DE69636780T2

DE69636780T2 - Resistenzgen gegen herbizid des porphyrin-akkumulierenden typs

Info

Publication number: DE69636780T2
Application number: DE69636780T
Authority: DE
Inventors: Ryo Sato; John Durham BOYNTON; W. Nicholas Durham GILLHAM; H. Elizabeth Durham HARRIS
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Duke University
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; Duke University
Priority date: 1995-07-20
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2016-07-20
Also published as: JP3928074B2; US6160206A; WO1997004089A3; US6346656B1; EP0839193B1; WO1997004089A2; EP0839193A2; WO1997004088A1; JPH11509732A; CA2227277A1; DE69636780D1

Description

Hintergrund der Erfindung
In Beziehung stehende Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilfortführung der internationalen Anmeldung PCT/US95/09098, angemeldet am 20. Juli 1995.
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Fragmente, die eine Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs auf Pflanzen- und Algenzellen übertragen, Plasmide und Mikroorganismen, die diese DNA-Fragmente enthalten, Verfahren für das Übertragen der Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs auf Pflanzen- und Algenzellen durch Verwenden dieser DNA-Fragmente und Pflanzen und Algen, in die diese DNA-Fragmente zum Zweck des Übertragens der Resistenz gegen solche Herbizide darauf eingebracht worden sind.
Beschreibung des in Beziehung stehenden Fachgebiets
Eine Gruppe von weithin bekannten Verbindungen, die als aktive Bestandteile von einigen Arten von kommerziell und anderweitig erhältlichen Herbiziden verwendet werden, zeigen in der Anwesenheit von Licht eine herbizide Aktivität, aber zeigen in der Dunkelheit keine herbizide Aktivität. Dies hat zu ihrer allgemeinen Bezeichnung als Licht-abhängige oder porphyrine Herbizide („porphyric herbicides") geführt. Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass diese Herbizide hohe Spiegel an Porphyrinakkumulation in Pflanzen und Algen induzieren, und sie werden daher jetzt als „Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs" [Zoku, lyakuhin-no-Kaihatsu, (Übersetzung: „The Development of Medical Drug Products; continuation") Bd. 18; Development of Agricultural Chemicals II, Kapitel 16, Abschnitt 16-1, Hajime Iwamura, Tamio Ueno & Katsuzo Kamoshita, Hrsg., Hirokawa Shoten, Tokyo, Verleger) oder einfach „porphyrine Herbizide" bezeichnet. Es wurde von Matringe, M., Camadro, J.M., Labbe, P. & Scalla, R. (Biochem J. 260: 231 (1989)) und von Matringe, M., Camadro, J.M., Labbe, P. & Scalla, R. (FEBS Lett. 245: 35 (1989)) berichtet, dass Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs (unten auch als porphyrine Herbizide bezeichnet) eine isolierte Protoporphyrinogen-Oxidase (unten als „Protox" bezeichnet) inhibieren.
Da die meisten Anbaupflanzen keine Resistenz gegen diese porphyrinen Herbizide zeigen, ist es nicht möglich, diese Herbizide auf Anbauland zu verwenden, wenn solche Anbaupflanzen gezüchtet werden. Wenn es möglich wäre, Anbaupflanzen zu entwickeln, die gegen porphyrine Herbizide resistent sind, könnten solche Herbizide auf diesen Anbaupflanzen verwendet werden. Dies würde das Anbaupflanzen-Management leichter machen und den Wert dieser Herbizide in landwirtschaftlichen Anwendungen erhöhen. Aus diesem Grund ist es wünschenswert, ein Verfahren zum Übertragen einer Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs auf Anbaupflanzen zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf diese Aufgabe haben die hiergenannten Erfinder einen mutierten Stamm, RS-3 bezeichnet, der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii untersucht, der eine spezifische Resistenz gegen porphyrine Herbizide zeigt. Wildtyp-Stämme dieser Alge sind normalerweise hochgradig empfindlich gegen porphyrine Herbizide. Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass die Inhibition der Protox-Aktivität durch porphyrine Herbizide in Chloroplasten-Fragmenten, die vom RS-3-Stamm von Chlamydomonas reinhardtii isoliert wurden, signifikant niedriger war als in Chloroplasten-Fragmenten des Wildtyp-Stamms. Die Erfinder konstruierten daher eine genomische DNA-Genbank von der nukleären Gesamt-DNA, die von dem mutierten RS-3-Stamm isoliert wurde, und waren erfolgreich im Isolieren von Clonen, die ein Gen enthalten, das für die Resistenz gegen porphyrine Herbizide verantwortlich ist. So waren die Erfinder in der Lage, DNA-Fragmente zu erhalten, die eine Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs auf Pflanzen- und Algenzellen übertragen können.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes, gereinigtes DNA-Fragment, das eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ überträgt, wenn es in Pflanzen- oder Algenzellen exprimiert wird, Plasmide und Mikroorganismen, die das DNA-Fragment enthalten, bereit zu stellen. Ein DNA-Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung hat vorzugsweise eine Nucleotidsequenz von einem oder mehreren Teilen der DNA, umfassend das Genom einer Alge, oder hat eine Nucleotidsequenz, die hochgradig homolog zu der Nucleotidsequenz der DNA ist, umfassend einen oder mehrere Teile des Genoms einer Alge.
Zusätzliche Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind ein Verfahren zum Übertragen einer Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ auf Pflanzen- und Algenzellen, umfassend das Einbringen des DNA-Fragments in die Pflanzen- oder Algenzellen, in denen das DNA-Fragment exprimiert wird; und Pflanzen oder Algen, in die das DNA-Fragment eingebracht worden ist und in denen das DNA-Fragment exprimiert wird, wodurch eine Herbizidresistenz auf die Pflanzen oder Algen übertragen wird.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein isoliertes, gereinigtes DNA-Fragment bereit zu stellen, das die folgenden Charakteristika aufweist:

a) umfassend eine Nucleotidsequenz, die von einem DNA-Fragment abstammt, das von einem Stamm der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii erhalten wurde, der eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ zeigt;
b) enthaltend Restriktionsstellen für XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI und XhoI und aufweisend eine Restriktionsstellenkarte, wie in 1(a) gezeigt;
c) aufweisend eine molekulare Größe von ungefähr 3,4 kb; und
d) das eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in Pflanzen- oder Algenzellen, wenn es darin exprimiert wird, überträgt oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon bereit zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein isoliertes, gereinigtes DNA-Fragment bereit zu stellen, das die folgenden Charakteristika hat:

a) umfassend eine Nucleotidsequenz, die von einem DNA-Fragment abstammt, das von einem Stamm der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii erhalten wurde, der eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ zeigt;
b) enthaltend Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI und HindIII und aufweisend eine Restriktionsstellenkarte, wie in 1(b) gezeigt;
c) aufweisend eine molekulare Größe von ungefähr 9,9 kB; und
d) das eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in Pflanzen- oder Algenzellen, wenn es darin exprimiert wird, überträgt oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon bereit zu stellen.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein isoliertes, gereinigtes DNA-Fragment bereit zu stellen, das die folgenden Charakteristika hat:

a) umfassend eine Nucleotidsequenz, die von einem DNA-Fragment abstammt, das von einem Stamm der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii erhalten wurde, der eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ zeigt;
b) enthaltend Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI, HindIII und KpnI und aufweisend eine Restriktionsstellenkarte, wie in 1(c) gezeigt;
c) aufweisend eine molekulare Größe von ungefähr 10,0 kb; und
d) das eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in Pflanzen- oder Algenzellen, wenn es darin exprimiert wird, überträgt oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon bereit zu stellen.

a) umfassend eine Nucleotidsequenz, die von einem DNA-Fragment abstammt, das von einem Stamm der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii erhalten wurde, der eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ zeigt;
b) enthaltend Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI, HindIII, BamHI, SalI, HindIII und KpnI und aufweisend eine Restriktionsstellenkarte, wie in 1(d) gezeigt;
c) aufweisend eine molekulare Größe von ungefähr 13,8 kb; und
d) das eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in Pflanzen- oder Algenzellen, wenn es darin exprimiert wird, überträgt oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon bereit zu stellen.

Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind, Plasmide und Mikroorganismen, die irgendwelche der vorhergehenden DNA-Fragmente enthalten, oder biologisch funktionelle Äquivalente davon, ein Verfahren zum Übertragen einer Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ auf Pflanzen- oder Algenzellen, umfassend das Einbringen der DNA-Fragmente oder biologisch funktionellen Äquivalente davon in Pflanzen- oder Algenzellen in einer funktionell durchführbaren Weise, bereitzustellen, so dass die DNA-Fragmente oder die biologisch funktionellen Äquivalente davon in den Pflanzen- oder Algenzellen exprimiert werden und die Expression des DNA-Fragments eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ auf die transformierten Pflanzen- oder Algenzellen überträgt. Es wird bevorzugt, dass die in vitro gezüchteten Zellen, die durch die DNA-Fragmente der Erfindung in einer funktionell durchführbaren Weise transformiert worden sind, resistent gegen ein Herbizid vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in einer Konzentration von mindestens 0,01 μM, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 0,03 μM, am meisten bevorzugt in einer Konzentration von mindestens 0,1 μM Herbizid sind. Wenn eine Verbindung A oder eine Verbindung B als die Testverbindungen verwendet werden, ist der Konzentrationsbereich vorzugsweise 0,01 bis 0,3 μM, mehr bevorzugt 0,03 bis 0,6 μM, am meisten bevorzugt 0,1 bis 0,3 μM. Andernfalls ist der Bereich zwischen 0,01 bis 30 μM, mehr bevorzugt 0,03 bis 10 μM, am meisten bevorzugt 0,1 bis 3 μM. Die Konzentration des Herbizids, das verwendet wird, um die Resistenz der transformierten Pflanzen oder Gewebe davon zu testen, liegt am oberen Ende dieser Bereiche oder sogar höher und kann durch einen Fachmann durch Versuche, die auf dem Fachgebiet typisch sind, bestimmt werden. Das Herbizid, das für das Testen der Herbizidresistenz der Zellen in vitro oder von ganzen transformierten Pflanzen oder Algen verwendet wird, ist vorzugsweise eine N-Phenyl-tetrahydrophthalimid-Verbindung. N-(4-Chlor-2-fuor-5-propargyloxy)phenyl-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid (Verbindung A) oder 7-Fluor-6-[(3,4,5,6)-tetrahydrophthalimido]-4-(2-propinyl)-1,4-benzoxazin-3(2H)-on (unten als „Verbindung B" bezeichnet) werden für diesen Zweck besonders bevorzugt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Pflanzen oder Algen bereit zu stellen, in die die DNA-Fragmente oder die biologisch funktionellen Äquivalente davon in einer funktionell durchführbaren Weise eingebracht worden sind.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein isoliertes, gereinigtes genomisches DNA-Fragment, umfassend die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO:1 gezeigt ist; Plasmide und Mikroorganismen, umfassend das DNA-Fragment; ein Verfahren zum Übertragen einer Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ auf Pflanzen- oder Algenzellen, umfassend das Einbringen der cDNA, die der mRNA entspricht, die durch das DNA-Fragment codiert wird, das die porphyrine Herbizidresistenz auf Pflanzen- oder Algenzellen überträgt, in denen die cDNA exprimiert wird; und Pflanzen oder Algen, in die die cDNA eingebracht worden ist, die der durch das DNA-Fragment, das die in SEQ ID NO:1 gezeigte Nucieotidsequenz hat, codierten mRNA entspricht, und in denen die cDNA exprimiert wird, bereit zu stellen.
Noch weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung von jedem der DNA-Fragmente oder biologisch funktionellen Äquivalente davon ein, die hierin als ein genetischer Marker (für die Herbizidresistenz) offenbart sind, um ein rekombinantes Plasmid oder transformierte Mikroorganismen zu produzieren, um eine Sonde zu produzieren, die für das Identifizieren von verwandten DNA-Sequenzen, die eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in Pflanzen- und Algenzellen verleihen, nützlich ist, und um Pflanzen oder Algen zu produzieren, die gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ resistent sind.
Die DNA-Fragmente und biologisch funktionellen Äquivalente davon der vorliegenden Erfindung werden hierin nachstehend als die „Gegenständliche Nucleinsäure-Fragmente" oder die „gegenständliche DNA-Fragmente" bezeichnet. Spezifische, individuelle Fragmente werden durch ihre Restriktionsstellen und molekularen Größen (kb) bezeichnet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt Plasmide, die die oben erwähnten DNA-Fragmente oder ihre biologisch funktionellen Äquivalente (hierin nachstehend als die „gegenständliche Plasmide" bezeichnet), Mikroorganismen, die diese DNA-Fragmente oder ihre Äquivalente enthalten (hierin nachstehend als die „gegenständlichen Mikroorganismen" bezeichnet), Pflanzen oder Algen, die diese DNA-Fragmente oder ihre Äquivalente enthalten (hierin nachstehend als die „gegenständlichen Pflanzen" bezeichnet), und Verfahren zum Übertragen einer Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ auf Pflanzen- und Algenzellen durch Verwenden dieser DNA-Fragmente oder ihrer Äquivalente ein.
In Bezug auf die hierin verwendete Terminologie bezeichnet der Begriff „DNA-Fragmente" nicht nur die gegenständlichen DNA-Fragmente, sondern auch degenerierte Isomere und genetisch äquivalente, modifizierte Formen dieser Fragmente. „Degenerierte Isomere" wird hier verwendet, um Isomere zu meinen, deren Nucleotidbasensequenz degeneriert mit den ursprünglichen Fragmenten in Beziehung steht; das heißt, alle Nucleinsäure-Fragmente, einschließlich der entsprechenden mRNA oder der entsprechenden cDNA, die im Wesentlichen dieselbe genetische Information wie die ursprünglichen Fragmente enthalten. „Genetisch äquivalente, modifizierte Formen" wird hier verwendet, um DNA-Fragmente zu meinen, die Basen-Änderungen, Additionen oder Deletionen durchgemacht haben können, aber die im Wesentlichen dieselbe inhärente genetische Information wie die ursprünglichen Fragmente enthalten.
Spezifische Beispiele des Letzteren schließen DNA-Fragmente ein, deren Nucleotidsequenz eine hohe Homologie mit den gegenständlichen Nucleinsäure-Fragmenten zeigt, die leicht unter Verwendung von konventionellen DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungstechniken isoliert werden oder die unter Verwendung von bekannten PCR(Polymerase-Kettenreaktion)-Verfahren amplifiziert werden und die die Fähigkeit besitzen, eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ zu übertragen, wenn sie durch konventionelle Transformationstechniken in Pflanzen- oder Algenzellen eingebracht werden, die normalerweise empfindlich gegen diese Herbizide sind.
Der Ausdruck „Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ" oder der Ausdruck „porphyrine Herbizide" bezeichnet lichtabhängige Herbizide, d.h. Verbindungen, die empfindliche Pflanzen in der Anwesenheit von Licht töten, aber die in der Dunkelheit keine herbizide Aktivität zeigen und die die Akkumulierung von hohen Spiegeln von Porphyrinen in den Pflanzen induzieren, auf die sie aufgetragen worden sind. Diese Herbizide schließen zum Beispiel Oxadiazon, Flupropacil, [N-(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxy)phenyl-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid (unten als Verbindung A bezeichnet), die Diphenylether-Herbizide wie Acifluorfen, Lactofen, Oxyfluorfen so wie die folgenden ein: Pentyl-[2-chlor-5-(cyclohex-1-en-1,2- dicarboximido)-4-fluor-phenoxy]acetat, 7-Fluor-6-[(3,4,5,6)-tetrahydrophthalimido]-4-(2-propinyl)-1,4-benzoxazin-3(2H)-on (unten als „Verbindung B" bezeichnet), 6-[(3,4,5,6-tetrahydro)phthalimido]-4-(2-propinyl)-1,4-benzoxazin-3(2H)-on, 2-[7-Fluor-3-oxo-4-(2-propinyl)-3, 4-dihydro-2H-1,4-benoxazin-6-yl]perhydroimidazo[1,5-a]pyridin-1,3-dion, 2-[(4-Chlor-2-fluor-5-propargyloxy)phenyl]perhydro-1-H-1,2,4-triazol-[1,2-a]pyridazin-1,3-dion, 2-[7-Fluor-3-oxo-4-(2-propinyl)-3,4-dihydro-2H-1,4-benoxazin-6-yl]5,6,7,8-1,2,4-triazolo[4,3-a]pyridin-3H-on, 2-[3-oxo-4-(2-propinyl)-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl]-1-methyl-6-trifluormethyl-2,4(1H,3H)-pyrimidindion, 2-[6-Fluor-2-oxo-3-(2-propinyl)-2,3-dihydrobenzthiazol-5-yl]-3,4,5,6-tetrahydrophthalimid, 1-Amino-2-[3-oxo-4-(2-propinyl)-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl]-6-tri-fluormethyl-2,4(1H,3H)-pyrimidindion so wie Analoge dieser Verbindungen.
Die gegenständlichen Nucleinsäure-Fragmente können durch die künstliche Synthese ihrer Nucleotidsequenzen konstruiert werden; sie werden jedoch typischer von einem mutierten Stamm der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, RS-3 bezeichnet, isoliert, der resistent gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs ist. Der mutierte Stamm RS-3 wird am Chlamydomonas Genetics Center (Adresse: DCMB Group, Department of Botany, Box 91000, Duke University, Durham, NC, 27708-1000, USA) unter der Eingangsnummer CC-2674 gelagert. So ist der mutierte Stamm RS-3 öffentlich für die Verteilung verfügbar. Wie es unten beschrieben werden wird, sind die Mikroorganismen, die die Plasmide, die die gegenständlichen Nucleinsäure-Fragmente enthalten, beherbergen, auch unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und sind daher auch frei erhältlich. Die Plasmide, die durch diese Mikroorganismen beherbergt werden, können leicht unter Verwendung von konventionellen Techniken und der gewonnenen gegenständlichen Fragmente durch Bezugnahme auf die in den 1(a)–1(d) gezeigten Restriktionskarten extrahiert werden. Es würde zum Beispiel möglich sein, spezifische Änderungen in diese Fragmente unter Verwendung der PCR oder von anderen ortsspezifischen Mutagenesetechniken einzubringen, oder die gegenständlichen Nucleinsäure-Fragmente oder ihre entsprechenden cDNAs, PCR-Produkte oder Oligonucleotide als Sonden zu verwenden, um andere DNA-Fragmente zu isolieren, die eine hohe Homologie zu den gegenständlichen Nucleinsäure-Fragmenten zeigen, und um so Homologe, wie oben diskutiert, herzustellen.
Ein weiterer Rahmen der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird von der detaillierten Beschreibung und den Zeichnungen, die unten geliefert werden, offensichtlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die folgende detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, nur als Veranschaulichung gegeben sind, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der Erfindung für Fachleute von dieser detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das obige und andere Aufgaben, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden detaillierten Beschreibungen, die im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen genommen, besser verstanden werden, wobei alle davon nur als Veranschaulichung gegeben sind und nicht einschränkend auf die vorliegende Erfindung sind, in der:
1(a)–1(d): die Restriktionsstellenkarten der clonierten DNA-Fragmente von verschiedenen Größen zeigt, die eine Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs übertragen. Die Größen der Fragmente werden durch die Zahlen (kb) in 1(e) angezeigt. Abkürzungen: B, BamHI; S, SalI; P, PstI; X, XhoI; E, EcoRI; N, HindIII; K, KpnI; C, ClaI.
1(a): 3,4 kb-DNA-Fragment, bezeichnet als Xho3.4;
1(b): 9,9 kb-DNA-Fragment, bezeichnet als Hind9.9;
1(c): 10,0 kb-DNA-Fragment, bezeichnet als Hind10.0;
1(d): 13,8 kb-DNA-Fragment, bezeichnet als Eco13.8;
1(e): ungefähr 40 kb-DNA-Fragment, beherbergt durch den Cosmid-Clon 2955 (Cos2955).
2 zeigt die Struktur eines pBS-Plasmids, das eine Xho3.4-Fragment-Insertion enthält. Die Abstände zwischen den Restriktionsstellen (kb) sind durch die Zahlen in der Insertion gezeigt.
3 zeigt die Struktur eines pBS-Plasmids, das eine Hind10.0-Fragment-Insertion enthält. Die Abstände zwischen den Restriktionsstellen (kb) sind durch die Zahlen in der Insertion gezeigt. Die 1(c) und 2 zeigen die PstI-Stellen.
4 zeigt die Struktur eines pBS-Plasmids, das eine Eco13.8-Fragment-Insertion enthält. Die Abstände zwischen den Restriktionsstellen (kb) sind durch die Zahlen in der Insertion gezeigt. Die 1(d) und 2 zeigen die PstI-Stellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung wird bereit gestellt, um Fachleuten beim Durchführen der vorliegenden Erfindung zu helfen. Trotzdem sollte die folgende detaillierte Beschreibung nicht ausgelegt werden, die vorliegende Erfindung übermäßig zu limitieren, da Modifikationen und Variationen in den hierin diskutierten Ausführungsformen durch Fachleute gemacht werden können, ohne vom Rahmen der vorliegenden Erfindungsentdeckung abzuweichen.
Überblick
Die vorliegenden Nucleinsäure-Fragmente werden durch konventionelle Gentechnik-Protokolle erhalten, wie in Veröffentlichungen wie Molecular Cloning, 2. Auflage, von J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Publications (1989) beschrieben. Insbesondere wird genomische DNA von dem mutierten Stamm RS-3 gemäß einem Protokoll wie jenem, das von E.H. Harris, The Chlamydomonas Source Book, S. 610–613 (Kapitel 12), Academic Press, San Diego (1989) beschrieben wird, extrahiert. C. reinhardtii-Zellen werden nämlich lysiert, und die DNA wird durch Behandlung mit einer Protease und grenzflächenaktiven Mitteln wie SDS oder Sarkosyl extrahiert. Die genomische DNA wird danach durch konventionelle Techniken, die Phenol-Chloroform-Extraktion, Zentrifugation, usw. involvieren, extrahiert, um Proteine zu entfernen, wonach die DNA durch Ethanol-Präzipitation gewonnen wird. Die so erhaltene DNA kann durch Natriumiodid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation weiter gereinigt und die niedrigste Hauptbande, die der nukleären genomischen DNA entspricht, gewonnen werden. Die so erhaltene nukleäre genomische DNA wird unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms wie Sau3AI teilweise verdaut. Linker oder Adaptoren werden an beide Enden der so erhaltenen DNA-Fragmente unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase angeheftet. Wenn nötig, können überschüssige freie Linker oder Adaptoren durch Gelfiltration entfernt werden, und die Fragmente können dann in einen geeigneten, kommerziell erhältlichen Cosmid-Vektor oder einen Phagen-Vektor wie jene, die vom Phagen λ stammen, inseriert werden. Phagenpartikel, die durch in vitro-Verpacken hergestellt wurden, werden in E. coli transfiziert, und es wird ihnen erlaubt, Kolonien oder Plaques auf festen Medien zu bilden. Eine genomische DNA-Genbank kann durch Isolieren und Bewahren von individuellen E. coli-Clonen, die Hybrid-Cosmide beherbergen, oder durch konventionelle Verfahren zum Isolieren und Bewahren von E. coli-Clonen oder Phagenpartikeln in einem Gemisch erhalten werden.
Da früher kein porphyrines Herbizidresistenz-Gen aus irgendwelchen Pflanzen- oder Algenarten vor der vorliegenden Erfindung isoliert und charakterisiert worden war, war es nicht realisierbar, die oben beschriebene genomische DNA-Genbank durch Synthese einer Oligonucleotidsonde, die der abgeleiteten Nucleotidsequenz eines solchen Gens entspricht, Markieren dieser Sonde mit einem Radioisotop oder einer fluoreszenten Markierung und Verwenden dieser, um genomische DNA-Clone zu selektieren, die die gegenständlichen DNA-Fragmente enthalten, zu screenen. Daher wurden die genomischen Clone, die gegenständliche DNA-Fragmente enthalten, durch Transformieren eines Stamms von Chlamydomonas reinhardtii, der empfindlich gegen porphyrine Herbizide ist, mit der genomischen DNA der Cosmid-Genbank unter Verwendung von normalen Transformationstechniken für diesen Organismus (Kindle, K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87, S. 1228 (1990); Boynton J.E. und Gillham, N.W., Methods In Enzymology: Recombinant DNA, Teil H, R. Wu, Hrsg., Academic Press, San Diego, KA, Bd. 217, S. 510, (1993)) gescreent, um Hybrid-Cosmide zu isolieren, die nukleäre genomische DNA-Fragmente enthalten, die in der Lage sind, eine Resistenz gegen ein porphyrines Herbizid zu übertragen. Eine Restriktionskarte des so erhaltenen Hybrid-Cosmid-Clons wurde bestimmt, verschiedene Restriktionsfragmente wurden in den pBluescript-Vektor subcloniert, und die Subclone, die eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide auf normal empfindliche Chlamydomonas-Stämme übertrugen, wurden selektiert. Unter Verwendung der gegenständlichen DNA-Fragmente und der gegenständlichen Plasmide als Ausgangsmaterial wurde die Nucleotidsequenz des 3,4 kb-Fragments durch das Verfahren nach Sanger (Sanger, F. und Coulson, A.R. J. Mol. Biol., Bd. 94, S. 441 (1975); Sanger, F., Nicklen und Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, S. 5463 (1977)) oder verbesserte Versionen dieses Verfahrens bestimmt. Die Sequenzen der größeren 9,9, 10,0 und 13,8 kb-Fragmente oder die cDNAs, die diesen Fragmenten entsprechen, können durch dieselbe Methode bestimmt werden. Die transkriptionelle Startstelle des porphyrinen Herbizid-Resistenzgens kann in einem oder mehreren dieser überlappenden Fragmente unter Verwendung der Primerextensionstechnik, die von Bina-Stem, M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76, S. 731, (1977)) und Sollner-Webb und Reeder, R.H. (Cell, Bd. 18, S. 485 (1978)) beschrieben wurde, oder durch die S1-Kartierungstechnik, die von Berk, A.J. und Sharp, P.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, S. 1274 (1978)) beschrieben wurde, lokalisiert werden. Typischerweise werden die Promotorsequenzen, die für die Regulierung der Genexpression verantwortlich sind, in einer Region ungefähr 1 kb bis 10 kb stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle gefunden. Die Promotorregion des Gens, das die Resistenz gegen porphyrine Herbizide überträgt, kann durch Verwenden von Chlamydomonas-Transformations-Standardtechniken (Kindle, K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87, S. 1228 (1990)) und chimäre Reporterkonstrukte bestimmt werden. Zum Beispiel können verschiedene Längen der Region stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle mit einem geeigneten heterologen Reportergen wie GUS oder eines, das eine enzymatisch bestimmte Antibiotika-Resistenz codiert, verbunden werden. Durch Einbringen dieser Konstrukte in Chlamydomonas reinhardtii unter Verwendung einer Transformation und dem Überwachen der Reportergen-Expression kann die Promotorregion des Gens, das die Resistenz gegen porphyrine Herbizide überträgt, schlussendlich bestimmt werden. Zusätzlich wird erwartet, dass eine Transkriptionsterminierungssequenz innerhalb eines oder mehrerer der überlappenden clonierten genomischen DNA-Fragmente stromabwärts des poly-A-Additionssignals vorliegt, das in der nicht-codierenden 3'-Region stromabwärts des Stoppcodons gefunden wird.
Herbizid-resistente Transformanten wurden von den 13,8 und 10,0 kb-Fragmenten von RS-3 in etwa 80-fach höherer Frequenz erhalten als vom 3,4 kb-Fragment. Dies ist in Übereinstimmung mit den 13,8 und 10,0 kb-Fragmenten, die die gesamte codierende Sequenz plus stromaufwärts und stromabwärts liegende regulatorische Elemente enthalten und nicht homolog und zufällig in das nukleäre Genom des Herbizid-empfindlichen Empfängerstamms integrieren. Im Gegensatz dazu ist die niedrige Transformationsfrequenz, die mit dem 3,4 kb-Fragment beobachtet wird, in Übereinstimmung mit diesem Fragment, das nur einen Teil des RS-3-Gens enthält, das in das Herbizid-empfindliche RS-3-Gen des Empfängers durch homologe Rekombination integrieren muss, um exprimiert zu werden. Nukleäre Transformanten von Chlamydomonas reinhardtii entstehen viel häufiger durch zufällige, nicht homologe Rekombination als durch homologe Rekombination, was durch Versuche mit dem nukleären nit-1-Gen von Sodeinde, O.A. und Kindle, K.L., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 90, S.9199 (1993)) gezeigt worden ist.
Das Vorhergehende wird im Detail in den unten präsentierten Beispielen beschrieben, obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
Konstruktion einer genomischen DNA-Genbank von Chlamydomonas reinhardtii
Der gegen porphyrine Herbizide resistente mutierte Stamm RS-3 der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas Genetics Center, Stamm GB-2674) wurde mixotrophisch unter 200 μE/m²/sec photosynthetisch aktiver Bestrahlung mit Schütteln für 5 Tage in flüssigem TAP-Medium, zusammengesetzt aus 7 mM Na₄Cl, 0,4 mM MgSO₄·7H₂O, 0,34 mM CaCl₂·2H₂O, 25 mM Kaliumphosphat, 0,5 mM Tris (pH 7,0), 1 ml/L Hutner-Spurenelementen und 1 ml/L Eisessig (Harris, E.H., The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989, S. 576–77), auch enthaltend 0,03 μM Verbindung A, gezüchtet. Sechs Liter der Kultur, die Zellen in der frühen stationären Wachstumsphase enthält (7,6 × 10⁶ Zellen/ml), wurden geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (8000 × g, 10 min, 4°C) gesammelt, in 50 ml TEN-Puffer, zusammengesetzt aus 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0, resuspendiert, re-zentrifugiert und wieder in 50 ml TEN-Puffer resuspendiert. Zu diesem wurden vorsichtig 5 ml 20% (Gew./V) SDS, 5 ml 20% Sarkosyl und 4 ml Proteaselösung, zusammengesetzt aus 5 g Protease (Boehringer Mannheim Nr. 165921), 10 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 0,11 g CaCl₂, in einem Gesamtvolumen von 100 ml deionisiertem destilliertem Wasser zugefügt. Dies wurde durch langsames Rotieren der Lösung in einer Flasche für 24 h bei 4°C gemischt. 60 ml Phenol-CIA (Phenol, vorgesättigt mit TEN-Puffer und gut gemischt mit einem gleichen Volumen Chloroform:Isoamylalkohol, 24:1, V/V) wurden danach zugefügt, und die Bestandteile wurden in derselben Flasche bei Zimmertemperatur für 1 Std. rotiert.
Die Bestandteile wurden dann durch Zentrifugation (15000 × g, 20 min, Zimmertemperatur) aufgetrennt, die wässrige (obere) Phase wurde gewonnen und mit 2 Volumina 95% (V/V) Ethanol sanft aber gründlich gemischt, und die DNA präzipitierte durch Platzieren der Bestandteile bei –20°C über Nacht. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation (1500 × g, 20 min, 4°C) gewonnen und einmal mit eiskaltem 70% (V/V) Ethanol gewaschen. Überschüssiges Ethanol wurde entfernt und das DNA-Präzipitat wurde unter einem Stickstoffdurchfluss für 5 min bei Zimmertemperatur getrocknet.
Das getrocknete Präzipitat wurde in der Folge in 60 ml 10 mM Tris (pH 7,5) gelöst, und unter schwachem Licht wurde das Folgende zugefügt: 8 ml 10-fach konzentrierter TEN-Puffer, 0,4 ml Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml), 9,8 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 120 ml Natriumiodid(NaI)-gesättigter TEN-Puffer. Die Bestandteile wurden durch vorsichtiges Umdrehen des Behältnisses gemischt, und 25 ml wurden in jedes von 8 Zentrifugenröhrchen dispensiert. Diese wurden einer Ultrazentrifugation in einem Beckman 70 Ti-Rotor (44000 UpM, 40 Std., 20°C) ausgesetzt. Nach der Ultrazentrifugation wurde die unterste Hauptbande, die aus nukleärer DNA besteht, durch Langwellen-UV-Beleuchtung sichtbar gemacht und durch die Verwendung einer Spritze mit hoher Gaugezahl gewonnen. Die DNA in dieser Bande wurde wieder einer Ultrazentrifugation in einem Beckman 70 Ti-Rotor (44000 UpM, 44 Std., 20°C) ausgesetzt. Die gereinigte nukleäre DNA-Bande wurde wie oben gewonnen.
Ethidiumbromid wurde durch Zugabe von Isoamylalkohol, der mit 1–2 Volumina TEN-Puffer gesättigt war, und nachfolgendem Verwerfen der Alkohol-(oberen)Phase aus der Lösung extrahiert, die die gewonnene nukleäre DNA enthält. Nach dem dreimaligen Wiederholen dieses Schritts wurde die nukleäre DNA, von der Ethidiumbromid entfernt worden war, durch die Zugabe von 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol präzipitiert. Das gewonnene Präzipitat wurde zweimal in eiskaltem 95% (V/V) Ethanol gewaschen, in einem kleinen Volumen 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) wieder gelöst und bei –20°C gelagert. Ein Aliquot dieser Probe wurde 100-fach verdünnt, und die Konzentration und Reinheit der DNA wurden durch Messen des Absorptionsvermögens bei 260 nm und 280 nm quantifiziert.
25 μg der so erhaltenen genomischen DNA wurden durch die Reaktion mit 0,83 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau3AI bei 37°C für 15 min in 277 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreit, teilweise verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem gleichen Volumen Phenol, das mit Tris-Puffer (pH 7,5) äquilibriert wurde, gefolgt von einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. 3 M Ammoniumacetat wurden zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu ergeben, gefolgt von der Zugabe von 2 Volumina eiskaltem Ethanol. Diese Lösung wurde gründlich gemischt, und nach der Lagerung der Probe über Nacht bei –20°C bildete sich ein DNA-Präzipitat. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (10 000 UpM, 10 min) gewonnen, in 70% (V/V) Ethanol gewaschen und re-zentrifugiert. Das Präzipitat wurde dann in 20 μl TE-Puffer (zusammengesetzt aus 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA·2Na) resuspendiert, und die DNA wurde durch die Zugabe von 70 μl deionisiertem, destilliertem Wasser, 10 μl 10-fach konzentriertem CIAP-Puffer, zusammengesetzt aus 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 1 mM EDTA und 1 Einheit CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – alkalische Kälberdarm-Phosphatase), dephosphoryliert. Das Gesamtvolumen von 100 μl wurde für 60 min bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch die Zugabe von 3 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) und Hitzebehandlung für 10 min bei 68°C gestoppt. Die DNA wurde Phenol- und Chloroform-Extraktionen ausgesetzt und durch die Zugabe von Ethanol, das Ammoniumacetat enthielt, präzipitiert, wie oben beschrieben.
Das Präzipitat wurde mit 70% (V/V) Ethanol gewaschen und die gewonnene DNA wieder in TE-Puffer zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml gelöst. Danach wurde der kommerziell erhältliche Cosmid-Vektor SuperCos-1 (Stratagene Inc.) dem Protokoll folgend hergestellt das in dem SuperCos-1-Anweisungshandbuch, das vom Hersteller bereitgestellt wird, ausgeführt ist. Der Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, mit CIAP dephosphoryliert, mit dem Restriktionsenzym BamHI wieder verdaut, durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und in TE-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml wieder gelöst. 2,5 μg der hergestellten genomischen DNA-Fragmente wurden an 1 μg des hergestellten SuperCos-1-Vektors in 20 μl Reaktionspuffer (zusammengesetzt aus 1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreit) durch die Zugabe von 2 Einheiten T4-DNA-Ligase und Inkubation bei 4°C über Nacht ligiert. 0,5 μg der so erzeugten Hybrid-Cosmide wurden dann durch die Verwendung eines kommerziellen in vitro-Phagenverpackungs-Kits (Gigapack II XL, Stratagene Inc.) dem Protokoll folgend, das im bereitgestellten Anweisungshandbuch beschrieben wird, in λ-Phagenpartikel, die zum Infizieren von E. coli in der Lage sind, verpackt. λ-Phagenpartikel, die diese Hybrid-Cosmide beherbergen, wurden dann in den E. coli-Stamm NM554 (Stratagene, Inc.) durch die unten beschriebene Vorgehensweise transfiziert, und diesen E. coli-Zellen wurde erlaubt, Kolonien auf LB-Medium-Platten (10 g/l NaCl, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,5, 1,5% (Gew./V) Agar), enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, zu bilden. Das Transfektionsprotokoll ist wie folgt: (1) eine einzelne Kolonie des E. coli-Stamms NM554 wurde in 50 ml Medium (5 g/l NaCl, 10 g/l Bacto-Trypton, pH 7,4, 0,2% (Gew./V) Maltose, 10 mM MgSO₄) beimpft und durch kräftiges Schütteln über Nacht bei 37°C gezüchtet; (2) die Zellen wurden durch Zentrifugation (4000 UpM, 10 min, 4°C) gewonnen und in 10 mM MgSO₄ auf eine OD₆₀₀ von 0,5 resuspendiert; (3) 25 μl dieser bakteriellen Suspension wurden mit 25 μl einer 1/20-Verdünnung der Phagenpartikel-Lösung gemischt, die die Hybrid-Cosmide, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, beherbergt. Der Phage wurde durch Stehenlassen des Gemischs bei Zimmertemperatur für 30 min in E. coli infiziert. 200 μl LB-Medium (10 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt) wurden in der Folge zugefügt, und die Suspension wurde bei 37°C für 1 h inkubiert, um die Expression der Ampicillin-Resistenz zu ermöglichen. Die Suspension wurde dann auf LB-Medium-Platten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, plattiert, und Kolonien bildeten sich nach der Inkubation bei 37°C über Nacht. Die Transformationswirksamkeit des Ampicillin-Markers war 1,7 ± 0,1 × 10⁵ Transformanten/μg DNA. Die E. coli-Kolonien, die die so erhaltenen Hybrid-Cosmide enthalten, wurden mit sterilen Zahnstochern individuell gepickt und in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Falcon, 24 Vertiefungen), die je 0,5 ml LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, enthalten, übertragen und ohne Schütteln bei 37°C für 24 h inkubiert. 10080 individuelle Clone wurden dadurch in 420 Microtiterplatten isoliert. Dann wurden 187,5 μl Medium von jeder Vertiefung entfernt und in Pools von je 8 Clonen (gesamt 1,5 ml) in 1260 Mikroröhrchen kombiniert. Die Bakterien in jedem Mikroröhrchen wurden durch Zentrifugation (10000 Upm, 5 min, Zimmertemperatur) pelletiert und einer DNA-Extraktion unterzogen. Die in den Mikrotiterplatten verbleibenden Bakterien wurden nach der Zugabe eines gleichen Volumens 30% (Gew./V) Glycerin eingefroren. Diese Platten wurden in der Folge bei –20°C gelagert.
Beispiel 2
Screenen der genomischen DNA-Genbank
Die verschiedenen Versuchsverfahren, die verwendet wurden, um die genomische DNA-Genbank zu screenen, werden unten beschrieben (Verfahren A, B und C).
A. DNA-Extraktion
Die Extraktion der Cosmid-DNA von E. coli, die die genomische DNA-Genbank enthielten, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt wurde, so wie die Extraktion des Plasmids pARG7.8 (Debuchy, R., Purton, S., Rochaix, R.D., EMBO J., Bd. 8, S. 2803, (1989)), das als eine Transformationskontrolle verwendet wurde, wurden durch Extraktions-Standardverfahren (zum Beispiel J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Publications, (1989), Bd. I, S. 1.38–1.39) durchgeführt. Eine Beschreibung des spezifischen Protokolls folgt.
Das bakterielle Pellet in jedem Mikroröhrchen wurde in 100 μl Lösung I (zusammengesetzt aus 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA), zu der 200 μg Lösung II (zusammengesetzt aus 0,2 N NaOH, 1% (Gew./V) SDS) zugefügt wurden, gründlich resuspendiert. Jedes Mikroröhrchen wurde verschlossen, die Inhalte wurden durch 5–6-maliges Umdrehen des Röhrchens sanft gemischt, und das Röhrchen wurde durch Platzieren auf Eis abgekühlt. 150 μl eiskalte Lösung III (zusammengesetzt aus 60 ml 5 M Kaliumacetat (pH 4,8), 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml deionisiertem, destilliertem Wasser) wurden in der Folge zugefügt, die Inhalte wurden gut gemischt und die Röhrchen für 5 min auf Eis gekühlt. Die Röhrchen wurden dann in einer Tischzentrifuge zentrifugiert (10000 Upm, 2 min, 4°C) und der Überstand wurde gewonnen. Ein gleiches Volumen Phenol:Chloroform (1:1, V/V, pH 7,5) wurde zu dem gewonnenen Überstand zugefügt, die Inhalte wurden auf einem Vortexgerät gründlich gemischt, und die Röhrchen wurden wieder in einer Tischzentrifuge zentrifugiert (10000 UpM, 2 min, 4°C), und der Überstand wurde gewonnen. Nach dem Re-Extrahieren mit Chloroform wurden 900 μl Ethanol zu dem Überstand zugefügt und gemischt. Die DNA wurde durch Abkühlen der Röhrchen auf Eis präzipitiert, und die Präzipitate wurde durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (12000 × g, 2 min, 4°C) gewonnen. Die Präzipitate wurde in 70% Ethanol (Gew./V) Ethanol gewaschen und wieder durch Zentrifugation (12000 × g, 2 min, 4°C) gewonnen. Überschüssiges Ethanol wurde durch Öffnen der Mikroröhrchen-Deckel und Verdunstenlassen des Ethanols bei Zimmertemperatur für 10 min entfernt. Die so erhaltenen Präzipitate wurden in 50 μl TE-Puffer (zusammengesetzt aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA·2Na) wieder gelöst, um die DNA löslich zu machen.
B. Transformation durch das Glasperlen-Verfahren
Das Glasperlen-Transformationsprotokoll, wenn es angewendet wurde, folgte jenem, das durch Kindle, K. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, Bd. 87, S. 1228, (1990)) beschrieben wurde. Das tatsächlich verwendete Protokoll wird unten dargelegt.
Als Erstes wurde die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, Stamm CC-425 (Arginin-auxotroph arg-2, Zellwand-defizient cw-15), mixotrophisch für 2 Tage zu einer Zelldichte von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml in flüssigem TAP-Medium, zusammengesetzt aus 7 mM NH₄Cl, 0,4 mM MgSO₄·7H₂O, 0,34 mM CaCl₂·2H₂O, 25 mM Kaliumphosphat-0,5 mM Tris (pH 7,0), 1 ml/L Hutner-Spurenelementen, 1 ml/L Eisessig (beschrieben in Harris, E. H., The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989, S. 576–77) + 50 μg/ml Arginin, gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation der Kultur (8000 × g, 10 min, 20°C) gewonnen und in einem kleinen Volumen TAP resuspendiert, um eine Enddichte von 2,8 × 10⁸ Zellen/ml zu ergeben.
In einem kleinen sterilen Teströhrchen, enthaltend 0,3 Gramm sterile Glasperlen (0,45–0,52 mm), wurden 0,3 ml dieser Zellsuspension, 0,5–1,0 μg Plasmid oder 1–2 μg Genbank-DNA und 0,1 ml 20% (Gew./V) Polyethylenglycol (PEG) zugefügt, sanft gemischt, dann bei hoher Geschwindigkeit für 15 Sekunden unter Verwendung eines Vortex-Mischers verwirbelt. Das Röhrchen wurde für 2 min stehen gelassen und dann für weitere 15 Sek. auf dieselbe Weise verwirbelt.
Die Zellsuspension wurde dann auf 2 Platten mit festem Medium (Zusammensetzung: a), 0,2 ml pro Platte, plattiert, bei Verwendung der Arginin-Auxotrophie als einen Transformationsmarker: TAP-Medium + 1,5% (Gew./V) Agar; oder b) bei Verwendung der Resistenz gegen porphyrine Herbizide als einen Transformationsmarker: TAP-Medium + 0,1 μM Verbindung A + 50 μg/μl Arginin + 1,5% (Gew./V) Agar), und es wurde erlaubt, Kolonien unter Beleuchtung zu bilden.
C. Transformation durch das Gentransfer-Verfahren mit Hilfe der Partikel-Kanone
Das Transformationsprotokoll mithilfe der Partikelkanone, wenn es angewendet wurde, folgte jenem, das von Boynton, J. E. & Gillham, N. W. (Methods in Enzymol.: Recombinant DNA, Part H, Wu, R. Hrsg., Academic Press, San Diego, CA, 1993, Bd. 217, S. 510) beschrieben wurde. Das tatsächlich angewendete Protokoll wird unten beschrieben.
Als Erstes wurde die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, Stamm CC-48 (Arginin-auxotroph arg-2), mixotrophisch für 2 Tage in flüssigem TAP-Medium, zusammengesetzt aus 7 mM NH₄Cl, 0,4 mM MgSO₄·7H₂O, 0,34 mM CaCl₂·2H₂O, 25 mM Kaliumphosphat – 0,5 mM Tris (pH 7,0), 1 ml/L Hutner-Spurenelementen, 1 ml/L Eisessig (beschrieben in Harris, E. H., The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989) + 50 μg/ml Arginin, zu einer Zelldichte von 1,5–3 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation der Kultur (8000 × g, 10 min, 20°C) gewonnen und in einem kleinen Volumen HS-Medium (zusammengesetzt aus 500 mg/l NH₄Cl, 20 mg/l MgSO₄·7H₂O, 10 mg/l CaCl₂·2H₂O, 1440 mg/l K₂HPO₄, 720 mg/l K₂HPO₄, 1,2 g/l wasserfreies Natriumacetat, 1 ml/l Hutner-Spurenelementen (beschrieben in Harris, E. H., The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989) zu einer Zelldichte von 1,14 × 10⁸ Zellen/ml resuspendiert. 1 ml dieser Zellsuspension wurde zu kleinen Teströhrchen zugefügt, die schon 1 ml HS-Medium + 0,2% Agar (Difco Bacto Agar), vorgewärmt auf 42°C, enthielten. Nach sanftem Mischen wurden 0,7 ml der Suspension auf jede von zwei Platten HSHA-Agar (zusammengesetzt aus 500 mg/l NH₄Cl, 20 mg/l MgSO₄·7H₂O, 10 mg/l CaCl₂·2H₂O, 1440 mg/l K₂HPO₄, 720 mg/l K₂HPO₄, 2,4 g/l wasserfreies Natriumacetat und 1 ml/l Hutner-Spurenelementen (beschrieben in Harris, E. H., The Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989)), auch enthaltend 50 μg/μl Ampicillin, plattiert, und die Zellen wurden durch Trocknen im Dunkeln auf die Oberfläche der Platten fixiert.
Als Nächstes wurden 60 mg Goldpartikel (1 μm Durchmesser, DuPont Biotechnology Systems, 7556, Wilminton, DE) und 1 ml Ethanol zu einem Mikroröhrchen zugefügt und bei der höchsten Geschwindigkeit für 2 min unter Verwendung eines Vortex-Mischers verwirbelt. Die Goldpartikel wurden dann durch Zentrifugation (10000 UpM, 1 min, Zimmertemperatur) gewonnen, und dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt. Die gewonnen Goldpartikel wurden dann in 1 ml sterilem, destilliertem Wasser resuspendiert. Die Partikel wurden wieder durch dasselbe Zentrifugationsverfahren gewonnen, und dieses Waschverfahren wurde weitere 2 Male wiederholt. Schließlich wurden die Goldpartikel in 1 ml sterilem, destilliertem Wasser resuspendiert. 50 μl dieser Partikel-Suspension wurden zu einem Mikroröhrchen zugefügt, zu dem 5 μl DNA (1 μg/μl), 50 μl 2,5 M CaCl₂ und 20 μl 0,1 M Spermidin unter Mischen mit einem Vortex-Mischer zugefügt wurden. Das Mischen wurde für 3 min fortgesetzt, danach wurde das Präzipitat durch Zentrifugation (10000 UpM, 10 min, Zimmertemperatur) gewonnen. Die präzipitierten Goldpartikel wurden in 250 μl Ethanol resuspendiert, wieder durch dasselbe Zentrifugationsverfahren gewonnen und schließlich in 60 μl Ethanol resuspendiert. Chlamydomonas-Zellen, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, wurden mit den so erhaltenen DNA-beschichteten Goldpartikeln unter Verwendung einer Partikelkanone bombardiert. Sofort danach wurden die Zellen durch sanftes Abkratzen mit einem Glasstab von der Oberfläche der Agarplatten in 1,5 ml flüssiges HS-Medium gewonnen. Die Hälfte dieser Suspension wurde auf jede von zwei selektiven Agar-Mediumplatten (Zusammensetzung: a) verteilt, wenn die Arginin-Auxotrophie als ein Transformationsmarker verwendet wurde: TAP-Medium + 1,5% (Gew./V) Agar; b) wenn die Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ als ein Transformationsmarker verwendet wurde: TAP-Medium + 0,3 μM Verbindung A + 50 μg/μl Arginin + 1,5% (Gew./V) Agar), und es wurde erlaubt, dass sich unter Beleuchtung (75–90 μMolm^–2sec^–1) Kolonien ausbilden.
Die oben beschriebenen Versuchsverfahren wurden verwendet, um die genomische DNA-Genbank zu screenen. Details der Screening-Verfahren werden unten als getrennte primäre, sekundäre und tertiäre Screening-Schritte dargelegt.
1. Primäres Screening
Die einzellige Empfänger-Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, Stamm CC-425 (Arginin-auxotroph arg-2, Zellwand-defizient cw-15) wurde mit pARG 7.8 (Plasmid-DNA) zusammen mit der Genbank-DNA (ein Gemisch von DNAs, die von 48 Clonen extrahiert wurden) unter Verwendung des Glasperlen-Verfahrens (siehe oben für Details) transformiert. Die Hälfte der Zellen in jedem Transformationsversuch (3,0 × 10⁷ Zellen) wurde verwendet, um die Transformationsfrequenz, angezeigt durch den Arginin-prototrophen Phänotyp, zu bestimmen. Die verbleibende Hälfte (3,0 × 10⁷ Zellen) wurde auf die erworbene Resistenz gegen porphyrine Herbizide untersucht. Dieses Experiment wurde 198-mal wiederholt, und insgesamt wurden 9504 individuelle Clone der Genbank gescreent. Insgesamt wurden 7046 Arginin-Prototrophe von 5,8 × 10⁹ gescreenten Zellen erhalten. Unter der Annahme, dass alle diese Arginin-prototrophen Kolonien wahre Transformanten sind, war die Transformationsfrequenz im Schnitt 1,2 × 10^–6. Zusätzlich wurde von 5,8 × 10⁹ gescreenten Zellen ein Clon erhalten, der eine Resistenz gegen ein porphyrines Herbizid zeigte (d.h., der in der Anwesenheit der Verbindung A wuchs). Diese Kolonie war auch in der Lage, auf Medien, denen Arginin fehlte, normal zu wachsen, und zeigte einen Verlust der Motilität, wenn sie in flüssigen Medien kultiviert wurde.
Der DNA-Pool von 48 Clonen, die das Cosmid enthalten, das die Kolonie hervorgebracht hatte, die eine Resistenz gegen ein porphyrines Herbizid zeigte (Cosmid-Clon 2953–3000), wird als Cos2953–Cos3000 bezeichnet.
2. Sekundäres Screenen
Die einzellige Empfänger-Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, Stamm CC-48 (Arginin-auxotroph arg-2) wurde mit den in Tabelle 1 gezeigten DNAs durch das Gentransfer Verfahren mithilfe der Partikelkanone transformiert (siehe oben für Details). Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 gezeigt.
Die Transformation mit dem DNA-Pool, der die 24 Clone Cos2953–Cos2976 enthält, erbrachte Kolonien, die gegen die Verbindung A resistent waren, was daher darauf hinweist, dass das Gen für Resistenz gegenüber Herbiziden vom Porphyrin-akkumulierenden Typ in diesem Pool enthalten sein muss. Tabelle 1
3. Tertiäres Screening
Die einzellige Empfänger-Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, Stamm CC-48 (Arginin-auxotroph arg-2) wurde mit der Hybrid-Cosmid-DNA, die hergestellt wurde, wie für die entsprechenden Clone, die den DNA-Pool Cos2953–Cos2976 ausmachen, beschrieben, durch das Gentransfer-Verfahren mithilfe der Partikelkanone transformiert (siehe oben für Details). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Transformation nur mit dem Hybrid-Cosmid, das im Clon Cos2955 enthalten war, erbrachte Kolonien, die gegen die Verbindung A resistent sind. Tabelle 2
Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde eine gereinigte Hybrid-Cosmid-DNA von Cos2955 unter Verwendung entweder eines Minisäulen-Plasmid-Reinigungsverfahrens (Quiagen Inc.) oder des Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahrens hergestellt, und die Transformationsexperimente wurden unter Verwendung desselben Protokolls, das oben beschrieben wird, wiederholt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Transformation mit der Cos2955-DNA erbrachte wiederholbar zahlreiche Kolonien, die eine Resistenz gegen die Verbindung A zeigten, was darauf hinweist, dass ein Resistenzgen gegen porphyrines Herbizid in dieser Hybrid-Cosmid-DNA enthalten sein muss. Tabelle 3
Beispiel 3
Konstruktion einer Restriktionskarte und Subclonierung
Die Hybrid-Cosmid-DNA des Clons Cos2955 wurde durch das CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren gereinigt. Die gereinigte Hybrid-Cosmid-DNA (unten als Cos2955-DNA bezeichnet) oder ihr, wie unten beschrieben, isolierter Subclon wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SalI, BamHI, ClaI, KpnI, XhoI, PstI und HindIII entweder alleine oder in Kombination verdaut, und die Größen der so erzeugten Fragmente wurden durch Elektrophorese mit 0,8% Agarose-Gel (25 V, 15 Std.) geschätzt. Von einer Analyse der Größen von jedem Fragment in einzelnen und doppelten Verdauen wurde eine Restriktionskarte konstruiert. Dieses Ergebnis ist in 1(e) gezeigt. Die PstI-Stellen wurden in dem 3,4 kb-DNA-Fragment bestimmt, das in 1(a) gezeigt ist. Die Cos2955-DNA enthält Stellen für die folgenden Restriktionsenzyme (geordnet und mit den Abständen (kB) zwischen den Stellen, in Klammen angegeben): ClaI (4,4) BamHI (3,1) BamHI (6,6) BamHI (8,2) ClaI (3,1) EcoRI (1,4) XhoI (0,6) PstI (0,5) PstI (0,1) PstI (0,4) PstI (0,1) PstI (0,5) BamHI (0,1) SalI (0,2) SalI (0,9) XhoI (5,1) HindIII (2,8) BamHI (0,2) SalI (0,8) und HindIII. Die gesamte molekulare Größe (Nucleinsäure-Länge) des nukleären DNA-Fragments in Cos2955, das die Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ überträgt, ist ungefähr 40,4 kb.
Cos2955 und das kommerziell erhältliche Plasmid pBluescript-II KS+ (pBS, Stratagene, Inc.) wurden mit individuellen Restriktionsenzymen oder einer geeigneten Kombination von zwei Restriktionsenzymen geschnitten, mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA-Fragmente wurden durch Ethanol-Präzipitation gewonnen. Der pBS-Vektor wurde, wenn nötig, durch eine Behandlung mit CIAP dephosphoryliert, und der pBS-Vektor und die verdauten Cosmid 2955-DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die so erhaltenen Hybrid-Plasmide wurden durch Elektroporation (12,5 kV/cm, 4,5 ms) in den E. coli-Stamm XL1-Blue eingebracht und auf LB-Agarplatten (zusammengesetzt aus 10 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 1,5% (Gew./V) Agar und auch 1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthaltend) verteilt, auf die 2% (Gew./V) X-GaI ausgebreitet worden waren. Von diesen wurden weiße Kolonien isoliert, d.h. jene Clone, die den pBS-Vektor aufgenommen hatten und so Ampicillin-resistent waren, die ein DNA-Fragment, das von der Cos2955-DNA stammt, in die Clonierungsstelle des pBS-Vektors inseriert hatten und so eine weiße Farbe hatten. Die isolierten Kolonien wurden in der Anwesenheit von Ampicillin gezüchtet, und danach wurde Plasmid-DNA von diesen Kolonien durch das alkalische Lyseverfahren (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, Publications, (1989), Bd. I, S. 1.38–1.39) isoliert. Die isolierten Plasmide wurden wieder mit dem (den) Restriktionsenzym(en), das (die) für die Clonierung verwendet wurde(n), verdaut, um die Insertionen freizusetzen, und die Größen der erhaltenen inserierten Fragmente wurden wieder durch 0,8% (Gew./V) Agarose-Gelelektrophorese (75 V, 5 Std.) geschätzt. Wenn eine Insertion mit der erwünschten Größe erhalten wurde, wurde sie einer weiteren Restriktionsanalyse unterzogen, um zu bestätigen, dass das korrekte DNA-Fragment cloniert worden war. Die so clonierten DNA-Fragmente sind in den 1(a)–1(d) gezeigt. Um den Clon zu identifizieren, der die porphyrine Herbizidresistenz-Mutation rs-3 enthält, wurde der Chlamydomonas reinhardtii-Empfängerstamm CC-48 (Arginin-auxotroph arg-2) mit der DNA von den pBS-Subclonen von Cos2955 durch das Gentransfer-Verfahren mithilfe der Partikelkanone transformiert (siehe oben für Details). Die pBS-Subclone von Cos2955, die in der Lage waren, eine Resistenz gegen die Verbindung A zu übertragen, enthielten die Eco13.8-, Hind10.0- und Xho3.4-Fragmente. Diese Ergebnisse bestätigten, dass diese DNA-Fragmente die porphyrine Herbizidresistenz-Mutation rs-3 enthielten.
Herbizid-resistente Transformanten wurden von den 13,8- und 10,0 kb-Fragmenten von RS-3 in einer etwa 80-fach höheren Häufigkeit erhalten als vom 3,4 kb-Fragment (Tabelle 4). Dies ist übereinstimmend mit den 13,8 und 10,0 kb-Fragmenten, die die gesamte codierende Sequenz plus stromabwärts und stromaufwärts liegende regulatorische Elemente enthalten und nicht homolog und zufällig in das nukleäre Genom des Herbizid-empfindlichen Empfängerstamms integrieren. Im Gegensatz dazu ist die niedrige Transformations-Häufigkeit, die mit dem 3,4 kb-Fragment beobachtet wird, übereinstimmend mit diesem Fragment, das nur einen Teil des RS-3-Gens enthält, das in das Herbizid-empfindliche RS-3-Gen des Empfängers durch homologe Rekombination integrieren muss, um exprimiert zu werden. Nukleäre Transformanten von Chlamydomonas reinhardtii entstehen viel häufiger durch zufällige, nicht homologe Rekombination als durch homologe Rekombination, wie es für das nukleäre nit-1-Gen von Sodeinde, O.A. und Kindle, K.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 90, S. 9199 (1993)) gezeigt worden ist. Tabelle 4
Eco13.8 ist ein DNA-Fragment von ungefähr 13,8 kb, das in der Lage ist, eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide zu übertragen und das Stellen für die folgenden Restriktionsenzyme enthält (geordnet und mit dem Abstand (Kb) zwischen den Stellen angegeben in Klammern; dieselbe Bezeichnung wird durchgehend verwendet werden): EcoRI (1,4) XhoI (0,6) PstI (0,5) PstI (0,1) PstI (0,4) PstI (0,1) PstI (0,5) BamHI (0,1) SalI (0,2) SalI (0,9) XhoI (5,1) HindIII (2,8) BamHI (0,2) SalI (0,8) und HindIII (0,1 >) KpnI. Die Restriktionsstellenkarte für dieses Fragment ist in 1(d) gezeigt. Hind10.0 ist ein DNA-Fragment von ungefähr 10,0 kb, das in der Lage ist, eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide zu übertragen und das Stellen für die folgenden Restriktionsenzyme enthält: EcoRI (1,4) XhoI (0,6) PstI (0,5) PstI (0,1) PstI (0,4) PstI (0,1) PstI (0,5) BamHI (0,1) SalI (0,2) SalI (0,9) XhoI (5,1) HindIII (0,1 >) KpnI. Seine Restriktionsstellenkarte ist in 1(c) gezeigt. Darüber hinaus ist das Hind10.0-Fragment ein Derivat des oben aufgelisteten Eco13.8-Fragments, von dem ein DNA-Fragment von ungefähr 3,8 kB deletiert worden ist, das Stellen für die Restriktionsenzyme HindIII (2,8) BamHI (0,2) SalI (0,8) HindIII enthält. Hind9.9 (1(b)) ist von Hind10.0 durch Deletion eines ungefähr 0,1 kB-Fragments abgeleitet (siehe 1(b) und 1(c)). Xho3.4 ist ein DNA-Fragment von ungefähr 3,4 kB, das in der Lage ist, eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide zu übertragen und das Stellen für die Restriktionsenzyme XhoI (0,6) PstI (0,5) PstI (0,1) PstI (0,4) PstI (0,1) PstI (0,5) BamHI (0,1) SalI (0,2) SalI (0,9) XhoI enthält. Seine Restriktionsstellenkarte ist in 1(a) gezeigt. Xho3.4 ist ein Derivat von Eco13.8, das oben beschrieben ist, von dem ein DNA-Fragment von ungefähr 9,1 kB, das die Stellen für die Restriktionsenzyme XhoI (5,1) HindIII (2,8) BamHI (0,2) SalI (0,8) HindIII (0,1 >) KpnI enthält, und ein DNA-Fragment von ungefähr 1,4 kB, das die Stellen für die Restriktionsenzyme EcoRI (1,4) XhoI enthält, deletiert worden sind.
E. coli-Stämme, die pBS-Plasmide mit den oben beschriebenen Fragmenten, d.h. Eco13.8, Hind10.0 und Xho3.4 (2–4) inseriert enthalten, sind beim Chlamydomonas Genetics Center, c/o Dr. Elizabeth H. Harris, DCMB Group, LSRC Building, Research Drive, Box 91000, Duke University, Durham, North Carolina, 27708-1000 hinterlegt worden. Diese Hinterlegungen werden P-563, P-564 beziehungsweise P-566 bezeichnet. E. coli, das Cos2955 enthält, ist auch beim Chlamydomonas Genetics Center unter der Bezeichnung P-561 hinterlegt worden. Zusätzlich ist Escherichia coli XL1-BLUE/Eco13.8 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, am 19. Juli 1995 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden und ihm ist die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 69870 gegeben worden.
Beispiel 4
Bestimmung der Nucleotidsequenz des Xho3.4-DNA-Fragments
Die Nucleotidsequenz des Xho3.4-DNA-Fragments, das, wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten wurde, wurde durch das enzymatische Sanger- Sequenzierungsverfahren (Sequenase Version 2.0 Kit, USB Inc.) unter Verwendung einer α-³⁵-dATP-Markierung bestimmt. Dieses Protokoll ist unten beschrieben.
Ungefähr 5 μg des Xho3.4-DNA-Fragments, das, wie in Beispiel 4 beschrieben, erhalten wurde, ein Plasmid, das dieses Fragment enthält, oder ein Plasmid, das das 1,7 kb-PstI-XhoI-Fragment des Xho3.4-Fragments enthält, wurde in 0,2 M NaOH, 0,2 M EDTA bei 37°C für 30 min inkubiert. Die DNA wurde durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und mit 70% (V/V) Ethanol gewaschen. Zu diesem Präzipitat wurden 7 μl deionisiertes, destilliertes Wasser, 2 μl Sequenase-Anelierungspuffer (5-fach konzentriert), 1 μl Primer zugefügt, um eine Endzusammensetzung von 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM MgCl₂, 50 mM NaCl und 5 μg/l Primer zu ergeben. Diese Lösung wurde auf 65°C für 2 min erhitzt und auf Zimmertemperatur unter 30°C über 30 min abkühlen gelassen. Die Lösung wurde dann auf Eis platziert. Zu diesem Gemisch wurden 1 μl 0,1 M DTT (Dithiothreit), 2 μl Markierungsgemisch (enthaltend 1,5 μM dGTP, 1,5 μM dCTP, 1,5 μM dTTP), 0,5 ml [α-³⁵S]dATP (10 μCi/ml, 1000 Ci/mMol) und 3 Einheiten Sequenase-Version 2.0 T7 DNA-Polymerase zugefügt. Die Lösung wurde gut gemischt und bei Zimmertemperatur für ungefähr 5 min reagieren gelassen. Zur selben Zeit wurden vier Mikroröhrchen individuell G, A, T und C markiert, und zu diesen wurden 2,5 μl der entsprechenden ddNTP-Reaktionslösungen (zusammengesetzt aus 80 μM dGTP, 80 μM dATP, 80 μM dTTP, 80 μM dCTP, 50 mM NaCl und 8 μM entweder Didesoxy-dGTP, Didesoxy-dATP, Didesoxy-dTTP oder Didesoxy-dCTP) zugefügt. Diese Röhrchen wurden bei 37°C für 1 Std. vorinkubiert. 3,5 μl des vollständigen Markierungs-Reaktionsgemisches wurden dann zu jedem dieser vier Röhrchen zugefügt, schnell gemischt und für ungefähr 5 min bei 37°C reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 4 μl einer Reaktionsstopp-Lösung (enthaltend 95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylolcyanol FF) gestoppt und sofort gemischt. Die Proben wurden durch 8 M Harnstoff-6% (Gew./V) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (ungefähr 65 Watt, ungefähr 4 Std.) analysiert, das Gel wurde getrocknet und einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt und die Sequenz wurde von dem resultierenden Autoradiogramm bestimmt. Die resultierende Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO:1 gezeigt.
Beispiel 5
Biologisch funktionelle, äquivalente DNA-Fragmente, die eine Resistenz gegen Herbizide des Porphyrin-akkumulierenden Typs übertragen
Jede der hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen oder ihre biologisch funktionellen Äquivalente können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Ausdruck „biologisch funktionelle Äquivalente", wie hierin verwendet, bezeichnet Nucleinsäuresequenzen, die dieselbe oder eine ähnliche biologische Aktivität zeigen wie die bestimmten Nucleinsäuresequenzen, die hierin beschrieben ist, d.h. wenn in einer funktionell wirksamen Weise in Pflanzen- oder Algenzellen eingebracht, so dass sie exprimiert werden, übertragen sie darauf eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ.
Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Nucleinsäuresequenzen durch Basensubstitutionen, -additionen oder -deletionen verändert werden, um biologisch funktionell äquivalente Nucleinsäuren zu produzieren, die Proteine codieren, die eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide in vitro und in vivo übertragen. Zusätzlich können aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen dieselben Aminosäuresequenzen, wie hierin beschrieben, codieren und eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide in vitro und in vivo übertragen, in der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen Nucleotidsequenzen, die die gesamten oder Teile der hierin beschriebenen genomischen DNAs umfassen, oder die entsprechenden mRNAs oder cDNAs ein, die durch die Substitution von verschiedenen Codons verändert sind, die einen physiologisch funktionell äquivalenten Aminosäurerest in der Proteinsequenz codieren, wobei eine stille Änderung produziert wird, sind aber nicht darauf limitiert. In ähnlicher Weise schließen die Proteine, die eine porphyrine Herbizid-Resistenz übertragen, oder Derivate davon, die durch die vorliegende Erfindung codiert werden, jene ein, sind aber nicht darauf limitiert, die alle der Aminosäuresequenzen enthalten, die durch die DNA-Sequenzen, im Wesentlichen wie hierin beschrieben, codiert werden, einschließlich veränderter Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste Reste innerhalb der Sequenz substituieren, was in einer stillen Änderung resultiert. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von ähnlicher Polarität substituiert werden, die als ein funktionelles Äquivalent wirkt, was in einer stillen Änderung resultiert. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen ersetzbare nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Ersetzbare polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Aspargin und Glutamin ein. Ersetzbare positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparginsäure und Glutaminsäure ein.
Die Varianten der genomischen DNAs, der entsprechenden mRNAs oder cDNAs und der Proteine, die hierin in Betracht gezogen werden, sollten mehr als 75% Homologie, vorzugsweise mehr als 85% Homologie und am meisten bevorzugt mehr als 95% Homologie mit den natürlich vorkommenden genomischen DNAs, den entsprechenden mRNAs oder cDNAs und den hierin diskutierten Proteinen besitzen. Um diese Homologie zu bestimmen, werden zwei Proteine (oder Nucleinsäuren) gegeneinander ausgerichtet, um unter Verwendung von Lücken und Insertionen eine maximale Zahl von übereinstimmenden Resten zu erzielen. Die Homologie (der zwei Proteine) wird als das Ergebnis der Zahl von übereinstimmenden Aminosäuren, geteilt durch die Zahl der gesamten Aminosäuren plus Lücken und Insertionen, multipliziert mit 100, bestimmt.
Biologisch funktionelle Äquivalente zu den hierin offenbarten Nucleinsäurefragmenten können durch Mutagenesetechniken wie jenen, die zum Beispiel in Osuna, J., Flores, H. und Soberon, X. (Critical Reviews in Microbiology 20: 107–116 (1994)) beschrieben werden, gebildet und durch Transformation und Screenen von Chlamydomonas, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgewählt werden.
Beispiel 6
Isolierung von DNA-Fragmenten, die eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ übertragen, von anderen Organismen als Chlamydomonas reinhardtii
Degenerierte Oligonucleotidprimer, die auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz einer cDNA basieren, die dem RS-3-Gen von Chlamydomonas reinhardtii entspricht, können synthetisiert und verwendet werden, um das äquivalente Gen oder die äquivalente cDNA von Eubakterien, Cyanobakterien, Algen und höheren Pflanzen zu isolieren. PCR-Technologie, die die reverse Transkriptase (Kawasaki, E.S. PCR Protocols, Kap. 3, S. 21, Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, (1990)) und diese degenerierten Oligonucleotide anwendet, kann verwendet werden, um die äquivalenten cDNAs von Algen und höheren Pflanzen zu amplifizieren, und diese können leicht in geeigneten Transformations/Expressionsvektoren für Dikotyledone wie pBIN, beschrieben von Bevan, M. (Nucl. Acids Res. Bd. 12, S. 8711 (1984), oder pZ597, wie von Svab, Z. et al. (Plant Mol. Biol. Bd. 14, S. 197 (1990)) beschrieben, oder für Monokotyledone unter Verwendung von pDB1, beschrieben von Becker, D. et al. (Plant J., Bd. 5, S. 299 (1994)), oder pBARGUS, beschrieben von Vasil, V. et al. [Bio/Technology, Bd. 10, S. 667 (1992)), cloniert werden. Transformierte Pflanzen, die die cDNAs in diesen Vektoren exprimieren, können unter Verwendung von etablierten Vorgehensweisen, wie unten beschrieben, isoliert werden. Alternativ können die degenerierten Oligonucleotide als Sonden verwendet werden, um cDNA-Genbanken von Anbaupflanzen in Lambda-Phagenvektoren wie λZapII (Stratagene) zu screenen. Die entsprechende cDNA kann für das Einbringen in monokotyledone oder dikotyledone Anbaupflanzen in einen geeigneten Transformations/Expressionsvektor transferiert werden, wie unten beschrieben. Im Fall von Eubakterien und Cyanobakterien können die degenerierten Oligonucleotide verwendet werden, um direkt genomische Genbanken zu screenen, und die geeigneten codierenden Sequenzen können in einen dieser Transformations/Expressionsvektoren für Anbaupflanzen transferiert werden, wie unten beschrieben.
Beispiel 7
Transformation von Anbaupflanzen und Algen für die Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ
Die hierin beschriebene Forschung hat DNA-Fragmente identifiziert, die in der Lage sind, eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide auf Pflanzen und Algen zu übertragen. Anbaupflanzen können durch das Einbringen von diesen DNA-Fragmenten oder ihrer biologisch funktionellen Äquivalente gegen porphyrine Herbizide resistent gemacht werden. Diese Erfindung wird die Verwendung von porphyrinen Herbiziden während der Anbaupflanzen-Züchtung erlauben und so die Unkraut-Kontrolle und das Züchtungs-Management von solchen Anbaupflanzen erleichtern.
Da die Chlamydomonas rs-3-Resistenzmutation dominant ist (Sato, R. et al., ACS SymposiumSeries, Bd. 559, Porphyric Pesticides, S.O. Duke und C.A. Rebeiz, Hrsg., Kapitel 7, S. 91 (1994)), kann eine Volllängen-cDNA, die den gegenständlichen DNA-Fragmenten entspricht, unter der Kontrolle der geeigneten stromaufwärts und stromabwärts liegenden regulatorischen Sequenzen in Anbaupflanzen eingebracht werden, denen eine Resistenz gegen Herbizide vom Porphyrin-akkumulierenden Typ fehlt, damit die RS-3-Resistenz verwendet werden kann, um Anbaupflanzen herzustellen, die gegen porphyrine Herbizide resistent sind.
Im Fall von dikotyledonen Anbaupflanzenarten kann das chimäre RS-3-Resistenzkonstrukt in einen binären Agrobacterium-Vektor wie pBIN, beschrieben von Bevan, M. (Nucl. Acids Res. Bd. 12, S. 8711 (1984)), oder pZ597, wie von Svab, Z. et al. (Plant Mol. Biol. Bd. 14, S. 197 (1990)) beschrieben, inseriert werden, durch triparentale Paarung gemäß Hoekema, A. et al. (Nature Bd. 303, S. 197 (1983)) in Agrobacterium transferiert und durch CO-Kultivierung auf Medium, enthaltend Carbenicillin und Kanamycin, in die Blattscheiben einer landwirtschaftlich erwünschten Sorte transformiert werden. Sprosse können von Kanamycin-resistenten Kalli regeneriert und induziert werden, um unter Verwendung von Pflanzengewebekultur-Standardprotokollen (Bevan, M. Nucl. Acids Res. Bd. 12, S. 8711 (1984)) Wurzeln zu bilden. Kanamycin-resistente Pflanzen können auf die Spiegel der Resistenz gegen porphyrine Herbizide getestet und die erwartete dominante 3:1-Segregation kann der Resistenz in Kreuzungen mit empfindlichen Sorten bestätigt werden. Abhängig vom Zuchtsystem für eine bestimmte Anbaupflanzenart können die Herbizid-resistenten Transformanten durch Selbstbestäubung vermehrt oder mit der empfindlichen Sorte rückgekreuzt werden, um eine reinzüchtende, Herbizid-resistente Linie zu etablieren. Beispiele von dikotyledonen Anbaupflanzen, bei denen dieses Verfahren angewendet kann, schließen Alfalfa, Bohnen, Kohl, Karotten, Klee, Baumwolle, verschiedene Kürbisse, Flachs, Erbsen und andere landwirtschaftlich wichtige Leguminosen, Erdnüsse, Paprika, Kartoffeln, Sojabohnen, Zuckerrüben, Sonnenblume, Tabak und Tomaten ein.
Im Fall von monokotyledonen Anbaupflanzenarten kann die Volllängen-RS-3-cDNA in einen monokotyledonen Expressionsvektor wie pDB1, beschrieben von Becker, D. et al. (Plant J., Bd. 5, S. 299 (1994)), oder pBARGUS, beschrieben von Vasil, V. et al. (Bio/Technology, Bd. 10, S. 667 (1992)), fusioniert an den Adh1-Promotor und das Intron oder den Act1-Promotor und an den nos-Terminator, der das GUS-Gen in den Konstrukten ersetzt, inseriert werden. Abhängig von den Arten kann das chimäre Plasmid durch biolistische Transformation in embryogene Kalli, unreife Embryonen, skutellares Gewebe, unreife Blütenstände, Mikrosporen oder Protoplasten eingebracht und Kalli, Sprosse und Pflanzen können unter selektiven Bedingungen in der Anwesenheit von Glufosinat regeneriert werden, auf die das bar-Genprodukt, das durch beide Plasmide codiert wird, eine Resistenz überträgt. Glufosinat-resistente transgene Pflanzen können dann auf das Ausmaß der Resistenz gegen porphyrine Herbizide getestet und die erwartete dominante 3:1-Segregation kann in Kreuzungen mit empfindlichen Sorten bestätigt werden. Abhängig vom Zuchtsystem für eine bestimmte Anbaupflanzenart können die Herbizid-resistenten Transformanten durch Selbstbestäubung vermehrt oder mit der empfindlichen Sorte rückgekreuzt werden, um eine Herbizid-resistente Reinzuchtlinie zu etablieren. Beispiele von monokotyledonen Anbaupflanzen, bei denen dieses Verfahren angewendet werden kann, schließen Gerste, Mais, Futterpflanzen, Hafer, Zwiebeln, Reis, Roggen, Hirse, Zuckerrohr und Weizen ein.
Wenn solche Anbaupflanzen, die dadurch eine Resistenz gegen porphyrine Herbizide erworben haben, gezüchtet werden, wird die Verwendung dieser Herbizide bei diesen Anbaupflanzen realisierbar. Dies sollte eine einfachere und wirksamere Bekämpfung Unkrauts ermöglichen und den Wert dieser Herbizide in der landwirtschaftlichen Verwendung erhöhen. Darüber hinaus sollte es durch Verwendung der gegenständlichen DNA-Fragmente als Sonden möglich sein, andere DNA-Fragmente in Anbaupflanzen zu identifizieren, die einen hohen Grad an Sequenzhomologie mit den gegenständlichen DNA-Fragmenten zeigen. Dies sollte es möglich machen, vor ihrer tatsächlichen Behandlung mit solchen Herbiziden qualitativ und/oder quantitativ zu bewerten, ob eine bestimmte Anbaupflanze resistent gegen porphyrine Herbizide sein wird. Zusätzlich könnte dieses Gen als ein genetischer Resistenz-Typ-Marker in der Pflanzen-Gentechnologieforschung und Pflanzen-Molekularbiologie/Biotechnologie verwendet werden und sollte daher eine signifikante industrielle Anwendung haben.
Aufgrund einer solchen Beschreibung der Erfindung wird es offensichtlich sein, dass dieselbe auf viele Arten variiert werden kann. Solche Variationen werden nicht als ein Abweichen vom Rahmen der Erfindung angesehen, und alle solchen Modifikationen, wie sie für einen Fachmann offensichtlich sein würden, sollen im Rahmen der folgenden Ansprüche eingeschlossen sein, was für einen Fachmann offensichtlich sein würde. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes, gereinigtes DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, welches Resistenz gegenüber Herbiziden des Porphyrin akkumulierenden Typs überträgt, wenn es in Pflanzen- oder Algenzellen exprimiert wird, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Nucleotidsequenz SEQ ID. No:1 oder einem Teilbereich davon; (b) einer Nucleotidsequenz, welche mindestens zu 85% homolog zur Nucleotidsequenz aus (a) ist; (c) einer Nucleotidsequenz, welche mit einer Nucleotidsequenz aus (a) hybridisiert; und (d) einer Nucleotidsequenz, die verwandt ist mit einer Nucleotidsequenz aus (a) durch die Degeneration des genetischen Codes.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass es: (a) Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI und HindIII enthält und eine Restriktionsstellenkarte wie in 1(b) gezeigt aufweist; und (b) eine Molekulargröße von ungefähr 9,9 kb hat.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass es: (a) Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI, HindIII und KpnI enthält und eine Restriktionsstellenkarte wie in 1(c) gezeigt aufweist; und (b) eine Molekulargröße von ungefähr 10,0 kb hat.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass es: (a) Restriktionsstellen für EcoRI, XhoI, PstI, PstI, PstI, PstI, PstI, BamHI, SalI, SalI, XhoI, HindIII, BamHI, SalI, HindIII und KpnI enthält und eine Restriktionsstellenkarte wie in 1(d) gezeigt aufweist; und (b) eine Molekulargröße von ungefähr 13,8 kb hat.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Herbizid des Porphyrin akkumulierenden Typs N-(4-Chlor-2-fuor-5-propargyloxy)phenyl-3,4,5,6-tetrahydrophthalimido oder 7-Fluor-6-[(3,4,5,6)-tetrahydrophthalimido]-4-(2-propinyl)-1,4-benzoxazin-3(2H)-on ist.
Plasmid, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Mikroorganismus, enthaltend das Plasmid nach Anspruch 6.
Verfahren zur Übertragung der Resistenz gegenüber Herbiziden des Porphyrin-akkumulierenden Typs auf Pflanzen- oder Algenzellen, umfassend das Einbringen eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einer cDNA entsprechend einer mRNA, die von einem DNA-Molekül nach Anspruch 1(a), (b) oder (d) codiert wird, in die Pflanzen- oder Algenzellen, wobei das DNA-Molekül oder die cDNA exprimiert wird.
Pflanze, in welche ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eine cDNA entsprechend einer mRNA, die von einem DNA-Molekül nach Anspruch 1(a), (b) oder (d) codiert wird, eingebracht wurde, wobei das DNA-Molekül oder die cDNA exprimiert wird.
Protein, das durch ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird, wobei das Protein Resistenz gegenüber Herbiziden des Porphyrin-akkumulierenden Typs überträgt, wenn es in Pflanzen- oder Algenzellen exprimiert wird.
Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5, um Pflanzen oder Algen resistent gegenüber Herbiziden des Porphyrin-akkumulierenden Typs zu machen.
Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als genetischen Markerr.