JPH04501855A - ストレプトマイシスにおけるｓａｆポリペプチド、遺伝子、プロモーターおよび発現用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （９）請求項８記載の宿主細胞を培養することによるポリペプチドの製造方法。

（１０）請求項３記載のＤＮＡ配列を含むベクター。

（１１）ＤＮＡ配列が調節単位と近接している、請求項１０ｇ己載０ベクター。

（１２）Ａ　Ｔ　Ｇまでの上流にある調節単位が下記ヌクレオチド配列：ＡＧＡ ＴＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＣＧＭＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＴＡ ＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴ を有する、請求項１１記載のベクター。

（１３）請求項１Ｏ記載のベクターにより形質転換されたストレプトマイシス宿 主細胞。

（１４）請求項１３記載の宿主細胞を培養することによる、ポリペプチドの製造 方法。

（１５）請求項４記載のＤＮＡ配列を含むベクター。

’（１６）Ｄ　Ｎ　Ａ配列が調節単位と近接している、請求項１５記載のベクタ ー。

（１７）ＡＴＧまでの上流にある調節単位が下記ヌクレオチド配列：ＴＴＣＡＧ ｅＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴ を有する、請求項１６記載のベクター。

（１８）請求項１５記載のベクターにより形質転換されたストレプトマイシス宿 主細胞。

（１９）請求項１８記載の宿主細胞を培養することによる、ポリペプチドの製造 方法。

（２０）プラスミドｐＵＬＡＤ３゜ （２１）下記ＤＮＡ配列： 入ＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＣＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＣＧＧＧＣＧＡＡＧＴＡＧＧ ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＣ ＧＧＴＧＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＡＧＧＣＣＧＴＧＣ ＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧ ＣＴ を有するプロモーター。

（２２）請求項２１記載のプロモーターと機能し得るように結合したポリペプチ ドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むクローニング・ビヒクル。

（２３）ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシスにとって内在性の配列である、請求 項２２記載のクローニング・ビヒクル。

（２４）ＤＮＡ配列が、非ストレプトマイシス・ポリペプチドまたは蛋白質をコ ードするＤＮＡ配列と同じ解読枠内で融合したストレプトマイシスにとって内在 性のポリペプチドまたは蛋白質をコードする配列の全部または一部分を含む、請 求項２２記載のクローニング・ビヒクル。

（２５）請求項２２記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。

（２６）請求項２３記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。

（２７）請求項２４記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。

（２８）ストレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ配列を発現させる方法であって 、外来ＤＮＡ配列を請求項２１記載のプロモーターを含むストレプトマイシス発 現制御配列と機能し得るように結合させることを含む方法。

（２９）外来Ｄ　Ｎ　Ａ配列およびストレプトマイシス発現制御配列を、ストレ プトマイシスの染色体ＤＮＡに挿入する、請求項２８記載の方法。

（３０）さらに宿主ストレプトマイシスが、ＳＡＦ型のポリペプチドを発現し得 るプラスミドを含む、請求項２９記載の方法。

（３１）外来ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシスから分泌される蛋白質またはポ リペプチドのシグナル配列の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列を介して ストレプトマイシス発現制御配列と機能し得るように結合されており、シグナル 配列をコードするＤＮＡ配列が、ストレプトマイシス発現制御配列の制御下で外 来ＤＮＡ配列と一緒に発現されることにより、外来ＤＮＡ配列によりコードされ る蛋白質またはポリペプチドが分泌され得る、請求項２８記載の方法。

明　細　書 ストレプトマイシスにおけるＳＡＦポリペプチド、遺伝子、プロモーターおよび 発現用途 発明の分野 この発明はバイオテクノロジー分野に属する。さらに詳しくは、この発明は、細 胞外酵素の生産性を高める新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするＤ ＮＡ、前記ＤＮＡを含む組換え体ベクター、およびポリペプチドをコードするＤ ＮＡを含む組換え体ベクターにより形質転換された宿主生物に関するものである 。さらに、この発明は、新規ポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター配 列に関するものである。さらにこの発明は、ストレプトマイシス発現系並びにス トレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ配列を発現させ、周囲の培地に前記外来Ｄ ＮＡ配列によりコードされたポリペプチドおよび蛋白質を分泌させる方法に関す るものである。

発明の背景 ストレプトマイシスは、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キシラナーゼ、セルラ ーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヌクレアーゼを含む様々な細胞外酵素のよく 知られた生産体である。

さらに、ストレプトマイシス属の構成員は、多数の抗生物質、色素および他の２ 次代謝物を産生じ、胞子を形成させる複雑な分化パターンを有する。ストレプト マイシスのパッチ培養物では、通常、細胞外酵素の生産性並びに抗生物質製造お よび色素生合成および胞子形成の開始か一致している。これらのプロセスは全て 、高い生長割合に有利な栄養条件により抑制され、Ｐ、ＣまたはＮ供給源を断つ ことにより抑制解除される。酵素分泌、２次代謝物の形成および分化は完全に独 立したものであるが、似たトリガー機構に反応すると思われる。

細胞外酵素をコードする幾″つかのストレプトマイシス属は既にクローン化され ている。これらの例としては、ストレプトマイシス・コエリコロルからのアガラ ーゼ、ストレプトマイシス・プリカラスからのエンドグリコシダーゼＨ、ストレ プトマイシス・リビダンスからのキシラナーゼ、ストレプトマイシス・ヒグロス コピクスからのアルファーアミラーゼ、ストレプトマイシス・ｓｐＡ　２からの セルラーゼ、ストレプトマイシス・リビダンスからのベーターガラクトシダーゼ およびストレプトマイシス・カカオイ、バジウスおよびフラディアエからのベー ターラクタマーゼがある。

しかしながら、これらの遺伝子の発現を制御する調節機構は事実上未知である。

栄養素の取捨選択（シフトダウン）後に幾つかのポリマー性基質分解酵素の同時 生成がストレプトマイシスにおいて観察されたことから、特異的な調節機構、例 えばデキストリンまたはマルトトリオースによるアミラーゼの誘導およびアミラ ーゼまたはアガラーゼの炭素代謝物四節に加えて、幾つかの細胞外酵素の抑制解 除の一般的機構が存在すると思われる。それらのトランス作用調節遺伝子は、バ チラス・スブチリス（ツヤ−ナル・オン・バクテリオロジー、１６９：３２４− ３３３．１９８７）、バチラス・ナツト（ジャーナル・オン・バクテリオロジー 、１６６：２０−２８．１９８６）およびバチラス・リチェニホルミスにおいて 見出された。

酵素合成および／または分泌に作用する陽性調節遺伝子は、低分泌性株、例えば ストレプトマイシス・リビダンスにおいて細胞外酵素の高い分泌性を捜すことに よりクローン化され得る。

ストレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ配列を発現させるシステムは、例えばＥ Ｐ１４８５５２およびＷＯ３Ｂ１０７０７９で既に記載されている。これらのシ ステムは、ストレプトマイシスにより産生された細胞外酵素の内在性プロモータ ーを使用する。

発明の目的 この発明の主たる目的は、新規アミノ酸ポリペプチド（以後、ＳＡＦポリペプチ ドと称す）をコードする、新たに分離された遺伝子（以後、５ａｆ（２次代謝活 性化因子）遺伝子と称する）のクローニングおよび特性検定法の提供である。Ｓ ＡＦポリペプチドは、細胞外酵素の構造遺伝子の制御領域と相互作用することに より、ストレプトマイシスにおける細胞外酵素に関する遺伝子の発現を直接的ま たは間接的に変調する。

この発明の第２の態様は、発現時に上記ＳＡＦポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列を含むＤＮＡ単位またはフラグメントである。

この発明の第３の態様は、上記ＤＮＡを含むクローニング・ビヒクル（ベクター ）である。

この発明の第４の態様は、上記クローニング・ビヒクルにより形質転換された結 果、細胞外酵素または所望の異種ポリペプチドの生産性が高められた宿主生物ま たは細胞である。

この発明の第５の態様は、この発明に従い形質転換された宿主生物を培養し、培 養ブロスから生成物を回収することによる、細胞外酵素または所望のポリペプチ ドの製造方法である。

この発明のさらに別の態様はｓａｆ遺伝子のプロモーターである。

この発明のさらに別の態様は、内在性細胞外酵素の分泌性シグナル領域と機能し 得るように結合したｓａｆ遺伝子のプロモーターを含む（両方とも外来ＤＮＡ配 列に機能し得るように結合している）クローニング・ビヒクル（ベクター）、並 びに前記クローニング・ビヒクルにより形質転換された結果、外来ＤＮＡ配列に よりコードされる外来ポリペプチドを発現および分泌する宿主生物または細胞の 製造に関するものである。

この発明のさらに別の態様は、ストレプトマイシスの染色体ＤＮＡへの、外来Ｄ ＮＡ配列を有する上記クローニング・ビヒクルの組み込みである。好ましい実施 態様において、ｓａｆ遺伝子を含む発現ベクターはまた上記形質転換生物に組み 込まれる。

この発明の上記および他の対象は、さらに明細書においてより詳細に記載されて いる。

発明の要旨 ストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣＩ　０１３７から、ストレプトマイシ ス・リビダンスおよびストレプトマイシス・コエリコロルにおける少なくとも５ 種の細胞外酵素に関する共通の制御機構に関与する遺伝子５ａｔ（２次代謝活性 化因子）をコードするＤＮＡフラグメントが単離された。ｓｓｒ遺伝子は試験さ れた全てのストレプトマイシスに存在することから、この遺伝子が代謝において 重要な役割を担うに違いないことが示されている。事実、我々は、ストレプトマ イシス・グリセウスＴＭＲＵ３５７０というカンディンディン生産株からｓａｆ と似た遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをクローン化した。若干のストレプトマ イシス、例えばストレプトマイシス・リビダンスおよびストレプトマイシス・ラ クタムデユランスの場合、ハイブリダイゼーション・パターンは、ｓａｆ遺伝子 が染色体ＤＮＡにおける幾つかのコピーに存在することを示唆している。

これは、ストレプトマイシスにおける細胞外酵素の製造および胞子形成に関与す る遺伝子の最初の例である。

ｓａｔ遺伝子は、１１３個のアミノ酸を有するポリペプチド（ＳＡＦポリペプチ ド）をコードする。エシェリヒア・コリでのインビトロ転写−翻訳試験は、正確 なサイズが約１５０００ダルトンの蛋白質が形成されることを示している。ＳＡ Ｐポリペプチドは、強い正電荷を有しく１８個の正電荷アミノ酸）、ペプチド・ リーダーまたは膜内性蛋白質に典型的な組成を示さないため、蛋白質排出に対す る直接作用はありそうもないと思われる。正電荷蛋白質はＤＮＡと容易に相互作 用し得る。事実、幾つかの調節蛋白質に典型的なりＮＡ結合ドメイン（アニュア ル・レビュー・オン・バイオケミストリー、５３＋２９３−３２１．１９８４） がＳＡＰポリペプチドにおいて観察されている。ｓａｆプロモーターは、予想外 にも細胞外酵素の天然プロモーターよりも強力であることが見出された。例えば 、アミラーゼ遺伝子は、ｓａｆプロモーターを天然アミラーゼ・プロモーターの 代わりに用いた場合、かなり大量のアミラーゼを発現する。すなわち、蛋白質の 天然プロモーターの代わりにｓａｆプロモーターを用いることにより、内在性ポ リペプチドまたは蛋白質の発現を向上させることができる。

ＳＡＦポリペプチドは、細胞外酵素、色素生成および分化に対する多面発現作用 、すなわち複数の経路に作用する効果を有する。この発明により、内在性（細胞 外）蛋白質の生産性増強が達成される。

広範には、ｓａｔ遺伝子および対応するポリペプチドを用いて、細胞外酵素をコ ードする遺伝子の適当な開裂部位へ所望の蛋白質をコードする遺伝子を挿入しく この発現はＳＡＰまたはその一部分により高められる）、組換え遺伝子によりｓ ａｆ遺伝子を含むストレプトマインス宿主を形質転換し、形質転換された細菌を 培養して選択された蛋白質またはその一部分を排出させることにより、選択され た異種蛋白質のストレプトマイシスにおける発現を増強することができる。好ま しくは、ｓａｆプロモーターの制御下において、異種ＤＮＡを染色体ＤＮＡに挿 入しく組み込み）、ＳＡＦポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクター を同時に挿入する。発現ベクターを染色体ＤＮＡへ組み込む必要はない。

ストレプトマイシスにおける抗生物質の生合成および分化に作用する多面発現性 遺伝子が報告されている。ストレプトマイシス・コエリコロルおよびストレプト マイシス・リビダンスにおいてＡ因子、アクチノルホジンおよびプロジギオンン の生成を積極的に制御する遺伝子ａｆｓＢは、ストレプトマイシス・コエリコロ ルＡ３（２）からクローン化された（堀之内等、ジャーナル・オン・バクテリオ ロジー、１５５：１２３８−１２４８．１９８３）。

ｓａｒ遺伝子はａｆｓＢとは異なる。事実、それらはアクチノルホジンの生成に 対して反対の作用を有する。それらは、ＤＮＡ結合蛋白質に典型的なアミノ酸配 列を有する点で共通している。ａｆｓＢおよびＳａｆ遺伝子は両方とも、−１０ および一３５共通配列を伴わないプロモーターを有し、潜在的翻訳調節シグナル 並びに転写ターミネータ−として作用し得る強いステムおよびループ構造により 結合している（堀之内等、ジャーナル・オン・バクテリオロジー、１６８：２５ ７−２６９．１９８６）。転写が非常に安定したループを形成する場合、リポソ ームの結合は排除される。遺伝子発現制御のそれらの減衰様機構は、ストレプト マイシスにおいて抗生物質耐性遺伝子の制御を変調することが見出された（堀之 内等、プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエ ンシーズ・オン・ザ・ニー・ニス・ニー、７７：７０７９−７０８３．１９８０ ）。

ｓａｆ遺伝子は酵素排出に関する様々な遺伝子を転換する「マスター」遺伝子と して見なされ得るため、その発現は恐らく細胞において堅固に制御されると思わ れる。ｓａｆ遺伝子により刺激された酵素は全て複雑なポリマーの分解に関与す るため、この遺伝子は、バチラスにおいても示唆されている通り、代替的栄養源 の探索に関与する包括的調節システムの一部分であると予想される（ヘナー等、 ジャーナル・オン・バクテリオロジー、＋７０：２９６−３００．１９８８）。

図面の簡単な記載 第１図は、アルカリ性ホスファターゼ過剰生産の遺伝子決定基を有するｐＩＪ７ ０２のＢｇｌ１１部位におけるストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣ０１０１ ３７クローンから得られた染色体ＤＮＡフラグメントの制限地図である。

第２図は、ｐＵＬＡＤ３の１ｋｂＢｇｌｌｌフラグメントおよび他種のストレプ トマイシスのゲノムＤＮＡ間における相同性のサザーン・ハイブリダイゼーショ ン分析である。（Ａ）ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ消化により生成されたＤＮＡフ ラグメント（レーン２〜７）。（Ｂ）プローブとしてＩｋｂフラグメントを用い た、パネルＡで示されたＤＮＡのハイブリダイゼーション。レーン＋１，２３． ９．５９．６．６８．４，２９．２．２８．１．９４および０．５８ｋｂのフラ グメントを与えるＤＮＡの１−（ｉｎｄｌ［Ｉ消化、２、ストレプトマイシス・ ラクタムデユランス：３、ストレプトマイシス・アクリマイシニ；４、ストレプ トマイシス・コエリコロル１１５７．５、ストレプトマイシス・グリセウス２２ １２．６、ストレプトマイシス・グリセウス３５７０：　７、ストレプトマイシ ス・リビダンス１３２６゜第３図は、ｐＩＪ７０２により形質転換されたストレ プトマイシス・リビダンス（左）およびｐＵＬＡＤ３により形質転換されたスト レプトマイシス・リビダンス（右）のプロテアーゼ（Ａ）、アミラーゼ（Ｂ）お よびリパーゼ（Ｃ）活性のペトリ皿における分析である。

第４図はｓａｆ遺伝子発現に対する遺伝子用量効果である。ｐｌＪ７０２により 形質転換されたストレプトマイシス・リビダンス（左）、ｐＵＬＡＤ３により形 質転換されたストレプトマイシス・リビダンス（中央）およびｐＵＬＡＤ３０に より形質転換されたストレプトマイシス・リビダンス（右）によるプロテアーゼ （Ａ）およびアミラーゼ（Ｂ）の製造。

第５図はｓａｆ遺伝子のトリミング・ダウン状況である。ｐＬＩＬＡＤ３のｌ　 ｋｂ　Ｂｇｌｌ＋フラグメントを出発物質として用いた。この記載で示されてい る通り、固体培地プレート上において全プラスミド構築物に関する細胞外酵素製 造を測定した。−は野生型生産体、＋＋、＋＋＋および＋＋＋＋は相異なる過剰 生産割合を示す。短い白矢印は、プラスミドｐｌＪ７０２におけるチロシナーゼ 遺伝子（ｍｅｔ）の転写の局在および方向を示す。白い円（・−）はｍｅｌ遺伝 子プロモーターを示す。黒い円（０−）は、ｐＩＪ７０２における推定的右回り プロモーター活性を示し、白い四角（ロー）はｓａｆプロモーターを示す。

翻訳の方向は矢印で示されている。ＯＲＦ　Ｉは、ヌクレオチド配列データから 推定されたｓａｆリーディング・フレームに対応する（第６図参照）。

第６図は、ｐＵＬＡＤ３の１　ｋｂ　８ｇｌｌｌフラグメントのヌクレオチド配 列お上びｓａｆ遺伝子産物の推定されたアミノ酸配列を示す。第２の推定的ＡＴ Ｇ開始コドンは下線部である。逆方向相補的反復配列をふく金的矢印により示す 。波線は、既知ＤＮＡ結合蛋白質のＤＮＡ結合領域と類似したアミノ酸配列を示 す。関連した制限部位を示す。ヌクレオチドに対しＢｇｌｌ＋部位から始めて番 号付けする（右側の番号）。

第７図は、既知ＤＮＡ結合蛋白質におけるＤＮＡ結合ドメインとｓａｆ遺伝子産 物の推定されたアミノ酸配列からの領域との比較を示す。データは、パーボおよ びサラエル（パーボ等、「アニュアル・レビュー・オン・バイオケミストリー」 、５３：２９３−３２Ｌ　１９８４）並びに堀之内および別府（堀之内等、「ジ エネティックス・オン・インダストリアル・マイクロオーガニズムス」、４１頁 、ブリバ、ザグレブ、ユーゴスラビア、１９８６）から得た。

第８図は、ｓａｔ遺伝子の「上流および下流」反復ヌクレオチド配列を示す。

第９図は、ｓａｆ遺伝子に存在するヌクレオチドの反復群を示す。

第１Ｏ図は、プラスミドｐＩＪ２９２１を示す。

第１１図（第１１ＡおよびＢ図）は、ストレプトマイシス・グリセウスのアミラ ーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を示す。切 断したＢｓｔＥＩｌは外来遺伝子の融合に最適な場所であると考えられる。

第１２図は、プラスミドｐＩＪ６９９を用いたストレプトマイシス・グリセウス ＩＭＲＵ３５７０のα−アミラーゼ遺伝子のクローニングに使用される戦略であ る。

第１３図において、一連のグラフは、異なる培地での異なるプラスミドによる皿 での経時的α−アミラーゼ製造を示す。

（△）ＭＭ＋澱粉（％）＋チオ （ロ）ＭＭ１ｍＭＰ＋澱粉（１％）＋チオ（■）ＭＭ、燐酸不含有＋澱粉（１％ ）＋チオ（・）ＭＭ＋澱粉（１％）＋チオ＋Ｉ　ＰＴＧ右下のパネルは、最良生 産培地においてｐＵＬＴＶｌ、ストレプトマイシス・リビダンスおよびｐＵＬＴ Ｖ　１００（第６ａ図参照）と比較したプラスミドｐＵＬＶＤｌＯの生産値を示 す。（×）燐酸不含有ＭＭ＋　１％澱粉＋チオにおけるストレプトマイシス・リ ビダンス（ｐＩＪ６９９）、（・）前記培地におけるｐＵＬＴＶｌ、（−）前記 培地におけるｐＵＬＴＶ　１００、および（△）ＭＭ　１ｍＭＰ＋１％澱粉＋チ オにおけるｐＵＬＶＤｌｏ。

第１４図は、ＣＲＦ分子を含む融合蛋白質を生産する染色体遺伝子を含む組換え 体ストレプトマイシス細胞およびＳＡＦポリペプチドをコードするＤＮＡを含む プラスミドの構築の概略図を示す。

好ましい実施態様の記載 ここに記載されている作業は、下記の原材料および方法を用いて行なわれた。

細菌株およびプラスミド。この試験で使用されたストレプトマイシスおよびエシ ェリヒア・コリ株を第１表に列挙する。プラスミドおよびファージを第２表に示 す。

培地および培養条件。Ｒ２ＹＥ、最少培地（ＭＭ）、ＴＳＢ（ディフコ）または ３４％しよ糖および５ミリモルＭｇＣＩｔを補ったＹＥＭＥ中でストレプトマイ シス株を生長させた（ホップウッド等、ジエネティック・マニピユレーション・ オン・ストレプトマイシス、「ア・ラボラトリ−・マニュアル」、ザ・ノヨーン ・イネス・ファウンチーンヨン、ノーウィッチ、イギリス国、１９８５）。２２ ０　ｒｐｍで撹はんしながら回転震とう器中２８℃でトリプル・パツフルド・フ ラスコにおいてストレプトマイシス株を生長させた。

３７℃でルリア・ブロス（ＬＢＸミラー等、「エクスベリメンツ・イン・モレキ ュラー・ジエネティックス」、４３３頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ ボラトリーズ、ニューヨーク、１９７２）またはルリア・アガー（ＬＡ）中にお いてエシェリヒア・コリ株を生長させた。

プレートにおける酵素検定。ストレプトマイシスに関するアルカリ性ホスファタ ーゼ（ＡＰ）検定を、グルコース不含有で、３０ａｃｇ／ｍｌの５−ブロモ−４ −クロロ−３−インドリルホスフェ−）−Ｐ−トルイジン（ＸＰ）を補った低レ ベル［１ｍＭ］のホスフェートを含むＰＲＭＭ培地（ＭＭ）中において実施した 。ＡＰを産生ずるコロニーは青く、それを産生じ得ないコロニーは白かった。エ シェリヒア・コリの場合、Ｂ−ＸＰ培地を使用した（１リツトル当たり、ｌｏｇ のバクトペクトン、１２ｇのトリスマーベース、ｔｏｇのＮａＣ１，２０ｇのデ ィフコ寒天、ＰＩ４７　、５および４０　ＩＩＩＣｇ／ｍｌのＸＰを含有）。

１％澱粉を補ったＭＭ（グルコース不含有）においてストレプトマイシス・コロ ニーのアミラーゼ活性を検定した。生長３日後、プレートをヨウ素蒸気に晒した 。コロニー周囲の透明ゾーンは、澱粉の）　分解によるものであった。２％（Ｖ ／Ｖ）オリーブ油、０．５％（Ｗ／Ｖ）トウィーン８０および０．５％（ｖ／ｖ ）トウィーン２０を補ったＭＭにおいてストレプトマイシスを生長させることに より、リパーゼ活性を測定した。生長３日後、プレートに１＋１の１モルＣａＣ １ｔを注入した。リパーゼ生成は、Ｃａ”＋−脂肪酸複合体の沈澱として観察さ れた（手前等、ＦＥＲＭＥＮＴ、ＴＥＣＨＮＯＬ、６４：３６３−３７１．１９ ８６）。０．５％カゼインおよびｌＯミリモルＣａＣ１ｇを補ったＭＭ（グルコ ース不含有）においてプロテアーゼ活性を検定した。コロニー周囲の透明ゾーン として酵素活性が検出された。

プレートにダラム・ヨウ素溶液を注入することにより、グルコース不含有ＭＭに おいてストレプトマイシス・コエリコロルのアガラーゼ活性を検定した。ベータ ーガラクトシダーゼ活性は、Ｘ　−ｇａｌ（３６ｍｃｇ／ｍｌ）およびＩ　ＰＴ Ｇ（１０ｓｃｇ／ｍｌ）を補ったグルコース不含有ＭＭで生長しているコロニー の青色として観察された。

ＤＮＡ分離。ホップウッド等による記載（ホップウッド等、ア・ラボラトリ−・ マニュアル、ザ・ジョーン・イネス・ファウンデーション、ノーウィッチ、イギ リス国、１９８５）に従いストレプトマイシスからの全ＤＮＡを製造した。キー ザーの方法（キーザー等、プラスミド、１２：１９−３６．１９８４）に従い、 ストレプトマイシスまたはエシェリヒア・コリからのプラスミドＤＮＡを分離し た。

クローニング方法。］Ｏｍｃｇのストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ］０ １３７染色体ＤＮＡおよび０　、５　ｍｃｇのｐｌＪ７０２をＢｇｌＩＩにより 全体的に消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１４°Ｃで１２時間ライゲーショ ンした。ライゲーション混合物を形質転換に直接使用した。適当な制限酵素（複 数も可）で１−２ｍｃｇのプラスミドＤ　Ｎ　Ａを消化することによりＤＮＡフ ラグメントのサブクローニングを行い、低融点アガロース（ＬＭＰＡ）でのゲル 電気泳動により反応生成物を分離した。ＣＴＡＢ補助方法（ラングリッジ等、［ アナリティカル・バイオケミストリーＪ、１０３：２６４−２７１，１９８０） を用いて必要とされるＤＮＡ帯を抽出した。

形質転換方法。ホップウッド等による記載（ホップウッド等、「ア・ラボラトリ −・マニュアル」、ザ・ジョーン・イネス・ファウンデーション、ノーウィッチ 、イギリス国、１９８５）に従いストレプトマイシス株を形質転換した。形質転 換後、プロトプラストをＲ２ＹＥ培地において培養し、３０℃で１５−２０時間 再生させた。

次いて、１ｍｌのチオストレプトン水溶液（３０Ｑｍｃｇ／ｍｌ）をプレートに 注ぎ、ｌまたは２時間乾燥し、２または３日間以上インキュベーションした。形 質転換体を、チオストレプトン（５０ｎａｇ／　ｍｌ）およびＸ　Ｐ　（３０ｎ ａｇ／　ｍｌ）を含むＰＲＭＭ培地へ複製した。

ニーエン等に従いエシェリヒア・コリの形質転換を行った（プロシーディンゲス ・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシーズ・イン・ザ・ニー ・ニス・ニー、６９：２１１０−２１１４．１９７２）。アンピシリンを含む（ ２００ｍｃｇ／　ｌｌ１ｌ）プレート上で形質転換体を選択した。必要ならば、 Ｘ　−ｇａｌ（３６ｍｃｇ／ｍｌ）およびＩ　Ｐ　Ｔ　Ｇ　（ｌ　Ｏｗｃｇ／ｍ ｌ）をＬＡプレートに加えた。

ハイブリダイゼーション試験。ホップウッド等の記載（「ア・ラボラトリ−・マ ニュアル」、ザ・プローブ・イネス・ファウンデーノヨン、ノーウィッチ、イギ リス国、１９８５）に従い、アガロース・ゲルからニトロセルロース・フィルタ ーへのＤＮＡの移動およびハイブリダイゼーションを行った。プラスミドｐＵＬ ＡＤ１からの７・。

２ｋｂ　ＢｇｌｌｌフラグメントおよびプラスミドｐＵＬＡＤ３からのｌｋｂＢ ｇｌｌ＋フラグメントをプローブとして用いた。７０℃で２４時間ハイブリダイ ゼーシ式ンを行った。フィルターを、７０℃で２ｇのｓｓｃ、ｏ、ｔ％ＳＤＳ中 ３０分間２回、次いで０．２ｇのＳＳＣ。

０．１％（ＳＤＳ）中で再び３０分間２回洗浄した。

ヌクレオチド配列分析。サンガー等の鎖終結方法（プロシーディンゲス・イン・ ザ・ナシロナル・アカデミ−・イン・サイエンシーズ・イン・ザ・ニー・ニス・ ニー、７４：５４６３：５４６７．１９７７）によりヌクレオチド配列を決定し た。ＤＮＡフラグメントをＭ１３ｍｐｌＯおよびＭ１３ｍｐＨへサブクローニン グすることにより、いずれかの配向の挿入体が得られた。ライゲーション混合物 を適格エシェリヒア・コリＪＭ１０３細胞へトランスフエクシジンし、白色プラ ークを挿入体の選抜用にスクリーニングした。アマ−ジャム・インターナシロナ ル・パブリック・リミテッド・カンパニー（イギリス国）およびシーケナーゼ（ ユナイテッド・バイオケミカル・コーポレーション、アメリカ合衆国）キットを 用いることにより、両鎖において配列決定を行った。ｄＧＴＰを用いて全フラグ メントの配列決定を行ったが、必要に応じてｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰを使用 した。６％または８％ポリアクリルアミド連続ゲルにおいて反応混合物を分離し 、次いでオートラジオグラフィーに付すためにＸ線フィルムに暴露した。

プロモーター・クローニング。マルチコピー・プロモーター−プローブ・プラス ミドｐｌＪ４８６を用いることにより（ワード等、「モレキュラー・アンド・ジ ェネラル・ジエネテイツクス」、２０３：４６Ｂ−４７８，１９８６）、転写開 始活性を有するフラグメントを選択した。１５ｍｃｇ／ｍｌのカナマイシンを含 むＭＭへのコロニーの複製により、カナマイシン（Ｋｍ）耐性形質転換体を単離 した。

インビトロ転写−翻訳。アマ−ジャム・インターナシロナル・ｌ（ブリック・リ ミテッド・カンパニーからの原核生物ＤＮＡ指向翻訳キットを用いることにより 、プラスミドＩ）ＵＬＡＤ３００およびｐＵＣ１９を転写し、翻訳した。Ｌ（３ ５Ｓ）メチオニンを放射性標識として使用した。ドデシル硫酸ナトリウム含有１ ２．５％ポリアクリルアミド・ゲルを用いて、標識蛋白質を分析した。

本発明の実施方法 下記の詳細な記載は本発明を説明するものである。

種々のストレプトマイシスによるアルカリ性ホスファターゼ生産。

１０種の相異なるストレプトマイシス株（第１表に列挙）の幾つかの固体培地に おけるアルカリ生産ホスファターゼ生産を検定した。

ストレプトマイシス・グリセ１クスＩＭＲＵ３５７０およびストレプトマイシス ・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７は、検定された全培地の中で最も優れた生産体 であった。アルカリ性ホスファターゼ生産にとって最良の固体培地は、ＰＲＭＭ （３０ｍｃｇ／ｍ１ＸＰ含有）であった。この培地において、ストレプトマイシ ス・グリセウスＩＭＲＵ３５７０およびストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣ Ｃ１０１３７は、４８時間の生長後に濃い青色を示した。ストレプトマイシス・ リビダンス１３２６およびストレプトマイシス・コエリコロルＪＩ２２８０は、 生産性の低いアルカリ性ホスファターゼ生産体であった。ＸＰ含有ＰＲＭＭにお ける９０時間の生長後には、弱い青色しか観察され得ない。

アルカリ性ホスファターゼ生産に関与する遺伝子のクローニング。

ストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７から得た全ＤＮＡをＢｇｌ ｌｌにより消化し、Ｂｇｌｌｌ−消化ｐｒＪ７０２にライゲーションし、ストレ プトマイシス・リビダンス１３２６ブロトブラストへの形質転換によりライゲー ション混合物を導入した。形質転換体を、チオストレプトン（５０ｍｃｇ／　ｍ ｌ）およびＸ　Ｐ　（３０ｍｃｇ／　ｍｌ）を含むＰＲＭＭへ複製した。ストレ プトマイシス・リビダンスの２８００個のメラニン陰性形質転換体の中から、１ 個の濃青色コロニーが見出された。その濃青色コロニーは、ｐＵＬＡＤｌ（第１ 図）と称する７　、　２　ｋｂ　Ｂｇｌｌ＋挿入体を有するｐＩ　Ｊ　７０２誘 導体を含んでいた。

プラスミドｐＵＬＡＤＩはストレプトマイシス・リビダンスにおいて不安定であ り、形質転換後、白色および青色のコロニーを生じた。青色コロニーは全て最初 のｐＵＬＡＤｌを含み、白色コロニーは、ｐＵＬＡＤｌの欠失形態を含んでいた （これらはそれ以上試験されない）。この不安定性は、プラスミド、例えばある 種の不安定性を宵することが知られているｐＩＪ７０２における大きなサイズの 挿入体に起因し得るため、７　、２　ｋｂ挿入体を、プラスミドｐｌ　Ｊ　６９ ９（キーザー等、「ジーン」、６５：８３−９１．１９８８）の５ｋｂＢｇｌｌ ＋フラグメントヘサブクローニングした。反対配向での挿入体により、２種のプ ラスミドｐＵＬＡＤ　１００およびｐＵＬＡＤ　１０１が得られた。両プラスミ ドは安定しており、遺伝子はストレプトマイシス・リビダンスにおいて両配向で 発現された。

ｓａｆ遺伝子の局在性。

７　、２　ｋｂ　８ｇｌｌｌフラグメントを５ａｕ３ＡＩにより部分消化し、Ｂ ｇｌｌｌ−消化ｐＩＪ７０２にライゲーションした。ライゲーション混合物をス トレプトマイシス・リビダンス・プロトプラストへ形質転換し、形質転換体をＸ Ｐ含有ＰＲＭＭへ複製した。プラスミドＤＮＡを幾つかの青色コロニーから単離 した。アルカリ性ホスファターゼ生産に関する決定基を有する４種の小さなプラ スミド、Ｉ）ＵＬＡＤ２、ｐＵＬＡＤ３、ｐＵＬＡＤ　ｌ　６およびｐＵＬＡＤ ｌ８を詳細に試験した。それらは安定した形質転換体ストレプトマイシス・リビ ダンス・プロトプラストであり、各々２．４．１，２．１およびｌ。

９ｋｂの挿入体を存していた（第１図）。プラスミドρＵＬＡＤ３は、Ｂｇｌｌ ｌによりレスキューされ得る最小の挿入体（ｌｋｂ）を有する。ストレプトマイ シス・リビダンスへ導入すると、ｐＵＬＡＤ３（ブダペスト条約および規則２８ ＥＰＣ下、１９８９年５月１９日にＣＮＣＭ（コルクティヨン・ナツィオナール ・ド・クルツール・ド・ミクロオルガニスム、２８リユードウ・ドクツール・ル ーシス、Ｆ７５７２４パリ・セデックス１５、フランス国）に番号１−８５９と して寄託）は、ｐＵＬＡＤｌと同様高いアルカリ性ホスファターゼ生産性を示し た。

幾つかのストレプトマイシスの染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション。

、　ＢａｍＨＩまたはＢｇｌｌｌにより消化されたストレプトマイシス・グリセ ウスＡＴＣＣ１０１３７から得た全ＤＮＡを、（３２ｐ）ｄＣＴ　Ｐによるニッ ク翻訳により標識されたＩ）ＵＬＡＤＩからの７．２ｋｂＢｇＩＩ＋フラグメン トにハイブリダイゼーションした。予想通り、プローブと相同性を示す７．２ｋ ｂ　８ｇｌｌｌフラグメントが、Ｂｇｌｌｌにより消化されたストレプトマイシ ス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７ＤＮＡに存在していた。フラグメントには、 全ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化したとき、２つの明白なハイブリダイゼーション帯 （７，９ｋｂおよび９　、４　ｋｂ）を生じる内部Ｂ　ａｍＥ　Ｈ１部位が存在 した。

同じ遺伝子が他のストレプトマイシスに存在するか否かを試験するため、ストレ プトマイシス・アクリマイシニ、ストレプトマイシス・コエリコロル１１５７、 ストレプトマイシス・グリセウス２２１２、ストレプトマイシス・グリセウス３ ５７０、ストレプトマイシス・リビダンス１３２６およびストレプトマイシス・ ラクタムデユランスＮＲＲＬ３８０２からの全ＤＮＡをＢａｎ＋ＨＩにより消化 し、プローブとしてｐＵＬＡＤ３のＩ　ｋｂ　８ｇｌｌｌフラグメントとハイブ リダイゼーションした。上記ストレプトマイシスの最初の４株において９．５Ｋ ｂ共通帯とのハイブリダイゼーションが観察され、ストレプトマイシス・リビダ ンスおよびストレプトマイシス・ラクタムデユランスのＤＮＡでは、各々４つお よび５つの弱いハイブリダイゼーション帯が観察された（第２図）。さらにまた 、ストレプトマイシス・アルプスＧ１ストレプトマイシス・コエリコロルＪＩ２ ２８０、ストレプトマイシス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５およびストレプ トマイシス・フラディアエＡＴＣＣ１０４７５のＤＮＡとのハイブリダイゼーシ ョンが観察された。これ以上、）Ｓイブリダイゼーションしている帯の特性検定 の試みは行われなかった。

エシェリヒア・コリｐｈｏ−突然変異体の相補性の欠如。

我々がストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣＩ　Ｏ１３７からのアルカリ性 ホスファターゼ構造遺伝子をクローン化したか否かを確認するため、エシェリヒ ア・コリｐｈｏ　Ａ突然変異体Ｅ１５およびＡＷ１０４６の相補性を試験した。

ｐＵＬＡＤｌからの７．２ＫｂＢｇｉｌ＋フラグメントおよびｐＵＬＡＤ３から のｌ　Ｋｂ　Ｂｇｌｌ＋フラグメントを、Ｂ　ａｏ＋Ｈｒ−消化ｐＵｃ１９にお いて両配向で別々にサブクローニングした。これらのプラスミド構築物を全てエ シェリヒア・コリＪＭ１０３細胞において確認し、次いでそれらを用いてエシェ リヒア・コリＥ１５（サージ−等、「ジャーナル・イン・バクテリオロジー」、 １４５：２８８−２９２．１９８１）およびエシェリヒア・コリＡＷ１０４６を 形質転換した。Ｂ−ＸＰにおける青色コロニーは一切見出されず、アルカリ性ホ スファターゼの完全な構造遺伝子がストレプトマイシス・グリセウスの７．２Ｋ ｂフラグメントには存在しないこと、またはそれがエシェリヒア・コリにおいて は発現されないことが示された。アルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）または バチラス・ルチェニホルミス（ヒユーレット、Ｆ、Ｍ、、ｒジャーナル・イン・ バクテリオロジー」、１５８：９７８−９８２．１９８４）の構造遺伝子は、ク ローン化されたＩＫｂフラグメントとはハイブリダイゼーションしなかった（デ ータは示さず）。さらに、ｐｈｏＢ（ｆｆ節）エシェリヒア・コリ突然変異体Ｈ ２（クロイツエル等、「ジェネティックス」、８１：４５９−４６８．１９７５ ）は、ｐＵＬＡＤ３の１　ｋｂ　Ｂｇｌｌ＋フラグメントまたはｐＵＬＡＤｌの ７．２ｋｂ　Ｂｇｌｌｌフラグメントのいずれとも相補性を示さなかった。

他の細胞外酵素の過剰生産。

ＰＵＬＡＤ３を用いてストレプトマイシス・リビダンスのプロトプラストを形質 転換した場合、明らかに遅れた色素形成および胞子形成が観察された。これらの 多面発現作用により、蛋白質分泌または遺伝子発現の制御におけるこの遺伝子の 役割に関する我々の試験は促進された。第３図で示す通り、アミラーゼ、プロテ アーゼおよびリパーゼを含む幾つかの細胞外酵素は、ｐＵＬＡＤ３により形質転 換されたストレプトマイシス・リビダンスにより過剰生産された。

また、β−ガラクトシダーゼ生産性も増加し、その生産は、非形質転換ストレプ トマイシス・コエリコロルの場合よりも約２４−３０時間早く開始した。このク ローン化された遺伝子は細胞外酵素、色素生成および分化に対して多面発現作用 を示すため、この遺伝子は５ａｔ（２次代謝活性化因子）と命名された。

遺伝子用量効果。

ｐｌＪ７０２のコピー数を概算すると、ｌ染色体当たり１００〜２００である。

ｐＴＪＬＡＤ３の正確なコピー数は測定されなかったが、ｐＩ　Ｊ　７０２およ びｐＵＬＡＤ３の両帯の強度は、似たコピー数であることを示唆していた。

遺伝子用量効果を試験するため、我々は、ｐＵＬＡＤ３の１ｋｂＢｇｌｌ＋フラ グメントを、低コピー数プラスミドｐＩＪ６１（１細胞当たり３〜４コピー）の ＢａｍＨ１部位へサブクローニングした。（ホップウッド等、「ア・ラボラトリ −・マニュアル」、ザ・ジョーンズ・イネス・ファウンデーション、ノーウィッ チ、イギリス国）。この新規プラスミドはｐＵＬＡＤ３０と命名された。第４図 は、ｐＵＬＡＤ３０により形質転換されたストレプトマイシス・リビダンスによ る細胞外酵素の生産性が、ｐＵＬＡＤ３をもつストレプトマイシス・リビダンス に関して明らかに減少していることを示す。さらに、ｐＵＬＡＤ３０をもつスト レプトマイシス・リビダンスは、非形質転換ストレプトマイシス・リビダンスと 似た色素生成および胞子形成パターンを示した。

エシェリヒア・コリにおける発現および遺伝子のトリミング・ダウン。

エシェリヒア・コリのＰｈｏ突然変異体はｓａｆ遺伝子により補足されなかった が、我々は、ｐＵＬＡＤ３のｌ　ｋｂ　Ｂａ１ｌｌ挿入体をＰＵＣ１９において 一方向でサブクローニングした場合（ｐＵＬＡＤ３００と命名されたプラスミド ）、エシェリヒア・コリにおける発現の結果、固体培地で生長させた場合に異常 形態が誘発されるが、それを反対方向で挿入した場合（プラスミドｐＵＬＡＤ３ ０１）には発現しないことを観察した。プラスミドｐｔＪＬＡＤ３００は、１ａ ｃＺプロモーターから下流に０ＲＦ（下記参照）を含む。これらの結果は、ｓａ ｆ遺伝子が、ｐＵｃ１９に存在するｌａｃ　Ｚプロモーターからエンエリヒア・ コリにおいて発現されることを示唆している。

エシェリヒア・コリ検定におけるインビトロ転写−翻訳を実施しくｐＵＬＡＤ３ ００を使用）、反応生成物を１２．５％ポリアクリルアミド・ゲルにおいて負荷 した。分子量１５０００の帯は、対照ｐＵＣ１９レーンに存在しないｐＵＬＡＤ ３００対応するレーンに存在した。

ｓａｆ遺伝子の位置を正確に確認するため、プラスミドｐＵＬＡＤ３００のＩＫ ｂフラグメントの解離続行が決定された。これらの試験では、ｌｋｂフラグメン ト内における制限酵素５ｓｔｌ　（ｎｔ２１６）、Ｋｐｎｒ　（ｎｔ６４８）お よび５ａｌＧ　Ｉ　（ｎｔ９３６）について特有の切断部位の存在か開発された 。ｐＵＬＡＤ３００のｌｋｂ挿入体から得られた相異なるサブフラグメントを第 １段階でｐＩＪ２９２１．すなわちＢｇ１１１部位に近接した修飾ポリリンカー を含むｐＵｃ１８の誘導体（第１０図参照）へクローン化し、次いでＢｇｌｌ＋ 付着末端によりレスキューＬ、Ｂｇｌｌ＋消化ｐｌＪ７０２ヘクローン化した。

アルカリ性ホスファターゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼ生産性を、全プラス ミド構築物を用いてストレプトマイシス・リビダンスにおいて試験した。これら の試験の結果は第５図においで概略形態で現れており、それらの解釈の結果、下 記結論が導き出された。

１．１ｋｂフラグメントは、プラスミドｐＩＪ７０２の両配向（プラスミドｐＵ ＬＡＤ３およびｐＵＬＡＤ４）において類似レベルで発現されたことから、それ 自体のプロモーターを含めて完全なｓａｆ遺伝子を含む。

２、ｓａｆ遺伝子は、６４８ヌクレオチドＢｇｌｌｌ−ＫｐｎＩフラグメント（ プラスミドｐＵＬＡＤ５およびｐＵＬＡＤ６）に位置すると思われる。

３、フラグメントＳｓｔ　Ｉ　−Ｋｐｎｌ　（４３２ヌクレオチド）は、細胞外 酵素過剰生産に関する遺伝子決定基を含むと思われるが、−配向（プラスミドｐ ＵＬＡＤ１０およびＩ）ＵＬＡＤ１４）でのみ発現し、反対配向（グラスミ下ｐ ＵＬＡＤ９およびｐＵＬＡＤｌ　３）では発現しなかったため、そのプロモータ ー領域を喪失したと思われる。

４．２１５ヌクレオチド・フラジ１フ８８遺伝子プロモーター領域を含む。

５、細胞外酵素および分化に対する作用は全て、−緒に保たれるかまたは失われ 、単一の遺伝子産物が全酵素に対する作用に関与することが示された。

６、驚くべき聾様は、ｐＩＪ７０２に存在するｍｅｌ−遺伝子のチロシナーゼ・ プロモーターから始まるフラグメントＳｓｔ　Ｉ　−ＫｐｎＩ　（プロモーター をもたないｓａｆ遺伝子）の発現の欠如であったにも拘わらず、これは反対方向 （時計回り）では発現された。この発見は、遺伝子ｍｅｌの前およびＢｇｌｌｌ クローニング部位に位置するプロモーター活性を存するフラグメントが存在する ことを意味した（ベルナン等、「ジーン」、３７：１０１−１１０、１９８５） 。その発見は公開されなかったが、数人の著者が時折述べている（ジルおよびホ ップウッド、「ジーン」、２５：１１９１３２、１９８３）。逆方向（Ｋｐｎｌ 　−−９ｓｔｌ）での機能的ＯＲＦの可能性は幾つかの理由呻より却下された。

Ａ．ヌクレオチド配列を分析したとき、上記ＯＲＦは検出されなかった。

Ｂ．上記ＯＲＦ’が存在する場合、フラグメントＢｇｌｌｌ　−　Ｋｐｎ　Ｉ　 （ｎｔｌ　−ｎｔ６　４　Ｂ）は両方向で発現されたため（プラスミドｐＵＬＡ Ｄ５およびｐＵＬＡＤ６）、それはそれ自体のプロモーターをもたなければなら ないことは明白である。次に、ＫｐｎｌゾーンにプロモーターをもつＫｐｎｌ− Ｓｓｔｌフラグメントが単に一方向でそれ自体を発現し得ることは意味をなさな かった。

Ｃ．エシェリヒア・コリでの発現は、常にプロモーター１ａｃＺが（前）提案さ れたＯＲＦに有利な場合に行なわれ、反対方向では決して行なわれなかった。

ＯＲＦ　１上流ＤＮＡフラグメントのプロモーター活性。

以前の実験から推論され得る、Ｂｇｌｌｌ　−Ｓｓｔ　Ｉフラグメントにおける プロモーターの存在を確認するため、アミノグリコンド・ホスホトランスフェラ ーゼ（ｎｅｏ）を暗号化する（ｃｏｄｉｆｙ）遺伝子はもつが、そのプロモータ ーは随伴しない・・・・・。この遺伝子の発現によって、ストレプトマイシス・ リビダンスはカナマイシンおよびネオマイシンに対する耐性を獲得した。このフ ラグメントをｐｌＪ４８６（ｎｅＯ遺伝子の隣に５ｓｔＩ端を有する）において サブクローニングすると、プラスミドｐｌ　Ｊ４８４：：２１６が作製された。

ｐＩＪ４８６：＋２１６により形質転換されたストレプトマイシス・リビダンス は、１００　ｍｃｇ／ｍｌを越えるＫＩＩ＋を含むＭＭにおいて生長するが、ｐ ｌＪ４８６により形質転換されたストレプトマイシス・リビダンスは、５ｍｇ／ ｍｌＫｍを補ったＭＭにおいて生長しないことが観察された。

これらの結果は、上記フラグメントがプロモーター活性を有することを示し、提 案されたＯＲＦを支持するものであった。

ヌクレオチド配列および考えられるＯＲＦから導き出された他の考察は、次の通 りであった。

１、遺伝子ｓａｆは逆方向および相補的反復配列を有する２つの領域により囲ま れており、遺伝子５ａｆ（ｎｔ６３７−６９７）である、ｍＲＮＡにおいて非常 に安定した結合　Ｇ−＋＝−３８，４ｋｃａｌを形成し得る（第８図）。

２、配列決定されたフラグメントは、ストレプトマイシス遺伝子において通常見 出される高いＧ＋Ｃパーセンテージを含む。

３、遺伝子８訂の前、ＡＴＧ（ｎｔ２１９）および反復上流構造間には、非常に 興味深いヌクレオチド領域が存在する。すなわち３対の反復ヌクレオチド（各々 ７ｎｔを有する）が存在する（第９図）。この領域、特にプロモーター・ゾーン は、遺伝子ｓａｆ発現の調節において非常に重要な役割を演じるとほぼ考えられ る。

４、ＳＡＦ蛋白質が１８のネット正負荷を含むことは言うに値する。仮定的な見 通しによると、これはＤＮＡに対するかなり大きな親和力の存在を示し得る。推 定されたアミノ酸配列の場合でも、ＤＮＡ結合蛋白質のドメインと非常に類似し た領域が観察され得る（パボおよびサラエル、１９８４Ｍ第７図）。

ｓａｆ遺伝子のヌクレオチド配列。

出発物質としてプラスミドｐＵＬＡＤ３００を用いることにより、ｐＵＬＡＤの 全１　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ挿入体のヌクレオチド配列を測定した。

Ｍ１３ｍｐｌＯおよびＭ２３ｍｐＨはＫｐｎ１部位をらたないため、まずＫｐｎ ｌ端を有するフラグメントをｐＵｃ１９ヘサブクローニングし、次いでＥｃｏＲ Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌ１１フラグメントとしてレスキューし、ＥｃｏＲＩおよびＨｉ ｎｄｌｌｌにより消化したｍｐｌＯおよびｍｐＨへ導入した。活性領域の完全ヌ クレオチド配列は、推定的ＳＡＦポリペプチドをコードする３３９個のヌクレオ チドを有するＯＲＦ　１を示す（第６図）。ｎｔ１８３のＡＴＧ開始コドンから 始まり、ｎｔ５２４のＴＧＡ停止フドンで終結するＢｇｌｌｌ−ＫｐｎＩフラグ メントには唯一の可能なオープン・リーディング・フレームが含まれる（第５お よび６図におけるＯＲＦ　Ｉ）。プラスミドｐＵＬＡＤ１４に含まれた５ｓｔ１ −Ｋｐｎｌ挿入体は、同じ＜Ｓｓｔ１部位の下流領域を含むプラスミド（ｐＬＪ ＬＬＡＤ３、ｐＵＬＡＤ４、ｐＵＬＡＤ４およびｐＵＬＡＤ６）よりも低度の活 性を示すため、仮定的ｓａｔリーディング・フレームと枠を形成するＡＴＧ（ｎ ｔ２１９）はまた、ｐＵＬＡＤＩＯおよびｐＵＬＡＤ１４において開始コドンと して作用し得るとほぼ考えられる。

ＴＧＡ終止コドンが最初のＡＴＧの上流に存在するため、他の代替的開始トリプ レットはあり得ない。非常に安定したステムおよびループ構造（Ｇ＝−５３，６ ｋｃａｌ）を形成し得る長い逆方向反復領域は、ｓａｆ遺伝子の上流、ｎｔ９０ 〜ｎｔ１３５に存在する。別のハイフンで結んだ逆方向配列は、ヌクレオチド６ ３７から６９７へ伸びるＯＲＦ　１のターミネータ−・トリブレットから下流で 観察された（Ｇ−−３８，４ｋｃａｌ）。

ｓａｆ遺伝子は、高いＧ＋Ｃ含有率（７６，３％）および著しい遺伝子・・・・ ・を有する（ホップウッド等、レギュレーション・オン・ジーン・エクスプレッ ション２５イヤーズ・オン、キャンプリッジ・ユニバージティー・プレス、２５ １−２７６頁、１９８６）。

ＯＲＦ　１の上流のＤＮＡフラグメントのプロモーター活性。

Ｂ　ｇｉｌｌ　−Ｓ　ｓｔ　Ｉフラグメント（ｎｔｌ　＝ｎｔ２１６）を欠くプ ラスミドは−配向でのみ発現され（プラスミドｐＵＬＡＤ１０およびｐＵＬＡＤ ｌ４）、反対方向では発現されなかったため（プラスミドｐＵＬＡＤ９およびｐ ＵＬＡＤｌ　０）、恐ら＜ＯＲＦ　１プロモーターはそのフラグメントに位置す ると思われた。この領域における転写開始配列の存在は、このフラグメントを、 プロモーター欠失アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ ）を含むプロモーター−プローブ・プラスミドｐＩＪ４８６（ワード等、「モレ キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックスＪ、２０３：４Ｂ８：４７Ｂ 、１９８６）へサブクローニングすることにより確認された。この遺伝子の発現 により、ストレプトマイシス・リビダンスにはカナマイシンおよびネオマイノン 耐性が付与される。Ｂｇｌｌｌ　−Ｓ　ｓｔ　ＩフラグメントをｐＩ　Ｊ　４８ ６（ｎｅｏ遺伝子に近接する５ｓｔｌ末端）へサブクローニングした（このプラ スミドをｐＩＪ４８６：：２１６と命名）。ｐＩＪ４８６・＝２１６により形質 転換されたストレプトマイシス・リビダンスは、１００　ｍｃｇ／ｍｌを越える Ｋｍを含むＭＭにおいて生長し得たが、ｐｌＪ４８６をもつストレプトマイシス ・リビダンスは、５ＩＩＩＣｇ／ｆｆ１ｌのＫｍを含むＭＭにおいて生長しない 。この結果は、Ｂｇｌｌｌ−ＳｓｔＩフラグメントがプロモーター活性を有する ことを示す。しかしながら、ストレプトマイシスの他のプロモーターとのヌクレ オチド相同性によって、典型的な「共通」−１Ｏまたは一３５領域は全く同定さ れなかった（ホップウッド等、レギュレーション・オン・ジーン・エクスプレッ ション２５イヤーズ・オン、キャンプリッジ・ユニバージティー・プレス、２５ ＋−２７６頁、１９８６）。

アミラーゼ遺伝子のクローニング。

現在、ストレプトマイシス・グリセウスＩＭＲＵ３５７０のアミラーゼ遺伝子（ ａｍｙ）の決定的配列が解明された。ストレプトマイシス・グリセウスのアミラ ーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定的アミノ酸配列は第１１図に現 れている。リーダー・ペプチドを伴う蛋白質は５６６個のアミノ酸を有しくヌク レオチド３１８〜２１５５、両端を含む）、５９７１３ＤのＰＭに対応する。ス トレプトマイシス・アリセウスＩＭＲＵ３５７０のＤＮＡを５ａｕ３Ａで消化し 、３〜９Ｋｂのフラグメントを分離し、Ｂｇｌ［Ｉ消化ｐＩＪ６９９にライゲー ションすることにより、全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＬＴＶ１ が構築された。α−アミラーゼ活性についてスクリーニング後、全α−アミラー ゼ遺伝子を含むＰＵＬＴＶ１プラスミドを選別した。ｐＵＬＴＶＩの構築を第１ ２図に示す。

全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドを得る別の方法は、それを２つのさら に小さなフラグメントから構築する方法である。クローニングにより得られたプ ラスミドの中で、ストレプトマイシス・グリセウスの全ＤＮＡライブラリーは、 ５°末端から始まる部分的遺伝子を有するもの、および３°末端から始まる部分 的遺伝子を有するものである。前者からは、遺伝子の５°末端を含む１．３Ｋｂ フラグメントＢａｍＨＩ−８ａｅｌが得られ、後者からは、遺伝子の３゜末端を 含む１．２ＫｂＳａｃｌ−３ａｌＩフラグメントが得られる。次いで、両者をＳ ａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩで処理したｐｌＪ２９２＋に結合することにより、無傷 の天然α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドが得られるｃｐｕｔ、’ｒｖ　２ ００）。

ｓａｔプロモーターの優れた有効性。

種々のプロモーターの制御下でのａｍｙ遺伝子の発現を試験するため、ストレプ トマイシス・リビダンスＪＩ６６によるアミラーゼの生産性を試験した。ａｍｙ 遺伝子を相異なるプロモーターの制御下に置き、アミラーゼ生産性を、天然プロ モーター（ＰａｆｆｌＹ）の使用による生産性と比較した。試験されたプロモー ターは、ｓａｔ遺伝子のプロモーター（Ｐ　５ａｆ）、Ｋｍ　遺伝子のプロモー ター（Ｐｎｅｏ）、シンテナーゼＰＡＢＡ遺伝子のプロモーター（Ｐｐａｂ）お よびエシェリヒア・コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐｌａｅ ）であった。ｐＵＬＴＶ２００から抽出されたＥｃｏＲＩ　８ｇｌ１１フラグメ ントを、ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍ１　Ｉで消化したｐｕｃｔｓヘライゲーションす ることにより、プロモーターを伴わないα−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミド ｐＵＬＴＶ２２０が得られた。ｐＵＬＴＶ２２０からのＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌ １１フラグメントを、５ａｆ１ｐａｂまたはＫｍ　遺伝子のプロモーターへ直接 ライゲーションすることにより、ｐＵＬＶＤｌＯｌｐＵＬＶＡｌおよびｐＵＬＴ Ｖ８０プラスミドが各々得られた。

ｌａｃのプロモーターを含むｐＵＬＴＶｌ　５０は、ｐＵＬＴＶ２２０のＨｉｎ ｄｌｌ！消化およびｐｌＪ６９９の５Ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントへのラ イゲーションにより直接得られた。

ＭＭ＋澱粉（１％）＋チオストレプトン、ＭＭ（１ｍＭ　ｐ）＋ＪＲ粉（１％） ＋チオストレプトン、ホスフェート不含有ＭＭ＋澱粉＋チオストレプトンおよび ＭＭ−１−ＪＲ粉（１％）＋チオストレプトン＋Ｉ　ＰＴＧを含む皿において、 生成したプラスミドの生産性試験を行った。ｐＩＪ６９９、ｐＵＬＴＶ　１００ （第６ａ図参照）およびｐＵＬＴＶｌを対照として用いた。アミラーゼ生産性の 相対尺度は、■、含有生長培地の染色時に各コロニーの周囲で得られる円形コロ ナ領域であると考えられた。

種々の構築物の生産性グラフは第１３図に示されている。対照の場合を除くと、 最高の生産性は、ＭＭ（１ｍＭ　Ｐ）十澱粉＋チオストレプトンにおいて達成さ れた。生産性ピークがｐＵＬＶＤ　１０（ｓａｆ遺伝子プロモーターを有する） によりいかにして得られたかは（１１４時間のインキュベーションでＰｌａｃプ ロモーターを含む、２番目に高い生産体ｐＵＬＴＶ１５０の１３３５ｍｍ’と比 べて１４８２ｆｆｌｆｆｉ”）、明らかに注目に値することである。

第１３図（下部右側パネル）において、ｐＵＬＶＤｌｏの生産値は、各タイプの 構築についてこれまでに知られている最善条件下での対照と比較して表されてい る。ｐＵＬＴＶｌ（天然）の場合と比べたｐＵＬＶＤ　Ｉ　Ｏ生産性の増加は、 全く無視できない（Ｉ　Ｉ　０５＋＋＋ｍ”に対して１４８２＋ｎｍ”）。

すなわち、ｓａｆ遺伝子プロモーターを他の天然プロモーターの代用物として使 用することにより、様々な内在ストレプトマイシス・ポリペプチドおよび蛋白質 の発現が改良され得る。同様に、外来ＤＮＡが挿入される場合、ｓａｆ遺伝子プ ロモーターは、アミラーゼにより立証された結果と同じく優れた結果を与えると 予想される。

外来ポリペプチドまたは蛋白質の発現。

外来ポリペプチドまたは蛋白質を発現させるため、好ましくは外来ＤＮＡを内在 遺伝子、好ましくは細胞外酵素をコードする遺伝子の適当な認識部位に挿入する ことにより、外来ポリペプチドまたは蛋白質を確実に分泌させる。遺伝子がアミ ラーゼ遺伝子である場合、適当な認識部位はＢｓｔＥ１１部位である（第１１図 参照）。外来ＤＮＡは、好ましくは細胞外酵素遺伝子からの分泌シグナルを可能 な限り多く保持するように挿入される。これらのシグナルがリーダー配列におい て優勢である場合、アミラーゼ遺伝子に関してカルボキシル末端もまた分泌に重 要であることが立証される。すなわち、内在ＤＮＡの転写部分を除去し、外来Ｄ ＮＡと置き換えるよりも、外来ＤＮＡを内在ＤＮＡへ挿入することにより融合蛋 白質を作製するのが最善であり得る。

ｓａｔ遺伝子は染色体ＤＮＡにおいて細胞外酵素の産生を制御することが知られ ている。恐らく、染色体ＤＮＡにはＳＡＦポリペプチドを認識し、細胞外酵素生 産性を向上させる認識配列が存在すると思われる。プラスミドにおけるｓａｆ遺 伝子とアミラーゼ遺伝子の組み合わせは、アミラーゼの生産性向上を誘発しない 。すなわち、ＳＡＦにより制御され得る内在細胞外酵素の分泌シグナル配列と機 能し得るように結合し、好ましくはさらにｓａｆプロモーターと機能し得るよう に結合した（天然プロモーターの非存在下）外来蛋白質を、プラスミドとは反対 側の染色体ＤＮＡへ組み込むのが好ましい。この方法において、外来ポリペプチ ドまたは蛋白質の生産性は、天然ＳＡＦによりさらに高められる。さらに好まし い実施態様では、Ｓａｒ遺伝子は外来ＤＮＡが染色体ＤＮＡへ挿入された同じ機 構へプラスミドによって挿入される。これにより外来ポリペプチドまたは蛋白質 の分泌は確実に高められる。ＤＮＡフラグメントは、ストレプトマイシスの公知 バクテリオファージ・ベクターのいずれか、例えばφＣ３１またはＲ４によりス トレプトマイシスの染色体ＤＮＡへクローン化され得る（チャーター等、「ジー ン・クローニング・イン・オーガニズムス・アザ−・イン・エンエリヒア・コリ 」中［ジーン・クローニング・イン・ストレプトマイシスＪ、Ｐ、Ｈ，ホフシュ ナイダー等編、スブリンガーーフエルラーク、ベルリン、１９８２．８７−９５ 頁）。

第１４図の図式は、ストレプトマイシスからの外来蛋白質、この１場合ＣＲＦの 分泌を達成するための好ましい技術を示す。ＫＣ４００は、結合部位（ａｔｔ） を欠き、Ｃ遺伝子を有するφ３１誘導体である。チャーター、Ｋ、Ｆ、等、「ス トレプトマイシスにおける突然変異的クローニングおよび抗生物質製造遺伝子の 単離」、「ジーン」、２６：６７−７８（１９８３）参照。Ｃ遺伝子は、溶原状 態の維持に必要なリプレッサーをコードする。野生型ファージにおけるａｔｔ部 位は、宿主細胞ＤＮＡへのファージの結合を指示し、そこからの遊離を指示する 。ａｔｔ部位が無い場合、相同性ＤＮＡフラグメントがファージへクローン化さ れなければ、ファージは宿主染色体へ組み込まれ得ない。宿主株における内在遺 伝子は全て、この目的に使用され得るため、第１４図では単に「遺伝子Ｘ」とし て表される。ファージφ３１ＫＣ４００を公知技術で遺伝子操作することにより （ホップウッド、Ｄ、Ａ、等、「ノエネティック・マニピユレーション・イン・ ストレプトマイシス。ア・ラボラトリ−・マニュアル」、ザ・ジョーン・イネス ・ファウンデーション、ノーウィッチ、イギリス国（１９８５）参照）、相同性 遺伝子フラグメント（遺伝子Ｘ）並びにＳａｆプロモーターを含む遺伝子および 内在性α−アミラーゼ遺伝子およびα−アミラーゼ遺伝子に機能し得るように結 合し、これとり一ディング・フレームを形成するＣＲＦの遺伝子が挿入される。

このファージによって宿主ストレプトマイシス株、好ましくはストレプトマイシ ス・コエリコロルＡ　３　（２Ｘイギリス国ノーウィッチ、ザ・ジョーン・イネ ス・ファウンデーションのコレクションから入手可能）の感染後、全ファージＤ ＮＡは、好ましくはキャンベル型組換えを用いて、相同性遺伝子Ｘから始まる宿 主細胞の染色体ＤＮＡへ挿入される。示されている通り、これに従う特異的技術 の全ては、当業界の熟練者の技術範囲内に含まれるため、上記挿入は過度の実験 無しで行なわれ得る。

次いで、挿入された染色体遺伝子を含む細胞を処理することにより、ｐＵＬＡＤ ３プラスミドを取り上げる。前記細胞はＳＡＦポリペプチドを発現し、これが染 色体遺伝子による「α−アミラーゼ」の分泌を向上させる。この遺伝子における ｓａｆプロモーターの存在により、「α−アミラーゼ」の分泌はさらに高められ る。分泌された「α−アミラーゼ」はそこに融合したＣＲＦ分子を含み、これは 適当な酵素消化により容易に分離され得る。

ストレプトマイシスのα−アミラーゼ遺伝子について具体的に例を挙げて説明し たが、ｓａｆプロモーターを用いて発現を向上させることを目的として、使用さ れている種類のストレプトマイシスにより産生されたポリペプチドまたは蛋白質 の遺伝子は、天然プロモーターを除去し、ｓａｆプロモーターと置き換えること により修飾され得るものと理解すべきである。同様に、外来ポリペプチドまたは 蛋白質は上記内在遺伝子へ挿入され得る。しかしながら、好ましくは、選択され た内在遺伝子は、細胞壁を通って培養培地中へ蛋白質を発現するものであり、こ の場合分泌シグナル配列の保持が重要である。

外来遺伝子挿入用に選択されている遺伝子がＳＡＦにより制御され、前記挿入が 染色体ＤＮＡに存在し、好ましくはｓａｆ遺伝子含有プラスミドの同時挿入を伴 う場合、最善の結果が得られる。

ＣＲＦについて具体的に述べたが、外来ＤＮＡ配列は、蛋白質またはポリペプチ ドをコードする非ストレブトマインス誘導性ＤＮＡ配列であればよく、特に真核 生物またはウィルス起源のものであり得るものと理解すべきである。それらの真 核生物およびウィルスＤＮＡ配列の例には、ヒトおよび動物白血球インターフェ ロン（ＩＮＦ−α）、線維芽細胞インターフェロン（ＩＮＦ−β）および免疫イ ンターフェロン（Ｉ　ＮＦ−γ）、ヒト・インシュリン、ヒトおよび動物成長お よび他のホルモン類、例えばコルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）、ヒト血清ア ルブミンおよび様々なヒト血液因子およびプラスミノゲン活性化因子、両組織お よびつσキナーゼ、Ｂ型肝炎ウィルス・コアおよび表面抗原、ＦＭＤウィルス抗 原および他のヒト、動物およびウィルス性ポリペプチドおよび蛋白質をコードす る配列がある。

ｓａｆプロモーターは好ましいが、外来ポリペプチドまたは蛋白質の生産性は、 ｓａｆ遺伝子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりさらに高 められる。この発現ベクターは細胞のプラスミドＤＮＡに存在し得る。すなわち 、内在性プロモーターまたは他のプロモーターがあればそれを用いて、さらに外 来ポリペプチドまたは蛋白質の分泌を達成し得る。

実施態様の上記内容は本発明の全般的性質を充分に開示しているため、他の者で も、最新知識を適用することにより、包括的概念から逸脱することなく上記実施 態様を容易に修飾および／または様々な適用形態に適合させることができ、従っ て、それらの適合および修飾も開示された具体的態様の均等内容の意味および範 囲内に包含されるものとする。ここに用いられている表現または用語は、説明を 目的とするものであって限定的ではないものとする。

第１表、細菌株 各１　関連特性　出所 Ｓ、グリセウスＡＴＣＣ１０１３７野生型　ＡＴＣＣ８，グリセウスＪ１２２１ ２　野生型　ＪＩＳ、グリセウスＩＭＲＵ３５７０　野生型　ＩＭＲＵＳ、リビ ダンスＪ１１３２６　野生型　ＪＩＳ、アクリマイシニＪＩ２２３６　野生型　 ＪＩＳ、コエリコロルＪＩ２２８０　ＣｙｓＥ２４、ＰａｂＡｌ、５ｔｒｌ　Ｊ 　ＩＳ、コエリコロル月１１５７　野生型　ＪＩＳ、クラブリゲルスＮＲＲＬ３ ５８５　野生型　ＮＲＲＬＳ、ラクタムドユランスＮＲＲＬ３８０２　野生型　 ＮＲＲＬＳ、アルプスＧ　野生型　ＪＩ Ｅ、コリＥ１５　ｐｈｏＡ８　ＣＧ　Ｓ　ＣＥ、コリ＾Ｗ１０４６　Ｐｈｏ＾、 ｐｈｏＣ，ｔｓＺ：：ｔｎ５．１ｅｕＳＫａｎ　ＩＪ■：　ザ・ジョーン・イネ ス・インステイテユートの微生物コレクション。コレニー・レーン、ノーウィッ チＮＲ４ＵＨ１イギリス国。

ＡＴＣＣ：　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション。

ＩＭＲＵ：　ワクスマンズ・インステイテユート・イン・マイクロバイオロジー 、ルトガーズ・ユニバージティー、ニュープランスウィック、ニューシャーシー 、アメリカ合衆国。

ＮＲＲＬ：　ノーイン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ、ペオリア、 イリノイ、アメリカ合衆国。

ＣＧＳＣ：　エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）・ジエネテイツク・ストッ ク・センター。

第２表、プラスミドおよびファージ。

各１　関連特性　匿ｊ ｐｌＪ７０２　チオストレプトン耐性 およびメラニン＋　３ ｐｌＪ６９９　チオストレプトン、ビオマイシンおよびカナマイシン耐性　４ ｐｌＪ６１　チオストレプトンおよび ネオマイシン耐性　５ ｐｌＪ４８６　チオストレプトン耐性およびプロモーター非随伴ｓａｔ遺伝子　 ６ ｐＵＬＡＤ系列　ｓａｆ遺伝子および／または近接配列をもつ　本発明ストレプ トマイシスおよびエシェリヒア　の作業ｐｌＪ４８６　の作業 ｐＵｃ１９　ｂｌａ＋、ｌａｃ　Ｚ　ｐ　Ｚ　ｏ　Ｚ　’　７ｐｌＪ２９２１　 ｂｌａ＋、１ａｃＺｐＺｏＺ’　第１０図参照Ｍ１３　ｍｐｌｏお よびｍｐＨ１本鎖ＤＮＡの生成用ファージ　８第１表および第２表で引用された 参考文献。

１、ホフマン、Ｃ，Ｓ、、およびＡ、ライト。１９８５゜分泌された蛋白質のア ルカリ性ホスファターゼへの融合：　蛋白質分泌の試験方法。「プロシーディン ゲス・イン・ザ・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンシーズ・イン・ザ・ ニー・ニス・ニー」、８２：２、メッシング、Ｊ９、Ｒ，フレアおよびＰ、Ｈシ ーツ（−グ。１９８１０ノヨツトガンＤ　Ｎ　Ａ配列決定のシステム。「ヌクレ イツク・アルプス・リサーチ」、９：３０９−３２１０３、キャップ、Ｅ９、Ｃ ，Ｊ　、　）ンプソンおよびり、Ａ、ホップウッド。１９８３゜ストレプトマイ シス・リビダンスにおけるストレプトマイシス・アンティビオティクスからのチ ロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現。「ジャーナル・イン・ジェネラル ・マイクロバイオロジーＪ、１２９：２７０３−２７１４゜４、キーザー、Ｔ、 およびＲ，Ｅ、メルトン。１９８８゜プラスミドｐＩＪ６９９、ストレプトマイ シスのマルチコピー陽性−選択ベクター。「ジーン」、６５＋８３−９１゜５、 ホップウッド、Ｄ、Ａ、、Ｍ、Ｊ、、ビブ、Ｋ、Ｆ、チャーター、Ｔ　キーザー 、ＣＪ、ブルドン、Ｈ，Ｍ、キーザー、Ｄ、Ｊ、、、リゾイエイト、Ｃ，Ｐ、、 スミス、Ｊ、Ｍ、ワード、およびＨ，ンユレンブフ。１９８５゜ストレプトマイ シスの遺伝子操作。ア・ラボラトリ−・マニュアル。ザ・プローブ・イネス・フ ァウンデーション、ノーウィッチ、イギリス国。

６、ワード、Ｊ、Ｍ、、Ｇ、Ｒ，ジャンセン、Ｔ、キーザー、Ｍ、Ｊ。

ビブ、Ｍ、Ｊ　ブットナーおよびＭ、Ｊ、ビブ。１９８６゜指標としてＴｎ５か らのアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いた、ストレプト マイシスに関する一連のマルチコピー・プロモーター−プローブ・プラスミド・ ベクターの構築および特性検定。「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ ティックス」、２０３：４６８−４７８゜ ７、ヤニツシューペロン、Ｃ，、Ｊ、ビエイラおよびＪ、メッシング。１９８５ ゜改良されたＭ１３ファージ・クローニング・ベクターおよび宿主株：Ｍ１３ｍ ｐｌＢおよびｐＵＣ１９ベクターのヌクレオチド配列。「ジーン」、３３：１０ ３−１１９゜８、メッシング、Ｊ、。１９８３゜クローニング用新規Ｍ１３ベク ター。「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、１０１：２０−７８゜ 相異なるプラスミドにより形質転換されたストレプトマイシス・リビダンスの培 養物の培養ブロス（上清）における担体蛋白質（アミラーゼ）の定量。

我々は、３つの異なる方法を使用することにより、分泌された蛋白質の量を測定 した。

！、シマズ分光濃度計を用いた、銀染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける蛋白 質帯または同ゲルの写真ネガ（フィルム）の分光濃度測定法。

２、カラムＣ８アクアボアＲＰ−３００（２００Ｘ４．６ｎ＋ａ：ブラウンリー ・ラプス、アメリカ合衆国）を備えたＨＰＬＣを用いた異なる蛋白質の量の分析 。

３、分子ふるい（ゲルろ過）カラム・プロティン・パック３００ＳＷを備えたＨ ＰＬＣによる分析。

結果 ストレプトマイシス・リビダンス［ｐＵＬＴＶ　１００］、ストレプトマイシス ・リビダンス［ｐＵＬＶＤ１０］およびストレプトマイシス・リビダンス［ｐＵ ＬＴＶ８０］の胞子を、培地レチェバリアー＋Ｉ％澱粉に接種した。各々３６． ６０および６０時間の発酵後に最大アミラーゼ活性が得られた。細胞外流体（上 清）中の総蛋白質を、ブラッドフォード法により定量化した。各ブロスの蛋白質 ５μｇを５ＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、銀で染色した。

１、分光濃度測定法−ストレプトマイシス・リビダンス［ｐＵＬＴＶ　ｌ　００ ］（蛋白質５μｇ）、ストレプトマイシス・リビダンス［ｐＵＬＶＤＩＯ］（蛋 白質５μｇ）およびストレプトマイシス・リビダンス［ｐＵＬＴＶ８０］（蛋白 質５μｇ）ノ上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）における帯の分 光濃度測定を実施した。

２、カラム・アクアポアＲＰ−３００におけるＨＰＬＣ−５０ミリモル酢酸−酢 酸アンモニウム緩衝液およびメタノール勾配二〇−２０分０％メタノール、３０ −３５分１００％メタノール、４５分Ｏ％メタノールにより蛋白質を溶離した。

アミラーゼは、３３−３４分で１００％メタノールにより溶離する。結果を第３ 表に示す。

３、プロティン−バック３００　ＳＷにおけるＨＰＬＣ−上記と同じ構築物の培 養ブロスの上清を先に透析し、凍結乾燥により濃縮した。蛋白質は、０　、５　 ｍｌ／分の流速で酢酸−酢酸アンモニウム緩衝液により溶離した。アミラーゼは ２１−２２分で集中したピークとして溶離する。

ＦＩＧＩ ＦＩＧ２ ＩＧ３ ＦＩＧ４ ｏ　Ｌｎ　ＯＬｎ　寸　ｎ Ｌｒ）ｏ″１　寸　Ｃｏ　Ｃ％Ｊ　ＣＤｃｒ３　（’Ｑ　寸　寸　Ｌｎ　り ＦＩＧ１２ ＦＩＧＩ４ 国際調査報告 −１電−ａ＋酬自１−ａｌ＾−１＠ｌｌｆ＠電−−ＩＩｈｖＰＣＴ／ＧＢ９０１ ００７８１

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列： 【配列があります】 を有する実質的に純粋なポリペプチドおよび／または同じ活性を有するそのフラ グメント。
2. （２）請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
3. （３）下記ヌクレオチド配列： 【配列があります】 を含むＤＮＡ配列。
4. （４）請求項３記載のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションし、ＳＡＦ型 のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
5. （５）請求項２記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
6. （６）ＤＮＡ配列が調節単位と近接している、請求項５記載のベクター。
7. （７）ＡＴＧまでの上流にある置溶飾単位が下記ヌクレオチド配列：【配列があ ります】 を有する、請求項６記載のベクター。
8. （８）請求項５記載のベクターにより形質転換されたストレプトマイシス宿主細 胞。
9. （９）請求項８記載の宿主細胞を培養することによるポリペプチドの製造方法。
10. （１０）請求項３記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
11. （１１）ＤＮＡ配列が調節単位と近接している、請求項１０記載のベクター。
12. （１２）ＡＴＧまでの上流にある調節単位が下記ヌクレオチド配列：【配列があ ります】 を有する、請求項１１記載のベクター。
13. （１３）請求項１０記載のベクターにより形質転換されたストレブトマイシス宿 主細胞。
14. （１４）請求項１３記載の宿主細胞を培養することによる、ポリペプチドの製造 方法。
15. （１５）請求項４記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
16. （１６）ＤＮＡ配列が調節単位と近接している、請求項１５記載のベクター。
17. （１７）ＡＴＧまでの上流にある調節単位が下記ヌクレオチド配列：【配列があ ります】 を有する、請求項１６記載のベクター。
18. （１８）請求項１５記載のベクターにより形質転換されたストレブトマイシス宿 主細胞。
19. （１９）請求項１８記載の宿主細胞を培養することによる、ポリペプチドの製造 方法。
20. （２０）プラスミドｐＵＬＡＤ３。
21. （２１）下記ＤＮＡ配列： 【配列があります】 を有するプロモーター。
22. （２２）請求項２１記載のプロモーターと機能し得るように結合したポリペプチ ドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むクローニング・ビヒクル。
23. （２３）ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシスにとって内在性の配列である、請求 項２２記載のクローニング・ビヒクル。
24. （２４）ＤＮＡ配列が、非ストレブトマイシス・ポリペプチドまたは蛋白質をコ ードするＤＮＡ配列と同じ解読枠内で融合したストレプトマイシスにとって内在 性のポリペプチドまたは蛋白質をコードする配列の全部または一部分を含む、請 求項２２記載のクローニング・ビヒクル。
25. （２５）請求項２２記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。
26. （２６）請求項２３記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。
27. （２７）請求項２４記載のクローニング・ビヒクルにより形質転換されたストレ プトマイシス宿主細胞。
28. （２８）ストレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ配列を発現させる方法であって 、外来ＤＮＡ配列を請求項２１記載のプロモーターを含むストレプトマイシス発 現制御配列と機能し得るように結合させることを含む方法。
29. （２９）外来ＤＮＡ配列およびストレブトマイシス発現制御配列を、ストレプト マイシスの染色体ＤＮＡに挿入する、請求項２８記載の方法。
30. （３０）さらに宿主ストレプトマイシスが、ＳＡＦ型のポリペプチドを発現し得 るプラスミドを含む、請求項２９記載の方法。
31. （３１）外来ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシスから分泌される蛋白質またはポ リペプチドのシグナル配列の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列を介して ストレプトマイシス発現制御配列と機能し得るように結合されており、 シグナル配列をコードするＤＮＡ配列が、ストレプトマイシス発現制御配列の制 御下で外来ＤＮＡ配列と一緒に発現されることにより、外来ＤＮＡ配列によりコ ードされる蛋白質またはポリペプチドが分泌され得る、請求項２８記載の方法。