CN111935980A - 含有固氮细菌和另外的试剂的组合的组合物及其在植物物种中固氮的用途 - Google Patents
含有固氮细菌和另外的试剂的组合的组合物及其在植物物种中固氮的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于供应植物的氮需求的方法，该方法包括向所述植物施用非致病性固大气氮细菌和一种或多种活化剂的组合。这些活化剂中的许多拥有有力的抗炎和抗微生物活性。该方法特别适合用于实现植物物种如小麦、玉米和其他谷类作物中的氮固定，其中通常不可能进行固氮。本发明还提供了包含固氮细菌和合适的活化剂的组合物。在一个优选的实施方案中，固氮细菌是根瘤菌属的。
Description
发明领域
本发明涉及用于增强植物中固氮的组合物和方法。更具体地，本发明提供了非致病性固大气氮细菌与一种或多种另外的试剂的组合，以及所述组合在几种不同物种(包括禾本科植物)中固氮的用途。
发明背景
固氮是地球大气中的氮气被转化为氨或其他含氮分子，然后它们可用于生物体以满足其代谢和生物合成需求的过程。在植物的情况下，从萌发后的早期阶段直至植物成熟并形成其全部作物产率潜力都需要氮供应。
禾本科(Gramineae)包括玉米、小麦和稻，它们是全世界用于供给人类人口的三种主要农作物。
与可通过与某些细菌物种，包括根瘤菌属(Rhizobium)物种共生而固定大气氮的豆科(Leguminosae)植物不同，禾本科无法固定大气氮，并且种植者需要使用化肥为植物供应所需量的氮，以便提高作物产率。
然而，这种化学施肥方法并非没有重大问题，其中不仅包括地球上的淡水资源的大量污染，从而导致严重的生态破坏。例如，这可以在将含氮肥料从植物的根区冲出并渗入更深的含水层和淡水库中时发生。
因此，可迫切需要实现和/或增强许多植物物种，特别是禾本科的植物物种中的氮固定的替代方法和组合物。本发明提供了用于此需求的解决方案。
发明概述
出乎意料地，本发明人发现当将某些细菌，例如根瘤菌属细菌与某些其他物质(如下文将公开和详细描述的)组合施用于植物时，所述组合能够固定大气氮，从而供应植物的氮需求。当如此处理的植物是禾本科的那些植物时，这种效果特别出乎意料，如上所述，禾本科植物通常不能通过土壤中存在的细菌介导的固氮来获得其氮需求。
本发明主要涉及完全或部分供应植物的氮需求的方法，其通过向所述植物施用非致病性固大气氮细菌与一种或多种活化剂的组合来进行。在某些情况下，还与所述细菌和活化剂一起供应一种或多种肥料。因此，本发明主要涉及实现植物物种中的大气氮固定的方法，所述植物物种通常不能以此方式获得其氮摄取。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含非致病性固氮细菌和一种或多种活化剂(如上文所定义和下文所述)的混合物。
在另一方面，本发明还提供了一种用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)提供组合物，其包含非致病性固氮细菌和如下文公开的一种或多种活化剂的组合；和
b)对所述宿主物种施用步骤(a)的组合物。
在另一方面，本发明进一步提供了一种用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)分开提供：
(i)包含一种或多种固氮非致病性细菌的组合物；和
(ii)包含一种或多种下文公开和定义的活化剂的组合物；和
b)分开将组合物(i)和(ii)中的每种施用于所述宿主物种。
在以上公开的方法和组合物中，在一个实施方案中，固氮非致病性细菌是根瘤菌属的成员。在一个优选的实施方案中，细菌是豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)物种的。在下文中公开合适的细菌的其他例子。
在以上公开的方法中，在一个实施方案中，具有农业或园艺意义的植物是通常不能通过大气氮的细菌固定获得其氮需求的物种的成员。在一个实施方案中，所述植物物种是禾本科的成员。在一个优选实施方案中，植物物种是玉米。在另一个优选的实施方案中，植物物种是小麦。在另一个优选的实施方案中，植物物种是稻。
附图简述
图1图示了用本发明的组合物处理的玉米植物的叶中的氮含量。
图2A和2B呈现的结果显示了用本发明的组合物处理后玉米植物高度增加。
图3A和3B呈现了在用本发明的组合物处理后显示抽丝(silking)迹象的玉米植物的百分比的结果。
图4A和4B图示了用本发明的组合物的处理对玉米植物中雄花形成的影响。
图5呈现了用本发明的组合物处理的玉米植株中穗轴形成的结果。
图6A和6B呈现了比较经处理的和未处理的玉米植物中的叶的绿色程度的结果。
图7图示了用本发明的组合物处理的玉米植物的氮含量的增加。
图8A和8B呈现的数据显示了本发明的处理对玉米植物高度的影响。
图9A和9B呈现了本发明的组合物对玉米植物中看到的抽丝量的影响的结果。
图10A和10B呈现的结果显示了本发明的组合物对玉米植物中雄花形成的影响。
图11图示了数据，其总结了本发明的组合物对经处理的玉米植物中的穗轴形成的影响。
图12A和12B呈现的数据显示了经处理的和未处理的玉米植物之间绿色着色程度的差异。
图13是比较照片，显示了经处理的和未处理的玉米植物的绿色变色和总体活力(vitality)的差异。
图14比较了经处理的和未处理的玉米植物的平均植物茎粗。
图15比较了经处理的和未处理的玉米植物的平均叶宽。
图16比较了从经处理的和未处理的玉米植物获得的平均穗轴重量。
图17比较了经处理的和未处理的玉米植物的平均总植物重量。
图18比较了经处理的和未处理的玉米植物的平均植物高度。
图19呈现了从经处理的和未处理的玉米植物采集的叶的平均总氮含量的结果。
图20是未处理的小麦植物的根的照片表示。
图21是用本发明的组合物处理的小麦植物的根的照片表示。
图22是用不同剂量的本发明组合物处理的小麦植物的根的照片表示。
图23图示了小麦中的数据(从左到右)：主枝直径、旗叶宽度和侧枝数。
图24总结了用本发明的组合物处理的小麦的旗叶氮含量数据。
图25总结了用本发明的组合物处理的小麦的平均小麦籽粒产率。
图26呈现了本发明组合物对真菌消除、细菌消除和根瘤菌物种活化的影响的获得的体外结果。
图27A、27B和27C总结了真菌、细菌和活化系数的体外结果。
图28A、28B和28C总结了使用不同浓度的活化剂的真菌、细菌和活化系数的体外结果。
图29呈现了使用不同根瘤菌组合物的真菌、细菌和活化系数的体外结果。
图30呈现了真菌、细菌和活化系数的体外结果，使用不同于图29中所用浓度的活化剂浓度。
图31呈现了在番茄植物中接种研究的结果。
图32呈现了黄瓜幼苗中接种研究的结果。
发明详述
如上文公开，本发明人发现非致病性固氮细菌和活化因子(其性质将在下文中详细描述)的某些组合能够允许植物物种(例如谷物)固氮，所述植物物种通常不能以此种方式获得其氮需求。
发明人还发现固氮细菌和活化因子的相同组合还具有抗炎和抗微生物特性(针对几种不同的细菌和真菌种类，包括已知为植物病原体的那些)。
这些组合在通常不能以此种方式获得氮的物种中允许固氮的能力与其抗炎和抗微生物特性之间的此种相关性的原因是不完全清楚的。
不希望受理论的束缚，认为通过将根瘤菌属细菌与本公开中列出的另外的物质和试剂一起施用，在所述细菌与物种植物，例如禾本科植物的根系之间形成共生，从而实现植物内的大气氮固定。同样，不受理论的束缚，可能的是在没有所述另外的试剂的情况下不发生此种共生的原因可能是禾本科植物对根瘤菌的排斥。因此，有可能的是使上述共生发生的其他物质和试剂通过防止此种排斥机制的形成这样做。
因此，通过这些手段，禾本科植物以及类似地不能通过单独的固氮细菌获得氮需求的其他物种的植物能够满足其氮需求。
在一个优选的实施方案中，植物是通常不能通过大气氮的细菌固定获得其氮需求的物种。在一个特别优选的实施方案中，植物物种是禾本科的成员。此类物种的一个例子是玉米(Zea mays)。
在一个优选的实施方案中，非致病性的固大气氮细菌是属于被称为根瘤菌的通用类别的细菌。这类细菌分布在几种不同的属中，并且具有共同的特征，即在所述植物的根瘤内建立后，能够在某些植物物种(例如豆类)中固氮。
因此，在本发明的一个实施方案中，非致病性的固大气氮细菌是根瘤菌，属于一种或多种选自下组的属：Bosea、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、Devosia、甲基杆菌属(Methylobacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、申氏杆菌属(Shinella)、大豆根瘤菌属(Sinorhizobium)/剑菌属(Ensifer)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)和贪铜菌属(Cupriavidus)。
在一个特别优选的实施方案中，根瘤菌是根瘤菌属的。在本发明的组合中可以使用许多不同种类的根瘤菌，包括奥氏根瘤菌(R.alamii)、碱土根瘤菌(R.alkalisoli)、R.cauense、解纤维素根瘤菌(R.cellulosilyticum)、大田根瘤菌(R.daejeonense)、菜豆根瘤菌(R.etli)、蚕豆根瘤菌(R.fabae)、山羊豆根瘤菌(R.galegae)、高卢根瘤菌(R.gallicum)、贾氏根瘤菌(R.giardinii)、R.grahamii、海南根瘤菌(R.hainanense)、R.halophytocola、R.helanshanense、R.herbae、R.huautlense、木兰根瘤菌(R.indigoferae)、豆科植物根瘤菌(R.leguminosarum)、R.leucaenae、黄土根瘤菌(R.loessense)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、R.lusitanum、R.mesoamericanum、华中根瘤菌(R.mesosinicum)、汨罗江根瘤菌(R.miluonense)、蒙古根瘤菌(R.mongolense)、多宿主根瘤菌(R.multihospitium)、R.nepotum、水稻根瘤菌(R.oryzae)、石油根瘤菌(R.petrolearium)、菜豆根瘤菌(R.phaseoli)、R.pisi、普沙根瘤菌(R.pusense)、R.qilianshanense、苦马豆根瘤菌(R.sphaerophysae)、R.sullae、R.taibaishanense、西藏根瘤菌(R.tibeticum)、热带根瘤菌(R.tropici)、吐蕃根瘤菌(R.tubonense)、居水根瘤菌(R.undicola)、红河谷根瘤菌(R.vallis)、R.vignae和杨凌根瘤菌(R.yanglingense)。
在一些其他实施方案中，用于实施本发明的固氮细菌可以是短根瘤菌属(Bradyrhizobim)的，例如，诸如日本短根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的物种。
在某些情况下，所选的根瘤菌物种可以是已经在商业上用于提供豆类物种，例如花生(落花生)和大豆的氮需求的。
然而，在一个特别优选的实施方案中，所使用的物种是豌豆根瘤菌。尽管存在该物种的几种不同的生物变种，但是在本发明的一个优选的实施方案中，所使用的生物变种是豌豆根瘤菌生物变种viceae。
在另一个优选的实施方案中，非致病性固大气氮细菌是梭菌属(Clostridium)的细菌。当将本发明的组合施用于在淹水条件下生长的作物如稻时，这些厌氧细菌是特别优选的。在本发明这一方面的一个优选的实施方案中，固氮梭菌选自巴氏梭菌(C.pasteurianum)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丁酸梭菌(C.butyicum)、亨氏梭菌(C.hungatei)和溶酸梭菌(C.acidisoli)。
要注意的是，术语“固氮细菌”用来表示这些细菌通常能够固定多种蔬菜和豆类物种中的大气氮，其中许多蔬菜和豆类物种(例如大豆和花生)具有重大经济价值。但是，如上所述，这些细菌本身不能在谷物和水稻中引起固氮。
在本发明的上下文中，术语“活化剂”用于表示当与非致病性固氮细菌一起存在于混合物中时，或者当与非致病性固氮细菌分开递送时，能够在施用于通常不能通常此途径获得其氮需要的生长植物物种时实现大气氮固定的物质。在某些情况下，可以看到此种效果是非致病性固氮细菌与活化剂之间协同相互作用的结果。
出乎意料地，本发明人发现，许多适用于本发明方法的活化剂共享共同的特征，即它们抑制更通常与高等动物物种(例如肿瘤坏死因子alpha[TNF-α])而非植物种类相关的炎性介质的能力。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
在本发明方法的一个实施方案中，活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在该方法的另一个优选实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.4mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在该方法的另一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.15mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在该方法的另一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.1mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于0.2mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在该方法的另一个优选实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.05mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于0.1mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在该方法的另一个优选实施方案中，活化剂选自香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷(Steviol glycoside)和大麻二酚(CBD)及其组合。
在该方法的一个特别优选的实施方案中，一种或多种活化剂包括大麻二酚(CBD)。在该实施方案中，该方法中使用的活化剂可以进一步包含各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50的试剂或物质。
所述CBD可以从许多不同的来源获得，但是在一个优选的实施方案中，以大麻油(hemp oil)的形式提供。
在该方法的另一个优选实施方案中，活化剂(包括具有上述公开的定性和定量抗炎特性的活化剂)衍生自植物材料(例如粗植物提取物，例如全植物水提取物，部分纯化或分级的提取物，纯化提取物和所述提取物中存在的活性分子的合成类似物)。
在本发明这一方面的一个优选实施方案中，植物来源的活化剂是选自下组的草药提取物：紫菀(Aster tataricus)、香附(Cyperus rotundus)及其组合。
尽管本发明的方法可以用于几乎任何具有商业意义的蔬菜或豆类植物中促进固氮，但是在一个优选的实施方案中，用本方法处理的植物是通常不能通过大气氮的细菌固定获得其氮需求的物种的成员。在一个优选的实施方案中，植物物种是禾本科的成员。此类物种的优选(但非限制性)实例包括玉米、小麦和稻。在一个特别优选的实施方案中，植物物种是玉米。在另一个实施方案中，它是小麦。
在一些实施方案中，本发明的方法可以进一步包括施用含磷肥料。在一个优选的实施方案中，肥料是Calurus。
在当前公开的方法的一些实施方案中，通过选自下组的手段(means)施用所述非致病性固大气氮细菌和一种或多种活化剂的组合：将缓释颗粒应用到种植所述植物的土壤，种子包被和喷雾播种沟渠或犁沟。在某些情况下，在单一组合物中一起施用所述非致病性固大气氮细菌和所述一种或多种活化剂。然而，在其他实施方案中，在分开的组合物中施用所述非病原性固大气氮细菌和所述一种或多种活化剂。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含非致病性固氮细菌和一种或多种活化剂(如上文所定义和下文所述)的混合物。
非病原性固氮细菌的许多不同物种和菌株可以与本文所述的活化剂组合使用(即，在单一组合物中)，或者可以在分开的组合物中施用。在后一种情况下，两种或更多种组合物可以同时或顺序施用。在本上下文中，术语“非致病性”表示所选择的物种对正在施用含有细菌的本发明的组合物的宿主物种没有或几乎没有毒性或其他有害作用。
在本文定义的方法和组合物的一个优选实施方案中，非致病细菌是根瘤菌类的。本文公开了合适的属和种。
在另一个优选的实施方案中，非致病性固氮细菌为梭菌属的，特别是本文公开的那些物种。
在一些优选的实施方案中，本发明的组合物还包含(除非致病性固氮细菌和一种或多种活化剂之外)一种或多种含磷肥料。用于该目的的合适肥料包括(但不限于)市售制剂，例如Calurus。
在一个优选的实施方案中，非病原性细菌、活化剂和肥料(如果存在)的组合可以作为单一组合物施用。在其他实施方案中，这些组分中的一些可以分开施用。
本发明组合物的施用途径包括(但不限于)将缓释颗粒应用到种植所述植物的土壤，种子包被和喷雾播种沟渠或犁沟。
如上所述，本发明人已经发现，在一些实施方案中，本发明的活化剂的特征在于其抑制一种或多种关键炎性介质如TNF-α和/或一氧化氮(NO)的能力。因此，在本发明的一个优选实施方案中，在前述方法中使用的一种或多种活化剂是能够抑制NO和/或TNF-α产生的物质。
在本发明的另一个优选实施方案中，活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在另一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.4mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在另一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.15mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在另一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.1mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于0.2mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
在又一个优选的实施方案中，每种单独的活化剂(无论是单独使用还是与其他此类试剂组合使用)具有小于0.05mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于0.1mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
要注意的是，使用IC50值(即导致最大程度抑制介质、激动剂或其他生物活性分子的50％的药剂浓度)作为比较拮抗剂和其他生物和药理学活性分子的效力的手段是所有本领域技术人员公知的。简言之，可以通过绘制参数，例如对特定炎性介质的抑制的剂量-响应曲线，并从所述曲线中提取所述值来获得IC50值。
在另一个优选的实施方案中，活化剂选自香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷和大麻二酚(CBD)及其组合。
在一个特别优选的实施方案中，一种或多种活化剂包括大麻二酚(CBD)。在该实施方案中，该方法中使用的活化剂可以进一步包含试剂或物质，其各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
所述CBD可以从许多不同的来源获得，但是在一个优选的实施方案中，以大麻油的形式提供。
在又一个优选的实施方案中，活化剂(包括具有上文公开的定性和定量抗炎特性的那些)衍生自植物材料(例如粗植物提取物，例如全植物含水提取物，部分纯化或分级提取的提取物，纯化的提取物和存在于所述提取物中的活性分子的合成类似物)。
在本发明这一方面的一个优选实施方案中，植物来源的活化剂是选自下组的草药提取物：紫菀、香附及其组合。其他合适的植物提取物在本文其他地方公开。
在另一方面，本发明还提供了一种用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)提供一种组合物，其包含非致病性固氮细菌和一种或多种本文公开的活化剂的组合；和
b)对所述宿主物种施用步骤(a)的组合物。
本发明进一步提供了一种用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)分开提供：
(i)包含一种或多种固氮非致病细菌的组合物；和
(ii)包含一种或多种本文公开和定义的活化剂的组合物；和
b)分别将组合物(i)和(ii)中的每种施用于所述宿主物种。
在以上公开的方法中，在一个实施方案中，固氮非致病性细菌是根瘤菌属的成员。在一个优选的实施方案中，细菌是豌豆根瘤菌物种的。
在以上公开的方法中，在一个实施方案中，具有农业或园艺意义的植物是通常不能通过大气氮细菌固定获得其氮需求的物种的成员。在一个实施方案中，所述植物物种是禾本科的成员。在一个优选实施方案中，植物物种是玉米。在另一个优选的实施方案中，植物物种是小麦。在另一个优选的实施方案中，植物物种是稻。
现在将在以下工作实施例和附图中更详细地描述本发明的优点和益处。
实施例
通用方法：
1.活化剂乳剂的制备：
在这项研究中，将以下活化剂混合在一起并与固氮菌结合使用：
香紫苏醇、努特卡酮、大麻二酚(CBD)、柚皮苷、甜菊糖苷。
由于柚皮苷和甜菊糖苷是水溶性的，而其他三种活化剂是脂溶性的，因此制备了下表中概述的两种单独的溶液(油相和水相)，然后使用高剪切混合器进行混合。从该表可以看出，油相包含(除了三种活化剂之外)中链甘油三酯(MCT)和水解的向日葵卵磷脂(Giralec HE-60；E-322)，而水相还包含水、甘油和非离子表面活性剂蔗糖棕榈酸酯(sucrose palmitate)(Sisterna PS750)：
在高剪切混合器中混合后，乳剂的液滴尺寸为214nm。
2.制备处理颗粒：
在某些处理中(如下文解释)，将一些或全部活性物质以颗粒的形式加入到已种有植物的犁沟中。通过将1kg珍珠岩颗粒(平均直径大于2mm)浸泡在以下溶液中来制备颗粒：
50ml浓缩的活化剂乳剂(如上所述)。
930ml水。
10ml豌豆根瘤菌生物变种viceae(Cell-TechTM颗粒；Monsanto Company)(Granule-R)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(B颗粒)
10ml Calirus。
------------
总计1000ml
3.测量植物材料的氮含量：
通常，在田间研究中，生长植物的氮含量是使用分光光度法根据标准方法组织公布的标准方法组织“4500-NO3_I.镉减少流动注射方法(4500-NO3_I.Cadmium ReductionFlow Injection Method)”(<https://www.standardmethods.org/doi/full/10.2105/ SMWW.2882.089)测定的。该方法基于通过将提取物通过铜化镉柱将水性植物材料提取物中的硝酸盐转化为亚硝酸盐。后续的处理步骤将亚硝酸盐转化为在540nm处具有吸收峰的品红色染料。
实施例1
用本发明的组合物处理生长的玉米植物：田间试验1
方法：
该试验于2017年8月29日使用先锋(pioneer maize)玉米青贮品种号32-W-68进行播种。通过喷溉将田地中可能的氮冲洗掉。与本研究相关的对植物施用的联合处理是：
C＝没有氮的未处理对照。
F＝豌豆根瘤菌生物变种viceae，在播种沟内喷雾的稀释20的1％乳剂和Calirus1％。
H＝豌豆根瘤菌生物变种viceae，在播种沟内喷雾的稀释20的1％乳剂和Calirus1％+含有颗粒的乳剂和枯草芽孢杆菌(bacillus s.)0.5％(颗粒B)。
计算含有1％根瘤菌、活化剂乳剂和肥料(Calirus)的溶液的量(处理F和H)，使得每1000m行添加2升到播种沟中。
在处理H的情况下，将颗粒量调节为每1000m2 4Kg颗粒。
在玉米植物生长期间的一个时间点(2017年10月29日)或两个时间点(2017年10月23日和10月29日)监视以下参数：
-叶中的氮％
-植物高度
-开花(抽丝和雄花开花)
-第二穗轴％
-叶颜色
结果：
1.叶中的氮含量：
| C | H | F | |
| 平均值 | 1.88 | 3.72 | 3.11 |
| S.D. | 0.22 | 1.32 | 0.34 |
从表和图1所示的曲线中可以看出，与未处理的对照相比，处理H和F导致显著更高的氮水平。这些结果表明，这些处理使植物能够吸收和固定大气中的氮。
| C | H | F | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 1.18 | 1.30 | 1.50 |
| SD | 0.10 | 0.08 | 0.08 | |
| C | H | F | ||
| 平均值 | 1.45 | 1.70 | 1.70 | |
| 29/10/17 | SD | 0.13 | 0.14 | 0.08 |
在两个时间点测量了正在生长的玉米植株的高度：2017年10月23日和2017年10月29日。从上表和图2A(10月23日)和2B(10月29日)可以看出，进行处理H和F的植物明显高于未处理的对照组中的植物。
3.抽丝：
| C | H | F | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 0.00 | 3.50 | 4.00 |
| SD | 0.00 | 1.29 | 0.82 | |
| C | H | F | ||
| 平均值 | 20.50 | 24.25 | 48.75 | |
| 29/10/17 | SD | 1.29 | 1.26 | 2.99 |
从这些在2017年10月23日和2017年10月29日获得的列表结果以及图3A和3B可以看出，显示抽丝迹象(即雌花中的功能性柱头的发育)的植物的百分比在两个处理组(H和F)中显著高于未处理的对照组(C)中。
4.雄花开花：
| C | H | F | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 0.00 | 7.50 | 11.25 |
| SD | 0.01 | 2.89 | 2.50 | |
| C | H | F | ||
| 平均值 | 93.00 | 91.00 | 90.75 | |
| 29/10/17 | SD | 2.16 | 3.37 | 3.77 |
如上表上部和附图4A中显示，在第一个时间点(10月23日)，处理H和处理F均比未处理的对照处理(C)产生显著更高程度的雄花形成。但是，在第二个时间点(10月29日)(表的下部和图4B)，对照组中雄花形成的程度高于处理组中。这表明对照组中雄性和雌性开花时机之间不匹配。但是，在两个处理组中，雄性和雌性开花的同步性更好，这是与全仁产率(full kernel yield)的发展相容的情况。
5.第二穗轴：
| C | H | F | ||
| 平均值 | 0.00 | 1.75 | 5.50 | |
| 29/10/17 | SD | 0.00 | 0.96 | 1.29 |
如此表显示，且在图5中图形汇总，第二穗轴形成仅在处理组H和F中的植物中看到，而在未处理的对照植物中看不到。
6.叶颜色：
| C | H | F | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 1.25 | 7.75 | 8.00 |
| SD | 0.50 | 0.96 | 0.82 | |
| C | H | F | ||
| 平均值 | 1.00 | 7.75 | 7.75 | |
| 29/10/17 | SD | 0.00 | 1.50 | 0.96 |
使用1-10的标称量表，分别在2017年10月23日(表的上部和图6A)和2017年10月29日(表的下部和图6B)评估了玉米植株的叶的绿色。从获得的结果可以看出，在两个时间点，处理组H和F中植物的绿色程度显著高于未处理的对照中的植物的绿色程度。由于绿色的叶颜色与植物的氮利用率高度相关，因此这些结果提供了进一步明确的指示：处理H和F具有在促进玉米植物中固大气氮方面的功效。
实施例2
用本发明的组合物处理生长中的玉米植物：田间试验2
方法：
与上述实施例1中报告的田间研究的情况中一样，该试验于2017年8月29日播种，使用先锋玉米青贮品种号32-W-68。使用喷灌将田地中可能的氮冲洗掉。与本研究相关的对植物的联合处理是：
1.豌豆根瘤菌生物变种viceae，播种沟中喷雾1％，和含有颗粒的活化剂乳剂以及Calrus和0.5％根瘤菌。
2.播种槽中喷雾的豌豆根瘤菌生物变种viceae，1％和活化剂乳剂以及含有颗粒的活性剂乳剂以及Calrus和0.5％根瘤菌。
计算含有1％根瘤菌(处理1)或1％根瘤菌和活化剂(处理2)的溶液的量，使得每1000m行添加2升到播种沟中。
在两种处理方案中，将颗粒量调整为每1000m2 4Kg颗粒。
在玉米植物生长期间的一个时间点(2017年10月29日)或两个时间点(2017年10月23日和10月29日)监视以下参数：
-叶中的氮％
-植物高度
-开花(抽丝和雄花开花)
-第二穗轴％
-叶颜色
结果：
1.叶中的氮含量：
| C | 1 | 2 | |
| 平均值 | 1.80 | 3.16 | 3.33 |
| SD | 0.00 | 0.37 | 0.23 |
如从表和图7所示的图中可以看出，与未处理的对照相比，处理1和2导致显著更高的氮水平。这些结果表明，这些处理使植物能够吸收和固定大气中的氮。
2.植物高度：
| C | 1 | 2 | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 0.91 | 1.68 | 1.70 |
| SD | 0.09 | 0.10 | 0.08 | |
| C | 1 | 2 | ||
| 平均值 | 1.46 | 2.18 | 2.00 | |
| 29/10/17 | SD | 0.05 | 0.10 | 0.08 |
从上表和图8A(10月23日)和8B(10月29日)中可以看出，接受处理1和2的植物明显比未处理的对照组中的植物高。
3.抽丝:
| C | 1 | 2 | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 0.00 | 5.25 | 11.75 |
| SD | 0.00 | 0.50 | 2.36 | |
| C | 1 | 2 | ||
| 平均值 | 24.25 | 81.50 | 94.25 | |
| 29/10/17 | SD | 0.96 | 7.23 | 2.99 |
从上表和图9A和9B可以看出，显示抽丝迹象的植物的百分比在两个处理组(1和2)中显著高于未处理的对照组(C)中。
4.雄花开花
| C | 1 | 2 | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 0.00 | 66.25 | 80.00 |
| SD | 0.00 | 7.50 | 4.08 | |
| C | 1 | 2 | ||
| 平均值 | 96.25 | 100.00 | 100.00 | |
| 29/10/17 | SD | 4.79 | 0.00 | 0.00 |
如上表上部和附图10A所示，在第一个时间点(10月23日)，处理1和处理2均比未处理的对照处理(C)产生显著更高的雄花开花程度。但是，在第二个时间点(10月29日)(表的下部和图10B)，对照组中雄花的形成程度与处理组中的大致相同。鉴于在这个时间点看到的抽丝(即雌花开花)水平低(见图9B)，对照组中雄花开花和雌花开花的时机之间似乎不匹配。但是，在两个处理组中，雄性和雌性开花的同步性更好，这是与全仁产率的发展相容的情况。
5.第二穗轴：
| C | 1 | 2 | ||
| 平均值 | 0.00 | 22.75 | 47.50 | |
| 29/10/17 | SD | 0.00 | 2.22 | 13.23 |
如此表中显示，且在图11中图形汇总，仅在处理组1和2中的植物中看到第二穗轴形成，而在未处理的对照植物中看不到。
6.叶颜色：
| C | 1 | 2 | ||
| 23/10/17 | 平均值 | 1.25 | 8.00 | 8.75 |
| SD | 0.50 | 0.82 | 0.50 | |
| C | 1 | 2 | ||
| 平均值 | 1.00 | 7.75 | 8.50 | |
| 29/10/17 | SD | 0.00 | 0.96 | 0.58 |
使用1-10的标称量表，分别在2017年10月23日(表的上部和图12A)和2017年10月29日(表的下部和图12B)评估了玉米植株的叶的绿色。从获得的结果可以看出，在两个时间点，处理组1和2中植物的绿色程度显著高于未处理的对照中的植物的绿色程度。由于绿色的叶颜色与植物的氮利用率高度相关，因此这些结果提供了进一步明确的指示：处理H和F具有在促进玉米植物中固大气氮方面的功效。
在图13所示的比较照片中，两个处理组和未处理的对照之间在绿色变色和植物总体活力上的此种差异也是明显的。因此，如该图中看到，进行处理1或处理2的植物与未处理的对照植物相比具有更深的绿色和健康得多的整体外观。
实施例3
用本发明的组合物处理生长的玉米植物：田间试验3-生长参数方法：
这项试验是在2018年以色列生长期使用先锋玉米青贮品种号W86播种的。使用喷灌将田地中可能的氮冲洗掉。与本研究相关的对植物的联合处理是：
A.阳性对照–全商业氮。通过向该区域施用60kg含46％尿素的尿素，以每1000m2用30个单位的氮处理植物。
B.阴性对照-不添加氮。
C.将豌豆根瘤菌生物变种viceae，3％(含有109个生物体)添加到上述“通用方法”中所述的活化剂乳剂，其中还添加Calirus(1％)。如上所述将珍珠岩颗粒用该混合物浸泡。将颗粒以每1000m2 2Kg颗粒的密度添加到播种沟中。
D.关于处理C，但是将颗粒量调节为每1000m2 1Kg颗粒。
E.关于处理C，但是将颗粒量调节为每1000m2 4Kg颗粒。
将它们播种后3个月，在玉米植物生长过程中的一个时间点监控以下参数：
-植物茎口径
-叶宽
-穗轴重量(取自10个植物的主茎)
-总植物重量(10个植物)
-植物高度
使用Tukey-Kramer HSD检验确定各个处理组之间差异的统计学显著性。
结果：
1.植物口径：
记录上面列出的5种处理(A-E)中每种处理的平均口径，并且所得结果显示在下面和图14中：
| 处理 | 平均植物茎口径(cm) |
| A.阳性对照–全氮 | 37.20 |
| B.阴性对照–无氮 | 18.73 |
| C.处理-2Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 37.49 |
| D.处理–1Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 37.72 |
| E.处理-4Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 37.90 |
这些结果表明，包含本发明的组合物的三种处理(C-E)中的每种处理均使生长的玉米植物达到与全氮阳性对照(A)所见的大致相同的植物粗度。每种处理方案产生的平均植物粗度均显著大于阴性对照植物(B)看到的。
2.叶宽：
记录以上列出的5种处理(A-E)中的每种处理的平均叶宽，并且所得结果显示在下面和图15中：
| 处理 | 平均叶宽度(cm) |
| A.阳性对照–全氮 | 10.5 |
| B.阴性对照–无氮 | 9.1 |
| C.处理-2Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 10.5 |
| D.处理–1Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 10.7 |
| E.处理-4Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 10.6 |
这些结果表明，包含本发明的组合物的三种处理(C-E)中的每种处理均使生长中的玉米植物获得与用全氮阳性对照(A)所见的平均叶宽大致相同的平均叶宽。每种处理方案产生的平均叶宽均显著大于阴性对照植物(B)看到的。
3.穗轴重量(取自10个植物的主茎)：
记录以上列出的5种处理(A-E)中每种处理的10个植物的主茎的平均穗轴重量，并且所得结果显示在下面和图16中：
| 处理 | 平均穗轴重量(10个植物；kg) |
| A.阳性对照–全氮 | 3.96 |
| B.阴性对照–无氮 | 2.61 |
| C.处理-2Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 3.78 |
| D.处理–1Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 3.98 |
| E.处理-4Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 3.86 |
这些结果表明，包含本发明的组合物的三种处理(C-E)中的每种处理均导致与全氮阳性对照(A)所观察到的平均穗轴重量大致相同的平均穗轴重量。每种处理方案产生的平均穗轴重量均显著大于阴性对照植物(B)看到的平均穗轴重量。
4.植物总重量(10个植物)：
记录上面列出的5种处理(A-E)中每种处理的10个植物的平均总植物重量，并且所得结果显示在下面和图17中：
| 处理 | 总植物重量(10个植物；kg) |
| A.阳性对照–全氮 | 11.81 |
| B.阴性对照–无氮 | 7.21 |
| C.处理-2Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 11.46 |
| D.处理–1Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 11.62 |
| E.处理-4Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 11.65 |
这些结果表明，包含本发明的组合物的三种处理(C-E)中的每种处理均导致与全氮阳性对照(A)所观察到的平均总植物重量大致相同的平均总植物重量。每种处理方案产生的平均总植物重量均显著大于阴性对照植物(B)看到的平均总植物重量。
5.植物高度：
记录用上面列出的5种处理(A-E)中每种处理看到的10个植物的平均植物高度，并且所得结果显示在下面和图18中：
| 处理 | 植物高度(m) |
| A.阳性对照–全氮 | 2.72 |
| B.阴性对照–无氮 | 2.61 |
| C.处理-2Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 2.73 |
| D.处理–1Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 2.73 |
| E.处理-4Kg颗粒每1000m<sup>2</sup> | 2.81 |
这些结果表明，包含本发明的组合物的三种处理(C-E)中的每种处理均导致与全氮阳性对照(A)所观察到的平均总植物重量大致相同的平均总植物重量。尽管每种处理方案产生的平均植物高度均略微大于阴性对照植物看到的平均植物高度(B)，但这种差异并未达到统计学显著性。
实施例4
用本发明的组合物处理生长的玉米植物：田间试验4–叶片总氮含量方法：
这项试验是在2018年以色列生长期使用先锋玉米青贮品种号W86播种的。使用喷灌将田地从可能的氮气中冲洗掉。与本研究相关的对植物的联合处理是：
PC.阳性对照–全商业氮。通过向该区域施用60kg含46％尿素的尿素，每1000m2用30单位的氮处理植物。
NC.阴性对照–无氮。
1.R1％G1kg＝按照“通用方法”和上文实施例3中制备的颗粒，使用1％豌豆根瘤菌生物变种viceae隔离群制备，每1000m2以1Kg颗粒的密度施于播种沟。
2.R1％G2kg＝如1，但每1000m2中具有2kg颗粒。
3.R1％G4kg＝如1，但每1000m2中具有4kg颗粒。
4.R3％G1kg＝如1，但是用根瘤菌浓度3％制备颗粒。
5.R3％G2kg＝如4，但每1000m2中具有2kg颗粒。
6.R3％G4kg＝如4，但每1000m2中具有4kg颗粒。
7.R5％G1kg＝如1，但用根瘤菌浓度5％制备颗粒。
8.R5％G2kg＝如7，但每1000m2中具有2kg颗粒。
9.R5％G4kg＝如7，但每1000m2中具有4kg颗粒。
10.(R3％G2kg)2＝如5，但用根瘤菌浓度6％制备颗粒。
在播种后三个月的玉米植物生长过程中的一个时间点测量平均总叶氮含量。
结果：
测量叶的平均总氮含量，并且结果示于下表和图19中。
这些结果表明，用本发明的组合物进行的各种处理中的每种处理都导致玉米植物中的氮水平与用阳性对照(PC)获得的氮水平相当。这些处理中的每种处理均导致比未处理植物组(NC)中看到的叶氮水平显著更高的叶氮水平。因此可以得出结论，用本发明的组合物处理使得根瘤菌能够在生长的玉米植物中引起固氮。
实施例5
用本发明的组合物处理生长的小麦：田间试验5
选择了以色列的两个不同的农业地点进行田间试验，其中研究了本发明的组合物对小麦作物的影响。如上文实施例3和4中所述，将各种组合物施用于生长中的小麦(Galil品种)。本研究中使用的处理如下：
B.阴性对照(无氮源)
A.根据实施例3制备的颗粒，以每1000m2 4kg颗粒的密度施用。
C.根据实施例3制备的颗粒，以每1000m2 2kg颗粒的密度施用。
F.阳性对照-全商业氮。通过向该区域施用60kg含46％尿素的尿素，每1000m2用30单位的氮处理植物。
结果：
1.处理后的根的外观：
在缺乏用含有本发明组合物的颗粒进行处理的情况下，生长的小麦植物的根没有显示根瘤形成的任何迹象。这在图20中看到，该图显示(白色)光滑的细长根，没有结节或小球形成的迹象。作为比较，图21呈现了已经进行了处理A的植物的根的照片(即每1000m2含有剂量4kg颗粒的本发明组合物的颗粒)。从该图可以看出，在根部的一侧已形成一个粗糙的结节(X)。类似地，图22显示了在用处理C进行处理的小麦植物的根侧形成根瘤(X)(每1000m2含有剂量2kg颗粒的本发明组合物的颗粒)
这些样品中的根瘤形成表明所施用的根瘤菌与植物根系之间共生关系的可能部位，该根系已发展为通过用本发明的组合物处理诱导的固氮过程的一部分。
2.各种处理对小麦植物参数的影响：
为了评估处理组合物对植物生长的影响，在小麦中测量以下参数：
a)侧枝数目；
b)旗叶宽度；
C)主枝直径。
这些测量的结果呈现在下表中：
这些数据也以图形方式显示在图23中。在该图中，主茎直径的结果在每种处理的左栏中给出，旗叶宽度数据在中间栏中给出，并且侧枝的数目在右栏中给出。
从这些结果可以看出，相对于阴性对照，在用处理A或处理C进行处理后，所有测得的生长参数都增加。另外，所述处理还提供了与阳性对照获得的生长结果相当或更大的生长结果。
3.各种处理对小麦旗叶固氮的影响：
下表呈现了旗叶固氮的结果：
| 处理 | 平均氮含量 | SD |
| A.4kg颗粒 | 2.94 | 0.07 |
| B.阴性对照 | 2.44 | 0.09 |
| C.2kg颗粒 | 2.96 | 0.19 |
| F.阳性对照 | 2.94 | 0.20 |
这些结果也以图形方式总结在图24中。
从这些结果可以看出，与阴性对照相比，处理A和C(本发明的组合物)和阳性对照均导致旗叶氮含量增加。这两种处理方案均导致氮含量增加，类似于阳性对照引起的氮含量增加。
| 处理 | 平均小麦粒产率(kg) |
| A(4kg颗粒) | 1.27 |
| B(阴性对照) | 1.06 |
| C(2kg颗粒) | 1.08 |
| F(阳性对照–添加的氮) | 1.11 |
这些数据在图25中也以图表的形式呈现。
从这些结果可以看出，在本田间研究中，包含本发明的组合物的处理和阳性对照两者均导致小麦粒产率的显著增加(即与阴性对照相比)。两种处理方案引起的增加在数值上与阳性对照组中看到的引起的增加相似。
田间试验-结论
在以上报道的所有田间试验中(实施例1-5)，包括根瘤菌和活化剂混合物乳剂两者的组合的处理方案导致大气氮的固定增加，如通过直接测量叶氮水平，根瘤的发育以及在这些试验中测得的各种生长相关参数证明的。不管施用处理组合的方式如何，都可以看到此种积极效果。
实施例6
初步筛选植物化学物质作为根瘤菌物种活化剂的潜力
导言：
黄瓜(Cucumis sativus L)幼苗在萌发过程期间极易受到真菌和细菌病原体侵袭，因此将其选为筛选和校准根瘤菌物种和可引起其活化的植物化学物质的模型植物。
材料与方法：
1.植物化学物质筛选：
将潜在的植物化学物质添加到培养皿中的30cc葡萄糖50％V/V底物，10cc真菌病原体混合物和10cc细菌病原体混合物的混合物。真菌混合物含有：灰霉菌(Botrytiscinerea)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，腐霉菌(Pythium spp.)和用于番茄发酵的非病原性真菌。细菌混合物包含：Clavibacter michiganensis，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和用于番茄发酵的非致病细菌。
通过计算每个测试的菌落形成系数(0＝无菌落；5＝最大菌落大小)，筛选约1000种潜在的植物化学物质的活化根瘤菌的能力。基于它们作为根瘤菌物种的活化剂的优异性能，从测试的约1000种植物化学物质选择实施例部分的导言中上文列出的5种植物化学物质。
对于下面报告的研究中使用的每种宿主生物，确定了上面列出的五种选定活化剂的最佳组合和浓度。选择的组合是在初步研究中发现的那些组合，它们具有能够产生期望保护作用的最低可能浓缩物。以这种方式，避免了在将这些试剂施用于宿主生物体期间可能的副作用和环境污染。
同时，筛选植物化学物质消除细菌和真菌病原体混合物的能力。为了在各种处理之间进行比较，计算了真菌和细菌的消除系数(0＝最大消除，5＝没有消除)。
含有葡萄糖底物和上述真菌和细菌混合物以及所有五种活化植物化学物质和渗透剂(MCT)以及两种类型的表面活性剂糖酯和异卵磷脂的测试混合物以四种不同浓度使用：浓度1、2、3和4。在每种情况下，将相同量的葡萄糖底物以及真菌和细菌混合物——30ml——添加到混合物中。类似地，如果在浓度2时香紫苏醇含量倍增，MCT和表面活性剂浓度也倍增，依此类推，则MCT和表面活性剂的浓度与活性成分的浓度相关。但是，根瘤菌物种和五种活化剂中每种的浓度(以％给出)为在浓度1，3时3％和浓度2，4时5％，如表1中所述。
表I
根据下表II中给出的处理列表，在本研究中使用了包含五种活化剂中的一些或全部的不同组合的各种不同的测试混合物。在每种情况下，均按表I所示的浓度使用活化剂、根瘤菌物种和底物。例如，在浓度1下测试时，含有该活化剂的测试混合物中香紫苏醇的浓度为0.04％，而在浓度2测试时，香紫苏醇以0.08％的浓度存在，依此类推。
表II
结果：
初步结果表明，使用浓度2和浓度3的测试混合物获得最佳的抗真菌和抗菌活性(参见上表)。由于使用浓度3，根瘤菌物种菌落的形成是最佳的，因此这是在剩余研究中选择使用的浓度。图26在图的前排、中排和后排分别总结了浓度3测试的真菌清除、细菌清除和根瘤菌物种活化(菌落大小)获得的结果。上表II中汇总的11种不同处理沿图的X轴标记为T1至T11。
如上解释，用于评估抗真菌、抗细菌和活化特性的三个半定量指标如下：
真菌系数：0(无形成)至5(最大形成)
细菌系数：0(无形成)至5(最大形成)
根瘤菌系数(菌落形成系数)：0(无形成)至5(最大形成)
从图26中可以看出，使用处理11获得最佳的结果——对于根瘤菌物种活化和病原体消除两者，处理11(如上表II所示)使用所有五种活化剂的组合。
活性物的识别号：
| 1 | 病原体混合物 |
| 2 | 1+2 |
| 3 | 1+2+3 |
| 4 | 1+2+4 |
| 5 | 1+2+5 |
| 6 | 1+2+6 |
| 7 | 1+2+7 |
| 8 | 1+2+3+4 |
| 9 | 1+2+3+4+5 |
| 10 | 1+2+3+4+5+6 |
| 11 | 1+2+3+4+5+6+7 |
| 12 | 1+3+4+5+6+7 |
| 13 | 1+3+4+5+6 |
| 14 | 1+3+4+5 |
| 15 | 1+3+4 |
| 16 | 1+3 |
实施例7
改变活化剂组成对根瘤菌物种的活化以及所述组合物的杀真菌和杀细菌活性的
影响
第二组研究旨在研究从完整的5组分组合中消除一种植物化学物质或选择性改变混合物中一种或两种组分的浓度的影响。
材料与方法：
对于实施例1。
各种测试混合物以浓度3或浓度4使用(如上述实施例1中所定义)。下面的两个表中汇总了每种测试混合物的组成：
表III
浓度3
*在测试8中，努特卡酮和甜菊糖苷分别以升高的浓度存在——0.4％v/v努特卡酮(而不是0.3％)和1.0％甜菊糖苷(而不是0.75％)。
表IV
浓度4
**在测试7中，柚皮苷以降低的浓度存在——0.3％v/v(而不是0.4％)。
结果：
如从图27A、27B和27C可以看出，与仅培养基和培养基加上根瘤菌物种对照(分别为混合物1和2)相比时，所有含有以浓度3使用的3种或4种活化剂的测试混合物均导致真菌和细菌系数的显著降低以及根瘤菌物种活化系数的显著增加。
类似地，如图28A、28B和28C所示，与仅培养基和培养基加上根瘤菌物种对照相比(分别为混合物1和2)时，所有含有以浓度4使用的3种或4种活化剂的测试混合物均引起真菌和细菌系数的显著降低以及根瘤菌物种活化系数的显著增加。
在图28A、28B和28C中也可以观察到，努特卡酮和甜菊糖苷组分均处于升高浓度(即浓度4，而所有其他组分均处于浓度3；即测试混合物8)的五组分活化剂混合物在所有三个系数上具有最大的活性。
此外，图28A、28B和28C表明，柚皮苷浓度降低到浓度3，所有其他组分均为浓度4的四组分活化剂混合物(编号7)在该数据集中具有最大的活性，如由所有三个指标测量。
这些数据表明，包含小于最大值5种活化剂的混合物可用于保护宿主生物体免受真菌或细菌侵袭。另外，这些结果还表明可以通过操作混合物中一种或多种单独的活化剂的浓度来获得混合物的优化。
实施例8
与不同根瘤菌物种制剂结合的各种活化剂组合物的杀真菌和杀细菌活性
在这项研究中，使用不同的根瘤菌物种制剂(即由以色列耶路撒冷Bio-Lab Ltd.生产和出售的根瘤菌组合物，标记为“培养花生的培养物”)重复上述实施例7中进行的实验。
材料与方法：
对于实施例6。
各种测试混合物以浓度3或浓度4使用(如上文实施例6中所定义)。这些测试混合物各自的组成如上文实施例7中的表III和IV中汇总。
结果：
该研究证实了在实施例7中获得的结果。因此，如图29(浓度3)和图30(浓度4)所示，所有以浓度3含有3、4或5种活化剂的测试混合物均导致真菌和细菌系数的显著降低。此外，它们还引起根瘤菌物种活化系数的显著增加。
特别值得注意的事实是，在浓度3时，努特卡酮和甜菊糖苷组分均处于升高的浓度(即浓度4，而所有其他组分均处于浓度3；即测试混合物8)的五组分活化剂混合物在所有三个指标上具有最大的活性(图29)。类似地，如图30所示，在该数据集中，柚皮苷浓度降低至浓度3，所有其他组分均为浓度4的四组分活化剂混合物(编号7)具有最大的活性，如通过所有三个指标测量。
用根瘤菌物种制剂获得的这些结果证实了用该制剂获得的发现(上文的实施例7)，表明观察到的效果对于任何一种特定的根瘤菌制剂都不是特异性的。
实施例9
用于本发明的试剂的抗炎活性
在以上实施例6-8中报道的用根瘤菌物种和一些或全部五种活化剂的组合所获得的结果之后，对所述试剂进行了研究，以寻找除其杀细菌、杀真菌和根瘤菌物种之外的共同功能特性——-活化能力。
在一系列初步研究后，本发明人出乎意料地发现，在以上呈现的研究中测试的五种活化剂中的每种也共享高度有效的抗炎活性。
为了进一步研究这点，测试了先前实施例中使用的三种活化剂(单独，彼此组合以及与根瘤菌物种组合)抑制培养的巨噬细胞系中两种主要的炎性抑制剂：一氧化氮(NO)和TNF-α的体外产生的能力。另外，在进行抗炎测定时，在与NO和TNF-α抑制相对应的适当IC50值下测量巨噬细胞的存活力。
方法：
RAW 264.7巨噬细胞细胞系：
使用标准生长培养基(添加有5％FBS、抗生素和谷氨酰胺的DMEM)在平底烧瓶中培养RAW 264.7巨噬细胞。按照本领域公知的标准程序维持细胞。在细胞达到汇合后，用机械手段将它们从烧瓶中取出，然后离心浓缩并重悬于少量新鲜培养基中。用生长培养基调节细胞浓度，以便可以向96孔板的每个孔中加入约75,000个细胞。用25μg/mL LPS和10U/mlIFN-γDMEM的组合活化巨噬细胞，在活化前1小时将各种测试试剂加入孔中，然后将细胞再孵育24小时，之后测定炎性介质的产生和细胞存活力。
细胞存活力测定法：
通过向每个孔中添加100μL的10％Alamar Blue溶液并在37℃下孵育1-2小时来进行Alamar Blue存活力测定法。测量荧光(在545nm激发和在595nm发射)，并表示为未处理对照细胞中的数值的百分比。
通过Griess测定法确定一氧化氮的产生：
使用Griess试剂(在5％HCl中等体积的1％氨苯磺胺和0.1％萘亚甲基二胺)测定经受各种处理的巨噬细胞的NO产生。将来自每个测试孔的70μL上清液转移至新鲜的96孔板中，并与70μL Griess试剂混合，并在540nm下测量产生的紫色。
ELISA法测定TNF-α：
夹心式ELISA用于确定TNF-α浓度。在PBS中以浓度0.5μg/mL使用一抗。TNF-α标准品在稀释剂(PBS中0.05％Tween-20，0.1％BSA)中从0-1000pg/mL的系列稀释液用作内部标准品。用生物素化的二抗和抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物，以TMB作为检测试剂检测TNF-α。在655nm处监控显色，每5分钟读取读数。25分钟后，使用0.5M硫酸终止反应，并在450nm下测量吸光度。
测试试剂：
上述方法用于确定香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷及其彼此的组合以及与根瘤菌物种的组合对NO和TNF-α产生以及对细胞存活力的影响。抗炎活性的结果在下表V中以抑制NO和TNF-α产生的IC50值以及细胞存活力结果表示。此外，从科学文献(A.S.Ravipati et al.(2012)BMC Complementary and Alternative Medicine,12:173“Antioxidant and anti-inflammatory activities of selected Chinese medicinal plants and theirrelation with antioxidant content”)中对于两种另外的植物物种紫菀和香附子的水提取物获得的可比结果在表末尾呈现。本发明人就其杀真菌和杀细菌效果而言与枯草芽孢杆菌组合研究了这两种物种的提取物。这些研究的结果在下面的实施例5中呈现。
结果：
下表V中呈现了用各种试剂处理的培养的巨噬细胞的抗炎和存活力测定法的结果。
表V
可以看出，所测试的处理剂均未对巨噬细胞的存活力具有任何明显的不利影响。因此，由这些试剂引起的对两种炎性介质生成的任何抑制不是一般细胞毒性作用的结果。
从表中注意到，当分开采用时，三种试剂香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的NO抑制的IC50分别为0.04、0.04和0.02。此外，当彼此组合使用时，所述组合甚至更有效，在不存在根瘤菌物种的情况下，NO抑制的IC50为0.004，在根瘤菌种存在下的IC50为0.001。如果将这些结果与A.S.Ravipati et al.(2012)在上述论文中发表的针对44种选定植物提取物的NO抑制的相当IC50值进行比较，可以看出，香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的值在该论文的值范围的下端(0.03-1.49)，在一种情况下(甜菊糖苷)甚至超出了该范围的最低程度。类似地，如果将香紫苏醇、柚皮苷和甜菊糖苷的平均值与该论文报道的44种植物的平均值进行比较，则可注意到前者(0.03)远低于从所述公布值中提取的平均值(0.26)。
与A.S.Ravipati et al.(2012)中的44种植物提取物的公布结果(范围＝0.07–2.5；平均值-1.04)相比，当分开测试时，就香紫苏醇，柚皮苷和甜菊糖苷对TNF-α的抑制而言也可以得到类似的结果，IC50值分别为0.08、0.09和0.08(范围＝0.08-0.09；平均值＝0.083)。
因此，可以得出结论，在上文的实施例1-3中选择和测试的三种试剂均具有抗炎活性，并且就NO和TNF-α的抑制而言比常用中药的一组44种草药提取物(A.S.Ravipatiet al.(2012))中的大多数具有更强的效力(即具有更低的IC50)。
此外，从表V中值得注意的是，即使在抗炎性植物提取物(紫菀和香附)的效力较弱的情况下，所述提取物在抗真菌和抗细菌活性方面也有效地用作根瘤菌物种的活化剂(如下文的实施例5所示)。
实施例10
番茄幼苗接种
方法：
播种后10小时，向番茄幼苗接种10cc的每种测试混合物，其含有根瘤菌物种和各种活化植物化学物质的组合(包括下述细菌和真菌混合物)。
在处理后5天，使用半定量接种系数(0＝健康，5＝死亡)评估每种植物的健康。
以下两张表中总结了各种测试混合物的组成和浓度以及组合使用的不同活化剂的数量(所有浓度均以％v/v给出)：
表VI
*葡萄糖50％与水混合W/W
**真菌混合物由以下制成：灰霉菌，立枯丝核菌，腐霉菌和用于番茄发酵的非病原性真菌。
***细菌混合物由以下制成：Clavibacter michiganensis，野油菜黄单胞菌，丁香假单胞菌和用于番茄发酵的非致病细菌。
表VIII
| <u>处理</u> | <u>材料(来自表VI)</u> |
| 1 | <u>1</u> |
| 2 | <u>1+2-3</u> |
| 3 | <u>1+2-3+3</u> |
| 4 | <u>1+2-3+4-3</u> |
| 5 | <u>1+2-3+5-3</u> |
| 6 | <u>1+2-3+6-3</u> |
| 7 | 1+2-3+7-3 |
| 8 | 1+2-3+7-3+8-3 |
| 9 | 1+2-3+7-3+9-3 |
| 10 | 1+2-3+8-3 |
| 11 | 1+2-3+9-3 |
| 12 | 1+2-3+7-3+8-3+9-3 |
| 13 | 1+2-3+3-3+4-3+5-4+6-4+7-3+8-3+9-3 |
| 14 | 1+2-3+10-3 |
| 15 | 1+2-3+11-3 |
| 16 | 1+2-3+3-3+4-3+5-4+6-4+7-3+8-3+9-3+10-3+11-3 |
结果
该接种研究的结果以图形方式总结在图31中。从该图中可以看出，仅测试混合物13对番茄植物引起接近最大的保护。如以上表VI和VII中所定义，该处理含有根瘤菌复合物与以下活化剂的混合物：香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷、大麻油、紫菀提取物和香附提取物。接下来最有活性的处理方法是7(根瘤菌和大麻油)、8(根瘤菌、大麻油和紫菀提取物)和12(根瘤菌、大麻紫菀提取物和香附提取物)。
这些结果表明，在最有活性的处理混合物中发现的常见成分是大麻二酚(CBD；大麻油)，即使作为唯一的活化剂存在也具有高活性。
实施例11
黄瓜幼苗接种
方法：
从相关培养皿中取样10cc的活化剂、根瘤菌物种和其他成分的每种混合物(如上文实施例6的表I和II中所述)，并在播种后10小时注射入4个发芽的黄瓜种子的重复中。
在处理后5天，使用半定量接种系数(0＝健康，5＝死亡)评估每种植物的健康。
结果
该研究的结果以图形方式显示在图32中，其中四个单独的图总结了使用浓度1、2、3和4(从上到下)的活化剂获得的数据。
从图32的第一张(上部)图中可以看出，大多数处理方案当以最低浓度(浓度1)使用时，不能保护植物免受微生物感染(接种系数接近5)，或者具有最小的保护作用。
图32中的第二张图表明，在系列中的下一个较高浓度(浓度2)下，活化剂混合物6至11均为黄瓜植物提供高水平的保护而免受真菌和细菌感染。如图32的第三张图所示，当以浓度3使用试剂时，也看到了类似的结果。
在最高浓度(浓度4；图32中的最后一张图)下，用活化混合物5至11看到最大的保护效果。
总结：当以浓度2-4使用时，所有多组分活化剂混合物以及仅包含一种活化剂的某些混合物在体内有效保护黄瓜植物。这项研究中获得的半定量数据与经过各种处理的植物的外观非常好地相关联。
实施例12
本发明的组合物对细菌植物病原体Clavibacter michiganensis
sp.Michiganensis(Cmm)的影响(1)
在这项研究中，体外研究根瘤菌物种与活化剂的各种组合对致病细菌Clavibacter michiganensis sp.Michiganensis(Cmm)存活的影响。
方法：
将3％根瘤菌物种制剂与含有5种活化剂(E-91)的乳剂或所述乳剂的成分之一(柚皮苷)的各种组合以及植物病原体Cmm的培养物(最终浓度105-106CFU/ml)在试管中孵育直至3天(每个组合重复4次)。在3天的孵育期结束时，将包含所有这些成分的试管的内容物铺在生长培养基上，并测量每种测试条件下Cmm和根瘤菌物种的菌落数(CFU/ml)。
如上文实施例6中所述制备含有5种活化剂(香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷和CBD；在下文结果表中称为5％植物乳剂E-91)的乳剂。
结果：
下表呈现获得的结果(CFU/ml)：
从这些结果可以看出，唯一能够降低Cmm数的测试混合物是5％植物乳剂E-91和3％根瘤菌物种的组合。这种处理导致Cmm计数从对照值5.25x105大幅减少到最终计数172.5。
柚皮苷(作为唯一的活化剂)和3％根瘤菌的组合对Cmm计数(3.63x105)没有影响。因此可以得出结论，根瘤菌和单独的柚皮苷的组合(即在没有任何其他活化剂或抗炎剂的情况下)不能杀死Cmm病原体。
实施例13
本发明的组合物对细菌植物病原体Clavibacter michiganensis
sp.Michiganensis(Cmm)的影响(2)
方法：
该研究以与实施例12中呈现的研究基本相同的方式进行。然而，在本研究中，将5-组分活化剂乳剂(5％植物乳剂E91)的作用与以下活化剂组合进行比较：
结果：
下表中阐述了这些比较的结果：
从这些结果可以看出，在某些情况下，2、3或4种活化剂与根瘤菌的组合(在每种情况下，在不存在CBD的情况下)对Cmm计数具有次要的抑制效果。然而，当与根瘤菌属组合使用时，所有所述部分组合均远不如完整的5组分活化剂乳剂有效。
实施例14
本发明的组合物对细菌植物病原体的影响：链格孢属种(Altenaria spp.)和
Xanthomonas euvesicatoria
方法：
在这项研究中，研究了5组分活化剂混合物E91与3％根瘤菌的组合对另外两种植物病原体-链格孢属真菌物种和革兰氏阴性细菌Xanthomonas euvesicatoria的存活的影响。除了共同孵育时间(在本研究中为2天)以外，所有材料和方法均如上文实施例12和13所述。
结果：
下表显示了该研究的结果：
XV＝Xanthomonas euvesicatoria
从这些结果可以看出，与单独用活化剂处理的样品相比，活化剂与根瘤菌的组合在2天后引起Xanthomonas euvesicatoria计数的适度降低。
在链格孢属物种的情况下，与单独的活化剂相比，由活化剂和根瘤菌的组合引起的微生物计数的减少显著得多。
可以得出结论，本发明的组合物对一系列不同的细菌和真菌物种具有抗微生物活性，包括作为重要植物病原体的那些物种。
Claims (37)
1.用于供应植物的氮需求的方法，其包括向所述植物施用非致病性固大气氮细菌和一种或多种活化剂的组合。
2.根据权利要求1的方法，其中所述非致病性固大气氮细菌是根瘤菌属(Rhizobiumgenus)的成员。
3.根据权利要求2的方法，其中所述细菌是豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)物种的。
4.根据权利要求1的方法，其中所述一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
5.根据权利要求4的方法，其中所述活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
6.根据权利要求1的方法，其中所述活化剂选自下组：香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷和大麻二酚及其组合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述大麻二酚存在于大麻油中。
8.根据权利要求1的方法，其中所述活化剂包括大麻二酚，并且任选地进一步包括活化剂，所述活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
9.根据权利要求1的方法，其中所述活化剂选自下组：从紫菀(Aster tataricus)、香附(Cyperus rotundus)及其组合获得的提取物或其他材料。
10.根据权利要求1的方法，其中所述植物是通常不能通过大气氮的细菌固定获得其氮需求的物种成员。
11.根据权利要求10的方法，其中所述植物物种是禾本科的成员。
12.根据权利要求11的方法，其中所述植物物种是玉米。
13.根据权利要求11的方法，其中所述植物物种是小麦。
14.根据权利要求1的方法，其进一步包括施用一种或多种含磷肥料。
15.根据权利要求14的方法，其中所述肥料是Calirus。
16.根据权利要求1的方法，其中通过选自下组的手段(means)施用所述非致病性固大气氮细菌和一种或多种活化剂的组合：将缓释颗粒应用到种植所述植物的土壤，种子包被，和喷雾播种沟渠或犁沟。
17.根据权利要求1的方法，其中在单一组合物中一起施用所述非致病性固大气氮细菌和所述一种或多种活化剂。
18.根据权利要求1的方法，其中在分开的组合物中施用所述非病原性固大气氮细菌和所述一种或多种活化剂。
19.组合物，其包含非致病性固氮细菌和一种或多种活化剂的混合物。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述非致病性固大气氮细菌是根瘤菌属的成员。
21.根据权利要求20的组合物，其中所述细菌是豌豆根瘤菌物种的。
22.根据权利要求19的组合物，其中所述一种或多种活化剂是具有抗炎活性的物质。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
24.根据权利要求22的组合物，其中所述活化剂选自下组：香紫苏醇、柚皮苷、努特卡酮、甜菊糖苷和大麻二酚及其组合。
25.根据权利要求22的组合物，其中所述活化剂包括大麻二酚。
26.根据权利要求22的组合物，其中所述活化剂包括大麻二酚，并且任选地进一步包括活化剂，所述活化剂各自具有小于1.6mg/ml的抑制NO产生的IC50和/或小于2.4mg/ml的抑制TNF-α产生的IC50。
27.根据权利要求22的组合物，其中所述活化剂选自下组：从紫菀、香附及其组合获得的提取物或其他材料。
28.根据权利要求19的组合物，进一步包含一种或多种含磷肥料。
29.根据权利要求28的组合物，其中所述含磷肥料是Calirus。
30.用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)提供根据权利要求19-29中任一项的组合物；和
b)对所述宿主物种施用步骤(a)的所述组合物。
31.用于提高具有农业或园艺意义的植物的产率的方法，其通过如下手段进行：
a)分开提供：
(i)包含一种或多种固氮非致病性细菌的组合物；和
(ii)包含一种或多种如权利要求23-27中任一项限定的活化剂的组合物；和
b)分开将组合物(i)和(ii)中的每种施用于所述宿主物种。
32.根据权利要求31的方法，其中所述固氮非致病性细菌是根瘤菌属的成员。
33.根据权利要求32的方法，其中所述细菌是豌豆根瘤菌物种的。
34.根据权利要求30或权利要求31的方法，其中所述具有农业或园艺意义的植物是通常不能通过大气氮的细菌固定获得其氮需求的物种的成员。
35.根据权利要求34的方法，其中所述植物物种是禾本科的成员。
36.根据权利要求35的方法，其中所述植物物种是玉米。
37.根据权利要求35的方法，其中所述植物物种是小麦。
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Granted publication date: 20220816 |
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