CN117964723A - 蛋白Arc1及其在水稻抗病性和培育抗除草剂植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白Arc1及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明首次研究发现，蛋白Arc1能够显著影响条斑病菌的致病力；外源喷施蛋白Arc1可显著诱导水稻早期免疫反应，减少条斑病害的产生；异源表达蛋白Arc1的水稻植株比野生型表现的更抗病；异源表达蛋白Arc1的水稻植株对除草剂具有很强的抗性。因此，蛋白Arc1在绿色防治细菌性病害方面和培育抗除草剂植物领域中具有非常广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及蛋白Arc1及其在水稻细菌性条斑病菌抗性和培育抗除草剂植物中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是全球重要粮食作物之一。目前制约着水稻产业发展的原因有二，一是由稻黄单胞菌条斑病致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起的细菌性条斑病每年会给水稻造成高达30％的产量损失，二是农田草害不仅直接造成作物产量和品质的降低，而且是多种病虫害的宿源地，间接影响作物的正常生长发育和产量形成。因此，控制稻田杂草与防治水稻细菌性条斑病，对于提高水稻产量、保障粮食生产安全有着重要意义。
在现阶段的水稻生产过程中，防治水稻细菌性条斑病与稻田杂草仍以喷施化学药剂为主，但过度使用化学药剂不仅会破坏生态环境，造成空气污染、水体污染、土壤污染，同时还会导致有毒物质在作物表面残留和积累，这些有害物质是人们慢性疾病的潜在威胁。因此，发掘绿色免疫诱抗剂或者培育并应用广谱抗性品种是替代化学防治的有效措施。
深入了解水稻与细菌性条斑病互作的分子机制，有助于开发新的广谱有效的细菌性条斑病菌防治策略。在植物与病原微生物长期互作选择及协同进化的过程中，植物进化出了细胞膜表面的模式识别受体通过识别病原相关分子模式触发初级免疫反应，包括活性氧的爆发、钙离子内流、胼胝质沉积、防御基因的表达等。因此，寻求良好的植物源制剂，通过触发植物先天免疫反应来提高水稻对细菌性条斑病抗性，可以为细菌性条斑病的防治提供绿色环保、精准高效的新思路。
在农业生产中，杂草不仅会与作物争夺光照、生长空间与营养物质，而且还会传播病虫害，杂草蔓延会严重影响作物的生长发育。喷施除草剂是清除杂草的有效治理方式，但是除草剂的喷施在一定程度上也会对作物造成伤害，影响作物产量。因此提高作物对除草剂的抗性，培育耐除草剂的作物品种成为遗传育种研究领域的重要方向。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种蛋白Arc1及其在水稻细菌性条斑病菌抗性中的应用。经验证，本发明的蛋白Arc1能够显著诱导水稻早期免疫反应，减少细菌性条斑病害的发生，在绿色防治细菌性病害方面具有广阔的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面，提供了蛋白Arc1在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)激活水稻免疫信号；
(2)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(3)制备防治水稻细菌性条斑病的药剂；
(4)培育抗除草剂的水稻新品种；
所述蛋白Arc1为如下(A1)或(A2)或者(A3)任一所示的蛋白质：
(A1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)在(A1)中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
(A3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的蛋白质，其功能与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质相同。
所述除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类。
所述伴侣蛋白Arc1通过如下(a)或(b)途径来增强水稻对细菌性条斑病菌的抗性：
(a)诱导水稻防御基因的表达；
(b)触发水稻活性氧的爆发。
本发明第二方面，提供了编码上述蛋白Arc1的基因在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(2)培育抗细菌性条斑病菌的水稻品种；
(3)培育抗除草剂的水稻品种；
所述基因为如下(A1)-(A3)任一所示的核酸分子：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子；
(A2)与(A1)的核苷酸序列具有90％或90％以上同源性且表达相同或者相似功能蛋白质的DNA分子，以及对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；
(A3)除(A1)以外的编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核酸分子。
本发明第三方面，提供了含有编码蛋白Arc1的基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(2)培育抗细菌性条斑病的水稻品种；
(3)培育抗除草剂的水稻品种。
上述方法中，所述重组表达载体可用现有的植物表达载体或原核表达载体构建。所述载体包括双元农杆菌载体和用于原核表达的载体等，如pCXUN、pCAMBIA1300、pTA7001、pTA7002、pBin、PET-30a、PMAL-C2X、pGEX-4T或其它衍生载体。用蛋白Arc1构建重组表达载体时，可结合任意一个或多个增强子或启动子，所述增强子或启动子包括翻译增强子或转录增强子，增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如35S启动子、Ubiquitin启动子、地塞米松诱导型启动子等。
本发明第四方面，提供了一种提高水稻对细菌性条斑病菌抗性的方法，包括：在水稻中异源表达蛋白Arc1的步骤。
上述方法中，在水稻中异源表达蛋白Arc1可以通过外源转入编码蛋白Arc1的基因的方法。
本发明第五方面，提供了一种提高水稻对除草剂的抗性的方法，包括：构建蛋白Arc1超量表达转基因植株的步骤；
优选的，所述的除草剂为精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。
本发明第六方面，提供了一种防治水稻细菌性条斑病的免疫诱抗剂，所述免疫诱抗剂以上述蛋白Arc1为活性成分。
所述免疫诱抗剂中，蛋白Arc1的浓度为0.01-0.5mg/ml。
本发明第七方面，提供了一种防治水稻细菌性条斑病的方法，包括以下步骤：
在水稻细菌性条斑病害产生前，将上述蛋白Arc1或者上述免疫诱抗剂喷施于水稻叶片。
本发明的有益效果：
本发明首次研究发现，蛋白Arc1能够显著影响条斑病菌的致病力；外源喷施效应蛋白Arc1可显著诱导水稻早期免疫反应，减少条斑病害的产生；异源表达蛋白Arc1的水稻植株比野生型表现的更抗病；异源表达蛋白Arc1的水稻植株对除草剂具有很强的抗性。因此，蛋白Arc1在绿色防治细菌性病害方面和培育抗除草剂植物领域中具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1：蛋白Arc1对条斑病菌致病力的影响。
图2：外源喷施蛋白Arc1可以诱导水稻防御基因的表达。
图3：外源喷施蛋白Arc1可以触发水稻活性氧的爆发。
图4：外源喷施蛋白Arc1可以提高水稻对RS105的抗性。
图5：表达蛋白Arc1的水稻比野生型更抗细菌性条斑病。
图6：表达蛋白Arc1的水稻比野生型更抗除草剂。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明，而非限制本发明的范围。
如前所述，水稻是重要的粮食作物之一，细菌性条斑病害与田间草害的发生严重制约着水稻产量和品质的提升。化学防治是目前最主要的防治手段，但过度使用化学药剂不仅会破坏生态还会导致有毒物质直接或间接在作物与人体中积累，对人类健康造成不可逆转的伤害。发掘绿色免疫诱抗剂或者培育并应用广谱抗性品种是替代化学防治的有效措施。
基于此，本发明的目的是提供蛋白Arc1在水稻抗病中的应用。本发明验证了蛋白Arc1是影响稻黄单胞菌条斑病致病变种致病力的关键一员，同时还可以作为免疫诱抗剂的活性成分，外源喷施蛋白Arc1不仅可以被水稻受体识别激发活性氧的爆发，还可以提高水稻对细菌性条斑病的抗性。并且，异源表达蛋白Arc1的水稻植株对除草剂具有很强的抗性。
编码蛋白Arc1的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGAAAACTTTGACAGGCGCAGACGCACTCGAATTTCATAAGAAGCTTAAGGAACGCAATAAAGCCTTACATGCTTCCGACCTCGAGTTAGCACTGGTGCACGCCGATGCTGTCGGCAAAGAACGGTTCGATCTCGAGGAGCTGGAGAAAATTTGCGATACCAGCGATGCGGGGCGCCTTACTGATGCGAAAGAGCGAAACGACATATATGAACGGATGTACTACGTTGAGTATCCCAACGTTATGACGTTAAAGGAATTCGCTCATATCGTCGAGACACTTTTCTCGTGGTCATGA
蛋白Arc1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MKTLTGADALEFHKKLKERNKALHASDLELALVHADAVGKERFDLEELEKICDTS DAGRLTDAKERNDIYERMYYVEYPNVMTLKEFAHIVETLFSWS
本发明通过原核表达并纯化得到蛋白Arc1。外源喷施蛋白Arc1，发现蛋白Arc1可以显著诱导水稻防御基因的表达。本发明外源喷施蛋白Arc1后接种RS105，发现蛋白Arc1可以显著提高水稻对RS105的抗性。通过构建蛋白Arc1超量表达的转基因植株，发现其有明显的抗细菌性条斑病表型。通过对异源表达蛋白Arc1的水稻植株喷施精噁唑禾草灵，发现其对除草剂具有很强的抗性。
综合上述试验结果可以确定：蛋白Arc1及其编码基因具有防治水稻细菌性条斑病和培育抗除草剂植物的功效，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
本发明实施例中所使用的水稻细菌性条斑病菌为RS105菌株，记载在非专利文献“水稻黄单胞菌遗传操作体系的建立及hrp基因和avrBs/thA家族基因的功能研究”(上海交通大学博士学位论文，2004年)中，公众可从申请人处获得以用于重复本试验。
本发明实施例中所用诱导培养基、筛选培养基、分化培养基、生根培养基按照崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩.(2018).农杆菌介导水稻快速转化.Bio-101：e1010176.Doi:10.21769/BioProtoc.1010176.中记载的配置方法进行配置。
实施例1：蛋白Arc1调控条斑病菌生理小种RS105的致病力检测
1.试验作物：水稻(水稻品种为‘中花11’，下文中称“ZH11”)。
2.种植方式：水稻在温室中种植，每天交替进行16小时光照、8小时黑暗，培养温度为常温28℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。
3.试验方法：
将Arc1上游200bp和下游200bp融合成一个片段，并连接到pk18mobsacB载体上，将测序正确的阳性克隆电转入RS105中，并在含有kana抗生素(50μg/mL)的NAN培养基(多价蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，牛肉膏3g/L，琼脂15g/L)和不含抗生素的NAS培养基(多价蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，牛肉膏3g/L，蔗糖100g/L，琼脂15g/L)上筛选，28℃培养，长出单菌落后，PCR检测是否缺失Arc1片段。验证无误的即为缺失Arc1的RS105突变体(RS105_ΔArc1)。
将Arc1连接到pVSP61载体上，将测序正确的阳性克隆电转入RS105_ΔArc1中，并在含有kana抗生素(50μg/mL)的PSA培养基(蛋白胨10g/L，蔗糖10g/L，谷氨酸1g/L，琼脂15g/L)上28℃培养3天，长出单菌落后PCR检测，验证无误的即为携带Arc1的回补菌株(RS105_ΔArc1(Arc1)。
将RS105、缺失Arc1的RS105突变体(RS105_ΔArc1)、携带Arc1的回补菌株(RS105_ΔArc1(Arc1))接种于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)上，28℃培养3天后，接种于4周大的ZH11水稻叶片上，并于10天后统计病斑长度。
实验结果：蛋白Arc1调控条斑病菌生理小种RS105的致病力的效果显著(图1)。
实施例2：外源喷施蛋白Arc1对水稻防御基因表达以及抗条斑病性能影响考察
1.实验方法
将编码蛋白Arc1的基因cDNA全长序列(见SEQ ID NO.1)扩增出来，并连接到原核表达载体pMAL-C2X。将构建好的载体转入感受态BL21，挑选测序正确的阳性克隆进行原核表达。将转入空载体、Arc1的BL21在含有1mMIPTG的LB液体培养基中37℃诱导表达3h。表达完成后，用缓冲液(50mMTris-Hcl(pH8.0)、1mMEDTA、100mMNacl、1％NP-40)重悬菌体，用超声波破碎仪破碎10min，4度离心6000rpm，10min，收集上清。将获取的蛋白用试剂盒(北京聚合美M5HiPerMBP蛋白纯化层析介质)进行纯化，获得纯化的空载体、Arc1，用于后续对水稻防御基因表达效果、水稻活性氧影响效果以及抗水稻条斑病抗性检测。
其中，蛋白Acr1诱导水稻防御基因表达检测方法如下：
将5mg纯化好的空载体(CK)、Arc1均匀的喷施到ZH11水稻叶片上，喷施后2h将叶子剪下立即用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。分别取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。并通过网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计好相应的实时定量PCR引物P1、P2、P3、P4、P5、P6，具体如下：
P1:TTCATCTGGTCAGCGGATAGC；SEQ ID NO.3
P2:TATCACGACCGTTCGATGGA；SEQ ID NO.4
P3:CCTGCCGAATACGCCTAAGA；SEQ ID NO.5
P4:CTCAAACGCCACGAGAATTT；SEQ ID NO.6
P5:AGCAATCGTCCGGGAATTC；SEQ ID NO.7
P6:GAAGTAGGCCTTTGGGTGCTT；SEQ ID NO.8
用设计的引物P1、P2、P3、P4、P5、P6进行实时定量RT-PCR分析接种处理后水稻防御基因的表达。
蛋白Arc1触发水稻活性氧检测方法如下：
将5mg纯化好的空载体、Arc1均匀的喷施到ZH11水稻叶片上，喷施后2h将叶子剪下浸泡到0.5mg/mL的DAB溶液中，光照8h后，将DAB溶液换成95％乙醇，95℃脱色。
蛋白Arc1调控水稻条斑病抗性检测方法如下：
将5mg纯化好的空载体、Arc1均匀的喷施到ZH11水稻叶片上，喷施后2h接种RS105，接种量保持一致，并于14天后统计病斑长度。
2.实验结果
实时定量RT-PCR检测结果显示，蛋白Arc1可以显著诱导水稻防御基因(PR8、PR10、WRKY45)的表达(图2)。
活性氧检测结果显示，蛋白Arc1可以显著触发水稻活性氧的爆发(图3)。
调控水稻条斑病抗性检测结果显示，蛋白Arc1可以显著提高水稻对RS105的抗性(图4)。
通过上述实验结果，可以得出蛋白Arc1具有激活水稻免疫信号从而诱导水稻防御基因的表达，触发水稻活性氧的爆发以及增强水稻对细菌性条斑病的抗性的作用。
实施例3：Arc1转基因株系调控水稻条斑病以及抗除草剂抗性检测
1.实验方法
为进一步验证Arc1具有调控水稻条斑病抗性的作用，利用地塞米松诱导型启动子进行了Arc1转基因水稻的遗传转化。具体操作如下：
将Arc1连接到pTA7001载体上，测序正确的克隆转入农杆菌EHA105中。将成熟的ZH11去壳，75％酒精消毒，并将种子放置于诱导培养基30℃光照培养一周。将携带Arc1的EHA105和愈伤组织共培养3天。共培养完成后，用灭菌蒸馏水清洗愈伤，并将愈伤放置于筛选培养基上，30℃光照培养20天后转入分化培养基分化培养，在生根培养基中诱导水稻苗长出健壮根系，直至形成完整植株。PCR检测正确的阳性植株收种子，T1代用于水稻条斑病以及抗除草剂抗性检测实验。
将30mM地塞米松喷施于Arc1转基因植株(DEX::Arc1)叶片表面，诱导表达12h以后接种RS105，并于14天后统计病斑长度。实验重复3次，最终实验结果取平均值绘制柱状图。
随机选择30株获得的T1代Arc1转基因材料和30株ZH11水稻进行除草剂喷施实验。将30mM地塞米松喷施于Arc1转基因植株(DEX::Arc1)叶片表面，诱导表达12h后用喷雾器喷施精噁唑禾草灵，施精噁唑禾草灵喷施7天后观察水稻生长状况。实验重复3次。随机选取实验后的Arc1转基因植株(DEX::Arc1)和ZH11水稻植株拍照观察表型。
2.实验结果
通过对病斑长度进行统计结果表明，Arc1转基因株系(DEX::Arc1)对RS105具有显著的抗性(图5)。
通过对水稻植株喷施除草剂实验结果表明，Arc1转基因株系(DEX::Arc1)对除草剂具有显著的抗性(图6)。
通过上述实验结果，可以得出构建的蛋白Arc1超量表达转基因植株在抗水稻条斑病以及抗除草剂方面效果显著，本发明实验结果表明蛋白Arc1在绿色防治细菌性病害方面和培育抗除草剂植物领域中具有非常广阔的应用前景。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.蛋白Arc1在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)激活水稻免疫信号；
(2)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(3)制备防治水稻细菌性条斑病的药剂；
(4)培育抗除草剂的水稻新品种；
所述蛋白Arc1为如下(A1)或(A2)或者(A3)任一所示的蛋白质：
(A1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)在(A1)中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；
(A3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的蛋白质，其功能与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质相同。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白Arc1通过如下(a)或(b)途径来增强水稻对细菌性条斑病菌的抗性：
(a)诱导水稻防御基因的表达；
(b)触发水稻活性氧的爆发。
4.编码权利要求1所述蛋白Arc1的基因在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(2)培育抗细菌性条斑病菌的水稻品种；
(3)培育抗除草剂的水稻品种；
所述基因为如下(A1)-(A3)任一所示的核酸分子：
(A1)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子；
(A2)与(A1)的核苷酸序列具有90％或90％以上同源性且表达相同或者相似功能蛋白质的DNA分子，以及对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；
(A3)除(A1)以外的编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核酸分子。
5.含有编码蛋白Arc1的基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)增强水稻对细菌性条斑病的抗性；
(2)培育抗细菌性条斑病的水稻品种；
(3)培育抗除草剂的水稻品种。
6.一种提高水稻对细菌性条斑病菌抗性的方法，其特征在于，包括：在水稻中异源表达蛋白Arc1的步骤。
7.一种提高水稻对除草剂的抗性的方法，其特征在于，包括：构建蛋白Arc1超量表达转基因植株的步骤；
优选的，所述除草剂为精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。
8.一种防治水稻细菌性条斑病的免疫诱抗剂，其特征在于，所述免疫诱抗剂以权利要求1所述的蛋白Arc1为活性成分。
9.根据权利要求8所述的免疫诱抗剂，其特征在于，所述免疫诱抗剂中，蛋白Arc1的浓度为0.01-0.5mg/ml。
10.一种防治水稻细菌性条斑病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在水稻细菌性条斑病害产生前，将权利要求1所述的蛋白Arc1或者权利要求8或9所述的免疫诱抗剂喷施于水稻叶片。
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