KR102169157B1

KR102169157B1 - 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제

Info

Publication number: KR102169157B1
Application number: KR1020180128358A
Authority: KR
Inventors: 김다연; 이상엽; 한지희; 안성호
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-10-22
Also published as: KR20200046768A

Abstract

본 발명은 식물 역병균에 대하여 방제효과를 갖는 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로서, 상기 균주를 이용한 환경공해와 인체독성이 없어 곰취 등의 식물에 대해 환경 친화적인 역병 방제 또는 식물의 생육 촉진이 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있다.

Description

신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제 {New microorganism Enterobacter asburiae ObRS-5 or microbial agent comprising the same}

본 발명은 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물 역병균인 파이토프토라 드레크슬레리(Phytophthora drechsleri)에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제에 관한 것이다.

곰취(Ligularia fischeri)는 그늘지고 습기가 많은 높은 지대의 숲에서 자생하는 숙근성 산채로서 1990년대부터 강원도, 경상남도, 경상북도 및 전라남도 일부 지역의 시설 또는 임야에서 재배되고 있다. 곰취는 생으로 먹을 수 있고, 맛과 향이 좋아 소비자 기호가 높은 산채 중 하나이다. 곰취는 고지대 산에서 자생하는 동안 병해충 발생이 거의 없는 식물로 알려져 있지만 기존의 자생지와 습도, 온도, 조도 등이 다른 환경인 시설하우스에서 밀식 연작 재배할 때 역병, 흰가루병, 흰비단병 등 병해가 다양하게 발생하여 문제가 된다고 보고된바 있다.

곰취에 발생하는 병해 중에서도 Phytophrhoa drechsleri 병원균에 의한 역병(Phytopthora root rot)은 한 번 발병하면 급속도로 확산되어 고사하기 때문에 방제가 매우 어려운 병이며 예방이 중요하다(Kwon et al., 1999). 합성농약을 이용한 화학적 방제는 환경오염과 인축에 대한 독성 등의 문제를 가지고 있어, 생으로 섭취하는 산채인 곰취의 특성상 생산농가나 소비자 모두 친환경 재배를 선호한다. 그러나 곰취 역병의 친환경 방제를 위한 미생물제와 같은 생물적 방제 수단이 부재하여 농가에서는 곰취 친환경재배의 어려움을 호소하고 있다. 곰취 종자는 발아율이 낮아 자가 육묘가 어렵고 곰취 묘의 가격이 다른 작물과 비교하여 비싼 편이기 때문에, 매년 식재하는 농가는 드문 편이라서 연작피해로 인한 역병 발생이 심하다. 최근에 2~3년 곰취 재배 농가들 중 일부에서 곰취 역병 발생이 24.1∼43.1%에 달하여 곰취 생산량이 큰 폭으로 감소하여 머위, 두릅 또는 고추 등 다른 작물로 대체하였다.

친환경 농업에서 유용미생물 또는 길항미생물은 화학 농약의 대체가 가능한 대안으로서 큰 역할을 하고 있다. 오늘날 농업은 품종 개량, 토양 비옥도 증진, 병해충 방제 및 잡초 제거 등의 방법으로 식량 증산에 몰두해 왔지만 지속적인 농약의 사용과 남용은 토양과 하천의 심각한 오염을 유발하고 있다. 또한, 농작물에 이들 농약이 잔류함으로써 독성, 환경오염 및 사람과 가축에 대한 독성 등의 문제를 일으키기 때문에 농약 사용은 현재 세계적으로 그에 대한 제제 조치가 강화되고 있다. 이와 같은 농약에 대한 우려와 삶의 질에 대한 관심이 커지면서 최근에는 새로운 대안으로서 농작물 병해충 방제에 미생물이나 식물추출물을 이용하는 생물학적 방제가 관심의 대상이 되고 있다.

미생물 제제는 식물병 또는 해충 방제에 효과를 나타내는 세균, 진균, 바이러스 등으로 만든 제품을 일컬으며, 병해충 방제 외에도 농업에 이용할 수 있는 영역은 토양개량, 유기물 분해촉진, 양/수분 흡수 촉진, 생육촉진 및 제초작용 등이 있다(Johansson et al., 2004; Khan et al., 2007; Chandler et al., 2008). 유용 미생물이 식물의 생장을 돕는 방법으로 인산가용화, 질소고정, 식물생장촉진 호르몬 생산 등 생물비료기작이 알려져 있으며, 그 외에도 용균작용, 기생작용, 공간이나 양분 경쟁을 통한 길항작용, 항생물질 생산, 병저항성 유도 등 생물적 방제기작으로 알려진 방법으로 식물 생장을 간접적으로 돕는다. 건전한 토양과 작물 근권에 상대적으로 높은 개체군을 나타낸다고 보고한 형광성 Pseudomonas sp., Bacillus sp., Streptomyces sp. 등은 식물과의 상호작용을 촉진하는 매체로서의 역할을 하고, 작물 근권에 서식하는 미생물은 숙주 식물과 관계를 형성하는 과정에서 식물병해충의 효율적인 생물적 방제 등 작물 수확량 증가에 이용될 가능성이 높아 미생물의 농업적 활용도를 높일 수 있을 것으로 보고 있다.

본 발명자들은 이러한 유용미생물 또는 길항미생물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5)가 곰취 등의 식물에 역병을 일으키는 파이토프토라 드레크슬레리(Phytophthora drechsleri)에 대한 방제효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1512653호 (발명의 명칭 : 신규한 미생물 균주 및 친환경 비료용 미생물제제, 출원인 : 강원대학교 산학협력단, 등록일 : 2015년04월10일) 대한민국 등록특허 제10-1820010호 (발명의 명칭 : 살선충 효능을 갖는 신규 엔테로박터 속 HK169균주 및 그의 배양물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제제, 출원인 : 한국화학연구원, 등록일 : 2018년01월12일)

Chandler, D., G. Davidson, W. Grant, J. Greaves and G. Tatchell. 2008. Microbial biopesticides for integrated crop management: an assessment of environmental and regulatory sustainability. Trends Food Sci. Technol. 19(5): 275-283. Khan, M. S., A. Zaidi and P. A. Wani. 2007. Role of phosphate-solubilizing microorganisms in sustainable agriculture - a review. Agron. Sustain. Dev. 27(1): 29-43. Kwon, S. B., H. J. Jee, S. B. Bang, K. K. Lee and C. K. Hong. 1999. Phytophthora root rot of Ligularia fischeri caused by P. drechsleri. Korean Soc. Plant Pathol. 5(1): 58-60. Johansson, J. F., L. R. Paul and R. D. Finlay. 2004. Microbial interactions in the mycorrhizosphere and their significance for sustainable agriculture. FEMS Microbiol. Ecol. 48(1): 1-13.

본 발명의 목적은 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제를 제공하는 데에 있다. 보다 상세하게는 본 발명의 목적은 식물 역병균인 파이토프토라 드레크슬레리(Phytophthora drechsleri)에 대하여 방제효과를 갖는 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 식물병 방제효능을 갖는 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP)에 관한 것이다.

상기 식물병은 역병균인 파이토프토라 드레크슬레리(Phytophthora drechsleri)로부터 유도되는 것을 특징으로 한다.

상기 식물은 곰취, 고추, 토마토, 오이, 상추, 수박, 겨자, 당귀, 양파, 배추, 파, 무, 인삼, 딸기, 상추 및 마늘로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 16s rRNA의 유전자를 포함한다.

본 발명은 상기 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.

이에 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 미생물 농약에 관한 것이다.

상기 미생물 농약은 종자코팅제, 종자침지제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 및 관주살포제로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형으로 제공될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 10~1000배로 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 식물 병원균 방제 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

본 발명에서 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 배양에 적용가능한 배지는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, TSB(Tryptic Soy Broth), TSA(Tryptic Soy Agar), NA(Nutrient Broth) 및 NA(Nutrient Agar)에서 선택되는 통상의 미생물 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 균주 배양액은 호기 조건에서 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5를 pH 5.0~9.0 및 15~35℃에서 배양한 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 호기 조건에서 pH 6.5~7.5 및 25~30℃에서 배양하는 것이 더 좋다. 이 때 적절한 배양시간은 24-48 시간인 것이 바람직하며, 배양방법은 액체 진탕 배양이나 고체 배양 어느 방법이든지 선택될 수 있다.

본 발명은 상기 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제제를 제공하는데, 상기 균주 또는 이의 배양액은 사용용도에 따라 적절하게 물 또는 균주 배양전의 배지로 희석하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 미생물 제제의 형태는 크게 제한되지 않으나, 미생물 농약으로 제공되며, 더 바람직하게는 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제의 제형으로 제공될 수 있다.

상기 미생물 농약으로서, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제는 통상의 식물 농약에 사용하는 담체 또는 부형제를 사용할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제로서 바람직하게는 벤토나이트, 계면활성제, 탈크, 제오라이트 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 미생물 제제를 10~1000배로 희석(1x10^6~8CFU/㎖)하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 식물 병원균 방제 방법을 제공한다. 상기 종자침지, 종자코팅 시의 희석액 대 종자의 혼합비는 종자가 침지되거나 코팅되기만 한다면 사용량은 적절하게 조절할 수 있다. 또한 상기 엽면살포 또는 관주살포 시 각 희석액의 살포량도 토양 분포나 식물 상태에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제의 방제대상 식물 또는 생육촉진 대상 식물은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 곰취, 고추, 토마토, 오이, 상추, 수박, 겨자, 당귀, 양파, 배추, 파, 무, 인삼, 딸기, 상추 및 마늘로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한 상기 방제대상 식물로서 역병에 취약한 각종 화훼류의 적용도 가능하다.

본 발명은 식물 역병균에 대하여 방제효과를 갖는 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP) 균주 또는 이를 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로서, 상기 균주를 이용한 환경공해와 인체독성이 없어 곰취 등의 식물에 대해 환경 친화적인 역병 방제 또는 식물의 생육 촉진이 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있다. 엔테로박터 아스뷰리에와 관련된 식물병 방제제 관련 기술로서 대한민국 등록특허 제10-1512653호와 대한민국 등록특허 제10-1820010호에 각각 수분 결핍과 염분 스트레스를 받는 사구식물의 근권에서 분리된 신규한 엔테로박터 아스뷰리에 m-4 및 이를 함유하는 식물생장촉진 효과가 있는 친환경 비료용 미생물제제, 토마토뿌리혹선충에 대해 높은 살선충력을 갖는 엔테로박터 속 HK169 균주에 관한 기술이 개시되어 있으나, 각 균주의 기능 및 이로 인해 발생하는 효과가 달라 본 발명과는 다른 기술이라고 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 길항미생물 분리과정에서 확인된 항균력을 나타내는 균주의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 종자 생물 검정법을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 종자 생물 검정 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4는 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 16S rRNA의 DNA 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 유전학적 위치를 나타내는 계통수 그림이다.
도 6은 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 종자 코팅처리에 의한 곰취 역병 방제 효과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 관주처리에 의한 곰취 역병 방제 효과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 신규 균주의 분리>

곰취 역병을 방제하기 위한 미생물을 분리하기 위해 공주, 익산, 밀양, 순창 등 국내 14개 지역의 작물 재배 토양, 근권 토양 및 뿌리로부터 세균을 분리하였다. 채취한 토양 및 근권토양은 3 g을 멸균수 27 ml에 넣고 28℃에서 180 rpm으로 30분 간 진탕 처리한 후 1 ml을 취하여 멸균수 9 ml에 단계 희석하여 Tryptic Soybean Agar (TSA; Difco), 1/10 TSA, Nutrient Agar (NA; Difco) 배지에 도말하였다. 채취한 뿌리는 수세 후 물기를 제거하고 멸균한 막자사발에 멸균수 3 ml과 시료를 넣고 완전히 갈은 후, 멸균수 24 ml을 더 첨가한 현탁액을 위와 같은 방법으로 각각의 배지에 도말하였다. 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 색과 형태가 다른 단일 콜로니를 순수 분리하였고, 20%(v/v) glycerol 수용액에 넣어 -70℃에 보관하며 실험에 이용하였다.

<실시예 2. 곰취 역병균에 대한 항균력 검정>

실시예 1에서 분리한 균주들의 역병균 Phytophthora drechsleri에 대한 항균력을 검정하였다. Potato Dextrose Agar (PDA; Difco) 배지의 중앙으로부터 35 ㎜ 거리에 분리균주를 획선 도말하여 25℃에서 24시간 동안 배양하였고, 대조구에는 멸균수를 이용하였다. Phytophthora drechsleri 균총을 PDA 배지의 정 가운데에 치상하여 25℃에서 5일 간 분리균주와 배양한 후 저지대(Inhibition zone)의 크기를 측정하여 항균력이 우수한 미생물을 선별하였다.

그 결과, 도 1과 같이 분리 세균 385점의 Phytophthora drechsleri에 대한 길항력을 검정한 결과, 역병균의 균사생장억제율이 25% 이상인 균주는 11점으로 확인되며 전체 분리균주의 3%로 나타난다. 또한 균사생장억제율이 10% 이상 25% 미만인 균주는 52점으로, 전체 분리균주의 14%로 나타났으며, 10% 미만이거나 억제 효과가 나타나지 않은 균주는 322점으로, 전체 분리균주의 84%로 나타나 분리 세균 중 대부분이 Phytophthora drechsleri에 대한 항균 활성이 없는 것으로 확인된다.

이 결과를 통해, 전체 분리균주의 17% 즉, 균사생장억제율이 10% 이상 나타난 분리세균 63점을 길항미생물로서 선별하였다.

<실시예 3. 종자 생물 검정을 통한 미생물 선발>

실시예 2에서 선별한 Phytophthora drechsleri에 대한 항균력이 우수한 63점의 분리균주를 대상으로 종자를 이용한 생물 검정을 수행하였다. 고추 종자는 발아 소요일수가 짧고 발아율이 높고 고르며 곰취 종자와 표면적이 비슷하면서 유묘기에 Phytophthora drechsleri에 대한 감수성이 높아, 종자 생물 검정을 수행하기에 효율 향상 및 시간과 비용 절감에 적합하였다. 종자를 이용한 생물 검정 방법은 Chang 등(2001)의 방법을 수정하여 실시하였다(도 2 참조).

먼저, 선별된 분리균주를 TSA 배지에 획선 도말하여 28℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 0.1%(w/v) peptone water (Becton Dickinson Biosciences, USA)에 현탁하여 농도를 1.0x10⁸ cfu/ml로 조절하였다(OD₆₀₀=0.5). Phytophthora drechsleri 균주는 0.02% glucose(w/v)가 첨가된 1.5%(w/v) water agar 배지 중앙에 직경 5 ㎜ 균총을 치상하여 28℃에서 24시간 배양하였다. 고추 종자(Manitta, Nongwoo-bio, Korea)는 표면의 미생물을 제거하기 위해 1% NaClO 및 70% Ethanol 용액으로 표면 살균하여 멸균수로 적신 필터페이퍼에 치상하였고 25℃에서 3일 동안 발아시킨 후 유근이 2 ㎜ 발아한 종자를 선별하였다. 선별한 종자는 준비한 분리균주현탁액에 3시간 침지처리한 후 Phytophthora drechsleri를 배양한 water agar 배지의 가장자리에 치상하였다(n=12). 대조구에는 멸균수에 침지한 고추 종자를 치상하였고, 모든 처리구는 25℃에서 광을 14시간/일으로 조사하면서 배양하였다. 이 후 처리 7일과 14일 후에 발병률(%)을 조사하였다.

이상과 같이 1차 선발한 분리균주 63점을 대상으로 역병 억제 효과가 있는 균주를 선발하기 위해 종자 생물 검정을 수행한 결과, ObRS-5 균주의 결과가 가장 좋은 것으로 확인되어 이 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 상단 '가' 그래프는 하단 '나'의 1.5%(w/v) water agar 배지에서 확인된 고추 종자의 성장 상태를 수치화하여 나타낸 것으로서, 도 3에서 '가'와 '나'의 A와 D는 ObRS-5 균주와 Phytophthora drechsleri가 같이 처리된 것이고, B와 E는 Phytophthora drechsleri만 처리된 것이며, C와 F는 무처리군이다.

도 3의 결과에서, Phytophthora drechsleri만 처리된 것의 발병률은 7일에 80.6%, 14일 94.4%로 나타나지만, ObRS-5 균주와 Phytophthora drechsleri가 같이 처리된 처리구(A와 D)에서 역병 발병률이 7일에 11.1%와 14일에 30.6%로 나타나, 현저한 역병 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 4. 선발균주의 생리학적 특성, 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통수 작성>

선발한 균주 ObRS-5를 동정하기 위해, 배양조건을 확인하였다. 상기 균주는 혐기 조건보다 호기 조건에서 잘 자라며, pH 5.0~9.0 및 15~35℃에서 배양가능한 것으로 확인된다. 보다 바람직하게는 호기 조건의 pH 6.5~7.5 및 25~30℃에서 배양이 잘 되며, pH 7.0 및 28℃에서 가장 잘 자랐다. 적합한 배양용 배지는 TSB(Tryptic Soy Broth), TSA(Tryptic Soy Agar), NA(Nutrient Broth), 및 NA(Nutrient Agar)인 것으로 확인되었고, 액체 진탕 배양이나 고체 배양 모두 균주의 성장이 잘 되었다. 또한 균주의 상태가 가장 최적으로 배양되기 위해서는 전배양된 균주를 새 배지에 24~48 시간 동안 배양하는 것이 바람직하였다. 이 때 배지 내 균주의 초기 접종 농도는 1x10^4~5CFU/㎖인 것이 바람직하였다.

다음으로는 유전학적 특성을 확인하기 위해, ObRS-5 균주를 TSA 배지에 획선 도말하여 28℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 단일 콜로니를 Tryptic Soybean Broth (TSB; Difco) 배지에 접종하여 28℃에서 48시간 동안 배양하였다. 균주 배양액은 8,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 균체를 수확한 뒤 Genomic DNA Prep kit (Nanohelix, Korea)로 제조사의 매뉴얼에 따라 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 16S rDNA 염기서열을 증폭하기 위해 27F (5'-GAGTTTGMTCCTGGCTCAG-3'), 1492R (5'-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') (M은 A 또는 C, Y는 C 또는 T을 나타냄) 프라이머를 이용하여(Weisburg et al., 1991) 95℃에서 5분 동안 열을 가한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초 동안 30회 반응 및 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동 분석으로 길이를 확인한 후 Genotech Co. (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 16S ribosomal RNA에 대한 DNA 염기서열을 이용한 분자계통수를 작성하기 위해 균주의 염기서열을 MEGA 6.06 프로그램을 이용하여 정렬한 뒤 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하여 계통수를 작성하였다(Bootstrapping 1000회 반복; Felsenstein, 1985). 비교한 표준 균주의 염기 서열은 EzTaxon-e 서버(http://www.eztaxon.org)를 통해 다운로드 받아 이용하였다.

이에 대한 ObRS-5 균주의 16S rRNA 유전자의 DNA 염기서열(서열번호 1)은 도 4와 같이 확인되었으며, 이를 이용하여 도 5와 같이 분자계통수를 작성한 결과, Enterobacter 속의 여러 균주들과 근연관계에 속하는 것으로 나타났다. 또한 ObRS-5 균주는 Enterobacter asburiae JCM 6052 균주와 99.9%의 높은 상동성을 보였으며 Bootstrap 값은 86%로 비교적 높은 것으로 나타나, Enterobacter asburiae의 subcluster에 속하는 것으로 확인되어, 최종적으로 Enterobacter asburiae ObRS-5로 동정하였다.

<실시예 5. ObRS-5균주의 종자 코팅처리에 의한 곰취 역병 방제 효과 검정>

곰취 역병의 토양처리(접종)는 다음과 같이 진행하였다. 역병균인 Phytophthora drechsleri의 유주자는 기주 식물에 침입하는 1차 전염원으로 알려져 있기 때문에 역병균을 다루는 연구에서 다량의 유주자(zoospores)를 확보하는 것은 실험을 수행하기 위한 중요한 요소 중 하나이다(Mansoori and Banihashemi, 1982). 먼저 유주자낭 유도에 필요한 토양추출물을 제조하기 위해, 2 ㎜ 체에 거른 토양을 증류수와 1 : 3(v/v) 비율로 혼합하고 CaCO₃ 3 g을 첨가하여 실온에서 20시간 동안 정치하였고, 3겹의 거즈로 토양을 걸러낸 여액을 취하여 필터페이퍼로 여과한 후 멸균하여 사용하였다. 직경 5 ㎜의 Phytophthora drechsleri 균총을 V8 juice 배지(V8 juice (Campbell's Soup Co., Camden, USA) 330 ml, CaCO₃ 1.5 g, DW 670 ml)에서 3일간 배양 한 후 멸균수로 배지를 씻어내고 토양추출물을 첨가한 후 20℃에서 광을 24시간/일로 조사하면서 6일간 정치배양하였다. 유주자낭 생성 여부를 실체현미경(M205A, LEICA, Germany)으로 확인한 후 유주자를 나출시키기 위해 25분간 -20℃에서 처리한 후 3시간 동안 실온에 정치하였다. 균사는 멸균한 거즈로 걸러낸 후 유주자 현탁액 농도를 조절하여 주 당 5 ml씩 토양 g당 5.0x10⁵ zoospores가 되도록 토양 관주처리하였다.

다음으로, 선발한 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 곰취 종자 코팅처리에 의한 역병 방제 효과를 검정하였다. 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주는 TSA 배지에 획선 도말하여 28℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 0.1% peptone water에 현탁하여 농도를 1.0x10⁸ cfu/ml로 조절하였다. 멸균한 상토(Baroker, Seoul Bio, Korea)에 멸균거즈를 깔고 그 위에 표면살균한 곰취 종자를 파종한 후 다시 멸균토양으로 얇게 덮었다. 파종 5일 후 유근이 1.5∼2 ㎜ 발아한 곰취 종자를 선별하여 준비한 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 현탁액에 3시간 동안 침지처리한 후 32공 트레이에 재 파종하였다(n=12). 대조구는 0.1% peptone water에 침지처리한 후 파종하였다. 파종 4주 후 역병균인 Phytophthora drechsleri를 앞서 제시한 토양관주처리를 통해 접종하고 대조구에서 지상부 시들음 병징이 50% 이상 나타났을 때 발병률(%)을 조사하였다.

이렇게 상기 발병률에 대한 결과를 표 1과 도 6에 나타내었는데, 도 6은 표 1의 Experiment 1 결과로서, A는 병원균인 Phytophthora drechsleri의 처리 전에 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5로 종자코팅 처리된 군, B는 병원균인 Phytophthora drechsleri 만의 처리군, C는 무처리군을 나타낸다. 또한 표 1의 결과를 이용하여 방제가도 계산하였다.

방제가 = ((무처리-처리)/무처리) x 100 (%)

표 1 및 도 6과 같이, 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주로 종자코팅 처리된 군의 역병 발병률은 25.0%로 나타나, 60%(방제가)의 곰취 역병 방제 효과가 있는 것으로 확인된다. 반복 수행한 결과에서도 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주로 종자처리된 군은 60%의 곰취 역병 방제 효과를 나타낸다.

Treatment	Disease incidence (%)
	Experiment 1		Experiment 2
	5 days after	15 days after	5 days after	15 days after
ObRS-5	25.0	25.0	18.8	25.0
pathogen-treated control	56.3	62.5	62.5	62.5
nontreated healthy control	0	0	0	0

<실시예 6. ObRS-5균주의 관주처리에 의한 곰취 역병 방제효과 검정>

엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 관주처리에 의한 곰취 역병 방제 효과를 검정하기 위해, ObRS-5 균주를 TSB 배지에 접종하여 180 rpm, 48시간 동안 진탕배양한 후 농도를 1x10⁸cfu/ml로 조절하였다. 준비한 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 배양액을 파종 4주된 곰취 12주에 주당 50 ml씩 1회(표 2의 Experiment 1 및 2) 또는 7일 간격으로 2회(표 2의 Experiment 3) 관주 처리하였고 대조구에는 TSB 배지를 동일하게 관주 처리하였다. 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 배양액 처리 7일 후 역병균 Phytophthora drechsleri를 실시예 5에서 수행한 바와 같이 접종하였고 대조구에서 지상부 시들음 병징이 50% 이상 나타났을 때 발병률(%)을 조사하여 표 2와 도 7에 나타내었다.

도 7은 표 2의 Experiment 1 결과로서, A와 C는 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주의 관주처리 후 역병균 Phytophthora drechsleri를 접종한 군이며, B와 D는 역병균 Phytophthora drechsleri만을 접종한 군이다.

Treatment	Disease incidence (%)
	Experiment 1		Experiment 2		Experiment 3
	7 days after	14 days after	7 days after	14 days after	7 days after	14 days after
ObRS-5	0	7.1	0	6.3	11.1	11.1
Control	68.8	75.0	50.0	50.0	86.7	93.3

표 2와 도 7을 참고하면, 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 배양액의 토양 관주처리 1회에 의한 곰취 역병 방제효과를 검정한 결과, 처리 14일째에 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 처리구에서 발병률이 6.3~7.1%로서, 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주가 처리되지 않고 Phytophthora drechsleri만 처리된 군과 비교하여 87.4~90.5%(방제가)의 곰취 역병 방제 효과가 있는 것으로 확인된다.

또한 토양 관주처리 2회 실시한 결과, 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 처리구의 발병률은 7일에 11.1%로 나타나 87.2%(방제가)의 곰취 역병 방제 효과가 나타났고, 역병균 접종 14일 후에 88.1%(방제가)의 곰취 역병 방제 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

이상과 같은 결과로, 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 배양액 처리에 의한 곰취 역병 방제 효과가 우수한 지속성을 나타내는 것으로 확인된다.

국립농업과학원

KACC81075BP

20180703

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> New microorganism Enterobacter asburiae ObRS-5 or microbial agent comprising the same <130> P-2018-0225 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1356 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Enterobacter asburiae <400> 1 ggttaagcta cctacttctt ttgcaaccca ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60 ggcccgggaa cgtattcacc gtagcattct gatctacgat tactagcgat tccgacttca 120 tggagtcgag ttgcagactc caatccggac tacgacgcac tttatgaggt ccgcttgctc 180 tcgcgaggtc gcttctcttt gtatgcgcca ttgtagcacg tgtgtagccc tactcgtaag 240 ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccagtt tatcactggc agtctccttt 300 gagttcccgg ccggaccgct ggcaacaaag gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360 cccaacattt cacaacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtctca gagttcccga 420 aggcaccaat ccatctctgg aaagttctct ggatgtcaag agtaggtaag gttcttcgcg 480 ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag 540 ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcgacttaa cgcgttagct ccggaagcca 600 cgcctcaagg gcacaacctc caagtcgaca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660 aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tgagcgtcag tctttgtcca gggggccgcc 720 ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg gaattctacc 780 cccctctaca agactctagc ctgccagttt cgaatgcagt tcccaggttg agcccgggga 840 tttcacatcc gacttgacag accgcctgcg tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac 900 gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt tagccggtgc ttcttctgcg 960 ggtaacgtca atcgacaagg ttattaacct tatcgccttc ctccccgctg aaagtacttt 1020 acaacccgaa ggccttcttc atacacgcgg catggctgca tcaggcttgc gcccattgtg 1080 caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc 1140 tggtcatcct ctcagaccag ctagggatcg tcgcctaggt gagccgttac cccacctact 1200 agctaatccc atctgggcac atctgatggc aagaggcccg aaggtccccc tctttggtct 1260 tgcgacgtta tgcggtatta gctaccgttt ccagtagtta tccccctcca tcaggcagtt 1320 tcccagacat tactcacccg tccgccgctc gtcacc 1356

Claims

곰취 역병 방제효능을 갖는 신규 미생물 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5(Enterobacter asburiae ObRS-5, 미생물 수탁번호 : KACC 81075BP)균주.
제1항에 있어서,
상기 곰취 역병은 식물의 역병균인 파이토프토라 드레크슬레리(Phytophthora drechsleri)로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 균주.
제2항에 있어서,
상기 식물은 곰취, 고추, 토마토, 오이, 상추, 수박, 겨자, 당귀, 양파, 배추, 파, 무, 인삼, 딸기, 상추 및 마늘로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표현되는 16s rRNA의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항의 엔테로박터 아스뷰리에 ObRS-5 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 곰취 역병 방제용 미생물 제제.
제5항의 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 농약.
제6항에 있어서,
상기 미생물 농약은 종자코팅제, 종자침지제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 및 관주살포제로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 미생물 농약.
제5항의 미생물 제제를 10~1000배로 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 종자침지, 종자코팅, 엽면살포 또는 관주살포하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 역병균(Phytophthora drechsleri) 방제 방법.