된 균을 포함하는 것이다.

페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105, 페니바실러스 종 BS-0277 등의 페니바실러스 속 균주는 일반 세균에 있어서의 통상의 배양 방법에 의해 배양된다. 이는 고체 배양 또는 액체 배양 (예, 시험관 진탕 배양, 왕복식 진탕 배양, 회전 진탕 배양, 단지 발효기 (jar fermenter) 배양, 탱크 배양) 등의 고려가능한 모든 방법으로 배양가능하다. 배양 배지로서, 각종 탄소원, 질소원, 유기염 및 무기염을 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 전분, 글리세롤, 덱스트린, 자당 및 동식물유 등을 들 수 있다. 유기 질소원으로는, 예를 들어 효모 추출물, 대두분, 옥수수 침지액 (corn steep liquor), 소맥 배아, 육(肉) 추출물, 펩톤 등을 들 수 있다. 무기 질소원으로는, 예를 들어 질산나트륨, 질산암모늄, 황산암모늄 및 아세트산암모늄 등을 들 수 있다. 유기염 및 무기염으로는, 예를 들어 아세트산나트륨 등의 아세트산염; 탄산칼슘, 탄산나트륨 등의 탄산염; 염화나트륨, 염화칼륨 등의 염화물; 인산2수소칼륨, 인산수소2나트륨 등의 인산염; 및 황산제일철, 황산아연, 황산구리 등의 황산염 등을 들 수 있다. 배양 온도는 미생물이 생육가능한 범위에서 적절하게 변경할 수 있지만, 바람직하게는 20℃∼40℃ 의 범위이다. 통상, 배양은 호기적 조건하에서 수행된다. 특히 단지 발효기 또는 배양 탱크로 배양하는 경우, 무균 공기를 불어넣으면서 배양을 행한다. 미생물이 생육가능한 한 배양 방법 및 조건은 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 식물 병해 저항성 유도 물질로서 사용하는 화합물 1 (푸사리시딘 A) 및 화합물 2 (푸사리시딘 B) 는, 본 발명에서 발견된 신규 페니바실러스 속 균주 (예, 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105, 또는 페니바실러스 종 BS-0277) 또는 상술한 화합물을 생성하는 것이 알려져 있는 바실러스 종 KB-291 (JP-A-2-275898) 또는 바실러스 폴리믹사 KT-8 (The Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129-135 (1996); The Journal of Antibiotics VOL.50, No.3, p.220-228 (1997)) 등의 바실러스 속 균주의 배양물로부터 얻을 수 있다. 화합물 3 및 화합물 4 는, 본 발명에서 발견된 상기 신규 페니바실러스 속 균주의 배양물로부터 얻을 수 있다. 구체적으로, 이들 균을 통상의 방법으로 배양하고, 얻어지는 배양액으로부터 상기 문헌에 기재된 방법이나 통상의 정제 방법을 조합함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 배양액을 부탄올, 아세트산에틸 등으로 추출하고, 추출액을 고성능 액체 크로마토그래피 처리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 식물 병해 방제에 있어서 사용되는 페니바실러스 속 균주 또는 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 등의 식물 병해 저항성 유도 물질은, 임의의 다른 성분을 전혀 첨가하지 않고 그대로 사용할 수 있다. 필요에 따라, 고체 담체 또는 액체 담체 등의 임의의 각종 담체와 혼합하여 제조된 조성물, 또는 첨가제 등의 제제용 보조제를 첨가하여, 균주 또는 물질을 수화제(wettable powder), 용액제, 현탁제, 과립제, 분제, 마이크로캡슐제, 페이스트제 등으로 제제화하여 수득된 제형물을 사용할 수 있다.

이들 제제는 본 발명의 페니바실러스 속 균주를, 통상 약 0.1%∼99 중량% 함유한다 (세균 중량은 습윤량). 상기 제제는 제제 1g 당 약 10³∼약 10¹¹ 의 콜로니 형성 단위 (이하, CFU 라 함) 의 본 발명의 페니바실러스 속 균주를 함유하는 것이 바람직하다. 페니바실러스 속 균주의 포자, 영양 균체 혹은 전체 배양물을 사용하는 경우에는, 제제 1g 당 약 10³∼약 10¹¹ CFU 혹은 통상 약 0.1%∼99 중량% 의 양 (습윤량) 을 함유하는 것이 바람직하다. 식물 병해 저항성 유도 물질의 경우에는, 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 0.01%∼99% 의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.

제제화에 사용되는 고체 담체로는, 예를 들어 미네랄 분말 (예, 카올린클레이, 벤토나이트, 규조토, 합성 함수 산화규소, 탈크, 석영, 버미큘라이트, 펄라이트 등), 무기염 (예, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등), 유기 분말 (소맥분, 대두분, 밀기울, 키틴, 쌀겨, 탈지분유 및 전지분유 등), 활성탄 및 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 액체 담체로는, 예를 들어 물, 글리세롤, 식물유 (예, 대두유 및 유채씨유), 액체 동물유 (예, 어유), 에틸렌글리콜, 폴리(에틸렌글리콜), 프로필렌글리콜 및 폴리(프로필렌글리콜) 등을 들 수 있다.

제제용 보조제로는, 예를 들어 카제인, 젤라틴, 다당류 (예, 전분가루, 아라비아고무, 셀룰로오스 유도체 및 알긴산), 리그닌 유도체, 벤토나이트, 당류, 식물유, 광물유, 합성 수용성 고분자 (예, 폴리(비닐알콜), 폴리(아크릴산) 등), 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜 등의 동결 방지제; 실리콘계 화합물 등의 소포제; 천연 다당류 (예, 잔탄검 등), 무기물 (예, 알루미늄 및 벤토나이트 등), 합성 수용성 고분자 (예, 폴리(아크릴산) 등) 등의 증점제 등을 들 수 있다.

제형물을 살충제, 살선충제, 살진드기제, 살진균제, 살균제, 제초제, 식물 생장 조절제, 전착제, 비료, 미생물 재료, 토양 개량제 등과 혼합하여 사용하거나, 또는 혼합하지 않고 동시에 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 식물 병해 방제에 있어서, 사용되는 페니바실러스 속 균주의 유효 성분의 적용량 (습윤량) 은, 통상 10 아르당 약 0.1g∼약 10000g 이며, 바람직하게는 약 10g∼약 1000g 이다. 수화제, 현탁제, 마이크로캡슐제 등을 물로 희석하여 사용하는 경우, 적용시의 세균 농도는 통상 약 10³CFU/㎖∼약 10¹¹CFU/㎖ 이고, 바람직하게는 약 10⁵CFU/㎖∼약 10⁹CFU/㎖ 이다. 과립제, 분제, 페이스트제 등은 전혀 희석하지 않고 상기 제형물 형태 그대로 적용할 수 있다.

페니바실러스 속 균주의 포자, 영양 균체 또는 전체 배양물을 사용하는 경우, 그 적용량은 10 아르당 약 0.1g∼약 10000g (습윤량) 이 바람직하다. 포자 또는 영양 균체를 물로 희석하여 사용하는 경우, 적용시의 그 농도는 약 10³∼ 약10¹⁰CFU/㎖ 이 바람직하다. 식물 병해 저항성 유도 물질의 적용량은, 10 아르당 약 0.001g∼10000g 이 바람직하다. 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 물로 희석한 후 사용할 경우, 적용시의 그 농도는 0.1∼1000㎍/㎖ 이 바람직하다.

본 발명의 식물 병해 방제에 있어서, 본 발명의 페니바실러스 속 균주 또는 식물 병해 저항성 유도 물질을 식물의 경엽(莖葉), 근권(根圈) 및/또는 종자에 적용하는 것이 바람직하다. 실제로 식물에 적용하기 위해서는, 예를 들어 통상 행해지는 입제를 주원 (株元) 또는 토양에 시용하는 방법, 희석액 혹은 희석하지 않은 액을 주원 또는 토양에 시용하는 방법 등이 있다. 그 밖에, 예를 들어 지상부 병해를 방제하는 방법과 동일한 산포법, 본 발명의 페니바실러스 속 균주 혹은 식물 병해 저항성 유도 물질을 고체 담체 및 바인더라 불리는 고착제 등과 혼합, 혹은 따로따로 식물의 종자에 코팅 혹은 침지 처리하는 방법, 또는 비료, 토양개량 자재, 배토 등과 혼합, 혹은 혼합하지 않고 동시에 시용하는 방법, 본 발명의 페니바실러스 속 균주 혹은 식물 병해 저항성 유도 물질을 고체 담체에 흡착시키고, 유기계 영양소 (쌀겨, 맥아 추출물, 아미노산 등), 비료 성분 등을 더 첨가하거나, 또는 첨가하지 않고 얻어지는 미생물 자재를 사용하는 방법 등을 사용할 수 있다.

이들의 적용량, 적용 농도는 모두, 제제의 종류, 적용 시기, 적용 장소, 적용 방법, 재배 방법, 작물의 종류, 식물 병해의 종류, 피해 정도 등의 상황에 따라 다르고, 상기의 범위와 관계없이 증가시키거나 감소할 수 있다.

이하, 본 발명의 식물 병해 방제에 대해, 세균의 분리예, 제조예, 제형예, 시험예, 배양예, 추출예, 정제예, 조제예 및 평가예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

세균의 분리예 1

신규 페니바실러스 종 BS -0048, 페니바실러스 종 BS -0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS -0105, 페니바실러스 종 BS - 0277 의 분리 및 동정

(1) 균주의 분리

일본 전국 각지의 재배 농장으로부터, 토마토, 가지, 피망, 오이, 멜론, 시금치, 딸기, 무, 장마 등의 근권 토양 및 뿌리를 채취했다. 이 근권 토양 혹은 뿌리 10g 을 멸균수 90㎖ 가 담긴 뚜껑 달린 유리병에 넣고 초음파 혹은 진탕 처리를 하였다. 이 현탁액을 적절하게 희석한 액 1㎖ 를 알부민 한천 배지 (계란알부민 0.25g, D-글루코오스 1g, 인산2칼륨 0.5g, 황산마그네슘 0.2g, 황산철 III 소량, 증류수 1L, pH 6.8∼7.0) 와 혼합 및 희석한 후 30℃ 에서 5∼10 일간 배양하였다. 이렇게 형성된 콜로니를 분리했다.

(2) 형태학적 및 생리- 성상학적 시험에 의한 균주의 동정

본원에서 예로든 균주는, 토마토 재배 토양, 장마 재배 토양, 유기 연용 토양 (organic successive application soil) 으로부터 분리된 미생물이고, 균주 코드 BS-0048 주, BS-0074 주, BS-0105 주, BS-0277 주로 명명했다. 하기 표 1 에 BS-0048 주, BS-0074 주, BS-0105 주, BS-0277 주의 형태학적 및 생리-성상학적 시험 결과를 나타낸다.

BS-0048 주 및 BS-0277 주는, B.폴리믹사와의 유사성이 가장 높았지만 V-P 반응성이 B.폴리믹사와 다르기 때문에 각각의 균주를 신종 균주로 판정했다. BS-0105 주는, B.폴리믹사 혹은 B. 마세란스(macerans) 와 유사하였으나, V-P 반응성과 카제인 이용성에 있어서 이들 균주와 달랐다. BiOLOG 동정 장치를 이용한 동정 결과에서는 BS-0105 균주가 B. 마세란스 및 B.폴리믹사와 일치했지만 B. 마세란스 및 B.폴리믹사와 유사성이 낮은 상이한 균주라는 점에서 BS-0105 균주를 신종 균주로 판정했다. BS-0074 주는, B.할로듀란스(halodurans) 와의 유사성이 약간 높지만, 이용성 면에서 BS-0074 주와 B.할로듀란스 간에 몇 가지 다른 점이 있기 때문에 신종 균주로 판정했다.

상기 형태학적 및 생리-성상학적 시험 결과, 토마토 재배 토양, 장마 재배 토양 또는 유기 연용 재배 토양으로부터 분리한 BS-0048 주, BS-0074 주, BS-0105 주 및 BS-0277 주는, 모두 바실러스 종으로 동정되었고, 다음과 같이 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (IPOD) 에 기탁되어 있다: BS-0048 주는 바실러스 종 BS-0048 (수탁일: 2004년 6월 18일; 수탁 번호: FERM P-20085) 로 기탁되었고, BS-0074 주는 바실러스 종 BS-0074 (수탁일: 2004년 6월 18일; 수탁 번호: FERM P-20086) 로 기탁되었고, BS-0105 주는 바실러스 종 BS-0105 (수탁일: 2004년년 6월 18일; 수탁 번호: FERM P-20087) 로 기탁되었고, BS-0277 주는 바실러스 종 BS-0277 (수탁일: 2004년 6월 18일; 수탁 번호: FERM P-20088) 로서 기탁되었다.

(3) 16S rDNA 염기서열 분석에 의한 동정

바실러스 종 BS-0105 주의 16S rDNA (16S rRNA 유전자) 의 염기서열 (약 1500bp) 을 결정하고, 세균 기준주 데이터베이스 및 GenBank/DDBJ/EMBL 에서 상기 염기서열의 상동성을 검색했다. 그 결과, 바실러스 종 BS-0105 주의 16S rDNA 염기서열은, 상동율 98.7% 로 페니바실러스 폴리믹사의 16S rDNA 와 가장 높은 상동성을 나타내었다. 분자계통도를 작성하여 분자계통 분석을 행한 결과, BS-0105 주는 P.폴리믹사와 근연일 가능성이 높다고 생각되었다. 또한, BS-0105 주와 P.폴리믹사의 기준주를, 하이브리드화를 이용한 DNA-DNA 상동치에 대해 비교한 결과, BS-0105 주가 기준주와 70% 이상의 상동율을 나타냄을 알았다.

이상으로부터, BioLOG 동정 장치를 이용한 동정 결과에서는 상동성이 낮았지만, 바실러스 종 BS-0105 주를 페니바실러스 폴리믹사로서 동정했다. 따라서, 바실러스 종 BS-0105 주를 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 라고 명명했다.

각 바실러스 종 BS-0048 주, BS-0074 주 및 BS-0277 주의 16S rDNA (16S rRNA 유전자) 의 부분 염기서열 (약 500bp) 을 결정하고, 세균 기준주 데이터베이스 및 GenBank/DDBJ/EMBL 에서 상기 염기서열의 상동성을 검색했다. 그 결과, 각 바실러스 종 BS-0048 주 및 BS-0277 주의 16S rDNA 염기서열은, 각각 상동율 98.5% 및 97.5% 로 페니바실러스 폴리믹사의 16S rDNA 에 대해 가장 높은 상동성을 나타냈다. 바실러스 종 BS-0074 주의 16S rDNA 염기서열은, 상동율 98.4% 로 페니바실러스 엘리지(eligii) 의 16S rDNA 에 대해 가장 높은 상동성을 나타냈다. 어느 데이터베이스에 대한 상동성 검색에 있어서도, 각 바실러스 종 BS-0048 주, BS-0074 주 및 BS-0277 주와 상동성이 높은 상위 30 균주의 16S rDNA 는 페니바실러스 유래의 것이었다. 분자계통도를 작성하여 분자계통 분석을 행한 결과, 바실러스 종 BS-0048 주 및 BS-0277 주는 P. 폴리믹사를 중심으로 하는 클러스터 내에 포함되고, 바실러스 종 BS-0048 주는, P. 엘리지와 동일한 계통 분지 (phylogenetic branch) 를 나타냈다.

상기 사실을 토대로, 바실러스 종 BS-0048 주, 바실러스 종 BS-0074 주 및 바실러스 종 BS-0277 주는, 페니바실러스 속 균주로서 동정되었다. 따라서, 각각 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074 및 페니바실러스 종 BS-0277 로 명명되었다.

상기의 새로운 명명에 따라, 일본 305-8566 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6 IPOD (독립행정법인) 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (IPOD) 에 기탁되어 있는 균주의 명칭을 새로운 명칭으로 변경하였고, 이들 균주의 국내 기탁을 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관했다. 그 결과, BS-0048 주, BS-0074 주, BS-0105 주 및 BS-0277 주는 다음과 같이 일본 305-8566 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제 6 IPOD (독립행정법인) 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 (IPOD) 에 기탁되었다: BS-0048 주는 페니바실러스 종 BS-0048 로 기탁되었고 (이관일: 2005년 7월 22일 (22.07.2005); 수탁 번호: IPOD FERM BP-10377), BS-0074 주는 페니바실러스 종 BS-0074 로 기탁되었고 (이관일: 2005년 7월 22일 (22.07.2005); 수탁 번호: IPOD FERM BP-10378), BS-0105 주는 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 로 기탁되었고 (이관일: 2005년 7월 22일 (22.07.2005); 수탁 번호: IPOD FERM BP-10379), BS-0277 주는 페니바실러스 종 BS-0277 로 기탁되었다 (이관일: 2005년 7월 22일 (22.07.2005); 수탁 번호: IPOD FERM BP-10380).

제조예 1

페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS- 0277 의 배양

본 발명의 균주 BS-0048, BS-0074, BS-0105 및 BS-0277 각각의 보존균 1 백금루프를 10㎖ YPMG 배지 (D-글루코오스 10g, 육 추출물 1g, 효모 추출물 3g, 펩톤 5g, 증류수 1L, pH 7.0) 를 포함하는 50㎖ 시험관내에 식균한 후, 진폭수 100 진폭/분, 25℃ 의 암흑하에서 3 일간 배양했다. 상기 전(前)배양에 의해 얻어진 각 균주 BS-0048, BS-0105 및 BS-0277 배양물 0.1㎖ 를 10㎖ 의 배지 (D-글루코오스 20g, 가용성 전분 10g, 펩톤 10g, 효모 추출물 10g, 맥아 추출물 10g, 대두분 15g, 증류수 1L) 를 포함하는 100㎖ Erlenmeyer 플라스크 내에 식균하였다. 한편, 균주 BS-0074 배양물 0.1㎖ 는 10㎖ 의 YPMG 배지를 포함하는 100㎖ Erlenmeyer 플라스크 내에 식균하였다. 이어서, 상기 배양물 모두를 회전수 200rpm 및 25℃ 의 조건에서 4 일간 배양했다.

제조예 2

페니바실러스 폴리믹사 BS - 0105 의 배양

본 발명의 균주 BS-0105 보존균의 1 백금루프를 100㎖ 의 YPMG 배지를 포함하는 250㎖ Erlenmeyer 플라스크 내에 식균한 후, 진폭수 100 진폭/분 및 30℃ 의 암흑에서 7 일간 배양했다.

제조예 3

페니바실러스 폴리믹사 BS- 0105 의 전체 배양물의 제조

제조예 1 에 의해 얻어진 균주 BS-0105 의 전체 배양물의 약 1L 를 1500rpm 에서 5 분간 원심분리하여 배지 유래의 오염물을 제거한 후, 상청액을 8000rpm 에서 20 분간 원심분리하여 균체를 침전시켰다. 0.8% 생리식염수로 침전물을 세정하고 다시 8000rpm 에서 20 분간 원심분리했다. 이 조작을 2 회 반복하여 균체 침전물을 얻었다.

제조예 4

페니바실러스 폴리믹사 BS- 0105 의 동결 건조 균체 (포자) 분말의 제조

상기 제조예 3 의 배양물 300㎖ 로부터 얻어진 세정 균체 침전물을 증류수 50㎖ 에 현탁하고, 수득된 현탁액을 동결 건조기에 넣어 8.8×10⁹CFU/g 양의 균체를 함유한 동결 건조 균체 (포자) 분말 2.13g 을 얻었다.

제조예 5

상기 제조예 3 과 동일한 배양물 300㎖ 로부터 얻어진 세정 균체 침전물을 20% 탈지우유 50㎖ 에 현탁하고, 수득된 현탁액을 동결 건조기에 넣어 3.5×10⁹CFU/g 양의 균체를 함유한 동결 건조 균체 (포자) 분말 11.08g 을 얻었다.

제조예 6

상기 제조예 3 과 동일한 배양물 300㎖ 로부터 얻어진 세정 균체 침전물을 5% 황산암모늄 용액 50㎖ 에 현탁하고, 수득된 현탁액을 동결 건조기에 넣어 4.3×10⁹CFU/g 양의 균체를 함유한 동결 건조 균체 (포자) 분말 4.67g 을 얻었다.

제조예 7

페니바실러스 폴리믹사 BS- 0105 의 전체 배양물 분말의 제조

제조예 2 에 의해 얻어진 전체 배양물 100㎖ 를 동결 건조하여, 4.1×10⁹CFU/g 양의 균체를 함유한 전체 배양물 분말 3.56g 을 얻었다.

다음으로 제형예를 나타낸다. "부"는 중량부를 나타낸다.

제형예 1

수화제의 제조

제조예 4, 5, 6 및 7 에 의해 각각 수득된 약 60 부 (건조 중량) 의 본 발명 세균을 20 부의 대두분, 10 부의 펩톤, 10 부의 D-글루코오스와 혼합하여 균체 함유 수화제를 얻었다.

제형예 2

수화제의 제조

제조예 4 및 5 에 의해 각각 수득된 약 80 부 (건조 중량) 의 본 발명 세균을 20 부의 대두분과 혼합하여 균체 함유 수화제를 얻었다.

제형예 3

배양 재료의 제조

본 발명의 균주 BS-0105 의 보존균 1 백금루프를 50㎖ 의 YPMG 배지를 포함하는 250㎖ Erlenmeyer 플라스크에 식균한 후, 진폭수 100 진폭/분 및 30℃ 에서 6 일간 배양했다. 다음으로, 제올라이트 및 대두분을 9 : 1 의 비율로 혼합하고, 그 혼합물 200g 을 마요네즈병에 넣은 후 물 50㎖ 를 첨가하고, 수득된 혼합물을 121℃ 에서 30 분간 멸균했다. 이렇게 수득된 재료에 상기 전배양에 의해 얻어진 배양물 1㎖ 를 첨가하고, 30℃ 에서 10 일간 배양하여 10⁹CFU/g 양의 BS-0105 균체를 함유한 배양 재료를 얻었다.

본 발명의 식물 병해 방제 방법이, 식물 병해에 대해 방제 효과가 있다는 것을 하기 시험예에 의해 증명한다.

시험예 1

각 균주 배양물의 오이 탄저병 방제 효과 시험

각 플라스틱 포트에 원예용 배토를 채우고, 오이 (품종: Suyo) 를 파종하여 온실내에서 20 일간 길렀다. 제 1 본잎이 전개된 오이 유묘 (幼苗) 의 자엽에 제조예 1 의 방법으로 제조한 각 균주 BS-0048, BS-0074, BS-0105 및 BS-0277 의 전체 배양물의 0.1㎖ 를 도포했다. 상기 포트를 3 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 둔 후, 증류수 중의 오이 탄저병균 분생 포자 현탁액 (Colletotrichum orbiculare, 1×10⁶ 포자/㎖) 을 식물체에 산포 접종했다. 상기 포트를 25℃ 암흑의 습실에 24 시간 유지한 후, 7 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 두어 발병시켰다. 각 묘목의 제 1 본잎의 병반수를 계측하고, 상기 병반수로부터 방제 수치를 하기 식에 의해 계산하여 방제 효과를 비교했다. 결과를 표 2 에 나타냈다.

방제 수치 = {1-(처리구의 병반수/미처리구의 병반수)}×100

각 균주 배양물의 오이 탄저병 방제 효과 시험

균주 No.	병반수	방제 수치
BS-0048 주	39.5	74.3
BS-0074 주	31.5	79.5
BS-0105 주	31.5	79.5
BS-0277 주	38.5	74.9
아시벤졸라-S-메틸 20ppm	5	96.7
미처리	153.5	-

표 2 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 각 세균 배양물을 자엽에 처리한 경우, 공지의 방제제인 아시벤졸라-S-메틸과 마찬가지로 제 1 본잎의 감염을 현저하게 억제했다.

시험예 2

정제 포자의 오이 탄저병 방제 효과 시험

각 플라스틱 포트에 원예용 배토를 채우고, 오이 (품종: Suyo) 를 파종하여 온실내에서 20 일간 길렀다. 제 2 본잎이 전개된 오이의 유묘에, 제조예 4, 5, 6 및 7 의 각 방법으로 제조한 본 발명의 세균을, 제형예 1 의 방법에 의해 제형화함으로써 수득된 균주 BS-0105 의 포자 제조 샘플을 2×10⁷CFU/㎖ 의 균체 비율로 경엽에 적용처리하였다. 포트를 25℃의 암흑 습실에 24 시간 유지한 후, 4 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 둔 다음, 증류수 중의 오이 탄저병균 분생 포자 현탁액 (Colletotrichum orbiculare, 1×10⁶ 포자/㎖) 을 식물체에 산포 접종했다. 25℃ 의 암흑 습실에 24 시간 유지한 후, 7 일간 25℃ 의 유리하우스 내에 두어 발병시켰다. 각 잎의 병반수를 계측하고, 그 병반수로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과를 표 3 에 나타냈다.

방제 수치 = {1-(처리구의 병반수/미처리구의 병반수)}×100

표 3 에 있어서, 동일한 알파벳은 유의차 없음을 나타냄 (유의 수준: 0.05).

표 3 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균을 주성분으로 하는 제제는 모두, 공지의 방제제인 Impression 수화제 및 아시벤졸라-S-메틸에 비해, 동등 내지 더 우수한 방제 효과를 나타냈다.

시험예 3

정제 포자의 오이 반점세균병 방제 효과 시험

각 플라스틱 포트에 원예용 배토를 채우고, 오이 (품종: Suyo) 를 파종하여 온실내에서 20 일간 길렀다. 제 2 본잎이 전개된 오이의 유묘에, 제조예 5 의 방법으로 제조한 본 발명의 세균을 제형예 1 의 방법으로 제형화하여 수득된 균주 BS-0105 의 포자 제조 샘플을 2×10⁷CFU/㎖ 의 균체 비율로 경엽 적용처리하였다. 상기 포트를 25℃ 암흑 습실에 24 시간 유지한 후, 4 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 둔 다음, 증류수 중의 오이 반점세균병 세균 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 의 현탁액 (1×10⁸CFU/㎖) 을 식물체에 산포 접종했다. 포트를 25℃ 암흑의 습실에 24 시간 유지한 후, 7 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 두어 발병시켰다. 각 묘목의 제 2 본잎의 병반수를 계측하고, 그 병반수로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과를 표 4 에 나타냈다.

방제 수치 = {1-(처리구의 병반수/미처리구의 병반수)}×100

표 4 : BS-0105 주의 오이 반점세균병 방제 효과

처리구	1엽당 병반수	방제 수치
BS-0105 균주 균체 2×10⁷CFU/㎖	2.2b	92.6
Impression 수화제 2×10⁷CFU/㎖	50a	0
아시벤졸라-S-메틸 20ppm	0b	100
미처리	29.3a	-

표 4 에 있어서 동일한 알파벳은 유의차 없음을 나타냄 (유의 수준: 0.05).

표 4 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균을 주성분으로 하는 제제는, 공지의 방제제인 임프레션 수화제 및 아시벤졸라-S-메틸에 비해 동등 내지 더 우수한 방제 효과를 나타냈다.

시험예 4

정제 포자의 딸기 탄저병 방제 효과 시험

플라스틱 포트에서 재배된, 10 장 정도의 소엽이 전개된 딸기 모종 (품종: Akihime) 에, 제조예 5 의 방법으로 제조된 본 발명의 세균을 제형예 2 의 방법으로 제형화하여 수득된 균주 BS-0105 의 포자 제조 샘플을 2×10⁷CFU/㎖ 의 균체 비율로 경엽 적용처리하였다. 상기 포트를 25℃ 암흑의 습실에 24 시간 유지한 후, 3 일간 (Amister 20 flowable 의 경우는 1 일간) 25℃ 의 유리 하우스내에 둔 다음, 증류수 중의 딸기 탄저병 분생 포자 현탁액 (Glomrella cigulata, 2×10⁶ 포자/㎖) 을 식물체에 산포 접종했다. 포트를 25℃ 암흑의 습실에서 24 시간 유지한 후, 14 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 두어 발병시켰다. 하기 식으로부터 발병도를 구하고 그 발병도 값으로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과는 표 5 에 나타냈다.

발병도 = (Σ발병지수×해당 묘목 수/4×조사 묘목 수)×100

발병지수 0: 감염 없음; 발병지수 1: 소엽에 소반점이 약간 보임; 발병지수 2: 경엽부에 소반점이 다수 보임; 발병지수 3: 경엽부에 눈에 띄는 대형 병반이 있음; 발병지수 4: 시들어 고사함

방제 수치 = {1-(처리구의 발병도/미처리구의 발병도)}×100

표 5 : BS-0105 주의 딸기 탄저병 방제 효과

처리구	발병도	방제 수치
BS-0105 균주 균체 2×10⁷CFU/㎖	1.6b	97.9
Amister-20 flowable 100ppm	3.1b	95.8
아시벤졸라-S-메틸 20ppm	10.9b	85.1
미처리	73.4a	-

표 5 에 있어서 동일한 알파벳은 유의차 없음을 나타냄 (유의 수준: 0.05).

표 5 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균을 주성분으로 하는 제제는, 공지의 방제제인 Amister-20 flowable 및 아시벤졸라-S-메틸에 비해 낮은 발병도 및 더 높은 방제 효과를 나타냈다.

시험예 5

배양액에 의한 멜론 반점세균병 방제 효과 시험

Aisai 1호 (Katakura Chikkarin Co., Ltd. 제조) 를 각 육묘 트레이에 채우고, 멜론 (품종: Arles) 모종을 각 트레이에서 길렀다. 이 때, 제조예 2 에서 제조한 균주 BS-0105 배양액 10㎖ (10⁸ 포자/㎖) 를 넣은 페트리 디쉬에 멜론 종자를 침지시키고 30℃ 에서 2 시간 동안 세균첨가처리(bacterization)함으로써 종자 처리구를 형성했다. 자엽이 전개된 후, Aisai 1호로 채운 12㎝ 폴리에틸렌 포트에 모종을 심었다. 본잎 3 장이 완전하게 전개되었을 때, 다음과 같은 구를 제조하였다: 제조예 2 에서 제조된 균주 BS-0105 배양액 1㎖ (10⁸포자/㎖) 를 각각 관주(drench) 또는 엽면 산포 처리한 구, 및 아시벤졸라-S-메틸의 2ppm 용액 2㎖ 를 엽면 산포 처리한 구. 병원균 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 의 접종은, 처리 5 일 후에, 미리 감자 반합성 배지 (감자 300g 과 증류수 1L 를 달인 액, 질산칼슘 4 수화물 0.5g, 인산수소 2나트륨 12수화물 2g, 펩톤 5g, 자당 20g, 분말 한천 15g) 에서 배양한 반점세균병 균을 함유한 액을 잎의 이면이 주로 처리되도록 각 잎 전체에 산포 접종했다. 감염 조사는 병원균 접종 8 일후에 제 2 엽 내지 제 4 엽 각각의 병반수를 계수하여 행하였다. 상기 병반수로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과는 표 6 에 나타냈다.

방제 수치 = {1-(처리구의 병반수/미처리구의 병반수)}×100

표 6 : BS-0105 주의 멜론 반점세균병 방제 효과

처리구	방제 수치
처리구	제2엽 제3엽 제4엽	평균
BS-0105 균 종자처리	28.0 65.3 59.5	50.9
BS-0105 균 엽처리	100.0 53.1 -	51.0
BS-0105 균 관주처리	100.0 81.3 88.9	90.0
아시벤졸라-S-메틸 2ppm	100.0 68.8 66.7	78.5

표 6 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 상술한 배양물로 임의의 종자, 엽면 산포 및 관주 처리를 수행한 경우, 본 발명의 세균 배양물이 공지의 방제제인 아시벤졸라-S-메틸에 비해 동등 내지 더 우수한 방제 효과를 나타냈다.

시험예 6

배양액에 의한 메론 덩굴쪼김병 방제 효과 시험

Aisai 1호를 각 육묘 트레이에 채우고, 멜론 (품종 : Prince) 묘목을 각 트레이에서 길렀다. 이 때, 제조예 2 에서 제조된 균주 BS-0105 배양액 10㎖ (10⁸포자/㎖) 를 넣은 페트리 디쉬에 멜론 종자를 침지시킨 후 30℃ 에서 2 시간 세균첨가처리하였다. 자엽이 전개된 후, 덩굴쪼김병 (Fusarium oxysporum f. sp. melonis) 의 병토를 채운 10.5㎝ 폴리에틸렌 포트에 상기 묘목을 심은 후, 제조예 2 에서 제조된 바실러스 종 BS-0105 배양액을 1㎖/포트 (10⁸포자/㎖) 의 비율로 관주했다. 벤레이트 수화제의 경우, 수화제의 1000 배 희석액 (농도 500ppm) 2㎖ 로 관주 처리했다. 하기 식으로부터 발병도를 계산하고, 발병도 값으로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과는 표 7 에 나타냈다.

발병도 = (Σ발병지수×묘목 수/4×묘목 수)×100

발병지수 : 0 (건강), 1 (경증), 2 (중등도), 3 (중증) 및 4 (고사) 의 0 ~ 4 단계로 평가함

방제 수치 = {1-(각 처리구의 발병도/미처리구의 발병도)}×100

표 7 : BS-0105 주의 멜론 덩굴쪼김병 방제 효과

처리구	감염된 묘목의 백분율	발병도	방제 수치
BS-0105 균주 + 관주	40	25	61.5
벤레이트 수화제 500ppm	20	5	92.3
미처리	80	65	-

표 7 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균 배양물을 종자 및 관주 처리에 사용한 경우, 공지의 방제제인 벤레이트 수화제와 동등한 방제 효과를 나타냈다.

페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 또는 페니바실러스 종 BS-0277 의 배양물로부터 화합물 1 (푸사리시딘 A) 및 화합물 2 (푸사리시딘 B) 를 얻는 방법으로서, 하기 예를 들 수 있다.

배양예 1

페니바실러스 폴리믹사 BS - 0105 의 배양

본 발명의 균주 BS-0105 보존균의 1 백금루프를 10㎖ 의 YPMG 배지 (D-글루코오스 10g, 육 추출물 1g, 효모 추출물 3g, 펩톤 5g, 증류수 1L, pH 7.0) 를 포함하는 100㎖ Erlenmeyer 플라스크에 식균한 후, 회전수 200rpm 및 25℃ 의 암흑에서 3 일간 배양했다. 상기 기술한 전배양에 의해 얻어진 배양물 0.5㎖ 를 10㎖ 의 생산 배지 (D-글루코오스 20g, 대두분 10g, 옥수수 침지액 5g, 글리세롤 2.5g, 옥수수전분 2.5g, 효모 추출물 1g, NaCl 1g, CaCO₃ 1g, 증류수 1L, pH 7.0) 를 포함하는 100㎖ Erlenmeyer 플라스크 내에 식균한 후, 회전수 200rpm 및 25℃ 에서 4 일간 진탕 배양했다.

추출예 1

페니바실러스 폴리믹사 BS - 0105 의 배양액으로부터의 추출

300㎖ 의 배양액을 동일 용량의 부탄올로 하룻밤 진탕 추출한 후, 얻어진 부탄올 추출액을 회전식 증발기로 농축했다. 추출물을 아세트산에틸/증류수로 추출한 후, 수층을 부탄올/증류수로 추출하였다. 부탄올층을 회수한 다음 농축 건조시켰다.

정제예 1

화합물 1 ( 푸사리시딘 A) 및 화합물 2 ( 푸사리시딘 B) 의 혼합물의 정제

조추출물을 4㎖ 의 디메틸술폭시드에 용해하고 HPLC 로써 정제했다. HPLC 조건은 다음과 같다. 즉, 이동상으로서 아세토니트릴-0.1%(v/v) TFA (35 : 65) 및 칼럼으로서 Senshu Pak PEGASIL ODS2 20×250㎜ 를 사용하고, 하기 조건 하에 HPLC 분리를 수행하였다: 1 회의 주입량 0.1㎖, 칼럼 온도 40℃ 및 유속 9㎖/분. 23 분의 체류 시간에 성분을 회수한 다음 농축 건조시켜서, 화합물 1 및 화합물 2 를 3 : 2 의 비율로 함유하는 혼합물을 60.7㎎ 얻었다.

화합물 1 ( 푸사리시딘 A) 및 화합물 2 ( 푸사리시딘 B) 의 동정

화합물 1 과 화합물 2 를 3 : 2 의 비율로 함유하는 혼합물을 DMSO-d₆ 에 용해시키고 ¹³C-NMR 측정을 행하였다. 그 결과, 상기 수득된 ¹³C-NMR 측정치는 비특허문헌 4 및 5 에 기재된 푸사리시딘 A 와 푸사리시딘 B 의 것과 일치하는 것으로 나타났다. 표 8 에, 화합물 1 (푸사리시딘 A) 과 화합물 2 (푸사리시딘 B) 의 화학적 이동 데이터를 나타냈다.

정제예 2

페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074 및 페니바실러스 종 BS-0277 로부터 화합물 1 ( 푸사리시딘 A) 과 화합물 2 ( 푸사리시딘 B) 의 생성

균주 BS-0048, BS-0074, BS-0105 및 BS-0277 을 상기 배양예 1 에 따라 배양했다. 이렇게 수득된 10㎖ 의 각 균주 배양액을 동일 용량의 부탄올로 하룻밤 진탕하여 추출한 후, 얻어진 부탄올 추출액을 회전식 증발기로 농축했다. 추출물을 1㎖ 의 디메틸술폭시드에 용해한 후, LC/MS 분석을 행하였다 (LC 및 MS 분석 장치는 NANOSPACE SI-2 (Shiseido) 및 FINIGAN LCQ^DUO (Thermo Quest)). HPLC 분석 조건은, 이동상으로서 0.1% TFA (트리플루오로아세트산) 함유 27% 아세토니트릴 수용액 및 칼럼으로서 CAPCELL PAK C₁₈ UG120 3㎛ 2.0×100㎜ (Shiseido) 를 사용하였고, 1 회의 주입량 3㎕, 칼럼 온도 40℃ 및 유속 0.2㎖/분으로 분리를 수행한 다음, 하기 조건에서 분자량 측정을 행하였다. 즉, 모세관 온도 245℃, 모세관 전압 10V, 시스 가스 유량 95 arb, 보조 가스 유량 10 arb, 스프레이 전압 5kV 및 전자 증폭 전압 700V 의 조건에서 측정을 행하였다. 그 결과, 임의의 균주 BS-0048, BS-0074, BS-0105 및 BS-0277 의 배양 추출물에 있어서, 체류 시간 18.5 분에 분자량 883(M+H)⁺에 해당하는 분자 이온 피크 및 체류 시간 17.8 분에 분자량 897(M+H)⁺에 해당하는 분자 이온 피크가 검출되었다. 또한, 정제예 1 에 기재된 화합물 1 과 화합물 2 의 혼합물의 경우에서도, 상기와 동일한 체류 시간에 각각 동일한 분자 이온 피크가 검출되었다. 이들 결과와 상기 ¹³C-NMR 측정의 결과로부터, 체류 시간 18.5 분에 검출된 물질은 푸사리시딘 A 이고, 체류 시간 17.8 분에 검출된 물질은 푸사리시딘 B 인 것이 확인되었다.

조제예 1

용액제의 조제

화합물 1 과 화합물 2 의 3 : 2 비율 혼합물을 디메틸술폭시드로 용해한 후, 수득한 용액을 증류수로 목적한 농도로 희석했다.

평가예 1

식물 병해 저항성 유도 활성의 평가

Siegrist, J. 등 (Physiological and Molecular Plant Patho1ogy 53, 223-238: 1998) 은, 식물 병해 저항성 유도 활성을 조사하는 모델 실험계로서, 파슬리 배양 세포의 유도체(elicitor) 반응성을 파이토알렉신 형광 검출에 의해 측정하는 방법을 이용하여, 식물 병해 저항성 유도 물질인 아시벤졸라-S-메틸에 의한 유도체 반응성의 향상을 밝혀냈다. 본 발명의 화합물 1 과 화합물 2 의 식물 병해 저항성 유도 활성 또한 Siegrist, J. 등의 방법에 따라 평가하였다. 그 결과를 표 9 에 나타냈다.

표 9 : 파이토알렉신 검출 결과

유도체 처리	화합물 처리구	농도(μM)	상대 형광값
있음	화합물1+화합물2 (3:2)	0.1+0.07	995.1
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	754.3
	미처리-1	-	409.8
없음	화합물1+화합물2 (3:2)	0.1+0.07	104.6
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	NT
	미처리-2	-	87.5

NT : 미처리

표 9 의 결과로부터, 화합물 1 과 화합물 2 는, 기존의 식물 병해 저항성 유도 활성 물질과 마찬가지로 파슬리 배양 세포의 유도체 반응성을 향상시키고, 따라서 식물 병해 저항성 유도 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

평가예 2

오이 반점세균병 세균에 대한 항균 활성 시험

화합물 1 및 화합물 2 가 오이 반점세균병 세균 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 에 대해 직접 항균 활성을 나타내는지를 조사했다. 즉, 45℃ 로 유지한 감자 반합성 배지 (감자 300g 및 증류수 1L 를 달인 액, 질산칼슘 4수화물 0.5g, 인산수소 2나트륨 12수화물 2g, 펩톤 5g, 자당 20g, 분말 한천 15g) 에 오이 반점세균병 세균을 1×10⁸CFU/㎖ 의 비율로 혼합하고, 수득한 혼합물을 20㎖ 씩 분취하여 멸균 페트리 디쉬에 나눠 부었다. 배지를 고화시킨 후, 화합물 1 및 2 의 3 : 2 혼합물을 디메틸술폭시드에 100㎍/㎖ 농도로 용해하여 수득한 용액 50㎕ 를 직경 8㎜ 페이퍼디스크에 스며들게 한 후 그 페이퍼디스크를 배지 위에 정치시켰다. 25℃ 의 암흑 하에서 48 시간 배양한 후에 페이퍼디스크 둘레의 저지원(inhibition zone)의 유무로 활성을 평가했다. 그 결과를 표 10 에 나타냈다.

표 10 : 오이 반점세균병 세균에 대한 직접 항균 활성

화합물 처리구	농도 (ppm)	저지원의 유무
화합물1+화합물2 (3:2)	60+40	없음
디메틸술폭시드	-	없음

표 10 의 결과로부터, 화합물 1 과 화합물 2 는, 오이 반점세균병 세균에 직접 항균 활성을 나타내지 않는다는 것이 밝혀졌다.

평가예 3

오이 반점세균병 방제 효과 시험

각 플라스틱 포트에 원예용 배토를 채우고 오이 (품종 : Suyo) 를 파종한 후 온실 내에서 20 일간 길렀다. 제 2 본잎이 전개된 오이의 유묘에, 상기 조제예에 의해 얻어진 제제를 1 모종 당 5㎖ 의 비율로 주원 관주 처리 (plant foot drench treatment) 했다. 상기 포트를 25℃ 유리 하우스내에 3 일간 둔 후, 증류수 중의 오이 반점세균병 세균 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) 의 현탁액 (1×10⁸CFU/㎖) 을 식물체에 산포 접종했다. 포트를 25℃ 암흑 습실에 24 시간 유지한 후, 7 일간 25℃ 의 유리 하우스내에 두어 발병시켰다. 각 잎의 병반수를 계측하고, 그 병반수로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과를 표 11 에 나타냈다.

방제 수치 = {1-(처리구의 병반수/미처리구의 병반수)}×100

표 11 : 화합물 1 및 화합물 2 의 오이 반점세균병 방제 효과

처리구	농도(ppm)	1엽당 병반수	방제 수치
화합물1+화합물2 (3:2)	12+8	223.8b	65.5
화합물1+화합물2 (3:2)	60+40	293b	54.9
아시벤졸라-S-메틸	20	137.8b	78.8
미처리	-	649.7a	-

표 11 에 있어서 동일한 알파벳은 유의차 없음을 나타냄 (유의 수준: 0.05).

표 11 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1 및 화합물 2 를 주성분으로 하는 제제는, 상기 제제가 직접 항균 활성을 나타내지 않는 오이 반점세균병에 대해 뛰어난 방제 효과를 나타냈다.

평가예 4

오이 덩굴쪼김병균에 대한 항균 활성 시험

화합물 1 및 화합물 2 가 오이 덩굴쪼김병균 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium) 에 대해 직접 항균 활성을 나타내는지를 검토했다. 즉, 45℃ 로 유지된 감자ㆍ덱스트로스 한천 배지 (Nissui Pharmaceutical) 에 오이 덩굴쪼김병균의 분생 포자를 1×10⁷ 포자/㎖ 의 비율로 혼합하고, 수득된 혼합물을 20㎖ 씩 멸균 페트리 디쉬에 나누어 부었다. 배지를 고화시킨 후, 화합물 1 및 2 의 3:2 혼합물을 디메틸술폭시드에 각각 소정의 농도로 용해하여 수득한 용액 50㎕ 를 직경 8㎜ 페이퍼디스크에 스며들게 한 후, 상기 페이퍼디스크를 배지 위에 정치시켰다. 25℃ 암흑 하에서 48 시간 배양한 후에 페이퍼디스크 둘레의 저지원의 유무로 활성을 평가했다. 그 결과를 표 12 에 나타냈다.

표 12 : 오이 덩굴쪼김병균에 대한 직접 항균 활성

처리구	농도 (ppm)
	12+8	30+20
화합물1+화합물2 (3:2)	-	-
미처리	-

+ : 명료한 저지원 있음, - : 저지원 없음

표 12 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 화합물 1 과 화합물 2 의 3:2 혼합물은, 그 농도가 각각 30ppm 및 20ppm 이 되도록 하는 혼합에서도 오이 덩굴쪼김병균 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium) 에 대해 항균 활성을 나타내지 않았다.

평가예 5

오이 덩굴쪼김병 방제 효과 시험

각 플라스틱 통에 원예용 배토를 채우고, 오이 (품종 : Sagamihanjiro) 를 파종하여 온실 내에서 12 일간 길렀다. 자엽이 전개된 오이의 유묘에, 상기 조제예에 의해 얻어진 제제를 1 모종 당 1㎖ 의 비율로 엽면 산포 처리를 행하였다. 상기 통을 25℃ 유리 하우스 내에 3 일간 둔 후, 증류수 중의 오이 덩굴쪼김병균 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium) 의 분생 포자 현탁액 (3×10⁷포자/㎖) 을 각 식물체의 주원에 2㎖ 씩 관주 접종했다. 상기 통을 14 일간 25℃ 의 유리 하우스 내에 두어 발병시켰다. 발병도를 감염의 정도로부터 계산한 후, 발병도 값으로부터 하기 식에 의해 방제 수치를 계산하여 방제 효과를 비교했다. 그 결과를 표 13 에 나타냈다.

발병도 = (Σ발병지수×해당 모종 수/4×조사 모종 수)×100

발병지수 0 : 감염 없음; 발병지수 1 : 땅 근접 부위에 약간 황화; 발병지수 2 : 땅 근접 부위에 눈에 띄는 갈변; 발병지수 3 : 줄기에 상당히 눈에 띄는 갈변과 지상부 생육 불량; 발병지수 4 : 식물체의 치유 불가능한 시들음 및 고사

방제 수치 = {1-(처리구의 발병도/미처리구의 발병도)}×100

표 13 : 오이 덩굴쪼김병 방제 효과

처리구	농도(ppm)	처리방법	발병도	방제 수치
화합물1+화합물2 (3:2)	12+8	산포	11.5b	70.2
아시벤졸라-S-메틸	20	산포	9.4b	75.6
벤레이트 수화제	200	주원 관주	15.6b	59.4
미처리/균 접종		-	38.5a	-
미처리/균 접종 없음		-	0	-

표 13 에 있어서 동일한 알파벳은 유의차 없음을 나타냄 (유의 수준: 0.05).

표 13 의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1 과 화합물 2 를 주성분으로 하는 제제는, 지상부 산포 처리에 의해 토양 병해인 오이 덩굴쪼김병을 방제했다. 상기 제제가 직접 항균 활성을 나타내지 않는 농도인, 화합물 1 및 화합물 2 각각 12ppm 및 8ppm 농도의 혼합물을 이용한 처리에 있어서 상기 제제는 뛰어난 방제 효과를 나타냈다.

정제예 3

화합물 1 ( 푸사리시딘 A) 및 화합물 2 ( 푸사리시딘 B) 의 분리 및 정제

화합물 1 과 화합물 2 의 혼합물 133.7㎎ 을 3㎖ 의 디메틸술폭시드에 용해하고, HPLC 를 사용하여 이것을 정제했다. HPLC 조건은 다음과 같다. 즉, 이동상으로서 아세토니트릴-0.1%(v/v) TFA (29:71) 및 칼럼으로서 Shiseido CAPCELL PAK C₁₈ SG120 5㎛ 4.6×250㎜ 를 사용하고, 하기 조건 하에 HPLC 분리를 행하였다: 1 회의 주입량 0.25㎖, 칼럼 온도 40℃, 및 유속 1㎖/분. 체류 시간 20 분부터 35 분까지의 용출액을 30 초 간격으로 회수하고, 각 분획을 LC/MS 로 분석했다. HPLC 분석 조건은 다음과 같았다. 즉, 이동상으로서 TFA (0.1%) 함유 아세토니트릴-0.1%(v/v)TFA (27:73) 및 칼럼으로서 Shiseido CAPCELL PAK C₁₈ UG120 3㎛ 2.0×100mm 를 사용하고, 1 회의 주입량 0.01㎖, 칼럼 온도 40℃, 및 유속 0.2㎖/분으로 분리를 수행한 후, 하기 조건에서 분자량 측정을 행하였다. 즉, 모세관 온도 245℃, 모세관 전압 10V, 시스 가스 유량 95arb, 보조 가스 유량 10arb, 스프레이 전압 5kV 및 전자 증폭 전압 700 V 의 조건에서 측정을 행하였다.

화합물 1 을 함유한 분획을 합하여 농축 건조한 결과, 화합물 1 을 44.7㎎ 얻었다. 화합물 2 를 함유한 분획을 합하여 농축 건조한 결과, 화합물 2 를 24.8㎎ 얻었다.

평가예 6

화합물 1 및 화합물 2 각각의 식물 병해 저항성 유도 활성의 평가

평가예 1 에서 실시한 방법, 즉 파슬리 배양 세포의 유도체 반응성을 파이토알렉신 형광 검출에 의해 측정하는 방법을 이용하여, 평가예 1 과 동일한 방식으로 화합물 1 및 화합물 2 각각의 식물 병해 저항성 유도 활성을 평가했다. 그 결과를 표 14 에 나타냈다.

표 14 : 파이토알렉신 검출 결과

유도체 처리	화합물 처리구	농도(μM)	상대 형광값
있음	화합물1	0.5	1000
	화합물2	0.5	1000
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	664.8
	미처리-1	-	366.2
없음	화합물1	0.5	98.5
	화합물2	0.5	100.7
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	86.9
	미처리-2	-	84.7

표 14 의 결과로부터, 화합물 1 및 화합물 2 각각은, 기존의 식물 병해 저항성 유도 활성 물질과 동일하게 파슬리 배양 세포의 유도체 반응성을 향상시키고, 따라서 식물 병해 저항성 유도 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

배양예 2

페니바실러스 폴리믹사 BS - 0105 의 배양

본 발명의 균주 BS-0105 의 동결 보존된 균체 현탁액 100 ㎕ 을 100㎖ 의 YPMG 배지 (D-글루코오스 10g, 육 추출물 1g, 효모 추출물 3g, 펩톤 5g, 증류수 1L, pH 7.0) 를 포함하는 400㎖ 플라스크에 식균한 후, 회전수 210rpm 및 25℃ 에서 1 일간 배양했다. 상기 기술한 전배양에 의해 얻어진 배양물 200㎖ 를 20L 의 생산 배지 (D―글루코오스 200g, 전분 600g, 황산암모늄 50g, 대두분 50g, 인산 2수소칼륨 10g, 염화나트륨 5g, 황산마그네슘 5g, 탄산칼슘 120g) 를 포함하는 단지 발효기에 옮겨서 식균한 후, 회전수 400rpm, 25℃ 에서 통기량 10L/분 으로 3 일간 배양했다.

추출예 2

화합물 3 및 화합물 4 의 추출

상기 배양예 2 에서 얻어진 배양액 5L 에, 이소프로필알콜 5L 및 1몰/L 염화칼슘 1L 를 첨가하고, 수득한 혼합물을 여과하여 약 10L 의 추출액을 얻었다. 추출액의 5L 를 500㎖ 로 농축하고, 농축액을 부탄올 500㎖ 로 추출한 후, 부탄올층을 200㎖ 의 증류수로 3 회 추출하여 600㎖ 의 수층을 얻었다. 이 수층을 회전식 증발기로 농축하고, 얻어진 수층을 옥타데실 실리카겔 칼럼에 채워넣었다. 칼럼을 물로 세정하고 10∼25% 아세토니트릴 수용액으로 용출했다. 용출액을 농축하여 조추출물을 얻었다.

정제예 4

화합물 3 및 화합물 4 의 분리 및 정제

상기 추출예 2 에서 얻어진 조추출물을 4㎖ 의 50% 메탄올에 용해하고, HPLC 로써 정제했다. HPLC 조건은 다음과 같았다. 즉, 이동상으로서 아세토니트릴: 0.1%(v/v) TFA(32:68), 칼럼으로서 Inertsil ODS 20×250㎜ 를 사용하고, 하기 조건 하에 HPLC 분리를 수행하였다: 1 회의 주입량 1.5㎖, 칼럼 온도 30℃, 및 유속 10㎖/분. 각 분획을 LC/MS (이동상: TFA (0.1%) 함유 아세토니트릴-0.1%(v/v) TFA(27:73), 칼럼: Shiseido CAPCELL PAK C₁₈ UG120 3㎛ 2.0×100㎜) 로 분석하고, 각 954m/z[M+H]⁺ 및 968m/z[M+H]⁺ 에 해당하는 분획을 합하고, 농축 건조하여 화합물 3 을 14㎎ 및 화합물 4 를 3.1㎎ 얻었다.

화합물 3 의 물리화학적 성질

분자량 : 954.16

분자식 : C₄₄H₇₉N₁₁O₁₂

용해성 : 메탄올, 부탄올, 이소프로필알콜 및 디메틸술폭시드에 잘 녹음; 아세트산에틸, 클로로포름 및 헥산에 불용

산가수분해 : 6-규정염산으로 110℃ 에서 24 시간 가수분해시켰을 때, 화합물 3 은 아스파르트산, 발린, 트레오닌, 알로트레오닌 및 알라닌을 1:2:1:1:2 의 몰비로 제공한다.

양성자 핵자기공명 스펙트럼: 도 1 에 나타냄.

C-13 핵자기공명 스펙트럼: 표 15 에 나타냄.

상기 물리화학적 특성 및 스펙트럼 분석의 결과로부터, 신규 화합물 3 의 화학 구조를 하기와 같이 동정했다:

[화학식 5]

화합물 4 의 물리화학적 성질

분자량 : 968.19

분자식 : C₄₅H₈₁N₁₁O₁₂

산가수분해 : 6-규정염산으로 110℃ 에서 24 시간 가수분해시켰을 때, 글루탐산, 발린, 트레오닌, 알로트레오닌 및 알라닌을 1:2:1:1:2 의 몰비로 제공한다.

양성자 핵자기공명 스펙트럼 (DMSO-d6) : 도 2 에 나타냄.

C-13 핵자기공명 스펙트럼 (DMSO-d6) : 표 15 에 나타냄.

상기의 물리화학적 특성 및 스펙트럼 분석의 결과로부터, 신규 화합물 4 의 화학 구조를 하기와 같이 동정했다:

[화학식 6]

평가예 7

화합물 3 및 화합물 4 각각의 식물 병해 저항성 유도 활성의 평가

평가예 1 에서 실시한 방법, 즉 파슬리 배양 세포의 유도체 반응성을 파이토알렉신 형광 검출에 의해 측정하는 방법을 사용하여, 평가예 1 과 동일한 방식으로 화합물 3 과 화합물 4 각각의 식물 병해 저항성 유도 활성을 평가했다. 그 결과를 표 16 에 나타냈다.

표 16 : 파이토알렉신 검출 결과

유도체	화합물 처리구	농도(μM)	상대 형광값
있음	화합물3	0.5	222.7
	화합물4	0.5	504.8
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	377.5
	미처리-1	-	135.3
없음	화합물3	0.5	3.1
	화합물4	0.5	0.7
	아시벤졸라-S-메틸	2.5	0.8
	미처리-2	-	1.0

표 16 의 결과로부터, 화합물 3 과 화합물 4 가 기존의 식물 병해 저항성 유도 활성 물질과 마찬가지로 파슬리 배양 세포의 유도체 활성을 향상시키고, 따라서 식물 병해 저항성 유도 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

이상에 상세하게 기재한 대로, 본 발명의 페니바실러스 속 균주, 예를 들어 신규 페니바실러스 종 BS-0048, 페니바실러스 종 BS-0074, 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 및 페니바실러스 종 BS-0277 은 각종 식물 병해 방제에 매우 효과적이고 따라서 방제제로서 유용하다. 또한, 이들 페니바실러스 속 균주, 공지의 물질인 화합물 1 (푸사리시딘 A) 및 화합물 2 (푸사리시딘 B), 및 신규 화합물 3 및 4 가, 식물 병해 저항성 유도 활성을 가지고 또한 방제가 불가능하다고 여겨졌던 식물 병해에도 방제 효과를 나타낸다는 것이 분명해졌다. 나아가, 이들 페니바실러스 속 균주 및 화합물이 식물 병해 저항성 유도 활성을 가지므로, 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어할 수 있다는 것이 명백해졌다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
신규 페니바실러스 종 BS-0048 (수탁번호 IPOD FERM BP-10377), 페니바실러스 종 BS-0074 (수탁번호 IPOD FERM BP-10378), 페니바실러스 폴리믹사 BS-0105 (수탁번호 IPOD FERM BP-10379) 또는 페니바실러스 종 BS-0277 (수탁번호 IPOD FERM BP-10380)인 페니바실러스 속 균주.
제 6 항에 따른 페니바실러스 속 균주를 함유하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 페니바실러스 속 균주의 포자, 영양 균체 또는 전체 배양물을 함유하는 조성물.
제 6 항에 따른 페니바실러스 속 균주의 배양물로부터 얻어지는, 하기 구조식을 갖는 화합물 1 (푸사리시딘 A), 화합물 2 (푸사리시딘 B), 화합물 3 및 화합물 4 로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 병해 저항성 유도 물질의 하나 또는 둘 이상의 조합을 함유하는 조성물:

[화합물 1 (푸사리시딘 A)]

[화합물 2 (푸사리시딘 B)]

[화합물 3]

[화합물 4]
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 식물 병해 방제제.
제 10 항에 있어서, 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속 균주 또는 글로메렐라(Glomerella) 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제하는 식물 병해 방제제.
제 10 항에 있어서, 박과 식물의 탄저병 또는 딸기 탄저병을 방제하는 식물 병해 방제제.
제 10 항에 있어서, 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타냄으로써, 그람 음성 세균에 의해 일어나는 식물 병해를 방제하는 식물 병해 방제제.
제 13 항에 있어서, 그람 음성 세균이 수도모나스(Pseudomonas) 속 균주인 식물 병해 방제제.
제 14 항에 있어서, 수도모나스 속 균주에 의해 일어나는 박과 식물의 반점세균병을 방제하는 식물 병해 방제제.
제 10 항에 있어서, 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타냄으로써, 푸사리움 속 균주에 의해 일어나는 식물 병해를 방제하는 식물 병해 방제제.
제 10 항에 있어서, 경엽 처리, 근권 처리 및 종자 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 사용되어 식물 병해를 방제하는 식물 병해 방제제.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 10 항에 따른 식물 병해 방제제를 식물에 적용하여 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어하는 것을 특징으로 하는 식물 병해 방제 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 식물 병해 방제제가, 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타내어 식물 병원체의 감염으로부터 식물체를 방어하는 식물 병해 방제 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 식물 병해 방제제가, 직접 항균 활성을 나타냄이 없이 식물 병해 저항성 유도 활성을 나타내어, 그 결과 식물 병해를 방제하는 식물 병해 방제 방법.
하기 구조식을 갖는 신규 화합물 3:

[화학식 5]

화합물 3
하기 구조식을 갖는 신규 화합물 4:

[화학식 6]

화합물 4