WO2018147462A1 - 粒子検出装置及び粒子検出方法 - Google Patents

粒子検出装置及び粒子検出方法 Download PDF

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和樹 飯嶋
俊薫 豊嶋
琴浩 古川
片山　晃治
尚孝 神
実 関
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東ソー株式会社
国立大学法人 千葉大学
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Definitions

  • the present invention relates to a particle detection apparatus and a particle detection method.
  • solid materials composed of inorganic materials, organic materials, metals, etc. are supplied as a product.
  • These materials are designed by examining their physical properties in order to improve the performance of the final product.
  • spherical particles are applied as final products, such as grinding balls (alumina, zirconia, silica, etc.), liquid crystal spacers (resin, silica, etc.), chromatographic separation materials, other adsorbents, etc. Is mentioned.
  • such a particle product having a uniform shape, size, and density greatly affects the characteristics of the product as a final form, so that more uniform particles are required.
  • the separation and classification methods listed above it is very difficult to separate particles of several tens of ⁇ m or less, particularly particles of 10 ⁇ m or less, and it is generally a batch type process and difficult to separate continuously. .
  • a batch type process since the amount of treatment per process is determined by the separation yield, relatively large equipment (stock container for raw materials, supply equipment, collection container for unnecessary products) is required.
  • the sieve classification method is suitable for mass processing, but it is necessary to gradually change the size of the sieve mesh, so that it is a batch process.
  • the gravitational classification method is basically a batch process similar to the sieving classification method, and it takes an enormous amount of time to process as the particle size decreases.
  • the centrifugal separation method and the cyclone separation method are suitable for high-speed processing, they require a large apparatus and are not suitable for a continuous process.
  • the target size can be determined from the mainstream flow trajectory using the Brownian vibrations of the particles, which are regularly arranged with micro-processed bowl-shaped projections called brownia ratchet.
  • this method is a split flow formation by Brownian vibration as a separation mode, the separation speed is slow, and the main flow formation is performed in the form of electrophoresis, and it takes time for the separation, especially with a diameter of 1 ⁇ m or more. For particles, it took a long time to separate, and due to the influence of disturbance during that time, there was a problem that it could not withstand practical use.
  • FACS can roughly separate the target from a large amount of fine particles and cells, but it is difficult to accurately separate a small amount due to the influence of the shape and refractive index of the cell, and the target is weak against impact. May be destroyed during separation.
  • Non-Patent Documents 2 to 4 In general, a stable laminar flow is formed in a microchannel, and the flow profile can be controlled arbitrarily on the order of micrometers. By using such features, fine particles and cells can be accurately and continuously produced. Can be separated.
  • Patent Document 1 reports a technique called pinched flow fractionation (hereinafter referred to as PFF) for separating cells and fine particles accurately and continuously according to size.
  • PFF pinched flow fractionation
  • a fluid is introduced from a plurality of branches into a channel whose diameter is partially narrowed (hereinafter referred to as a constricted channel), the position of particles in a direction perpendicular to the flow is controlled, and then the relative diameter When a particle flows through a thick channel (hereinafter referred to as an enlarged channel), the direction of force applied to the particle by the position of the particle in the narrow channel is noticed.
  • a structure having two inlets can be used. For example, a liquid containing target particles from one inlet and a liquid not containing target particles flow from the other inlet. Can be implemented.
  • the flow rate of the liquid containing the particles (hereinafter referred to as sample liquid)
  • the ratio of the liquid not included (hereinafter referred to as the sheath liquid) is small, the ratio, the width and length of the narrowed channel, the width of the enlarged channel, the width of the narrowed channel and the enlarged channel It is important to adjust the ratio and the height of each flow path.
  • a Coulter method (electric detection zone method; hereinafter referred to as ESZ) using electrical detection as a technique capable of accurately detecting minority particle groups by measuring particles one by one (see, for example, Non-Patent Document 5) )It has been known.
  • ESZ electric detection zone method
  • the information (signal) obtained from each detection means corresponds to each particle on a one-to-one basis, it is possible to evaluate each particle, and the number contained in the method is small.
  • the measurable particle diameter range dynamic range
  • the particle diameter is calculated using an electrical signal generated when a particle is passed through a small hole called an aperture.
  • the dynamic range is said to be 2 to 60% of the aperture diameter.
  • the aperture is blocked by the particles, making it impossible to measure afterwards. Therefore, it is necessary to measure after removing larger particles in a filter having an aperture smaller than the aperture diameter. It becomes.
  • the adsorption of particles to the filter base material occurs not a little, so there is a concern that a part of the sample may be lost.
  • An object of the present invention is to provide a particle detection apparatus and a particle detection method that can individually and continuously detect a wide range of particles.
  • the present inventors can measure particles with a wide distribution by separating the particles in a direction perpendicular to the fluid flow according to the particle diameter and then detecting the particles with a detector. I found out.
  • the present invention provides a particle separation channel in which particles are separated in a direction perpendicular to the fluid flow according to the particle diameter, and two or more particle recovery streams branched and connected to the particle separation channel.
  • a particle detection apparatus having a path, wherein the particle recovery flow path includes a particle detection unit including an aperture and an electric detector.
  • the particle size ranges that can be detected by the apertures of the particle detection units in the respective particle recovery channels may be different from each other, and some of the particle size ranges that can be detected by the apertures may overlap each other. .
  • At least one parameter among the number of the particle recovery channels, the shape of the branching portion, the width, the height, and the length is adjusted, and a channel structure in which particles of a certain size or more are not mixed. And thereby, the clogging of an aperture can be avoided. Further, by adjusting these parameters, particles having a particle size that can be detected by the aperture of each particle recovery channel can be caused to flow into the particle recovery channel.
  • a fluid discharge port in which an electrode is arranged to a particle detection unit consisting of an electric detector having an aperture.
  • a fluid discharge port may be provided downstream of the particle detection unit, and the electrode of the electric detector may be further provided in the liquid discharge port.
  • the particle separation channel may have a channel structure using the principle of PFF.
  • a flow channel structure using the principle of PFF can be formed in the particle separation flow channel.
  • By stiffening the material of the path it is possible to suppress the outward expansion of the flow path wall, thereby increasing the accuracy of the position of flowing particles (Accuracy) that is generally assumed, instead of the position of flowing particles. It has been found that the accuracy of (Precision) increases.
  • a particle separation channel capable of separating particles more accurately in the PFF, a particle detection device provided with the particle separation channel, and a particle detection device using the particle separation channel and / or particle detection device It came to invention of the separation or detection method.
  • “accuracy” refers to the degree of deviation between the theoretical value and the measured value of the particle position from the enlarged region wall surface, and “accuracy” refers to the particle position measured from the enlarged region wall surface multiple times. Show how reproducible it is.
  • the hardness in the present specification refers to durometer hardness (use of type A durometer), and is defined by the amount of deformation of a material when a constant load is applied. The greater the hardness, the smaller the amount of deformation.
  • the particle position in the enlarged flow channel can be predicted from the particle diameter, the narrowed flow channel width, and the expanded flow channel width under the liquid feeding condition in which the particles are aligned on the narrow channel wall.
  • the inner wall surface of the micro flow channel through which the fluid flows is always exposed to the shearing force of the fluid, and thus a force is applied in the direction in which the micro flow channel expands during liquid feeding. Therefore, the prediction of the particle position in the enlarged flow path needs to take into account the expansion of each flow path due to liquid feeding.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the width of the stenosis channel referred to here is the direction perpendicular to the wall surface of the inner wall 16a of the stenosis channel (hereinafter referred to as the width direction), and the depth is the direction perpendicular to the width direction (hereinafter referred to as the depth direction).
  • the length of the flow path is intended to increase the “accuracy” of the particle position, and is not considered to increase the “accuracy” of flowing all the flowed particles to a certain position every time.
  • the present inventors have found that in the particle separation flow channel, the inner wall 17a of the enlarged flow channel slides with respect to the inner wall 16a of the narrowed flow channel. It was found that nano- to micrometer-sized particles can be separated by connecting them so that the channel width does not increase toward the wall surface. That is, the present invention relates to a particle separation channel configured such that the inner wall 17a of the enlarged flow channel does not expand toward the port 14a for introducing the particle-containing sample liquid with respect to the inner wall 16a of the narrowed flow channel, and the particle separation. The present invention also relates to a particle detection apparatus provided with a flow path, and further to a particle separation and / or detection method using such a particle separation flow path or a particle separation apparatus.
  • the inner wall 16a of the constricted flow channel on the wall surface side where the particles flow and the inner wall 17a of the enlarged flow channel on the same side are connected in a planar manner, so that the particles can be more accurately obtained.
  • the particles Becomes separable.
  • by gradually increasing the flow path width toward the wall surface side where particles do not flow that is, by avoiding as much corners as possible between the wall surface of the narrowed flow path 16 and the wall surface of the enlarged flow path 17. Furthermore, it has been found that the separation accuracy of particles is improved.
  • the inside of the microchannel is a space where the viscous force is more dominant than the inertial force, and it is not easy to flow the fluid under the turbulent flow condition where the Reynolds number is 2300 or more. It is assumed that the fluid flows in a laminar flow. This is because when the fluid is flowed so that the Reynolds number is 2300 or more, it is necessary to flow the fluid into the microchannel at a high flow rate of several m / sec or more, so the pressure loss becomes a value far exceeding several MPa, This is because the pressure load on the liquid feed pump or the breakage of the flow path becomes a problem and the liquid feed becomes difficult. Therefore, it is not intended to be limited to theory, but since the fluid basically flows in a laminar flow even in the channel using PFF, the effect of the present invention is the generation of turbulent flow in the micro channel. It is considered that it is not due to.
  • Another aspect of the present invention is a method for detecting particles contained in a fluid, Separating the particles in a direction perpendicular to the fluid flow according to their particle size, Divide the separated particles into two or more channels, There is also a method in which the particles are detected by an electric detector including an electrode disposed with an aperture disposed in the flow path.
  • the particle size range that can be detected by the electric detector may be different depending on the installed flow path, or a part of the detectable particle size range may be overlapped by the installed flow path. Good.
  • a flow channel structure in which particles of a certain size or more are not mixed is used, so that the particles are divided into two or more. You may divide into a flow path or may isolate
  • the method of the present invention is implemented by driving the particle detection apparatus of the present invention as an example.
  • the present invention makes it possible to detect a sample having a broader particle size distribution accurately and continuously, and to measure a large amount of particle samples as compared with a separation technique of batch processing.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are diagrams showing an embodiment of the present invention, in which particle filtration for detecting separated particles by applying hydrodynamic filtration (HDF) to the particle separation channel 110.
  • the microchip 10 provided with the parts 103a and 103b is shown.
  • FIG. 1A is a top view of the microchip 10
  • FIG. 1B is an enlarged view of a region 190 in FIG.
  • FIG. 2A is a diagram showing an embodiment of the present invention, and shows a mode in which two particle detectors 103 are arranged in series.
  • FIG. 2 (b) is a diagram schematically showing how the measured current value changes with time when one particle continuously passes through the two particle detectors 103.
  • FIG. 3A is a diagram showing an embodiment of the present invention, which shows a case where two apertures are arranged in series. Unlike FIG. 2, a mode in which only one pair of electrodes is used is shown.
  • FIG. 3 (b) is a diagram schematically showing how the measured current value changes with time when particles continuously pass through two apertures.
  • FIG. 4A is a diagram showing an embodiment of the present invention, and shows a mode in which a plurality of particle detectors 103 are installed in parallel with respect to one particle recovery channel 102.
  • FIG. 4B shows an equivalent circuit of FIG.
  • FIG. 5 (a) is a diagram showing an embodiment of the present invention, showing an embodiment in which a plurality of particle detectors 103 are installed in parallel with respect to one particle recovery channel 102, and a plurality of particles
  • the detection part 103 shows the aspect which reduces the electrical interference between the some particle
  • FIG. 5B shows the equivalent circuit of FIG. 5A and shows that the plurality of particle recovery channels 102 are independent.
  • FIG. 6 is a diagram showing an embodiment of the present invention, in which a plurality of apertures are installed in parallel with respect to one particle recovery flow channel 102, and an electrode is disposed downstream of each aperture. A mode that can be used as a lower cost device by sharing is shown.
  • FIG. 7 shows an aspect for producing the particle detection unit 103 at a lower cost using the relay channel 60 and the electrode insertion port 59.
  • FIGS. 8A to 8C are diagrams showing an embodiment of the present invention, showing an aspect in which HDF is applied to the particle separation channel 110.
  • FIG. FIG. 8A shows two particle recovery channels 102
  • FIG. 8B shows three particle recovery channels 102
  • FIG. 8C shows particle recovery channels 102.
  • the particle separation channel 110 has a branch channel 105.
  • FIG.9 (a) is a figure which shows the flow of the fluid in the branch part 110A of FIG.8 (b), FIG.9 (b) shows the enlarged view of the linear flow-path part of Fig.9 (a).
  • FIG. 10A is a diagram showing the flow of particles in a straight channel under laminar flow conditions, and FIG. 10B shows the trajectory of the particle flow in the particle diffusion channel 110B.
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing the principle of PFF. The behavior of the fluid introduced from the two branches and the state of the separation of the particles are shown.
  • 12 (a) to 12 (c) are diagrams showing an embodiment of the present invention, showing a mode in which PFF is applied in the particle separation channel 110.
  • FIG. 12 (a) shows two particle recovery channels 102
  • FIG. 12 (b) shows three particle recovery channels 102
  • FIG. 12 (c) shows FIG. 12 (a).
  • region 21 of (b) is shown.
  • FIG. 13A is a diagram showing an embodiment of the present invention, and shows an aspect in which AsPFF is applied in the particle separation channel 110.
  • FIGS. 13B and 13C are enlarged views of the region 21 in FIG.
  • FIG. 14 (a) is a diagram showing an embodiment of the present invention, where AsPFF is applied in the particle separation channel 110, and the wall surface on the narrow channel wall surface 16 b side of the expansion channel 17 gradually expands. An aspect is shown.
  • FIG. 14B shows an enlarged view of the region 21 in FIG. FIG.
  • FIG. 15 is a diagram showing an embodiment of the present invention, in which the particle detector 103 is configured by two apertures, the downstream of each aperture is connected to an outlet, and each outlet is also used as an electrode insertion port 59.
  • FIG. 16A is a schematic diagram of the microchip 10 used in the first embodiment.
  • FIG. 16B shows an enlarged view of the region 21 in FIG.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating an example of electrical signals of 0.1 and 0.2 ⁇ m particles detected by the particle detection unit 102a in the first embodiment.
  • FIG. 18 is a diagram illustrating an example of electrical signals of 0.2 and 0.5 ⁇ m particles detected by the particle detection unit 102c in the first embodiment.
  • FIG. 19A and 19B are diagrams showing examples of electrical signals of 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m particles detected by the particle detection unit 102b in Example 1.
  • FIG. (A) shows 0.5 and 1.0 ⁇ m particles
  • FIG. 19 (b) shows 2.0 ⁇ m particles.
  • FIG. 20 shows the particle size distribution of the mixed particle sample created from the measurement results in Example 1.
  • FIG. 21 shows the particle size distribution of the mixed particle sample created from the measurement results in Comparative Example 1.
  • FIG. 22 shows the particle size distribution of the antibody aggregate sample prepared from the measurement results in Example 2.
  • FIG. 23A is a diagram showing an embodiment of the present invention. After particle separation by HDF in the particle separation channel 110, three particle recovery channels and two particles are installed in each particle recovery channel. An aspect provided with a particle
  • FIG. 23B shows an enlarged view of the region 21.
  • FIG. 24 shows the particle size distribution of the mixed particle sample created from the measurement results in Example 3.
  • FIG. 25 is a diagram showing an outline of the present invention, in which particles 50 are introduced into the aperture 53a or 53b, and particles are detected based on the principle of ESZ by the electrodes 54a and 54b arranged at the two fluid discharge ports.
  • FIG. FIG. 26 shows another embodiment of the microchip 10 for carrying out the present invention.
  • FIGS. 26A and 26B are top views of the microchip 10, and FIG. 26C shows an equivalent circuit thereof.
  • FIG. 27 shows a microchip 10 according to another embodiment for carrying out the present invention.
  • FIG. 27A is a top view of the microchip 10, FIG.
  • FIG. 30A shows a microchip 10 having an embodiment of a particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention
  • FIG. 30A is a view taken along arrow A in FIG.
  • FIG. 30B is a cross-sectional view taken along the line BB in FIG. 30A
  • FIG. 30C is an enlarged view of the region 21 in FIG.
  • FIG. 32A is a top view of the microchip 10 and is a view taken along arrow A in FIG.
  • FIG. 32B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 32A
  • FIG. 32C is an enlarged view of the region 21 in FIG.
  • FIGS. 32D to 32G show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS. 32A to 32C.
  • FIG. FIG. 32 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 32 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • FIG. 32 (f) is a graph plotting the fluorescence profile in the detection line 20 of the integrated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 32 (g) is the integrated of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads. It is the graph which plotted the fluorescence profile in the detection line 20 of a fluorescence image.
  • 33 (a) to 33 (c) show a conventional microchip 10, which is shown as a comparison with the microchip 10 of FIG. 32 according to the present invention.
  • FIG. 33 (a) is a top view of the microchip 10, and is a view taken in the direction of arrow A in FIG. 33 (b).
  • FIG. 33 (b) is a cross-sectional view taken along line BB in FIG.
  • FIG. 33 (a), and FIG. 33 (c) is an enlarged view of the region 21 in FIG. 33 (a).
  • FIGS. 33 (d) to (g) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 of the prior art shown in FIGS. 33 (a) to (c).
  • FIG. FIG. 33 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 33 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • FIGS. 34 (a) to (c) show a microchip 10 of FIG. 33 equipped with an embodiment of a particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention. 1 shows a microchip 10 for comparison designed to be FIG. 34A is a top view of the microchip 10, and is a view taken in the direction of arrow A in FIG.
  • FIG. 34B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 34A
  • FIG. 34C is an enlarged view of the region 21 in FIG. 34 (d) to (g) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS. 34 (a) to (c).
  • FIG. FIG. 34 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 34 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • FIGS. 35 (a) to 35 (c) show a microchip 10 equipped with an embodiment of a particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention.
  • FIG. 35A is a top view of the microchip 10, and is a view taken in the direction of arrow A in FIG.
  • FIG. 35B is a cross-sectional view taken along the line BB in FIG.
  • FIG. 35A, and FIG. 35C is an enlarged view of the region 21 in FIG. As shown in FIG. 35 (c), the channel width of the enlarged channel is configured to gradually increase.
  • FIGS. 35 (d) to (g) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS. 35 (a) to (c).
  • FIG. FIG. 35 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 35 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • 35 (f) is a graph plotting the fluorescence profile in the detection line 20 of the integrated fluorescent image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 35 (g) is the integrated of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads. It is the graph which plotted the fluorescence profile in the detection line 20 of a fluorescence image.
  • 36 (a) to 36 (c) show, in the microchip 10 of FIG. 35 having an embodiment of the particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention, the wall surface on which the expansion channel expands is reversed.
  • 1 shows a microchip 10 for comparison designed to be
  • FIG. 36A is a top view of the microchip 10 and is a view taken along arrow A in FIG. FIG.
  • FIG. 36B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 36A
  • FIG. 36C is an enlarged view of the region 21 in FIG. 36 (d) to (g) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS. 36 (a) to (c).
  • FIG. FIG. 36 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 36 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • FIGS. 37 (a) to (d) show a microchip 10 equipped with an embodiment of a particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention.
  • FIG. 37A is a top view of the microchip 10 and is a view taken in the direction of arrow A in FIG.
  • FIG. 37 (b) is a cross-sectional view taken along line BB in FIG.
  • FIG. 37 (d) is a diagram further enlarging the connection point (enlargement start point) between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17.
  • the slope portion 40 has partial recesses constituted by flow channel wall surfaces 41a and 41b (both have a length of 50 ⁇ m).
  • 37 (e) to (h) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads are separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS. 37 (a) to (d).
  • FIG. 37 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 37 (f) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 37 (g) is a graph plotting the fluorescence profile in the detection line 20 of the integrated fluorescent image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 37 (h) is the integrated of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads. It is the graph which plotted the fluorescence profile in the detection line 20 of a fluorescence image.
  • FIG. 38 shows a 0.1 ⁇ m fluorescent polystyrene bead and a 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene bead using the microchip 10 in which only the width of the narrowed flow path 16 and the depth of the flow path 13 are changed in the microchip 10 of FIG. It is a figure which shows having isolate
  • FIG. 38A is an accumulated fluorescence image of the separated 0.1 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 38B is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads.
  • FIG. 39 is modified to include a plurality of outlets 15a, 15b, and 15c in the microchip 10 of FIG.
  • FIG. 39A is a top view of the microchip 10 and is a view taken in the direction of arrow A in FIG.
  • FIG. 39B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 39A
  • FIG. 39C is an enlarged view of the region 21 in FIG. 40 (a) to 40 (c) show separation performance with respect to the enlarged flow path of the microchip 10 of FIG. 35 having an embodiment of the particle separation flow path for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention.
  • the microchip 10 is shown with modifications that are considered to have no effect.
  • FIG. 41 (a) to 41 (c) are designed such that the enlarged flow path wall surface 17a extends to the 17b side in the microchip 10 of FIG. 32 equipped with an embodiment for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention.
  • 1 shows a microchip 10 for comparison.
  • FIG. 41A is a top view of the microchip 10, and is a view taken in the direction of arrow A in FIG. 41B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 41A
  • FIG. 41C is an enlarged view of the region 21 in FIG. 41A.
  • 41 (d) to (g) show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS.
  • FIG. FIG. 41 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 41 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 41 (f) is a graph plotting the fluorescence profile in the detection line 20 of the integrated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 41 (g) is the integrated of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads. It is the graph which plotted the fluorescence profile in the detection line 20 of a fluorescence image.
  • FIGS. 42 (a) to 42 (c) show the enlarged channel walls 17a and 17b in the microchip 10 of FIG. 35 equipped with the embodiment of the particle separation channel for carrying out the continuous particle separation method according to the present invention.
  • 1 shows a comparative microchip 10 designed to gradually expand.
  • FIG. 42A is a top view of the microchip 10, and is a view taken in the direction of arrow A in FIG. 42B is a sectional view taken along line BB in FIG. 42A
  • FIG. 42C is an enlarged view of the region 21 in FIG. 42A.
  • FIGS. 42D to 42G show that 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads and 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads were separated using the microchip 10 according to the present invention shown in FIGS.
  • FIG. 42 (d) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 42 (e) is an accumulated fluorescence image of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 42 (f) is a graph plotting the fluorescence profile in the detection line 20 of the integrated fluorescence image of the separated 0.2 ⁇ m fluorescent polystyrene beads
  • FIG. 42 (g) is the integrated of the separated 0.5 ⁇ m fluorescent polystyrene beads. It is the graph which plotted the fluorescence profile in the detection line 20 of a fluorescence image.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the particle detection apparatus according to the present invention.
  • the cross section of the flow path in the microchip 10 is preferably rectangular in view of ease of manufacturing the flow path structure, but may be a cross section of a circle, an ellipse, a polygon, or the like, and is partially rectangular. Other shapes may be used.
  • the flow path height is preferably uniform from the viewpoint of ease of production, but the depth may be partially different.
  • the particle detection device includes a particle separation channel that enables separation of particles in a direction perpendicular to a fluid flow according to the particle diameter, and two or more particles that are branched and connected to the particle separation channel A recovery channel.
  • the microchip 10 is a microchip for measuring the particle size and particle size distribution by separating particles according to their sizes and using an appropriate detection system.
  • the microchip 10 is a polymer such as PDMS. It has a flat structure formed of two flat substrates 11 and 12 formed of a material.
  • a manufacturing technique using a mold such as molding or embossing is preferable in that the flow channel structure can be accurately and easily manufactured.
  • Manufacturing techniques such as wet etching, dry etching, nanoimprinting, laser processing, direct electron beam drawing, and machining can also be used.
  • a sample containing particles is introduced from an inlet 14 which is a fluid introduction port, and is sent to the downstream of the flow path by a liquid feeding unit, and the particle introduction flow path 101, the particle separation flow path 110, the particle recovery flow path 102a or 102b,
  • the particles pass through the corresponding particle detectors 103a or 103b, respectively, and flow out to the outlets 104a or 104b that are fluid discharge ports.
  • the particles are separated in a direction perpendicular to the fluid flow according to the particle diameter, and the separated particles flow to the particle recovery channel 102a or 102b. Electrical detection is performed in the particle detectors 103a and 103b that have reached through the particle recovery channel 102a or 102b.
  • the insides of the particle detectors 103a and 103b are filled with a solution containing an electrolyte, and are connected to an electrical measuring instrument 56 and a power source 57 via conductors 55 connected to the electrodes 54a and 54b, respectively.
  • an electrical measuring instrument 56 and a power source 57 via conductors 55 connected to the electrodes 54a and 54b, respectively.
  • a current of an arbitrary value flows from the power source 57, and a closed circuit is formed via the aperture 53.
  • the electric measuring device 56 is connected to the analyzing unit 61, and the detection signal obtained from the electric measuring device 56 is calculated by the analyzing unit 61 to create a particle size distribution.
  • the sample containing particles is a fluid containing particles to be measured.
  • the particles in the present invention have a particle size in the range of, for example, 1 nm to 100 ⁇ m, preferably 10 nm to 10 ⁇ m.
  • nucleic acids, proteins, vesicles, extracellular vesicles, inorganic powders, metal colloids, polymer particles, Viruses, cells, cell masses, protein aggregates and the like are included.
  • the fluid in the present invention is a conductive fluid, and preferably an aqueous solution containing an electrolyte, but conductive oil or oil can also be used.
  • An additive such as a surfactant may be added to the aqueous solution.
  • the inlet 14 only needs to have a structure capable of holding a sample containing particles, and preferably has a concave structure.
  • the material may be metal, glass, or ceramics with little eluate, but it is preferably formed of a polymer material for inexpensive production.
  • the particle introduction channel 101 is formed between the inlet 14 and the particle separation channel 110.
  • the particle introduction channel 101 is arranged to assist the separation of particles in the particle separation channel 110, but may be omitted to reduce the size of the microchip 10.
  • the liquid feeding unit may use a method of feeding by a pressure gradient such as a syringe pump, a peristaltic pump, or a pressure pump, or an electroosmotic pump for suppressing uneven velocity distribution in the cross section of the microchip 10. May be used.
  • a pressure gradient such as a syringe pump, a peristaltic pump, or a pressure pump, or an electroosmotic pump for suppressing uneven velocity distribution in the cross section of the microchip 10.
  • a pressure gradient such as a syringe pump, a peristaltic pump, or a pressure pump, or an electroosmotic pump for suppressing uneven velocity distribution in the cross section of the microchip 10.
  • a pressure gradient such as a syringe pump, a peristaltic pump, or a pressure pump, or an electroosmotic pump for suppressing uneven velocity distribution in the cross section of the microchip 10.
  • the pipe connected from the pump is directly connected to the inlet 14 to send the liquid by applying pressure to
  • the flow rate of the liquid feeding part is preferably set to an arbitrary value depending on the cross-sectional area of the flow path and the cross-sectional area of the aperture, and as an example, it is preferably set between 0.1 ⁇ L / hour and 1 mL / hour.
  • Two or more particle recovery channels 102 are provided from the viewpoint of expanding the measurable particle diameter range (dynamic range).
  • the particle detector 103 is provided inside or downstream of the particle recovery channel 102 and is used to detect particles flowing into the particle recovery channel 102.
  • At least one particle detector 103 needs to be provided for one particle recovery channel 102, and two or more particle detectors 103 may be provided (FIGS. 2 to 6).
  • two or more particle detection units When two or more particle detection units are provided for one particle recovery channel 102, they may be provided in series with one particle recovery channel (FIGS. 2 and 3), or the particle recovery channel may be branched. May be provided in parallel (FIGS. 4 to 6).
  • a flow path for collecting particles out of the measurable particle diameter range may be further provided.
  • the two or more particle detection units 103 may be arranged in series (FIGS. 2 and 3).
  • the passage speed of the particles in the flow path can be calculated from the interval of signals generated from the same particles that have passed through the two particle detectors 103. Since the passage speed of the particles is generally proportional to the flow rate of the recovery channel 102, the flow rate of the fluid in the recovery channel can be estimated.
  • the voltage applied to the electrode is applied from the upstream electrode of the upstream aperture 53 ′ and the downstream electrode of the downstream aperture 53 ′′.
  • the upstream electrode 54a ′ of the upstream aperture 53 ′ and the downstream side of the downstream aperture 53 ′′ as shown in FIG. Measurement may be performed using only the electrode 54b ′′.
  • the electrode insertion which is connected to the aperture fluidly and electrically via the relay channel 60 to the upstream and downstream of the particle detection channel, or to the upstream and downstream of the aperture, respectively.
  • Particle detection by ESZ may be performed by providing a mouth 59 and immersing the electrode 54 therein.
  • the two or more particle detection units 103 may be arranged in parallel (FIGS. 4 to 6). According to this aspect, an excellent effect is obtained that the processing amount increases in proportion to the number of the particle detection units 103 arranged in parallel.
  • the electrodes 54 for electrical detection are arranged so as to sandwich each aperture, and measurement is possible if the number of the particle detection units 103 is twice as many.
  • FIG. 6 measurement is possible even in a mode in which one electrode is arranged on the upstream side and the number of the particle detection units 103 on the downstream side with respect to each aperture. This aspect is preferable from the viewpoint of cost reduction by reducing the cost.
  • a switching circuit may be used between the electrode 54 and the power source 57, or an open circuit state may be made by a relay method or a photo moss method.
  • the particle detector 103 is preferably constructed as a measurement system in which electromagnetic noise is not affected as much as possible at the time of measurement.
  • the switching circuit uses a photocurrent such as a photomoss sensor rather than a relay system using an electromagnet. The method is preferred.
  • FIG. 5 when a voltage is applied from the electrode on the downstream side of the aperture toward the upstream side, the current value change of one aperture does not affect the current value of the other aperture. It may be used.
  • the particle detector 103 includes an aperture 53 and an electric detector.
  • the aperture 53 indicates a hole smaller than the channel diameter formed in the channel, and is defined by the particle detection channel 62 and the aperture forming structure 52.
  • the cross-sectional shape of the aperture may take various shapes depending on the manufacturing process. When processing by etching or laser irradiation, it takes a circular or elliptical shape, and a polymer material such as polydimethylsiloxane (hereinafter referred to as PDMS) by photolithography and soft lithography. In the case of molding by means of a rectangle or trapezoid.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the cross-sectional area of the aperture need only be larger than the particle to be measured, but generally the particle size range that can be measured by ESZ is said to be 2 to 60% of the cross-sectional area of the aperture. It is necessary to design according to the size.
  • the particle detection unit 103 may be configured by two apertures.
  • a plurality of apertures are formed by providing a plurality of particle detection units, and the downstream of each aperture is connected to an outlet, and each outlet also functions as an electrode insertion port 59. It is good also as a structure made to do. In this case, if the volume of the aperture is approximately the same, the signal obtained from each aperture is approximately the same.
  • a fluid discharge port is connected to each end of the branched particle recovery channel. (FIG. 25).
  • the electrodes 54a and 54b can be arranged so that the tips thereof are immersed in the solution containing the electrolyte in the fluid discharge port, and the current supplied from the power source is supplied from the one electrode 54a or 54b to the aperture 53a.
  • the electric detector of the particle detector 103 mainly includes an electrode 54, an electric measuring device 56 connected to the electrode 54 through a conductive wire 55, and a power source 57.
  • the two electrodes 54 are arranged with the aperture 53 interposed therebetween.
  • the electrical measuring device 56 may be any device that detects electrical characteristics, and examples thereof include a current measuring device, a voltage measuring device, a resistance measuring device, and a charge measuring device. In measuring ESZ, a current measuring device is used. Most preferred.
  • the sampling time interval of the electric measuring device 56 is preferably sufficiently shorter than the time required for the particles to pass through the aperture, and is 10,000 times or more per second. Sampling is preferable, and it is more preferable to sample 20,000 times or more per second.
  • the particle introduction channel 101 is provided with a branch channel 101d, or as shown in FIG. 26 (b), three particle recovery channels (102a, 102b, 102c) are provided.
  • One more electrode may be arranged at the fluid outlet 104c at the end.
  • the equivalent circuit is as shown in FIG. 26C, and the added electrode is connected in series with the aperture 53a and in parallel with the aperture 53b.
  • a DC or AC power source is used as the power source 57, but it is preferable to select a power source that is less susceptible to noise during measurement. From a cost aspect, it is preferable to use a DC power source that is inexpensive and low noise such as a dry battery. preferable.
  • the material of the electrode is not limited as long as it has a low electrical resistance, and a metal, an inorganic compound, or an organic compound can be used, but a metal is preferable from the viewpoint of durability and cost.
  • the analysis unit 61 can include a calculation device for calculating the measurement result and a recording medium for recording the measurement result or a calculation result derived therefrom.
  • the arithmetic device and the recording medium may be integrated with the electric measuring device 56 or may be an external device that can be connected to the electric measuring device 56.
  • the data recorded on the recording medium includes the sampled current value, the current value change that occurs when particles pass, and the particle diameter, number of particles, particle concentration, detection time, or measurement calculated from the current value change. The elapsed time from the start is included.
  • the ratio of the respective flow rates is the width w of the channel, It is calculated from the height h and the length L.
  • the flow rate in the straight flow path is calculated according to the following equation (2) from the Hagen Poiseuille equation.
  • the velocity distribution in the microchip channel under the laminar flow condition becomes a parabola, and is generally represented by u (r) in the following formula (3) (at this time, w0 is the radius of the tube, r is the distance from the center of the tube, ⁇ is the viscosity, L is the length of the tube, and ⁇ P is the pressure loss.
  • the ratio of the areas Sa, Sb, Sc in the parabola separated by arbitrary distances w1 and w2 from the flow path wall surface is equal to the ratio of the flow rates Qa, Qb, Qc flowing to the respective recovery flow paths.
  • the particles existing in the flow channel the particles whose center or center of gravity exists near the flow channel wall surface than w1 flow into the recovery flow channel 102a, and near the flow channel wall surface than w2.
  • the particles existing in the flow into the recovery flow path 102b, and the particles existing between w1 and w2 flow into the recovery flow path 102c. Accordingly, the radius of the largest particles flowing into the recovery channels 102a and 102b is w1 and w2, respectively.
  • the radius of the aperture must be greater than or equal to w1 or w2.
  • the minimum radius passing through the center or center of gravity of the substantially circular or elliptical shape needs to be w1 or w2.
  • the cross-sectional shape of the aperture is a rectangle, each of the two sets of opposing sides needs to have a length that is at least twice as long as w1 or w2.
  • the radius of the inscribed circle needs to be greater than or equal to w1 or w2.
  • a plurality of branch portions 110A may be provided at locations other than the end of the particle separation channel 110, and one or more branch channels 105 may be provided (FIG. 8C).
  • the branch channel 105 may be provided only on one channel wall surface side or on both sides of the channel wall surface. Further, the one or more branch flow paths 105 may be merged simultaneously in the downstream recovery flow path 102 or may be gradually merged.
  • a particle diffusion channel 110B may be formed on the fluid upstream side of the branching portion 110A (not shown in FIG. 10) of the particle separation channel 110 (FIG. 10B).
  • the fluid upstream side of the particle diffusion channel 110B is connected to the particle introduction channel 101, and the fluid downstream side is connected to the branching portion 110A.
  • the fluid upstream side of the particle diffusion channel 110B is directly connected to the inlet.
  • the particle diffusion channel 110B preferably has a structure in which the width and / or height of the channel increases from the fluid upstream side to the downstream side.
  • the preferred mode differs depending on whether there are a plurality of particle recovery channels in the channel width direction of the particle diffusion channel 110B or a plurality of particle recovery channels in the height direction.
  • microparticles obtained by general photolithography and soft lithography are different.
  • a structure in which the width of the flow path is enlarged is preferable in terms of ease of fabrication.
  • the particle diffusion channel 110B utilizes the Brownian motion of particles per unit time, that is, the fact that the diffusion distance is inversely proportional to the square root of the particle diameter, and the particles flow when flowing through the particle diffusion channel 110B. Since the particles diffuse in the direction in which the flow path expands according to the diameter, the existence probability of particles having a small particle diameter increases near the expanded flow path wall surface, and a concentration effect is obtained.
  • the angle ⁇ a connecting the channel wall surface a and the particle diffusion channel wall surface a in FIG. 10 and the angle ⁇ b connecting the channel wall surface b and the particle diffusion channel wall surface b are 180 in that the channel width is increased. Must be less than °.
  • angles ⁇ a and ⁇ b may be asymmetrical, and one wall surface may be connected in a substantially straight line, and only the other wall surface facing each other may be enlarged and connected at an angle of less than 180 °.
  • the particle size ranges that can be detected by the particle detection units 103a and 103b in FIG. 8 may be exactly the same, but a sample having a wide particle size range is measured. It is preferable to set so that different particle size ranges can be measured, and when some of them overlap each other, it is possible to detect particles that could not be separated and to obtain a more robust result. preferable.
  • the particle size range that can be detected by the particle detection units 103a and 103b is such that the particle detection unit 103a is set to a large particle size range.
  • 103b may be set to a small particle size range, and vice versa.
  • the flow rate flowing to each particle recovery channel 102 is calculated by using the flow rate of the set liquid feeding section and the formula (2) or (3).
  • the particle concentration is calculated by dividing the number of counts by.
  • concentration correction may be performed in consideration of the particle radius from the wall surface according to the particle diameter.
  • the flow rate from the wall surface to the particle radius may be calculated using Equation (3), the ratio to the flow rate to each particle recovery channel 102 may be calculated, and correction may be performed by the calculated ratio.
  • FIG. 12 shows an example of the configuration in the case of using a channel utilizing the principle of pinched flow fractionation (PFF) in the particle separation channel 110 of the particle detection device of the present invention.
  • the particle separation flow path 110 includes a branch flow path 18 a, a branch flow path 18 b, a narrowed flow path 16, and an enlarged flow path 17.
  • the inlets 14a and 14b holding the fluid 100P containing particles and the fluid 100N not containing particles are fluidly connected to the branch flow path 18a and the branch flow path 18b, respectively.
  • the branch flow path 18 a and the branch flow path 18 b merge downstream and are fluidly connected to the upstream side of the narrowed flow path 16. Thereafter, based on the principle of PFF, particle separation is performed in the enlarged flow channel 17 connected to the downstream side of the narrowed flow channel 16.
  • the flow path width of the enlarged flow path 17 is constant at a predetermined position, and particles are collected by the collection flow paths 102a and 102b that are fluidly connected downstream of the enlarged flow path 17 and connected downstream of the collection flow path. Particles are detected by the detection units 103a and 103b.
  • any number of recovery channels may be installed, but it is preferably 5 or less, and most preferably 3 or less, from the viewpoint of downsizing and cost reduction of the channel.
  • FIG. 11 shows an example of a narrowed channel and an enlarged channel formed by joining the channels in the microchips of FIGS. 12 to 14, FIGS. 30, 32 to 37, 39, and 41 to 42. Specifically, it is an enlarged view of a region 21 in FIG. Further, the fluid 100P and the fluid 100N shown by hatching are a fluid containing particles and a fluid not containing particles, respectively, and the particles 300a and 300b are relatively large particles and relatively small particles, respectively. Yes.
  • an arrow 200 indicates a streamline profile at the boundary between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17, and arrows 210a and 210b indicate motion vectors of the large particle 300a and the small particle 300b, respectively. ing.
  • the fluid 100P including particles and the fluid 100N not including particles are continuously supplied from the two inlets 14a and 14b using a syringe pump or the like. At this time, each fluid flows in the flow path 13 while maintaining a stable laminar flow.
  • the width of the fluid 100P in the constricted channel 16 (the distance from the channel wall surface to the interface between the fluid 100P and the fluid 100N)
  • the particle size should be smaller than the minimum particle size to be separated.
  • a difference occurs in the direction of the motion vector 210b of 300b, and the positional difference for each particle size is enlarged in the enlarged flow path 17 to enable classification.
  • the particle size of the particles and the particle size distribution of the particle group can be examined.
  • the channel wall of the particle separation channel is preferably made of a material that hardly expands outward. Therefore, as a material for producing the microchip 10 including the particle separation channel, it is preferable that the wall surface of the channel is made of a material that does not easily expand, but at least the wall surface of the channel is in the width direction of the channel. It is preferable to be made of a material that does not easily expand. More specifically, it is preferably made of a material having a durometer hardness of 40 or more, and more preferably made of a material having a durometer hardness of 60 or more.
  • Examples of usable materials include various polymer materials such as PDMS and acrylic, various metals such as glass, silicone, ceramics, and stainless steel.
  • various polymer materials such as PDMS and acrylic resin having a durometer hardness of 40 or more, more preferably a durometer hardness of 60 or more, glass, silicone, ceramics, stainless steel, and the like can be used.
  • any two kinds of materials can be used in combination.
  • PDMS having a durometer hardness of 40 or more, an acrylic resin, or the like is preferable, and a durometer hardness of 60 or more is more preferable.
  • the depth direction of the flow path may be made of a material that expands. Since it is cumbersome to change the degree of expansion in the width direction and depth direction of the flow path when manufacturing the flow path, the above-described microchip 10 is manufactured by PDMS having a hardness of 30, 44, 60, and 70. However, the hardness can be set to an arbitrary value, and a hardness of preferably 40 or more, more preferably 60 or more is used.
  • the hardness in the present specification refers to durometer hardness (uses a type A durometer), and is defined by the amount of deformation of a substance when a constant load is applied. small.
  • the hardness test is evaluated according to JIS K 6253mm-5 (durometer hardness test) in accordance with the standard of JIS K 6249.
  • a type A durometer hardness tester is mounted on an indentation depth measuring device consisting of a length measuring device having a measurement range of indentation depth of 0.000 to 2.500 mm and a displacement device, and the length is measured. It is desirable to use a micrometer for the system.
  • the length measuring instrument (the tip of the spindle of the micrometer) is fixed so that it is in vertical coaxial contact with the push needle, and the spindle is moved to give displacement to the push needle.
  • the pusher of the hardness tester is displaced from 100 to 0 according to each display, or the indicated value of the hardness tester for a known indentation depth value is verified.
  • the indentation depth is preferably verified at least at four locations including the instruction values 100 and 0.
  • the microchip 10 provided with the particle separation channel 110 based on the principle of PFF is formed by forming the channel 13 on the lower surface 11 a of the substrate 11 and overlapping the lower surface substrate 12.
  • the depth of the flow path can be set to an arbitrary value from 10 nm to 1 cm, but is preferably set to a value from submicron to several tens of ⁇ m for ease of production.
  • the flow path 13 has inlets 14a and 14b and an outlet 15.
  • the inlets 14a and 14b are fluid inlets for fluid containing particles and fluids not containing particles, respectively, and the outlet 15 is an outlet for fluid.
  • One end of the flow path 13 is at least two branch flow paths (18a, 18b), and the flow path 13 is composed of a narrowed flow path 16 and an enlarged flow path 17 having two different shapes. ing.
  • the connection portion between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17 can be referred to as an enlargement start point, and the channel width changes at the enlargement start point as shown in FIG.
  • the enlarged flow path 17 may have an arbitrary shape as long as the flow path width is larger than that of the narrowed flow path 16.
  • the branch channels 18 a and 18 b are connected to the inlets 14 a and 14 b, respectively, and the enlarged channel 17 is connected to the outlet 15.
  • the entire length of the flow path 13, that is, the length from one end where the inlets 14 a and 14 b are located to the other end where the outlet 15 is located can be set to an arbitrary value of 1 ⁇ m or more. However, it is preferable to set the thickness to several ⁇ m to several tens of mm from the viewpoint of easy flow path fabrication and pressure loss.
  • the lengths of the constricted flow channel 16 and the enlarged flow channel 17 can be set to arbitrary values of 10 nm or more. However, from the viewpoint of easy flow channel fabrication and pressure loss, the length is about submicron to several tens of mm. It is preferable to set. Further, from the viewpoint of achieving particle alignment, the lower limit of the length of the constricted flow path 16 is preferably 1 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, and the upper limit of the length of the constricted flow path 16 is 500 ⁇ m or less. Is preferably 100 ⁇ m or less.
  • the width of the stenosis channel 16 refers to the length of the channel in the direction perpendicular to the wall surface of the inner wall 16a of the stenosis channel.
  • the width of the narrowed channel 16 can be set to an arbitrary value of 10 nm or more as long as the condition that it is less than the width of the enlarged channel 17 is satisfied.
  • the lower limit of the width of the constricted flow channel 16 is preferably 1 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, and the upper limit of the width is preferably 100 ⁇ m or less, and further is 20 ⁇ m or less. preferable.
  • a plurality of outlet ports 15 of the enlarged flow path 17 may be provided, and some of the outlet ports 15 are based on the principle of “Asymmetric Pinched Flow Fractionation (AsPFF)” (Non-Patent Document 6). Separation can also be improved by flowing a large amount of fluid through the outlet port. More specifically, the resistance value of the flow path is appropriately designed, and a particle having a specific size can be introduced only into a specific outlet port from the relationship between the flow path width and the particle diameter of the narrowed flow path 16. This is the principle.
  • the entire flow channel network is regarded as an analogy of the resistance circuit, and an appropriate flow distribution ratio can be achieved by performing an appropriate design. It is desirable to design based on such an idea.
  • the introduction amount to achieve a desired flow rate condition in the flow path it is convenient and preferable to introduce the solution from the introduction port using a syringe pump or the like, but other pumps such as a peristaltic pump can be used. It is also possible to use a method to be used, a constant pressure liquid feeding method using a cylinder, a pressure device, or the like, a liquid feeding method using electroosmotic flow, centrifugal force, or the like. A pressure device that applies negative pressure from the outlet can also be used. In addition, it is desirable that the liquid feeding pressure is in a range where liquid feeding can be stably performed, and is preferably 20 MPa or less from the viewpoint of durability of the flow path and the liquid feeding pump itself.
  • the particles are fed under conditions where the Reynolds number is 1000 or less. It is preferable to perform a liquid operation.
  • a channel structure having a diameter of 1 mm or less it is relatively difficult to form a turbulent flow, and it is easy to achieve such a condition.
  • the width of the branch channels 18a and 18b is 100 ⁇ m, but these values can be set to arbitrary values of 10 nm or more, respectively.
  • both the fluid containing particles and the fluid not containing particles may be composed of the same fluid, or may be composed of two or more different fluids.
  • the particles introduced into the flow path 13 move in the downstream direction along the flow.
  • the position of the particles in the direction perpendicular to the wall surface of the inner wall 16a of the narrowed channel can be controlled by the size of the particles.
  • the ratio of the flow rate of the sheath liquid to the sample liquid is preferably 1 or more, more preferably 10 or more, and more preferably 50 or more. Most preferred.
  • the sum of the flow rates of the sample liquid and the sheath liquid is preferably set so that the liquid feeding pressure does not become too large, and the flow rate in the constricted flow path is preferably 10 m / sec or less, preferably 2 m / sec or less. Most preferably it is.
  • the enlarged flow channel 17 may be formed in the particle separation flow channel 110 based on the principle of AsPFF.
  • the drain channel 22 may be provided in the enlarged channel 17, and this aspect is more preferable in terms of improving the separation performance of the particles.
  • the drain channel 22 is connected to the outlet 23, and the fluid is discharged or collected. It is preferable that 50% or more of the fluid flow into the drain flow path, and more preferably 70% or more of the fluid flows.
  • the channel width may be expanded stepwise at the expansion start point as shown in FIGS. 13B and 13C. As shown in FIG. 12 (c) or FIG. 14 (b), the channel width may be gradually increased. When the channel width gradually increases, the wall surface 17b of the enlarged channel may be enlarged to draw a straight line to form the slope 40, or may be enlarged to draw a curve. When the channel width of the enlarged channel 17 is expanded stepwise or linearly, it is between the wall surfaces 16a and 16b of the narrow channel and the wall surfaces 17a and 17b of the enlarged channel 17 following the wall surface.
  • the expanded flow path can be defined by the angles 24a and 24b.
  • the angles 24a and 24b when expanding in a step shape are 90 °.
  • the angles 24a and 24b are represented by 90 ° to 180 °.
  • the wall surface of the enlarged channel may be enlarged as compared with the channel width of the narrowed channel.
  • the angle 24a may exceed 180 °, for example, 210 ° or 225 ° (FIG. 41).
  • the angle 24a, 24b of the wall of the enlarged region can independently take any angle between 90 ° and 180 °, for example, 120 °, 135 °, 150 °, 180 ° Can take.
  • the angle 24b of the enlarged flow channel wall surface 17b with respect to the constricted flow channel wall surface 16b is 90 ° or less, it is a partial structure and a structure that gradually expands gradually. If so, since most of the fluid gradually flows in the direction of the outlet 23, it is hardly affected by the vortex or particle diffusion, so such a structure may be used (FIGS. 40A to 40C). See).
  • the wall surface 17b of the expansion channel expands so as to draw a curve, the tangent plane at the expansion start point preferably coincides with the wall surface of the constriction channel from the viewpoint of preventing vortex flow.
  • the flow path width increases toward the wall surface 16a side where particles in the narrow flow path 16 slide among the wall surfaces of the expanded flow path 17.
  • the channel width is increased toward the wall surface 16b side where the particles in the narrow channel 16 do not flow.
  • the angle 24a on the wall surface side where the particles flow is 180 ° or more (less than 270 ° at the maximum) from the viewpoint that the flow path width does not increase toward the wall surface side where the particles flow.
  • Yes preferably 180 °
  • the other wall angle 24b is any angle between 90 ° and 180 °, eg 120 °, 135 °, 150 °, 180 °.
  • the wall surface 17a or 17b of the enlarged flow path is assumed to have a concave portion or a convex portion in a direction perpendicular to the wall surface 17a or 17b as shown by the dotted line portion in FIGS. 37 (d) and 40 (a)-(c).
  • this does not significantly affect the flow of particles in the fluid, the presence of a recess or projection will not affect the separation.
  • the microchip 10 has an irregular shape such as a manufacturing defect, if it does not greatly affect the flow of particles in the fluid, there is no problem even if such a structure is adopted. Such a configuration is not excluded.
  • the wall surface 16a in which particles flow in the stenosis channel 16 can also be referred to as the wall surface 16a of the sample liquid side stenosis channel, and the wall surface 16b in which particles in the stenosis channel 16 do not flow flows in the sheath liquid side stenosis channel. It can also be called the wall surface 16b.
  • the enlarged flow channel wall surface on the sample liquid side constricted flow channel wall surface 16a is used as the expanded liquid wall surface on the sample liquid side narrowed flow channel wall surface 16a
  • the enlarged flow channel wall surface on the sheath liquid side narrowed flow channel wall surface 16b is used as the sheath liquid side expanded flow channel wall surface. 17b.
  • FIG. 11 shows one or both of them may be curved.
  • the connection structure between the narrow channel and the enlarged channel wall surface is sufficiently effective on both the sample liquid side and the sheath liquid side wall surface, but it can be inferred from the principle of PFF that aligns particles on the sample liquid side.
  • the drain channel 22 may be used when particles are separated by AsPFF, and the width, height, and length of the drain channel so that at least a part of the fluid flowing to the enlarged channel 17 flows to the drain channel 22. Is preferably designed. More preferably, it is designed so that the same amount of fluid flows to the drain flow path 22, and most preferably designed so that more than twice as much fluid flows.
  • the drain channel 22 shown in FIG. 32 is designed in a direction perpendicular to the direction in which the fluid flows in the constricted channel 16, but it may be designed in a parallel direction. It may be set to an arbitrary angle.
  • the drain channel may be arranged at the expansion start point of the expanded channel. Alternatively, the drain channel may be disposed away from the enlargement start point (FIG. 35C).
  • the drain channel 22 is more preferably designed in a direction perpendicular to the direction in which the fluid flows in the constricted channel 16.
  • Each particle recovery channel 102 includes at least one particle detector 103, and a plurality of particle recovery channels 102 may be provided.
  • the enlarged flow channel 17 may be given a function of further promoting the separation performance of the particles by giving the function as the particle diffusion flow channel 110B described in the section of HDF.
  • the length needs to be long enough to allow the particles to diffuse, and at least 1 ⁇ m or more is required.
  • the channel length of the enlarged channel 17 is determined to an arbitrary value by the channel width to be enlarged and the angles 24a and 24b.
  • a plurality of particle recovery channels 102 may be provided directly downstream of the constriction channel 16 without using an enlarged channel.
  • the cross-sectional area of the aperture is such that the particle detector 103a detects the small particle, the particle detector 103c detects the medium particle, and the particle detector 103b detects the large particle. Is preferably set.
  • the particle detection unit 103 closer to the narrow channel wall surface 16a can detect smaller particles.
  • the particle detector 103a has a diameter of 0.1 to 0.00 mm.
  • the detection unit 103c has an aperture cross-sectional area of 2 ⁇ m ⁇ 2 (a rectangular shape with a width of 2 ⁇ m and a height of 1 ⁇ m, or a circular shape with a radius of 0.8 ⁇ m) in order to detect particles having a diameter of 0.2 to 0.8 ⁇ m.
  • the particle detector 103b has an aperture cross-sectional area of 14 ⁇ m ⁇ 2 (rectangular shape having a width of 3.5 ⁇ m and a height of 4 ⁇ m, or a radius 2.1 ⁇ m circular shape) may be installed .
  • the flow rate set by the liquid feeding unit is preferably set between 0.1 ⁇ L / hour and 1 mL / hour, and includes particles.
  • the flow rate of the non-fluid 100N is more than twice that of the fluid 100P containing particles. How many times the flow rate of the fluid 100N not containing particles is preferably larger than that of the fluid 100P containing particles depends on the channel width of the narrowed channel 16 and the diameter of the particles to be separated.
  • the flow rate of the fluid 100N not containing particles is preferably three times or more that of the fluid 100P containing particles, and separation is desired.
  • the particle diameter is 1/10 of the channel width of the constricted channel 16
  • the flow rate of the fluid 100N not containing particles is 9 times or more than the flow rate of the fluid 100P containing particles. That is, when the flow path width of the narrowed flow path 16 is N times the diameter of the particles to be separated based on the PFF principle, the flow rate of the fluid 100N that does not include particles is higher than that of the fluid 100P that includes particles. N-1 times or more is preferable. With the flow ratio, the particles to be separated slide on the wall surface 16a of the constricted flow path, so that particle separation based on the PFF principle is possible.
  • a flow path using the principle of PFF is used in the particle separation flow path 110, it is not necessary to slide all particles contained in the fluid 100P containing particles to the narrow flow path wall surface 16a, and relatively large particles. Only particles having a diameter may be slid to the narrow channel wall 16a.
  • a particle having a particle size equal to or smaller than the maximum particle size that can be detected by the particle detection unit 103a that detects a small particle size is supplied to the narrow channel wall surface 16a.
  • the particle detector 103a can create the distribution based on the ESZ principle. That is, even if there are particles that could not be separated by PFF, the particle size distribution can be created by the particle detector, so that an excellent effect that ESZ complements the separation ability of PFF can be obtained.
  • the enlarged flow path 17 in the PFF also plays the role of the particle diffusion flow path 110B described above, an excellent effect of promoting the separation of small particle diameter particles having a large diffusion distance per unit time can be obtained.
  • the small particle size flows into the particle detection unit 103c and also flows into the particle detection unit 102b in some cases, the small particle size particle flowing into the particle detection unit 103a includes a particle sample. It becomes a part of the fluid 100P. If the length of the enlarged flow path 17 serving as the particle diffusion flow path 110B is a distance sufficient for the small particle size to diffuse, the inflow amount thereof is the particle recovery flow path 102a and the flow path downstream thereof.
  • the “distance sufficient for the small particle size to diffuse” in the length of the enlarged flow path 17 is the sum of the flow rate of the fluid 100N not containing particles and the flow rate of the fluid 100P containing particles is 0.1 ⁇ L. If it is in the range of 1 hour / hour to 1 mL / hour, it is preferably 1 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more.
  • any flow distribution ratio can be achieved by considering the entire flow channel network as an analogy of the resistor circuit and making an appropriate design, so that It is desirable to make a design based on this idea.
  • the drain flow path 22 is designed in a part of the enlarged flow path 17 so that most of the fluid flows, and a drain outlet 23 is provided. May be.
  • the target object may be collected from the outlet 15 or an arbitrary outlet of a plurality of outlets such as the outlets 15a, 15b, and 15c of FIG.
  • the number of outlets 15 is set to an arbitrary number according to the purpose. It is preferable to set at least 2 or more.
  • the detection line 20 may be used for detection using a fluorescence or bright field image detection system. The number may be one.
  • FIG. 32 shows a microchip 10 equipped with an embodiment of a continuous classification method according to the present invention.
  • FIG. 32 (a) is a view as seen from an arrow A in FIG. 32 (b)
  • FIG. FIG. 33 is a cross-sectional view taken along line BB in FIG.
  • the flow path 13 of the microchip 10 in FIG. 32 has a rectangular cross-sectional shape at any point, and the flow path depth is uniform.
  • the cross-sectional shape is preferably rectangular in order to separate the particles according to their size in the cross-section, and from the viewpoint of ease of production of the flow channel structure.
  • the cross-sectional shape may be circular, elliptical, polygonal, etc.
  • a cross section may be sufficient and shapes other than a rectangle may be sufficient as it.
  • the wall surface on which the particles flow is preferably a flat surface.
  • the depth of the flow channel structure is preferably constant from the standpoint of ease of production, but the depth may be partially different.
  • the microchip 10 including the embodiment of the particle detection device according to the present invention was manufactured using general photolithography and soft lithography techniques. The specific procedure is as follows.
  • Photoresist SU-8 3005 (Microchem) was dropped onto a 4-inch bare silicon wafer (Filtec Co., Ltd.), and a photoresist thin film was formed using a spin coater (MIKASA). At this time, the diluent Cyclopentanone (Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was added to SU-8 3005 according to the target film thickness. Subsequently, a flow path pattern is formed on the photoresist film using a mask aligner (USHIO Inc.) and a chrome mask having an arbitrary pattern, and the flow path pattern is developed using SU-8 Developer (Microchem). As a result, a template for the flow channel to be used was prepared.
  • MIKASA spin coater
  • uncured LSR7070FC Momentive Performance
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the cured PDMS was carefully peeled off from the mold, formed into an arbitrary size with a cutter, and then a flow channel inlet and outlet were formed using a puncher.
  • the peeled PDMS and slide glass were subjected to surface treatment with an oxygen plasma generator (Meiwa Forsys Co., Ltd.), and then the PDMS and slide glass were bonded to produce a microchip 10.
  • Electrical detection example Electrical detection of particles by ESZ
  • the produced microchip 10 was placed on a substrate, and electrodes were connected to a plurality of particle detectors 103 in the microchip 10.
  • the electrode is composed of a pair of platinum wires, and one electrode is connected to a programmable current amplifier CA5350 (NF circuit company) via a conductive wire, connected to a PC via an AD converter, and transmitted digital signals are transmitted. Analyzed by LabView.
  • the other electrode connected to the particle detector 103 was connected to a 9V dry battery via a lead wire.
  • Each inlet was connected to a pressure pump P-PumpBasic (Dolomite) via a Teflon tube and fed at a constant flow rate.
  • P-PumpBasic Dolomite
  • Sample preparation example When using standard particles When using standard particles as particles in the fluid 100P containing particles to be separated, Standard polystyrene particles 3100A (manufactured by ThermoFisher) as 0.1 ⁇ m particles Standard polystyrene particles 3200A (manufactured by ThermoFisher) as 0.2 ⁇ m particles Polystyrene standard particles 3500A (manufactured by ThermoFisher) as 0.5 ⁇ m particles Polystyrene standard particles 4009A (manufactured by ThermoFisher) as 1.0 ⁇ m particles Polystyrene standard particle 4202A (manufactured by ThermoFisher) as 2.0 ⁇ m particles Was used.
  • Standard polystyrene particles 3100A manufactured by ThermoFisher
  • Standard polystyrene particles 3200A manufactured by ThermoFisher
  • Polystyrene standard particles 3500A manufactured by Therm
  • a 1 ⁇ PBS solution (phosphate buffer) containing 0.05% (v / v) Tween 20 was used as the fluid 100P containing particles to be separated.
  • the 1 ⁇ PBS solution containing 0.05% (v / v) Tween 20 was used after removing foreign substances using a syringe filter (manufactured by Merck Millipore) having a pore size of 0.1 ⁇ m before the experiment.
  • Particle separation detection Example 1 After particle separation by AsPFF, 0.1, 0.2, by a particle detection device that performs particle detection by three particle recovery channels and two particle detectors installed in each particle recovery channel Detection of 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m standard particle mixed sample
  • the microchip 10 shown in FIG. 16 is manufactured based on the above-described manufacturing example as a particle detection channel, and based on the above-described sample preparation example.
  • the concentration of the entire polystyrene particles contained in the sample was adjusted to 25 ⁇ g / mL.
  • the height of the flow path 13 is 4.5 ⁇ m except for the particle detection unit 103 a and the particle detection unit 103 c, and penetrates the upper surface of the substrate 11 at the end of the flow path 13.
  • Inlets 14a and 14b and outlets 104a, 104a ′, 104b, 104b ′, 104c, 104c ′, and 23 (each having a hole diameter of 2 mm) were provided.
  • the channel 13 includes a branch channel 18a (width 20 ⁇ m, length 1.5 mm), a branch channel 18b (width 40 ⁇ m, length 500 ⁇ m), a narrow channel 16 (width 6 ⁇ m, length 20 ⁇ m), an expanded channel. 17 (enlargement angle 135 degrees, maximum expansion channel width 600 ⁇ m, length 0.5 mm), drain channel 22 (width 500 ⁇ m, length 1.7 mm), particle recovery channel 102a (width 75 ⁇ m, length 4 mm), The particle recovery channel 102c (width 140 ⁇ m, length 7.5 mm) and the particle recovery channel 102b (width 512 ⁇ m, length 3.75 mm) were used.
  • the two apertures of the particle detector 102a are both 1 ⁇ m wide, 0.4 ⁇ m high, and 10 ⁇ m long, and the two apertures of the particle detector 102c are both 2 ⁇ m wide, 0.8 ⁇ m high, and long.
  • Each of the two apertures of the particle detection unit 102b had a width of 3.5 ⁇ m, a height of 4.5 ⁇ m, and a length of 20 ⁇ m.
  • the shape of each particle detection unit is the same as in FIG. 15, and the k value calculated in Equation (1) is 2 based on the aperture resistance and the resistance ratio of the flow path from the aperture to the outlet where the electrode is inserted. .6.
  • the prepared particle suspension is fed to the inlet 14a at a flow rate of 2.5 ⁇ L / hour, and 1 ⁇ PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20 is fed to the inlet 14b.
  • the liquid was fed at a flow rate of 10 ⁇ L / hour.
  • the particles flowing into the three particle recovery channels 102 were detected for 1 minute based on the above-described electricity detection example.
  • FIG. 17 shows a part of the measurement of the current value change of the particle detection unit 103a of the particle recovery channel 102a at this time, and the measurement of the current value change of the particle detection unit 103c of the particle recovery channel 102c. A part of it is shown in FIG.
  • the particle detection unit 103a has 0.1, 0.2 ⁇ m standard particles
  • the particle detection unit 103c has 0.2, 0.5 ⁇ m standard particles
  • the particle detection unit 103b has 1.0, A change in current value of 2.0 ⁇ m standard particles was confirmed.
  • the concentration of the 0.1 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 5.41 ⁇ g / mL
  • the concentration of the 0.2 ⁇ m standard particles is 3.52 ⁇ g / mL
  • the concentration of the 0.5 ⁇ m standard particles is 6.29 ⁇ g / mL
  • the concentration of 1.0 ⁇ m standard particles was 5.02 ⁇ g / mL
  • the concentration of 2.0 ⁇ m standard particles was 5.92 ⁇ g / mL.
  • the average particle size of the 0.1 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 0.107 ⁇ m
  • the average particle size of the 0.2 ⁇ m standard particles is 0.192 ⁇ m
  • the average particle size of the 0.5 ⁇ m standard particles The diameter was 0.52 ⁇ m
  • the average particle size of 1.0 ⁇ m standard particles was 0.98 ⁇ m
  • the average particle size of 2.0 ⁇ m standard particles was 2.05 ⁇ m. From the above, the present invention can be used to accurately detect even a sample having a wide distribution of 0.1 to 2 ⁇ m using a plurality of apertures having different cross-sectional areas, that is, a particle detector 103 having a plurality of detectable particle diameter ranges. It was confirmed that accurate particle size measurement was possible.
  • Comparative Example 1 Detection of 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m standard particle mixed samples using a particle detector by laser diffraction scattering method (LD) In the same manner as in Example 1.
  • Mixed particle samples were prepared and measured by AggregatesSize (Shimadzu Corporation). As shown in FIG. 21 showing the measurement results, the 0.2 and 2 ⁇ m peaks disappeared and the 0.1 ⁇ m peak increased, and it was confirmed that accurate measurement with a mixed particle sample was difficult.
  • Example 2 Example of detection of antibody aggregate sample by particle detection apparatus that detects particles by three particle recovery channels and two particle detectors installed in each particle recovery channel after particle separation by AsPFF Using the same microchip 10 as 1, antibody aggregates prepared based on the sample preparation examples were measured in the same manner. As shown in FIG. 22 showing the measurement results, it was confirmed that the antibody aggregates can also be measured.
  • Example 3 After particle separation by HDF, 0.1, 0.5, and 3 by a particle detection device that performs particle detection by three particle recovery channels and two particle detectors installed in each particle recovery channel Detection of 2.0 ⁇ m standard particle mixed sample
  • the microchip 10 shown in FIG. 23 was prepared based on the above-described manufacturing example as a particle detection channel, and prepared based on the above-described sample preparation example.
  • 0.1, 0.5, and 2.0 ⁇ m standard particles were prepared with a 1 ⁇ PBS solution containing 0.05% (v / v) Tween 20 to a concentration of 5 ⁇ g / mL. Therefore, the concentration of the entire polystyrene particles contained in the sample was adjusted to 15 ⁇ g / mL.
  • the height of the flow path 13 is 4.0 ⁇ m except for the particle detection section 103 a and the particle detection section 103 c, and penetrates the upper surface of the substrate 11 at the end of the flow path 13.
  • An inlet 14a and outlets 104a, 104a ′, 104b, 104b ′, 104c, 104c ′, and 23 (each having a hole diameter of 2 mm) were provided.
  • the flow path 13 includes a particle introduction flow path 101 (width 20 ⁇ m, length 1.5 mm), a narrow flow path 16 (width 6 ⁇ m, length 20 ⁇ m), an expansion flow path 17 (expansion angle 135 degrees, maximum expansion flow path width).
  • the two apertures of the particle detector 102a are both 1 ⁇ m wide, 0.4 ⁇ m high, and 5 ⁇ m long, and the two apertures of the particle detector 102c are both 3 ⁇ m wide, 1.2 ⁇ m high, and long.
  • Each of the two apertures of the particle detection unit 102b has a width of 3.5 ⁇ m, a height of 4.0 ⁇ m, and a length of 20 ⁇ m.
  • the shape of each particle detection unit is the same as in FIG. 15, and the k value calculated in Equation (1) is 3 from the aperture resistance and the resistance ratio of the flow path from the aperture to the outlet where the electrode is inserted. .0.
  • the prepared particle suspension is fed to the inlet 14a at a flow rate of 2.5 ⁇ L / hour, and 1 ⁇ PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20 is fed to the inlet 14b.
  • the solution was fed at a flow rate of 4 ⁇ L / hour.
  • the particles flowing into the three particle recovery channels 102 were detected for 1 minute based on the above-described electricity detection example.
  • the state of measurement of the current value change of the particle detection unit 103a of the particle recovery channel 102a 0.1 ⁇ m standard particles are confirmed as in FIG. 17, and the current value of the particle detection unit 103c of the particle recovery channel 102c is confirmed.
  • 0.5 ⁇ m standard particles are confirmed as in FIG. 18, and the state of the measurement of the current value change in the particle detection unit 103b of the particle recovery channel 102b is the same as in FIG. confirmed.
  • the concentration of the 0.1 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 4.41 ⁇ g / mL
  • the concentration of the 0.5 ⁇ m standard particles is 3.66 ⁇ g / mL
  • the concentration of the 2.0 ⁇ m standard particles is 6.08 ⁇ g / mL.
  • the average particle size of the 0.1 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 0.112 ⁇ m
  • the average particle size of the 0.5 ⁇ m standard particles is 0.470 ⁇ m
  • the average particle size of the 2.0 ⁇ m standard particles The diameter was 2.09 ⁇ m.
  • the present invention can be used to accurately detect even a sample having a wide distribution of 0.1 to 2 ⁇ m using a plurality of apertures having different cross-sectional areas, that is, a particle detector 103 having a plurality of detectable particle diameter ranges. It was confirmed that accurate particle size measurement was possible.
  • Particle detection Example 4 Detection of 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m standard particle mixed sample by particle detection unit
  • the particle detection units 103a and 103b of the microchip 10 shown in FIG. 1 are configured as shown in FIG. It produced based on the above-mentioned manufacture example.
  • the sample was prepared based on the above-mentioned sample preparation example.
  • 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m standard particles were prepared with a 1 ⁇ PBS solution containing 0.05% (v / v) Tween 20 to a concentration of 5 ⁇ g / mL. Therefore, the concentration of the entire polystyrene particles contained in the sample was adjusted to 15 ⁇ g / mL.
  • each flow path of the microchip 10 is set to 4.5 ⁇ m, and the inlet 14a penetrating the upper surface of the substrate 11 and the fluid discharge ports 104a and 104b (respectively holes 2 mm in diameter).
  • the two apertures of the particle detector 102 are both 3.5 ⁇ m wide and 20 ⁇ m long.
  • the k value calculated in the equation (1) is 2.6 based on the aperture resistance and the resistance ratio of the flow path from the aperture to the outlet where the electrode is inserted.
  • a syringe pump (KDS) was connected to the inlet 14a, and electrical detection was performed as described above except that the solution was fed at a constant flow rate.
  • FIG. 28 shows a part of the measurement of the current value change of the particle detector 103 at this time. As shown in FIG. 28, changes in current values of 0.5, 1.0, and 2.0 ⁇ m standard particles were confirmed. In addition, the measurement results are summarized in a histogram as shown in FIG. 29, and it was confirmed that peaks were separated even with mixed particles.
  • the concentration of 0.5 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 5.24 ⁇ g / mL, the concentration of 1.0 ⁇ m standard particles is 4.38 ⁇ g / mL, and the concentration of 2.0 ⁇ m standard particles is 7.86 ⁇ g / mL.
  • the average particle size of 0.5 ⁇ m standard particles obtained from the measurement results is 0.511 ⁇ m, the average particle size of 1.0 ⁇ m standard particles is 0.991 ⁇ m, and the average particle size of 2.0 ⁇ m standard particles The diameter was 2.145 ⁇ m. From the above, it was confirmed that accurate particle diameter measurement was possible using the present invention without patterning the electrodes in the flow path.
  • the microchip 10 was produced using LSR7070 (Momentive, hardness 70).
  • the microchip 10 has a flat structure formed by two flat substrates 11 and 12.
  • a flow path 13 is formed on the lower surface 11a of the substrate 11.
  • the inlet-side ports 14a and 14b, the outlet 15 (each having a hole diameter of 2 mm), the entire length of the flow path 13, that is, the inlets 14a and 14b The length from one end to the other end with the outlet 15 is 19 mm.
  • the depths from the flow path 18 to the flow path 17 are all 20 ⁇ m, the branch flow paths 18a and 18b (width 100 ⁇ m, length 800 ⁇ m), the narrow flow path 16 (width 20 ⁇ m, length 50 ⁇ m), the enlarged flow path 17 (width 500 ⁇ m, A flow path having a length of 10 mm) was produced.
  • the fluid 100P containing particles was diluted to 1 ⁇ g / mL of fluorescent polystyrene-divinylbenzene particles having a diameter of 2 ⁇ m (Fluoro-Max; manufactured by Thermo Scientific) using a 0.5 wt% Tween 80 aqueous solution.
  • FIG. 31 (a) shows a graph showing the measurement results.
  • the horizontal axis is the passing coordinates on the detection line 20, and the vertical axis is the count number for each coordinate. It can be seen that the particle distribution is narrower and the separation accuracy is higher than in Comparative Example 2.
  • Example 6 Durometer hardness 60 Particle separation evaluation was performed in the same manner as in Example 5 except that the material used for the production of the microchip 10 was changed to LSR7060 (manufactured by MOMENTIVE, hardness 60).
  • FIG. 31B shows a graph showing the measurement results. It can be seen that the particle distribution is narrower and the separation accuracy is higher than in Comparative Example 2.
  • Example 7 Durometer hardness 44 Separation evaluation of particles was performed in the same manner as in Example 5 except that the material used for the production of the microchip 10 was changed to SILPOT184 (manufactured by TORAY, hardness 44).
  • FIG. 31C shows a graph showing the measurement results. It can be seen that the particle distribution is narrower and the separation accuracy is higher than in Comparative Example 2.
  • Comparative Example 2 Durometer hardness 30 Particle separation was evaluated in the same manner as in Example 5 except that the material used to produce the microchip 10 was changed to LSR7030 (MOMENTIVE, hardness 30).
  • FIG. 31 (d) shows a graph showing the measurement results. Compared to Example 5, it can be seen that the particle distribution is wide and the separation accuracy is low. Using the material having a hardness of 40 or more with the above results, the separation accuracy can be increased.
  • Particle Separation Observation Example Separation of Particles and Acquisition of Fluorescence Image Instead of LSR7070FC (Momentive Performance), uncured siloxane monomer and polymerization initiator prepared using SYLGARD SILICONE ELASTOMER KIT (Toray Dow Corning) Separation was verified using particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m using the mixture (weight ratio 10: 1) and the other using a microchip prepared according to the procedure described in the production example.
  • fluorescent polystyrene beads Fluoresbrite DG (manufactured by Polyscience; absorption maximum wavelength 480 nm, fluorescence maximum wavelength; 520 nm) and 0.5 ⁇ m particles as fluorescent polystyrene beads Fluoresbrite BB (manufactured by Polyscience; absorption maximum wavelength 360 nm, fluorescence maximum wavelength; 407 nm).
  • fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m are 3.3 ng / mL
  • a 0.05% (v / v) Tween 20 aqueous solution was used as the fluid 100N containing no particles to be separated.
  • the 0.05% (v / v) Tween 20 aqueous solution used was used after removing foreign matters using a syringe filter (manufactured by Merck Millipore) having a pore size of 0.45 ⁇ m before the experiment.
  • the flow rate was adjusted by a syringe pump (KDS Scientific), and the fluid 100P was fed from the inlet 14a and the fluid 100N was fed from the inlet 14b at a flow rate of 5, 90 ⁇ L / h, respectively.
  • each flow rate employ
  • Each fluid was introduced into the microchip 10, and while being introduced, fluorescence images were separately acquired with light of corresponding wavelengths. Fluorescent images are taken using an inverted microscope IX71 (Olympus) to irradiate the observation area with a predetermined excitation light with a mercury lamp, and the digital CMOS camera ORCA-FLASH (Hamamatsu Photonics) takes an image acquisition area 30 for 2 seconds. Acquired by doing. After creating fluorescence images with 0.2 ⁇ m particles and 0.5 ⁇ m particles, the fluorescence profile of the detection line 20 was analyzed.
  • the horizontal axis of the fluorescence profile is the coordinate on the detection line 20, and the vertical axis indicates the relative fluorescence brightness for each coordinate.
  • the detection line 20 was set at a point 200 ⁇ m downstream from the branch point 31 in the direction of the outlet 15, and the coordinate 0 was the enlarged region wall surface 17 a side. Further, the image acquisition area 30 was set so that the detection line 20 fits within the acquired image.
  • FIGS. 32 (a) to 32 (c) The microchip 10 shown in FIGS. 32 (a) to 32 (c) was prepared as a particle separation device based on the above-described manufacturing example.
  • FIG. 32A is a top view of the microchip 10 and is a view taken along arrow A in FIG.
  • FIG. 32B is a cross-sectional view taken along line BB in FIG. 32A
  • FIG. 32C is an enlarged view of the region 21 in FIG.
  • the lower surface 11a of the substrate 11 was processed so as to form the flow path 13 when the substrate 12 was overlaid.
  • the depth of the flow path 13 was all 3.5 ⁇ m.
  • Inlets 14a and 14b and outlets 15 and 23 (each having a hole diameter of 1.5 mm) penetrating the upper surface of the substrate 11 were provided at the end of the flow path 13.
  • the flow channel 13 includes a branch flow channel 18a (width 20 ⁇ m, length 1.5 mm), a branch flow channel 18b (width 40 ⁇ m, length 500 ⁇ m), a constricted flow channel 16 (width 3.3 ⁇ m, length 20 ⁇ m), enlarged. It consisted of a channel 17 (width 215 ⁇ m, length 6.15 mm) and a drain channel 22 (width 300 ⁇ m, length 1.3 mm).
  • FIGS. 32A to 32C an integrated image of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m was obtained according to the separation observation example (FIG. 32).
  • FIGS. 32 (f) and 32 (g) show graphs showing fluorescence profiles in the detection line 20 of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m, respectively. From these results, it was confirmed that particles having diameters of 0.2 and 0.5 ⁇ m were almost completely separated.
  • Comparative Example 3 The flow path width expands stepwise toward the wall surface 16a where the particles flow, the flow path width expands stepwise toward the wall surface 16b where the particles do not flow, and the expanded flow Particle Separation Device with Drain Flow Path Arranged at Expansion Start Point 19 of Channel 17
  • the microchip 10 shown in FIGS. 33 (a) to 33 (c) was produced as a particle separation device based on the above-described manufacturing example. Compared with the microchip 10 of Example 8, the angles 24a and 24b between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17 are 90 °, and the width from the narrowed channel wall surface 16a to the enlarged channel wall surface 17a is 50 ⁇ m.
  • the sample was designed so that only the point was different from that of Example 8, and the flow conditions of the sample liquid and the sheath liquid were set to 5 and 80 ⁇ L / h, respectively. Verification of separation of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m was performed. In addition, as in Example 8, each flow rate employs conditions under which the separation of the two particles is the best, and is used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 33 (d) and 33 (e) The integrated images of the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are shown in FIGS. 33 (d) and 33 (e), respectively, and the fluorescence of the detection line 20 of the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • Graphs showing the profiles are shown in FIGS. 33 (f) and 33 (g), respectively. From these results, it can be seen that the separation of particles having diameters of 0.2 and 0.5 ⁇ m in this comparative example is partially inferior to that of Example 8 because of partial overlap.
  • Comparative Example 4 Wall surface in which the flow channel width expands stepwise toward the wall surface 16a side where the particles flow, and the drain flow channel 22 is arranged at the expansion start point 19 of the expanded flow channel 17 so that the particles do not flow.
  • Particle Separation Device whose Channel Width does not Enlarge toward the 16b Side
  • the microchip 10 shown in FIGS. 34 (a) to 34 (c) was produced as a particle separation device based on the above-described manufacturing example.
  • the microchip 10 is the same as that of the eighth embodiment except that the angle 24a between the narrowed flow channel 16 and the enlarged flow channel 17 is designed to be 90 ° and 24b is 180 °.
  • Fluorescent polystyrene particles having the same diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m under the same experimental conditions as in Example 8 except that the flow rate conditions of the sample liquid and the sheath liquid were set to 5 and 80 ⁇ L / h, respectively. Verification of separation was performed.
  • each flow rate employs conditions under which the separation of the two particles is the best, and is used for the evaluation of the separation.
  • the angle 24a is 90 ° and 24b is 180 °, a channel structure in which the enlarged channel 17 is positioned in a direction perpendicular to the narrowed channel and the drain channel 22 is positioned in a direction parallel to the narrowed channel.
  • the microchip 10 having the same was used.
  • this comparative example compares the structure of the connection part of the narrowed flow path 16 and the enlarged flow path 17 of Example 8 upside down.
  • the enlarged flow channel 17 is arranged in a direction parallel to the narrowed flow channel 22, that is, in the same direction as that of the eighth embodiment, and the drain flow channel 22 is arranged in a vertical direction and vertically inverted from that of the eighth embodiment.
  • the flow channel structure shown in FIGS. 34 (a) to (c) was used.
  • FIGS. 34 (d) and 34 (e) The integrated images of the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are shown in FIGS. 34 (d) and 34 (e), respectively, and the fluorescence of the detection line 20 for the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • Graphs showing the profiles are shown in FIG. 34 (f) and FIG. 34 (g), respectively. From these results, the separation of 0.2 and 0.5 ⁇ m diameter particles in this comparative example was partially overlapped, and the performance was greatly inferior to that of Example 8 and inferior to that of Comparative Example 3. You can see that
  • Example 9 The flow path width does not increase toward the wall surface 16a side where the particles flow, the flow path width gradually increases toward the wall surface 16b side where the particles do not flow, and the expansion flow path 17 Particle Separation Device with Drain Channel 22 Arranged at the End of Expansion
  • the microchip 10 shown in FIGS. 35 (a) to (c) was produced as a particle separation device based on the above-described manufacturing example.
  • the angle 24a between the constricted flow channel 16 and the enlarged flow channel 17 is 180 °
  • 24b is 135 °
  • the length of the slope portion 40 in the enlarged region is 1 / ⁇ 2 mm.
  • the microchip 10 having the same structure as that of Example 9 is used except that the length of the drain channel is set to 500 ⁇ m so that the ratio of the fluid flowing to the outlets 15 and 23 is equivalent to that of Example 8. Verification of separation of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m in the same experimental conditions as in Example 8 except that the flow rate conditions of the liquid and the sheath liquid are set to 3 and 90 ⁇ L / h, respectively. Went.
  • each flow rate employs conditions under which the separation of the two particles is the best, and is used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 35 (d) and 35 (e) The integrated images of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are shown in FIGS. 35 (d) and 35 (e), respectively, and the fluorescence of the detection line 20 for fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m is shown.
  • Graphs showing the profiles are shown in FIGS. 35 (f) and 35 (g), respectively. From these results, it can be seen that separation of particles having diameters of 0.2 and 0.5 ⁇ m in this example can be confirmed as complete separation, and the separation performance is superior to that of Example 8.
  • Comparative Example 5 The flow path width gradually increases toward the wall surface 16a where the particles flow, and the drain flow path 22 is disposed at the expansion end point of the expanded flow path 17 so that the particles do not flow.
  • the particle separation device in which the flow path width does not increase toward the surface the microchip 10 shown in FIGS. 36A to 36C was manufactured as a particle separation device based on the above-described manufacturing example.
  • the microchip 10 is the same as that of the ninth embodiment except that the angle 24a between the constricted flow channel 16 and the enlarged flow channel 17 is designed to be 135 ° and 24b is 180 °.
  • Fluorescent polystyrene particles having the same diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m under the same experimental conditions as in Example 10 except that the flow rate conditions of the sample liquid and the sheath liquid were set to 3, 95 ⁇ L / h, respectively. Verification of separation was performed. In addition, as in Example 9, each flow rate adopted conditions under which the separation of the two particles was the best, and was used for the evaluation of the separation. Further, since the angle 24a is set to 135 ° and 24b is set to 180 °, the enlarged flow channel 17 is positioned in a direction perpendicular to the narrowed flow channel 16, and the drain flow channel 22 is positioned in a direction parallel to the narrowed flow channel 16.
  • a microchip 10 having a structure was used. That is, this comparative example compares the structure of the connection portion of the narrowed flow path 16 and the enlarged flow path 17 of Example 9 upside down.
  • the enlarged flow channel 17 is arranged in a direction parallel to the constricted flow channel 22, that is, in the same direction as that of the ninth embodiment, and the drain flow channel 22 is arranged in a vertical direction and vertically inverted from that of the eighth embodiment.
  • the above-described channel structure particles flow into the drain channel 22 through which most of the fluid flows. That is, in the case of this arrangement, the effect of improving the separation performance by the drain flow path 22 could not be obtained. Therefore, in order to obtain a flow path structure having the same particle separation ability as in Example 9, the flow path structure shown in FIGS.
  • FIGS. 36 (d) and 36 (e) The integrated images of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are shown in FIGS. 36 (d) and 36 (e), respectively, and the fluorescence of the detection line 20 for fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • Graphs showing profiles are shown in FIGS. 36 (f) and 36 (g), respectively. From these results, it can be confirmed that the separation of 0.2 and 0.5 ⁇ m diameter particles in this comparative example is incomplete, and the separation performance is inferior to that of Example 9.
  • Example 10 Particle separation device having concave portions in the slope portion 40 of the particle separation device of Example 9
  • the microchip 10 shown in FIGS. 37 (a) to (d) is used as the particle separation device in the above-described production example. Based on this.
  • the microchip 10 has substantially the same structure as that of the eighth embodiment, but FIG. 37 (d) shows an enlarged view of a connecting portion between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17 in a part of the slope portion 40 in the enlarged region. ),
  • the microchip 10 having a partial recess composed of channel wall surfaces 41a and 41b (both having a length of 50 ⁇ m) between the sheath liquid side constricted channel wall surface 16b and the slope portion 40 is used.
  • Example 9 The other experimental conditions were set to be the same as those in Example 10, and the separation of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m was verified.
  • each flow rate adopted conditions under which the separation of the two particles was the best, and was used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 37 (e) and 37 (f) The integrated images of the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are shown in FIGS. 37 (e) and 37 (f), respectively, and the fluorescence of the detection line 20 for the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • Graphs showing profiles are shown in FIGS. 37 (g) and 37 (h), respectively. From these results, it can be seen that separation of particles having diameters of 0.2 and 0.5 ⁇ m in this comparative example can be confirmed as complete separation, and the separation performance is almost the same as that of Example 9.
  • the angle 24b between the narrowed channel wall surface 16b and the enlarged channel wall surface 17b on the sheath liquid side is preferably larger than 90 °, but even at an angle of 90 ° or less. Even if it is a partial recess structure and the recess structure is smaller than the width of the enlarged flow path or the drain flow path, from the viewpoint of particle separation by PFF, It can be considered that the fluid flow is almost equivalent to the case where only the slope portion 40 exists on the downstream side of the narrowed channel wall surface 16b on the sheath liquid side, and equivalent separation performance can be exhibited.
  • Example 11 The width of the narrowing channel 16 of the particle separation device 16 in which the width of the narrowing channel and the depth of the channel 13 of the particle separation device of Example 9 were changed was changed to 2 ⁇ m, and the depth of the channel 13 was changed to 2 ⁇ m. Except for the above, a microchip 10 having the same structure was manufactured as a particle separator based on the above-described manufacturing example. Using this microchip 10, the separation of 0.1 and 0.2 ⁇ m particles was verified.
  • 0.2 ⁇ m diameter fluorescent polystyrene beads Fluoresbrite DG (manufactured by Polyscience; absorption maximum wavelength 480 nm, fluorescent maximum wavelength; 520 nm) and 0.1 ⁇ m diameter fluorescent polystyrene beads Fluoresbrite BB (manufactured by Polyscience; absorption maximum wavelength) 360 nm, fluorescence maximum wavelength; 407 nm), 0.2 ⁇ m diameter fluorescent polystyrene particles were diluted to 3.3 ng / mL, and 0.1 ⁇ m diameter fluorescent polystyrene particles were diluted to 67 ng / mL and used in the experiment.
  • the flow rate conditions for the sample liquid and the sheath liquid were set to 0.5 and 75 ⁇ L / h, respectively.
  • each flow rate adopted conditions under which the separation of the most two particles was satisfactory, and was used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 38 (a) and 38 (b) Integral images of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.1 ⁇ m and a diameter of 0.2 ⁇ m are shown in FIGS. 38 (a) and 38 (b), respectively. Observe that particles having a diameter of 0.1 ⁇ m flow to the enlarged flow path 17 that flows to the outlet 15, and particles that have a diameter of 0.2 ⁇ m flow to the drain flow path 22 that flows to the outlet 23. It was confirmed that separation and collection were possible with the contents described.
  • Example 12 The enlarged flow passage wall surface 17a is reduced toward 17b, the flow passage width is increased stepwise toward the wall surface 16b side where particles do not flow, and the enlargement start point 19 of the enlarged flow passage 17 is reached.
  • Particle Separation Device with Drain Channel Arranged The microchip 10 shown in FIGS. 41 (a) to 41 (c) was produced as a particle separation device based on the above-described manufacturing example. Compared to the microchip 10 of the eighth embodiment, the microchip 10 is the same as that of the eighth embodiment except that the angle 24a between the narrowed flow path 16 and the enlarged flow path 17 is designed to be 210 ° and 24b is 90 °.
  • Example 8 The same experimental conditions as in Example 8 except that the pressure pump P-PumpBasic (Dolomite) was used as the liquid feed pump and the flow rate conditions of the sample liquid and the sheath liquid were set to 1090 and 1200 mbar, respectively.
  • each flow rate employs conditions under which the separation of the two particles is the best, and is used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 41 (d) and 41 (e) The integrated images of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m are respectively shown in FIGS. 41 (d) and 41 (e), and the fluorescence of the detection line 20 for the fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • the graphs showing the profiles are shown in FIGS. 41 (f) and 41 (g), respectively. From these results, it was confirmed that separation of particles having diameters of 0.2 and 0.5 ⁇ m in this comparative example was possible. From this result, it was suggested that it is preferable not to enlarge the enlarged flow path wall surface 17a.
  • Comparative Example 6 Particle separation device in which both the enlarged flow channel wall surfaces 17a and 17b are expanded and the drain flow channel 22 is disposed at the expansion end point of the expanded flow channel 17
  • the micro shown in FIGS. 42 (a) to (c) The chip 10 was produced based on the above-described manufacturing example as a particle separator. Compared with the microchip 10 of Example 8, the microchip 10 similar to that of Example 8 was used except that the angles 24a and 24b between the narrowed channel 16 and the enlarged channel 17 were designed to be 165 °.
  • each flow rate employs conditions under which the separation of the two particles is the best, and is used for the evaluation of the separation.
  • FIGS. 42D and 42E show integrated images of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m, respectively. Fluorescence of the detection line 20 of fluorescent polystyrene particles having a diameter of 0.2 ⁇ m and a diameter of 0.5 ⁇ m is shown in FIGS. The graphs showing the profiles are shown in FIGS. 42 (f) and 42 (g), respectively. From these results, it was confirmed that the separation of 0.2 ⁇ m diameter and 0.5 ⁇ m particles in this comparative example was incomplete. This result also suggests that it is preferable not to enlarge the enlarged flow path wall surface 17a.

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Abstract

本発明の課題は、広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供することにある。粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを含む粒子検出装置であって、前記粒子回収流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする粒子検出装置により課題が解決される。

Description

粒子検出装置及び粒子検出方法
　本発明は、粒子検出装置及び粒子検出方法に関する。
　無機物、有機物、金属などから構成された固形物を様々な産業分野に材料として適用する場合、例えば１次原料としては粉末での供給、また粉末を球状粒子に成形するか、他の形状に成形して製品として供給されている。これらの素材（固形物）は最終製品の性能を向上させるべく物性等を吟味して設計されている。また、最終製品として球状粒子が適用される例も数多く存在し、例えば粉砕用ボール（アルミナ、ジルコニア、シリカ等）、液晶用スペーサー（樹脂、シリカ等）、クロマトグラフィー用分離材、その他吸着剤などが挙げられる。このような粒子製品は一般的に形状、サイズ、密度が均一なものが最終形態としての製品の特徴に大きく影響し、より均一な粒子が求められているのが現状である。
　このような粒子の製造法としては、最初から均一な粒子を製造する技術を開発する方法と、均一ではない分布がある粒子から必要なサイズ、密度、形状のものを取り出す方法の２つが存在する。前者は比較的に新しい技術であり製造設備の更新が必要であるが、後者については現行設備に追加することが可能なため比較的容易に製造プロセスに取り込まれやすい。後者の技術として数十μｍ以上の粒子であれば、例えばフィルター分離法（篩分級も含む）、重力分級法、遠心分離法、サイクロン分離法、などが存在する。
　上記に挙げた分離、または分級法は数十μｍ以下の粒子、特に１０μｍ以下の粒子分離は極めて難しいこと、また一般的にはバッチ式のプロセスであり連続的に分離することが困難であった。バッチ式のプロセスでは分離収率により１回の処理量が決まるため比較的に大きな設備（元原料のストック容器、供給設備、不必要な製品の回収容器）が必要となる。例えば、篩分級法は大量処理に向いているが篩の目のサイズを徐々に変える必要があるため、バッチ式プロセスとなる。重力分級法も、基本的には篩分級法と同様バッチプロセスであり、粒子サイズが小さくなるにつれ処理するのに膨大な時間がかかる。遠心分離法やサイクロン分離法は高速処理に適するものの、大型装置が必要であり、連続プロセスには不向きである。
　しかし、連続的に分級ができれば元原料の仕込み量及び製造量を極限まで小さくすることが可能である。また、医療関係においても抗原抗体反応を用い検査する際に粒子に吸着した蛍光物質と反応していない成分を分離するためにＢ／Ｆ分離と呼ばれる工程が存在し、このような微少量の検体検査にも粒子分離が利用されている。しかしここで用いられている粒子分離の多くが磁性粒子を用いて磁石による粒子分離と洗浄を行うため、本工程分の時間がかかる課題が存在している。
　また、更に微細な粒子（ＤＮＡ、ワクチン等）を分離する技術としてはブラウニアラチェットという微細加工した鈎状の突起を規則的にならべ粒子のブラウン振動を使って主流となる流動軌跡から目的のサイズのＤＮＡあるいはワクチンを分流（分離）するという技術も存在する（非特許文献１）。ただしこの方法は、分離モードとしてブラウン振動による分流形成であるため、分離速度が遅く、主となる流動形成は電気泳動という形態で実施されており、分離に時間がかかること、特に径１μｍ以上の粒子に対しては分離に長大な時間を要し、その間の乱れの影響を受けることなどにより、実用に耐えないことが課題として存在した。
　また細胞を大きさに基づいて分離又は分級する方法としては、ＦＡＣＳを用いて前方散乱光を測定することにより細胞の大きさを測定し分離する方法が知られている。ＦＡＣＳは大量の微粒子や細胞から大まかに目的物を分離することが可能であるが、細胞の形状や屈折率の影響のため少量を正確に分離することは困難であり、また衝撃に弱い目的物は分離時に破壊される可能性がある。
　様々な大きさを有する粒子の中から特定の大きさの粒子を分離する技術及び装置が存在しており、例えば篩分級法、重力分級法、遠心分離法、電気泳動法などが挙げられるが、それぞれバッチ式処理には適しているものの、連続的な分離処理には不向きであった。
　一方近年、微細加工技術を用いて作製された、幅が数ミクロン～数百ミクロンの微小な流路構造（マイクロ流路）を用いることで、微粒子や細胞を正確に分離する研究が報告されている（非特許文献２乃至４）。一般的にマイクロ流路内では安定な層流が形成され、その流れのプロファイルをマイクロメートルオーダーで任意に制御できるため、そのような特徴を利用することで微粒子や細胞を正確に、かつ連続的に分離できる。
　例えば特許文献１に、大きさによって正確かつ連続的に細胞・微粒子を分離するピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ　Ｆｌｏｗ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（以下ＰＦＦと記載）という手法が報告されている。この手法の利点としては、前記ＦＡＣＳで必要となる光学系・情報処理系などの複雑な機器・装置を必要とせず、連続的な微粒子、細胞分離を容易に可能とする点、一つの要因を利用した分離ではあるものの複数のフラクションへの分離が可能である、つまり、たとえば大きさで分離する場合、大きいものと小さいものという２段階だけではなく、大きさによる３グループ以上の集団へと分離することができる点、さらに、流路の並列化などを行うことで、大量・高速な微粒子や細胞の分離が可能である点などがあげられる。
　ＰＦＦでは、径が部分的に細くなっている流路（以下狭窄流路と記載）に複数の分岐から流体を導入し、流れに垂直な方向における粒子の位置を制御し、その後相対的に径が太い流路（以下拡大流路と記載）に粒子が流れる際、狭窄流路内における粒子の位置によって流れが粒子に与える力の方向が異なることに着目してなされたものであり、連続的にかつ精密に分離が可能な技術である。ＰＦＦでは、特許文献１に記載のように、２つのインレットを持つ構造を用いることができ、例えば一方のインレットから目的の粒子を含む液、他方のインレットから目的の粒子を含まない液を流すことで実施することができる。
　ＰＦＦにおいて、より精度よく分離するためには、狭窄流路の壁面へ粒子を整列させることが重要であり、そのためには粒子を含む液（以下サンプル液と記載）の送液流量が、粒子を含まない液（以下シース液と記載）の送液流量に対して小さいこと、またその比、狭窄流路の幅とその長さ、拡大流路の幅、狭窄流路と拡大流路の幅の比、各流路の高さを調整することが重要である。
　粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺ）（例えば、非特許文献５参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定が可能となるが、測定できる粒子径範囲（ダイナミックレンジ）が比較的狭いという課題がある。例えば、ＥＳＺではアパーチャと呼ばれる小さい穴に粒子を通過させた際に発生する電気的シグナルを用いて粒子径を算出するが、一般にそのダイナミックレンジはアパーチャ径の２～６０％といわれている。また、ＥＳＺでは、アパーチャよりも大きい粒子が存在した場合、その粒子によりアパーチャが閉塞し、その後測定ができなくなるため、アパーチャ径以下の口径を持つフィルターにより大きい粒子を除去してからの測定が必要となる。しかしながら、フィルタリング操作では、フィルター基材への粒子の吸着が少なからず発生するため、サンプルの一部のロスが懸念される。また、この時点で定量的な結果を得られる可能性が減ってしまうという課題もあるため、サンプル中の粒子径分布を正確に測定した場合は、フィルタリング操作を行うことは望ましくない。また、粒子検出を行う部分を使い回す必要があり、測定ごとに洗浄し、サンプルのキャリーオーバーがないよう管理する必要があり、操作が煩雑となる。
特開２００５－２０５３８７号公報
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，９６，２３，１３１６５－１３１６９，１９９９． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６，５４６５-５４７１，２００４． Ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ，５，１２３３-１２３９，２００５． Ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ，６，９７４-９８０，２００６． Ｒ．Ｗ．Ｄｅ　Ｂｌｏｉｓ．ｅｔ　ａｌ、Ｔｈｅ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ　４１、Ｎｕｍｂｅｒ　７、ｐｐ９０９－９１６（１９７０） Ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ，５，７７８-７８４，２００５．
　本発明の課題は、広範囲の粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出装置、及び粒子検出方法を提供することにある。
　本発明者らは上記課題に鑑み、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離した後、検出器で検出することで広範な分布を持つ粒子試料測定が可能となることを見出した。
　すなわち、本発明は、粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを有する粒子検出装置であって、前記粒子回収流路が、アパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする、粒子検出装置に関する。
　また、本発明において、各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲は互いに異なっていてもよく、アパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が互いに重複していてもよい。
　さらに、本発明において、前記粒子回収流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とする。これにより、アパーチャの詰まりを避けることができる。また、これらのパラメーターを調整することで、各粒子回収流路のアパーチャにより検出可能な粒子径の粒子を粒子回収流路へと流入させることができる。
　ＥＳＺによる粒子検出において、定量性を担保しながらより安価な粒子検出装置を提供することも求められている。この課題を鑑み、アパーチャを有した電気検出器からなる粒子検出部に電極を配置した流体排出口を接続することで、定量性を担保しながらより安価で使い捨て可能な粒子検出装置が製造可能になることを見出した。すなわち、前述の粒子検出装置において、前記粒子検出部の下流に流体排出口を備え、前記電気検出器の電極が、液体排出口に備えられていることをさらに特徴として含んでもよい。
　さらに、本発明において、前記粒子分離流路は、ＰＦＦの原理を利用した流路構造としてもよい。具体的に粒子分離流路に、ＰＦＦの原理を利用した流路構造を形成することができる。これにより、流体の流れに対して、垂直方向に粒子径に応じて粒子の分離が可能となる。より単純な方法でＰＦＦにおいてより精度よく粒子を分離できる粒子分離流路、及び当該流路を用いた粒子分離方法を提供することが必要とされており、この課題を鑑み、検討したところ、流路の材質を硬くすることで、流路壁の外方向への膨張を抑制することができ、それにより一般に想定される流れる粒子の位置の正確さ（Ａｃｃｕｒａｃｙ）を上げるのではなく、流れる粒子位置の精度(Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ)が上がることを見出した。この発見に基づき、ＰＦＦにおいてより精度よく粒子を分離できる粒子分離流路、並びに当該粒子分離流路を備えた粒子検出装置、さらには当該粒子分離流路及び/又は粒子検出装置を利用した粒子の分離又は検出方法の発明に至った。なお、ここで「正確さ」とは拡大領域壁面からの粒子位置の理論値と測定値の間の乖離の度合いを示し、「精度」とは拡大領域壁面からの粒子位置が、複数回測定した際にどれだけ再現性があるかを示す。
　ここで、本明細書における硬さとは、デュロメータ硬さ（タイプＡデュロメータ使用）を指し、一定荷重を加えた際の物質の変形量で定義され、硬さが大きいほどその変形量は小さい。
　ＰＦＦでは、粒子が狭窄流路壁面へ整列される送液条件において、拡大流路内の粒子位置はその粒子径と狭窄流路幅、拡大流路幅から予測することができる。しかしながら一般に流体が流れるマイクロ流路内壁面は、常に流体のせん断力にさらされるため、送液中はマイクロ流路が拡大する方向に力が加えられている。したがって拡大流路内の粒子位置の予測には、送液による各流路の膨張を加味する必要がある。
　ポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳと記載）を含む、弾性のあるシリコーン樹脂で作製された流路の場合、送液による各流路の膨張、特に狭窄流路の幅に影響を受けやすいことが予想されるため、膨張しにくい材を用いること、すなわちより硬さの大きい樹脂へ変えることで、拡大流路内の位置をより正確に予測することが可能となるといえる。なお深さ方向については特に限定はなく膨張する材であってもよい。ここで言う狭窄流路の幅とは、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向（以下幅方向と記載）、深さとは幅方向に対して垂直方向（以下深さ方向と記載）の流路の長さをいう。しかしながら、この手法は粒子位置の「正確さ」をあげるものであり、流した粒子全てを毎回一定の位置に流すという「精度」を上げることにはつながらないと考えられる。
　しかしながら、本発明では流路の硬さを大きくすることで粒子が流れる位置の精度が上がることを見出した。これは、各流路の膨張を抑制することで、流路の広がりによる流速のむらを防ぐことができ、狭窄流路の壁面へ粒子を精度よく整列させられたためと考えられる。
　本発明者らは、さらにＰＦＦの原理を利用した流路構造を種々検討した結果、粒子分離流路において、拡大流路の内壁１７ａが狭窄流路の内壁１６ａに対して、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅が拡大しないように接続された構造とすることで、ナノ～マイクロメートルサイズの粒子が分離可能になることを見出した。すなわち、本発明は、拡大流路の内壁１７ａが狭窄流路の内壁１６ａに対して、粒子含有サンプル液を導入するポート１４ａ側に拡大しないように構成された粒子分離流路、並びに当該粒子分離流路を備えた粒子検出装置、さらにはかかる粒子分離流路又は粒子分離装置を用いた粒子の分離及び/又は検出方法に関する。
　さらに、粒子が滑流する壁面側の狭窄流路の内壁１６ａと、同じ側（粒子が滑流する壁面側）の拡大流路の内壁１７ａとが平面的に接続することで、より精度よく粒子が分離可能になる。さらに、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅を漸増させることで、つまり狭窄流路１６の壁面と拡大流路１７の壁面との間に出来るだけ角を設けないようにすることで、さらに粒子の分離精度が良くなることを見出した。
　一般に、マイクロ流路内は慣性力よりも粘性力が支配的な空間であり、レイノルズ数が２３００以上となるような乱流条件で流体を流すことは簡単ではないため、マイクロ流路内での流体は層流で流れることが前提となる。これはレイノルズ数が２３００以上となるように流体を流す場合、数ｍ／ｓeｃ以上の高流速で流体をマイクロ流路内へ流す必要があるため、圧力損失が数ＭＰａをはるかに超える値となり、送液ポンプへの圧力負荷や流路の破断などが問題となり送液が困難になるためである。したがって、理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＦＦを用いる流路内でも、流体は基本的に層流で流れるため、本発明の効果はマイクロ流路内での乱流の発生によるものではないことが考察される。
　一方でＰＦＦでは、粒子が狭窄流路から拡大流路へ侵入した際、流路の幅が大きく変わるために、狭窄流路側の拡大流路の入り口では流速分布が著しく変化する。従って本発明では、この著しい流速分布変化により、流路内で、特に流路幅が変化する拡大領域入り口付近の壁面近傍で渦流が発生している可能性を見いだした。そこで、理論に限定されることを意図するものではないが、この渦流を可能な限り低減することで、壁面近傍へ整列された粒子が渦流の影響で拡散が抑制され、より微小な粒子の分離が可能になったものと考えられる。
　また、本発明の別の態様として、流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
分離された粒子を２以上の流路に分断し、
前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを特徴とする方法も挙げられる。
　前記方法において、前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なっていてもよく、検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していてもよい。また、本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターを調整し、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断したり、ＰＦＦの原理を利用して粒子を分離してもよい。本発明の方法は、一例として本発明の粒子検出装置を駆動することにより実施される。
　本発明により、より広範な粒子径分布を持つサンプルを精度よく連続的に検出する事ができ、バッチ処理の分離技術と比較して、大量な粒子サンプルの測定が可能になる。
図１（ａ）（ｂ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０へ水力学的ろ過（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＨＤＦ）を応用し、分離した粒子を検出する粒子検出部１０３ａ、ｂを備えたマイクロチップ１０を示す。図１（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）における領域１９０の拡大図である。 図２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子検出部１０３を直列に２つ配置した場合の態様を示す。図２（ｂ）は、２つの粒子検出部１０３を１つの粒子が連続的に通過した場合の、測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図で、上側のグラフが上流側の粒子検出部１０３により測定されたもので、下側のグラフが下流側の粒子検出部１０３により測定されたことを示す。ここで、便宜上、２つの粒子検出部１０３のグラフの縦軸の位置をずらしたが、実際は粒子が通過しないときのベースラインとなる電流値はほぼ同一である。 図３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、アパーチャを直列に２つ配置した場合であり、図２とは異なり、電極を１対のみ用いた場合の態様を示す。図３（ｂ）は、２つのアパーチャを粒子が連続的に通過した場合の測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図である。 図４（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）の等価回路を示す。 図５（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示し、複数の粒子検出部１０３が、流体的に下流側の電極から電圧を印加することで、複数の粒子検出部１０３間での電気的干渉を低減する態様を示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）の等価回路を示し、複数の粒子回収流路１０２が独立していることを示す。 図６は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数のアパーチャが並列に設置され、各アパーチャの下流に電極を配置するものの、上流の電極を共有化することにより、より低コストな装置として利用できる態様を示す。 図７は、中継流路６０と電極挿入口５９を用いた、より安価に粒子検出部１０３を作製するための態様を示している。 図８（ａ）～（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＨＤＦを応用した態様を示す。図８（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図８（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図８（ｃ）は、粒子回収流路１０２が３つで粒子分離流路１１０に分岐流路１０５をもつものを示す。 図９（ａ）は、図８（ｂ）の分岐部１１０Ａでの流体の流れを示す図であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）の直線流路部分の拡大図を示す。 図１０（ａ）は、層流条件下における直線流路内での粒子の流れを示す図であり、図１０（ｂ）は、粒子拡散流路１１０Ｂでの粒子の流れの軌道を示す。 図１１は、ＰＦＦの原理を模式的に示した図である。２つの分岐から導入された流体の挙動と粒子の分離の様子が示される。 図１２（ａ）～（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＰＦＦを応用した態様を示す。図１２（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図１２（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図１２（ｃ）は、図１２（ａ）（ｂ）の領域２１の拡大図を示す。 図１３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＡｓＰＦＦを応用した態様を示す。図１３（ｂ）及び（ｃ）は、図１３（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１４（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＡｓＰＦＦを応用し、拡大流路１７の狭窄流路壁面１６ｂ側の壁面が徐々に拡大する場合の態様を示す。図１４（ｂ）は、図１４（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１５は、本発明の一実施形態を示す図であり、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成され、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした態様を示す。 図１６（ａ）は、実施例１で用いたマイクロチップ１０の概要図を示す。図１６（ｂ）は、図１６（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１７は、実施例１において粒子検出部１０２ａで検出された、０．１、０．２μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図である。 図１８は、実施例１において粒子検出部１０２ｃで検出された、０．２、０．５μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図である。 図１９（ａ）（ｂ）は、実施例１において粒子検出部１０２ｂで検出された、０．５、１．０、２．０μｍ粒子の電気的シグナルの一例を示した図であり、図１９（ａ）は０．５、１．０μｍ粒子を、図１９（ｂ）は２．０μｍ粒子の電気的シグナルを示している。 図２０は、実施例１における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。 図２１は、比較例１における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。 図２２は、実施例２における測定結果から作成された、抗体凝集体サンプルの粒度分布を示す。 図２３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＨＤＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部を備える態様を示す。図２３（ｂ）は、領域２１の拡大図を示す。 図２４は、実施例３における測定結果から作成された、混合粒子サンプルの粒度分布を示す。 図２５は、本発明の概要を示した図であり、粒子５０をアパーチャ５３ａまたは５３ｂへ流入させ、２つの流体排出口に配置した電極５４ａ、ｂによりＥＳＺの原理に基づいた粒子検出を行う態様を示す図である。 図２６は、本発明を実施するための別の態様のマイクロチップ１０を示す。図２６（ａ）、（ｂ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図２６（ｃ）はその等価回路を示す。 図２７は本発明を実施するための別の態様のマイクロチップ１０を示す。図２７（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図２７（ｂ）は粒子検出部の拡大図を示し、図２７（ｃ）はその等価回路を示す。 実施例４における粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を示したものである。 実施例４の測定結果をヒストグラムにまとめたものである。 本発明による連続粒子分離法を実行するための粒子分離流路の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示し、図３０（ａ）は図３０（ｂ）におけるＡ 矢視図であり、図３０（ｂ）は図３０（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３０（ｃ）は図３０（ａ）における領域２１の拡大図である。 （ａ）硬さ７０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例５）（ｂ）硬さ６０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例６）（ｃ）硬さ４４の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例７）（ｄ）硬さ３０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（比較例２） 図３２（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図３２（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３２（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３２（ｂ）は図３２（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３２（ｃ）は図３２（ａ）における領域２１の拡大図である。 図３２（ｄ）～（ｇ）は、図３２（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３２（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３２（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３２（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３２（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３３（ａ）～（ｃ）は、従来技術のマイクロチップ１０を示しており、本発明に係る図３２のマイクロチップ１０の比較として示す。図３３（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３３（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３３（ｂ）は図３３（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３３（ｃ）は図３３（ａ）における領域２１の拡大図である。 図３３（ｄ）～（ｇ）は、図３３（ａ）～（ｃ）に示した従来技術のマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３３（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３３（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３３（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３３（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３４（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えた図３３のマイクロチップ１０において、拡大流路の拡大する壁面が逆になるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図３４（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３４（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３４（ｂ）は図３４（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３４（ｃ）は図３４（ａ）における領域２１の拡大図である。 図３４（ｄ）～（ｇ）は、図３４（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３４（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３４（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３４（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３４（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３５（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図３５（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３５（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３５（ｂ）は図３５（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３５（ｃ）は図３５（ａ）における領域２１の拡大図である。図３５（c）に示すように拡大流路の流路幅が徐々に拡大するように構成されている。 図３５（ｄ）～（ｇ）は、図３５（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３５（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３５（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３５（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３５（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３６（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えた図３５のマイクロチップ１０において、拡大流路の拡大する壁面が逆になるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図３６（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３６（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３６（ｂ）は図３６（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３６（ｃ）は図３６（ａ）における領域２１の拡大図である。 図３６（ｄ）～（ｇ）は、図３６（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３６（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３６（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３６（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３６（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３７（ａ）～（ｄ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示す。図３７（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３７（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３７（ｂ）は図３７（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３７（ｃ）は図３７（ａ）における領域２１の拡大図である。図３７（ｄ）は、狭窄流路１６と拡大流路１７との接続点（拡大開始点）をさらに拡大して示した図である。図３７（ｄ）に示すようにスロープ部分４０に、流路壁面４１ａ、４１ｂ（共に長さ５０μｍ）により構成される部分的な凹部を有する。 図３７（ｅ）～（ｈ）は、図３７（ａ）～（ｄ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３７（ｅ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３７（ｆ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図３７（ｇ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図３７（ｈ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図３８は、図３５のマイクロチップ１０において、狭窄流路１６の幅と、流路１３の深さのみを変更したマイクロチップ１０を用いて、０．１μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図３８（ａ）は分離された０．１μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図３８（ｂ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。 図３９は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えた図３２のマイクロチップ１０において、複数のアウトレット１５ａ、１５ｂ、及び１５ｃを備えるように改良されたマイクロチップ１０を示す。図３９（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３９（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３９（ｂ）は図３９（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３９（ｃ）は図３９（ａ）における領域２１の拡大図である。 図４０（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えた図３５のマイクロチップ１０の拡大流路に対して、分離能に影響を与えないと考えられる変更を加えたマイクロチップ１０を示す。 図４１（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための実施形態を備えた図３２のマイクロチップ１０において、拡大流路壁面１７ａが１７ｂ側へ伸びるように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図４１（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図４１（ｂ）におけるＡ矢視図である。図４１（ｂ）は図４１（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図４１（ｃ）は図４１（ａ）における領域２１の拡大図である。 図４１（ｄ）～（ｇ）は、図４１（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図４１（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図４１（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図４１（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図４１（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。 図４２（ａ）～（ｃ）は、本発明による連続粒子分離方法を実施するための粒子分離流路の実施形態を備えた図３５のマイクロチップ１０において、拡大流路の壁面１７ａ、１７ｂが徐々に拡大するように設計された比較のためのマイクロチップ１０を示す。図４２（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図４２（ｂ）におけるＡ矢視図である。図４２（ｂ）は図４２（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図４２（ｃ）は図４２（ａ）における領域２１の拡大図である。 図４２（ｄ）～（ｇ）は、図４２（ａ）～（ｃ）に示した本発明にかかるマイクロチップ１０を用いて０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズ及び０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズを分離したことを示す図である。図４２（ｄ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像であり、図４２（ｅ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像である。図４２（ｆ）は分離された０．２μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフであり、図４２（ｇ）は分離された０．５μｍ蛍光ポリスチレンビーズの積算蛍光画像の検出ライン２０における蛍光プロファイルをプロットしたグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
＜粒子検出装置＞
　本発明による粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。粒子検出装置は、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向への分離を可能にする粒子分離流路と、当該粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを含む。
　このマイクロチップ１０は、粒子をその大きさにより分離し、適当な検出系を用いることにより、粒径と粒径分布を測定するためのマイクロチップであり、例えば、ＰＤＭＳなどの高分子（ポリマー）材料により形成された、２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有している。
　なお、マイクロチップ１０を作製する場合に用いる技術としては、例えば、モールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術は、流路構造を正確かつ容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、ウェットエッチング、ドライエッチング、ナノインプリンティング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能である。
　粒子を含むサンプルは、流体導入口であるインレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、粒子導入流路１０１、粒子分離流路１１０、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、流体排出口であるアウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。粒子分離流路１１０において、粒子径に応じて粒子が流体の流れに対して垂直方向へ分離され、分離された粒子が、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂにそれぞれ接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７に接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。
　粒子を含むサンプルは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が、例えば１ｎｍ～１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ～１０μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、細胞外小胞、無機粉末、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、細胞、細胞塊、タンパク質凝集体などが含まれる。また本発明における流体は、導電性の流体であり、好ましくは電解質を含む水溶液であるが、導電性のオイルや油を用いることもできる。また、前記水溶液中へ界面活性剤等の添加物を加えてもよい。
　インレット１４は、粒子を含むサンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。粒子導入流路１０１は、インレット１４と、粒子分離流路１１０との間に形成される。粒子導入流路１０１は、粒子分離流路１１０における粒子の分離を補助するために配置されるが、マイクロチップ１０を小型化するために省いてもよい。
　送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４へ直接接続することでインレット１４内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４の液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。
　送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。
＜粒子回収流路＞
　粒子回収流路１０２は、測定可能粒子径範囲（ダイナミックレンジ）を拡げる観点で２以上設ける。ここで、粒子検出部１０３は粒子回収流路１０２の内部または下流に設けられており、粒子回収流路１０２へ流入してきた粒子を検出するために用いられる。１つの粒子回収流路１０２に対して少なくとも１つの粒子検出部１０３が設けられている必要があり、２以上の粒子検出部１０３が設けられていてもよい（図２～６）。１つの粒子回収流路１０２に対し、２以上の粒子検出部が設けられる場合、１の粒子回収流路に直列に設けられてもよいし（図２、３）、粒子回収流路が分岐して並列に設けられてもよい（図４～６）。また、測定可能粒子径範囲を外れる粒子を回収する流路をさらに設けることもできる。１つの粒子回収流路１０２に対して２以上の粒子検出部１０３が設けられた態様においては、前記２以上の粒子検出部１０３は直列に配置されてもよい（図２、３）。例えば２つの粒子検出部１０３が直列に配置された場合、２つの粒子検出部１０３を通過した同一の粒子から生成されたシグナルの間隔から、流路内の粒子の通過速度を算出することができ、粒子の通過速度は回収流路１０２の流量に一般に比例するため、回収流路内の流体の流量を見積もることが可能となる。この時、図２に示す通り電極に印加する電圧は、上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極から印加する態様が好ましい。上流側のアパーチャ５３’の下流側の電極５４ｂ’または下流側のアパーチャ５３’’の上流側の電極５４ａ’’から電圧を印加した場合、前記２つの電極間で電圧降下が生じ、一方のアパーチャの電流値変化が、他方のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それらの影響を考慮しながら測定する必要がある。従って、２つまたは２つ以上のアパーチャを含む粒子検出部１０３を用いる場合、図３に示す通り上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極５４ａ’と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極５４ｂ’’のみを用いて測定してもよい。なお、図７に示すように、粒子検出流路の上流と下流それぞれへ、もしくはアパーチャの上流と下流それぞれへ、中継流路６０を介して流体的かつ電気的にアパーチャと接続している電極挿入口５９を設け、ここへ電極５４を浸漬させることでＥＳＺによる粒子検出を行ってもよい。
　また、１つの粒子回収流路１０２に対して２つ以上の粒子検出部１０３が設けられた態様において、前記２以上の粒子検出部１０３は並列に配置されてもよい（図４～６）。本態様により粒子検出部１０３の並列化された数に比例して処理量が増加するという優れた効果が得られる。この時、電気的に検出するための電極５４は、各アパーチャを挟むように配置され、粒子検出部１０３の数の２倍あれば測定は可能である。一方で、図６に示したように、各アパーチャに対して上流側に１本、下流側に粒子検出部１０３の数の分だけ電極を配置した態様でも測定は可能であり、電極の数を減らすことによる低コスト化という観点からは、こちらの態様の方が好ましい。ここで、粒子検出部１０３を並列化し、各アパーチャへ同時に電圧を印加した場合、各アパーチャを挟むように配置される複数の電極対へ電圧を同時に印加すると、図４に示すように、等価回路は複雑なものとなり、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それら影響を考慮する必要がある。一方で、電圧を各アパーチャで個々に印加し、それぞれ個別に検出したい場合、測定しないアパーチャをグラウンド、シャーシへ接続せず、開回路の状態にすることで実施可能であり、前述の他のアパーチャへの影響はなくなる。この時、開回路の状態にするために、電極５４と電源５７の間にスイッチング回路を用いてもよく、リレー方式やフォトモス方式によるもので開回路の状態にしてもよい。粒子検出部１０３は、測定時に電磁ノイズが極力影響しない測定系を構築する方が好ましく、この点でスイッチング回路には、電磁石を用いるリレー方式よりも、フォトモスセンサーのような光電流を用いた方式の方が好ましい。但し、図５の通り、アパーチャの下流側の電極から上流側へ向けて電圧を印加した場合、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼさないため、本態様を用いてもよい。
　粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形または台形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２～６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。また、図２、３、１５、２５、及び２７（ｂ）に示すように、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成されてもよい。また、図４～６に示すように、複数の粒子検出部を備えることで複数のアパーチャを構成し、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした構成としてもよい。この場合、アパーチャの体積が凡そ同一であれば各アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、各アパーチャ上流の回収流路へ流れてきた粒子全てを検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい態様といえる。また、一の態様では、１つの粒子回収流路１０２に対し粒子検出部１０３は少なくとも２以上並列に配置される場合には、分岐した粒子回収流路のそれぞれの末端に流体排出口が接続される（図２５）。この場合、電極５４ａ、５４ｂは流体排出口内の電解質を含む溶液内にその先端が浸漬するようにして配置することができ、電源から供給された電流は、一方の電極５４ａまたは５４ｂから、アパーチャ５３ａまたは５３ｂを通過し、分岐部１１０を通ってもう一方のアパーチャを通過し、他方の電極へと流れることになる。この態様により、電極の数を減らしつつ、電極を流体排出口にのみ配置することができる。ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。この時、Ｌはアパーチャを形成する流路の長さ、ｄｅはアパーチャの等価直径、Ｌ’は中継流路６０の長さ、ｄｅ’は中継流路６０の等価直径とした。また、式（１）によるシグナル低下の加味はその流路構造に応じて適宜行うことが好ましく、必ずしも式（１）と完全に合致した式でなくてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。２つの電極５４は、アパーチャ５３を挟んで配置される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。
　複数の粒子検出部１０３のアパーチャ５３ａ、５３ｂの各々の断面積または体積が同じ場合、両アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、両アパーチャへ流れてきた粒子全てを同様に検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい。
　また、図２６（ａ）に示すように粒子導入流路１０１に分岐流路１０１ｄを設けたり、図２６（ｂ）に示すように粒子回収流路を３本（１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ）設け、その末端の流体排出口１０４ｃに電極をさらに１本配置してもよい。この場合、等価回路は図２６（ｃ）に示す通りとなり、追加した電極は、アパーチャ５３ａに対して直列に、アパーチャ５３ｂに対して並列に接続されたことになる。従って、アパーチャ５３ａに粒子が通過した場合、追加した電極へ流れる電流値は減少するが、アパーチャ５３ｂに粒子が通過した場合は追加した電極へ流れる電流値は増大するため、追加した電極へも別の電気測定器５６’を接続しておき、電気測定器５６と同時に電気的測定をしておくことで、粒子がどちらのアパーチャを通過したのかを判別することが出来る。
　電源５７は直流または交流電源を用いられるが、測定の際によりノイズが影響しにくいものを選択する方が好ましく、コスト面からは、例えば乾電池等の安価で低ノイズである直流電源を用いる方が好ましい。また、電極の材料は電気抵抗が小さい材質であれば制限はなく、金属、無機化合物、有機化合物を用いることができるが、耐久性とコストの面から金属であることが好ましい。
　解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。
＜粒子分離流路＞
＜ハイドロダイナミックフィルトレーション（ＨＤＦ）＞
　粒子分離流路１１０で用いる分離手法において水力学的ろ過（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＨＤＦ）を用いる場合、粒子分離流路１１０の上流部の末端が粒子導入流路１０１と接続しており、流体が流出する下流部の末端の分岐部１１０Ａを介して粒子回収流路１０２へと接続していればよい（図８）。この時、分岐部１１０Ａは、粒子を分離するために少なくとも２つ以上の粒子回収流路１０２へと流体的に接続されている必要があり、粒子回収流路を含む下流の流体力学的抵抗を考慮して、各流路やアパーチャの断面積、体積を設定する必要がある。例えば、図８（ｂ）、図９の通り回収流路１０２を３つ設けた場合、各回収流路へ流れる流量をＱａ、Ｑｂ、Ｑｃとすると、各流量の比は流路の幅ｗ、高さｈ、長さＬから算出され、具体的にはハーゲンポアズイユの式から直線流路内における流量は下記式（２）に従い計算される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　また、拡大図９（ｂ）の通り、層流条件下でのマイクロチップの流路内の速度分布は放物線となり、一般に下記式（３）中のｕ（ｒ）で表される（この時、ｗ０は円管の半径、ｒは円管中心からの距離、μは粘度、Ｌは円管の長さ、ΔＰは圧力損失を示す。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　流路壁面からの任意の距離ｗ１とｗ２で区切られる放物線内の面積Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃの比は、各回収流路へ流れる流量Ｑａ、Ｑｂ、Ｑｃの比と等しくなる。この時、流路内に存在する粒子のうち、その粒子の中心または重心位置がｗ１よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ａへ流入し、ｗ２よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ｂへ流入し、ｗ１とｗ２の間に存在する粒子は、回収流路１０２ｃへ流入する。従って、回収流路１０２ａ、１０２ｂへ流れる最も大きい粒子の半径はそれぞれｗ１、ｗ２となるため、アパーチャの断面形状が円形の場合は、アパーチャの半径をｗ１またはｗ２以上とする必要があり、アパーチャの断面形状が略円形や楕円形の場合は、略円形または楕円形の中心または重心を通る最小半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。また、アパーチャの断面形状が矩形の場合、２組の対向する辺それぞれがｗ１またはｗ２の２倍以上の長さである必要がある。加えてアパーチャの断面形状が多角形の場合、その内接円の半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。
　ここで、粒子分離流路１１０の末端以外の箇所に分岐部１１０Ａ（図８に図示されていない）を複数設け、１以上の分岐流路１０５を設ける態様をとってもよい（図８（ｃ））。分岐流路１０５は一方の流路壁面側のみに設けてもよいし、流路壁面の両側へ設けてもよい。また１以上の分岐流路１０５は、下流の回収流路１０２において同時に合流してもよく、徐々に合流する態様をとってもよい。
　さらに、粒子分離流路１１０の分岐部１１０Ａ（図１０に図示されていない）の流体的に上流側に、粒子拡散流路１１０Ｂを形成してもよい（図１０（ｂ））。粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が粒子導入流路１０１へと接続されており、流体的な下流側が分岐部１１０Ａへと接続している。また、粒子導入流路１０１を用いない態様の場合は、粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が直接インレットへと接続される。
　粒子拡散流路１１０Ｂは、流体的な上流側から下流側へ向けて、流路の幅または高さ、もしくは両方が拡大していく構造をとることが好ましい。これは、粒子回収流路が、粒子拡散流路１１０Ｂの流路幅方向に複数存在するのか、高さ方向に複数存在するのかで好ましい態様が異なるが、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるマイクロチップの流路形成技術を用いる場合、その作製の容易さという点で、流路の幅が拡大していく構造が好ましい。
　この粒子拡散流路１１０Ｂでは、単位時間当たりの粒子のブラウン運動、つまり拡散距離がその粒子径の平方根に反比例することを利用し、粒子拡散流路１１０Ｂを粒子が流れていく際に、その粒子径に応じて粒子が流路の拡大する方向へ拡散するため、拡大した流路壁面付近では、粒子径の小さい粒子の存在確率が高くなり、濃縮効果が得られる。ここで、図１０の流路壁面ａと粒子拡散流路壁面ａの接続する角度θａ、流路壁面ｂと粒子拡散流路壁面ｂの接続する角度θｂは、流路幅を拡大させる点で１８０°未満である必要がある。また、流路壁面ａ、流路壁面ｂで囲まれる流路内の流速が１ｍ／秒以上となるような高流量の条件では、拡大部分での渦流れの発生が懸念されるため、１ｍ／秒未満となるような比較的低流量な条件で送液をするか、角度θａ、θｂを９０°よりも大きくすることが好ましい。一方で、粒子拡散流路１１０Ｂへ粒子が流入した際、粒子はその重さに応じて粒子が流れてきた方向（流体力学的な下流方向で、分岐部１１０Ａが存在する方向）に慣性力を受ける。つまり、粒子の密度が同じ場合、粒子径の大きい粒子ほど流路中央に近づく方向に慣性力を受けるため、より流路壁面では粒子径の小さい粒子の存在割合が高くなり、ＨＤＦにおける更なる分離能向上へと寄与する。また、角度θａ、θｂは非対称でも良く、一方の壁面を略直線に接続し、対向する他方の壁面のみを１８０°未満の角度で拡大させて接続してもよい。
　粒子分離流路１１０で用いる分離手法においてＨＤＦを用いた場合、図８における粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、それぞれ全く同一でもよいが、広範な粒子径範囲を持つサンプルを測定するために異なる粒子径範囲を測定できるよう設定することが好ましく、その一部がお互いに重複している方が、分離しきれなかった粒子を検出でき、よりロバストな結果を得られる点でさらに好ましい。図８（ａ）に示したように、粒子回収流路１０２が２本の場合、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、粒子検出部１０３ａを大きい粒子径範囲にし、粒子検出部１０３ｂを小さい粒子径範囲に設定してもよく、その逆でも問題はない。但しＨＤＦの理論に基づき、アパーチャが粒子により閉塞されないよう設定する必要がある。
　粒子のカウント数からの濃度換算においては、各粒子回収流路１０２へ流れる流量は設定した送液部の流量と式（２）または（３）を用いて算出されるため、測定時間当たりの粒子のカウント数をこれで割ることにより、粒子濃度を算出する。また、流路内での粒子中心もしくは重心位置は、流路壁面からその粒子半径よりも近くには位置し得ないため、流路壁面近傍の粒子濃度は相対的に低くなる。従って、粒子径に応じて壁面からの粒子半径分を考慮した濃度補正を行ってもよい。この場合、式（３）を用いて壁面から粒子半径分までの流量を計算し、各粒子回収流路１０２への流量に対する割合を算出し、算出された割合分だけ補正を行ってもよい。
＜ピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）＞
　本発明の粒子検出装置の粒子分離流路１１０において、ピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）の原理を利用した流路を用いる場合の構成の一例を図１２に示した。ＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、粒子分離流路１１０は、分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂ、狭窄流路１６、及び拡大流路１７を含む。粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを保持するインレット１４ａ、１４ｂはそれぞれ分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂと流体的に接続している。分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂはその下流で合流し、狭窄流路１６の上流側へと流体的に接続される。その後、ＰＦＦの原理に基づいて狭窄流路１６の下流と接続している拡大流路１７で粒子分離がされる。拡大流路１７の流路幅は、所定の位置で一定となり、拡大流路１７の下流で流体的に接続される回収流路１０２ａ、１０２ｂで粒子が回収され、回収流路の下流で接続される検出部１０３ａ、１０３ｂで粒子が検出される。ここで、回収流路は何本設置してもよいが、流路の小型化、低コスト化の観点で５本以下にすることが好ましく、３本以下が最も好ましい。
　図１１は、図１２～１４、図３０、３２～３７、３９、４１～４２のマイクロチップにおける流路が合流して形成される狭窄流路及び拡大流路の一例を示している。具体的には、図１２（a）における領域２１の拡大図である。また、流体１００Ｐと、斜線で示した流体１００Ｎは、それぞれ粒子を含む流体と、粒子を含まない流体であり、粒子３００ａ、３００ｂは、それぞれ相対的に大きな粒子と相対的に小さな粒子を示している。
　また、図１１において、矢印２００は、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界における流線のプロファイルを示しており、矢印２１０ａ、２１０ｂは、それぞれ大きな粒子３００ａと小さな粒子３００ｂの運動ベクトルを示している。
　まず、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを、シリンジポンプなどを用いて２つのインレット１４ａ、１４ｂからそれぞれ連続的に供給する。この時、流路１３内では、それぞれの流体が安定な層流を保ちながら流れる。
　そして、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎの流量を調節することで、狭窄流路１６における流体１００Ｐの幅（流路壁面から、流体１００Ｐと流体１００Ｎの界面までの距離）が、分離対象とする最小の粒子の粒径よりも小さくなるようにする。この操作により、分離対象とする全ての粒子は、狭窄流路の内壁１６ａに沿って流れるようになり、狭窄流路の内壁１６ａの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を、粒子の大きさによって一定にすることができる。
　そして狭窄流路１６と拡大流路１７の境界において、流線はプロファイル２００に示されているように広がるため、狭窄流路１６における任意の流線間の距離は、拡大流路１７においてより拡大される。
　したがって、狭窄流路１６における流れと垂直な方向における粒子の位置は、粒子の大きさによってそれぞれ異なるため、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界において、大きい粒子３００ａの運動ベクトル２１０ａと小さい粒子３００ｂの運動ベクトル２１０ｂの方向に差が生じ、つづく拡大流路１７において、粒子の大きさごとの位置差が拡大され、分級が可能となる。
　なお、分離した粒子を拡大流路１７における検出ライン２０に沿って、適当な検出系を用いて観察することで、粒子の粒径と粒子群の粒径分布を調べることが可能となる。
　ＰＦＦの原理に基づく、粒子分離流路１１０を用いる場合、粒子分離流路の流路壁が外側方向に膨張しにくい素材で構成されることが好ましい。よって、粒子分離流路を含むマイクロチップ１０を作製する場合の材質としては、流路の壁面が膨張しにくい素材で構成されることが好ましいが、少なくとも流路の壁面が、流路の幅方向に膨張しにくい素材で構成されることが好ましい。より具体的にはデュロメータ硬さ４０以上となる素材で構成されることが好ましく、デュロメータ硬さが６０以上となる素材で構成されることがさらに好ましい。使用できる素材としてはＰＤＭＳ、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコーン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属、などを用いることができる。好ましくはデュロメータ硬さ４０以上、さらに好ましくはデュロメータ硬さ６０以上のＰＤＭＳ、アクリル樹脂等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコーン、セラミクス、ステンレスなどを使用することができる。これらの材料のうち、任意の２種類の材料を組み合わせて用いることも可能である。ただし、流路自体を安価に作製し、ディスポーザブルな装置を提供するためには、少なくとも部分的にポリマー材料を用いることが好ましく、全体がポリマー材料で構成されることがより好ましい。そのような素材としては、デュロメータ硬さ４０以上のＰＤＭＳ、アクリル樹脂などが好ましく、デュロメータ硬さ６０以上がさらに好ましい。
　また、流路の深さ方向については膨張する素材で構成されていてもよい。流路を作製する上で流路の幅方向、深さ方向の膨張の程度を変えることは煩雑であるため、上記したマイクロチップ１０を、硬さ３０、４４、６０、７０のＰＤＭＳにより作製したが、硬さは任意の値に設定することが可能で、好ましくは硬さ４０以上、より好ましくは硬さ６０以上のものが用いられる。ここで、前述の通り、本明細書の硬さとはデュロメータ硬さ（タイプＡデュロメータ使用）を指し、一定荷重を加えた際の物質の変形量で定義され、硬さが大きいほどその変形量は小さい。
　硬さ試験はＪＩＳ　Ｋ　６２４９の標準規格に則ってＪＩＳ　Ｋ　６２５３ の ５（デュロメータ硬さ試験）で評価される。試験は、タイプＡデュロメータ硬さ試験機を押込み深さ０．０００～２．５００ｍｍの測定範囲をもつ長さ測定器と変位装置とから成り立っている押込み深さ測定装置に装着し、長さ測定系には、マイクロメータを用いるのが望ましい。長さ測定器（マイクロメータのスピンドル先端）が押針と垂直同軸上で接触するように固定し、スピンドルを移動させて押針に変位を与える。硬さ試験機の押針を１００から０まで、各表示に従って変位させるか、又は既知の押込み深さ値に対する硬さ試験機の指示値を検証する。押込み深さの検証は、指示値１００及び０を含む少なくとも４か所で実施することが好ましい。
　ここで、ＰＦＦの原理に基づく、粒子分離流路１１０を備えたマイクロチップ１０は、基板１１の下面１１ａに流路１３を形成し、下面基板１２と重ね合わせることにより形成される。流路の深さは１０ｎｍから１ｃｍまでの任意の値に設定することが可能であるが、作製の容易さから、サブミクロンから数十μｍの値に設定することが好ましい。
　流路１３は、インレット１４ａ、１４ｂおよびアウトレット１５を有し、インレット１４ａ、１４ｂは、それぞれ粒子を含む流体と粒子を含まない流体の流体導入口であり、アウトレット１５は流体の出口である。
　また、流路１３の一方の端は、少なくとも２つの分岐流路（１８ａ、１８ｂ）になっており、さらに流路１３は２つの異なる形状を持つ狭窄流路１６、拡大流路１７から構成されている。狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部を拡大開始点ということができ、図１２（ｃ）で表されるように拡大開始点において流路幅が変わる。拡大流路１７は、狭窄流路１６よりも流路幅が大きくなれば任意の形状であってよい。ここで、分岐流路１８ａ、１８ｂは、それぞれインレット１４ａ、１４ｂへ接続されており、また拡大流路１７はアウトレット１５へ接続されている。
　なお、流路１３の全体の長さ、つまり、インレット１４ａ、１４ｂのある一方の端から、アウトレット１５のあるもう一方の端までの長さは１μｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点から数μｍ～数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。
　また狭窄流路１６、拡大流路１７の長さは、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点からサブミクロン～数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。また、粒子の整列を達成する観点から、狭窄流路１６の長さの下限が１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましく、狭窄流路１６の長さの上限が５００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下がさらに好ましい。
　狭窄流路１６の幅は、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向の流路の長さをいう。狭窄流路１６の幅は、拡大流路１７の幅未満であるという条件を満たす限り、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。また、粒子の整列を達成する観点から、狭窄流路１６の幅の下限が１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましく、幅の上限が１００μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましい。
　なお、拡大流路１７の出口ポート１５は複数設けてもよく、「非対称ピンチドフローフラクショネーション（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　Ｐｉｎｃｈｅｄ　Ｆｌｏｗ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ））」（非特許文献６）の原理に基づいて、一部の出口ポートに多量の流体を流すことで分離能を向上させることもできる。より具体的には、流路の抵抗値を適切に設計し、また、狭窄流路１６の流路幅および粒子径の関係から、ある特定のサイズの粒子を、特定の出口ポートにのみ導入できる、という原理である。
　なお、複数のアウトレットを有する連続粒子分離装置及びその方法の場合、流路ネットワーク全体を抵抗回路のアナロジーとしてみなし、適切な設計を行うことで、任意の流量分配比を達成することができるため、そのような考えに基づいた設計を行うことが望ましい。
　流路内部における所望の流量条件を達成するための導入量の調節方法として、導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入することが操作上簡便であり好ましいが、ペリスタポンプ等の他のポンプを用いる手法、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液方法、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることも可能である。また、アウトレットから陰圧を付す圧力装置を用いることもできる。なお、送液圧力は安定して送液が可能な範囲であることが望ましく、流路や送液ポンプ自体の耐久性の観点から２０ＭＰａ以下であることが好ましい。
　なお、粒子の安定的かつ効率的な分離を達成するためには、流路内で安定な層流が保たれることが好ましく、具体的には、レイノルズ数が１０００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましい。ただし、直径１ｍｍ以下の流路構造を用いる場合、乱流を形成することは比較的困難であり、そのような条件を達成することは容易である。
　また分岐流路１８ａ、１８ｂの幅は、１００μｍのものを用いたが、これらの値はそれぞれ１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。
　なお、粒子を含む流体と粒子を含まない流体は、どちらも同じ流体から構成されていてもよく、また、それぞれ２種類以上の異なる流体から構成されていても良い。
　流路１３内に導入された粒子は、流れに乗って下流方向に移動するが、この時、２つのインレット１４ａ、１４ｂから導入された流体の流量を適切に調節することで、流路１３における狭窄流路１６において、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を粒子の大きさによって制御することができる。ここで、狭窄流路の壁面へサンプル液中の粒子を整列させるためには、サンプル液に対するシース液の流量の比は、１以上であることが好ましいが、１０以上がより好ましく、５０以上が最も好ましい。なお、サンプル液とシース液の流量の和は、送液圧力が大きくなり過ぎないよう設定することが好ましく、狭窄流路での流速が１０ｍ／ｓｅｃ以下であることが好ましく、２ｍ／ｓｅｃ以下であることが最も好ましい。
＜非対称ピンチドフローフラクショネーション（ＡｓＰＦＦ）＞
　本発明の粒子検出装置において、ＡｓＰＦＦの原理に基づいて、粒子分離流路１１０に拡大流路１７を形成してもよい。この場合、図１３及び１４に示される通り、拡大流路１７にドレイン流路２２を設置してもよく、粒子の分離能を向上させる点では、この態様がより好ましい。ドレイン流路２２は、アウトレット２３と接続されており、流体が排出又は回収される。ドレイン流路へは５０％以上の流体が流れるよう設計することが好ましく、７０％以上の流体が流れるよう設計することがさらに好ましい。
　さらに、狭窄流路１６と拡大流路１７が接続する構造は、図１３（ｂ）、（ｃ）に示すように拡大開始点で、流路幅が段状に拡大してもよいし、図１２（ｃ）や図１４（ｂ）に示すように流路幅が徐々に拡大するように構成してもよい。流路幅が徐々に拡大する場合、拡大流路の壁面１７ｂが直線を描くように拡大して、スロープ４０を形成してもよいし、曲線を描くように拡大してもよい。拡大流路１７の流路幅が、段状に拡大するか又は直線的に拡大する場合、狭窄流路の壁面１６ａ、１６ｂと、当該壁面に続く拡大流路１７の壁面１７ａ、１７ｂとの間の角度２４ａ、２４ｂにより、拡大流路を規定することができる。例えば、段状に拡大する場合の角度２４ａ、２４ｂは９０°である。拡大流路１７の壁面が、徐々に直線的に拡大する場合、角度２４ａ、２４ｂは、９０°～１８０°で表される。拡大流路の壁面は、狭窄流路の流路幅に比較して拡大していればよい。壁面１７ｂが段状に拡大している場合や、その角度２４ｂが９０°に近い場合に、角度２４ａは１８０°を超えてもよく、例えば２１０°、２２５°であってもよい（図４１）。一の態様では、拡大領域の壁面の角度２４ａ、２４ｂは、独立に９０°～１８０°の間の任意の角度をとることができ、一例として、１２０°、１３５°、１５０°、１８０°をとることができる。ただし、狭窄流路壁面１６ｂに対する拡大流路壁面１７ｂの角度２４ｂは９０°またはそれ未満の場合であっても、それが部分的な構造で、実質的には徐々に拡大していくような構造であれば、大半の流体は徐々にアウトレット２３の方向へ流れることから、渦流や粒子拡散の影響はほとんど受けないため、このような構造を用いてもよい（図４０（ａ）－（ｃ）を参照）。拡大流路の壁面１７ｂが曲線を描くように拡大する場合、渦流を防止する観点から、拡大開始点におけるその接平面が、狭窄流路の壁面と一致することが好ましい。
　本発明の別の態様では、上述のマイクロチップ１０などの粒子分離装置において、拡大流路１７の壁面のうち、狭窄流路１６における粒子が滑流する壁面１６a側に向けて流路幅は拡大せず、狭窄流路１６における粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅が拡大することを特徴としている。粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅が拡大しない観点から、角度２４a、２４ｂのうち、粒子が滑流する壁面側の角度２４ａは１８０°又はそれ以上（最大で２７０°未満）であり、好ましくは１８０°であるである一方で、もう一方の壁面の角度２４ｂは９０°～１８０°の任意の角度、例えば１２０°、１３５°、１５０°、１８０°である。このように構成することにより、狭窄流路の出口と拡大流路の入り口部分での渦流の発生や粒子拡散による分離能低下の影響を抑制することができる。
　拡大流路の壁面１７ａや１７ｂは、図３７（ｄ）、図４０（ａ）－（ｃ）点線部に示すように、壁面１７ａや１７ｂに対して垂直方向に凹部や凸部があったとしても、これが流体中の粒子の流れへ大きく影響しないのであれば、凹部や凸部が存在しても分離に影響はない。またマイクロチップ１０の製造上の欠陥の様な不規則な形状を持つものであっても、同様に流体中の粒子の流れへ大きく影響しないのであれば、そのような構造をとっても問題はなく、そのような構成を排除するものではない。
　狭窄流路１６において粒子が滑流する壁面１６aを、サンプル液側狭窄流路の壁面１６aと言うこともでき、狭窄流路１６における粒子が滑流しない壁面１６ｂを、シース液側狭窄流路の壁面１６ｂと言うこともできる。また、サンプル液側狭窄流路壁面１６a側の拡大流路壁面を、サンプル液側狭窄流路壁面１７ａ、またシース液側狭窄流路壁面１６ｂ側の拡大流路壁面をシース液側拡大流路壁面１７ｂということができる。
　また、狭窄流路壁面と拡大流路壁面は、それぞれ直線同士で結合しているものを図１１に示したが、何れか一方または両方が曲線であってもよい。ただし、前記狭窄流路と拡大流路の壁面の接続構造は、サンプル液側、シース液側壁面共に効果が十分見られるものの、粒子をサンプル液側に整列させるＰＦＦの原理からも推察されるように、粒子が滑流する壁面を直線的に接続する方が、より精度よく粒子分離が可能となり、さらにシース液側壁面の構造を前述の通り改良することで、さらに粒子の分離精度があがる。
　ドレイン流路２２は、ＡｓＰＦＦにより粒子を分離する場合に用いてもよく、拡大流路１７へ流れる流体の少なくとも一部がドレイン流路２２へ流れるよう、ドレイン流路の幅、高さ、長さを設計することが好ましい。さらに好ましくは同程度の流体がドレイン流路２２へ流れるよう設計することが好ましく、２倍以上の流体が流れるよう設計することが最も好ましい。
　また、図３２に示したドレイン流路２２は、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直な方向に設計したものを示しているが、平行な方向に設計してもよく、任意の角度に設定してもよい。ドレイン流路を、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直方向のシース液側壁面１７ｂに設計する場合、拡大流路の拡大開始点にドレイン流路を配置してもよいし（図３２（ｃ））、ドレイン流路を拡大開始点からは離して配置してもよい（図３５（ｃ））。平行な方向に設計した場合、狭窄流路１６中を高流速で流れてきた粒子が、拡大領域で低流速に急激に変化するため、慣性力の影響で粒子はその質量に応じた力を受ける。この時、この慣性力により整列したはずの粒子の位置がばらつき、分離の精度が悪くなる。従って、ドレイン流路２２は、狭窄流路１６中を流体が流れていく方向に対して、垂直な方向に設計したものがより好ましい。
　拡大流路１７の下流に接続する複数の粒子回収流路１０２は、少なくとも２つ設けられる必要があり、測定したい粒子径範囲に応じてその数を任意に増やすことが好ましい。各粒子回収流路１０２は、少なくとも１つの粒子検出部１０３があり、複数を設けてもよい。
　拡大流路１７は、ＨＤＦの項で記載した粒子拡散流路１１０Ｂとしての機能も持たせることで、さらに粒子の分離能を促進させる機能を付与させてもよいが、この場合は、拡大流路の長さは、粒子が拡散できる十分な長さを持つ必要があり、少なくとも１μｍ以上は必要となる。拡大流路１７の流路長さは、拡大する流路幅と角度２４ａ、２４ｂにより任意の値に決定される。
　また、拡大流路を用いず、狭窄流路１６の下流に直接複数の粒子回収流路１０２を設けてもよい。
　粒子分離流路１１０にＰＦＦの原理を利用した流路を用いた場合、粒子は狭窄流路壁面１６ａ側から１６ｂ側へ向けて存在しうる粒子の直径が大きくなっていくため、例えば図１２（ａ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定すること好ましい。また、図１２（ｂ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｃが中径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定することが好ましい。つまり、狭窄流路壁面１６ａに近い粒子検出部１０３ほど、小さい粒子を検出できるようアパーチャの断面積を設定することが好ましい。例えば、０．１～２．０μｍの粒子を検出しようとする場合、図１２（ｂ）、図１３（ａ）、図１４（ａ）の場合、粒子検出部１０３ａでは直径０．１～０．３μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が０．４μｍ＾２（幅１μｍ、高さ０．４μｍの矩形状のもの、または半径０．３６μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｃでは直径０．２～０．８μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が２μｍ＾２（幅２μｍ、高さ１μｍの矩形状のもの、または半径０．８μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｂでは直径０．４～２．０μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が１４μｍ＾２（幅３．５μｍ、高さ４μｍの矩形状のもの、または半径２．１μｍの円形状のもの）のものを設置してもよい。
　また粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、送液部により設定される流量は、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましく、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも２倍以上多いことが好ましい。粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも何倍以上であることが好ましいかについては、狭窄流路１６の流路幅と分離したい粒子の直径に依存し、例えば、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／４であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも３倍以上であることが好ましく、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／１０であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐの流量よりも９倍以上であることが好ましい。つまり、ＰＦＦの原理に基づいて分離したい粒子の直径に対して、狭窄流路１６の流路幅がＮ倍であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００ＰよりもＮ-１倍以上多いことが好ましい。前記流量比であれば、分離したい粒子は狭窄流路の壁面１６ａを滑流することになるため、ＰＦＦの原理に基づいた粒子分離が可能となる。
　さらに、粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合において、粒子を含む流体１００Ｐに含まれる粒子全てを狭窄流路壁面１６ａに滑流させる必要はなく、相対的に大きい粒子径を持つ粒子のみを狭窄流路壁面１６ａに滑流させてもよい。例えば図１２（ｂ）、図１３（ａ）、図１４（ａ）の場合、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以下の粒子を、狭窄流路壁面１６ａへ滑流させれば、最大粒子径以下の粒子が狭窄流路壁面１６ａに整列されなかったとしても、粒子検出部１０３ａでその分布をＥＳＺの原理に基づいて作成することができる。すなわち、ＰＦＦで分離しきれなかった粒子がいたとしても、粒子検出部でその粒子径分布が作成できるため、ＥＳＺがＰＦＦの分離能を補完するという優れた効果が得られる。
　また、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以上の粒子までしか狭窄流路壁面１６ａへ滑流させられない流量条件下であっても、前述のＨＤＦの理論に基づき、粒子検出部１０３ａのアパーチャが閉塞する粒子径の粒子が流入しないよう流路抵抗を設定することで、本発明の目的としている広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能となる。すなわち、ＰＦＦによる中粒径、大粒径粒子の分離と、ＨＤＦによる小粒径粒子の分離と、ＥＳＺによる精密な粒子径分布の作成により、広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能になるという優れた効果が得られる。この時、ＰＦＦにおける拡大流路１７が、前述の粒子拡散流路１１０Ｂの役割も併せて果たすため、単位時間あたりの拡散距離の大きい小粒径粒子の分離を促進させるという優れた効果が得られる。またこの態様において、小粒径粒子は粒子検出部１０３ｃにも流入し、場合によっては粒子検出部１０２ｂにも流入するため、粒子検出部１０３ａへ流入してくる小粒径粒子は粒子サンプルを含む流体１００Ｐの一部となる。その流入量は、粒子拡散流路１１０Ｂの役割を果たす拡大流路１７の長さが、小粒径粒子が拡散するのに十分な距離であれば、粒子回収流路１０２ａとその下流の流路構造から算出される流量に比例するため、その算出された値から定量することができる。ここで、拡大流路１７の長さにおける「小粒径粒子が拡散するのに十分な距離」とは、粒子を含まない流体１００Ｎの流量と粒子を含む流体１００Ｐの流量の和が０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの範囲であれば、１μｍ以上が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上が好ましい。
　複数のアウトレットを有する連続粒子分離装置及びその方法の場合、流路ネットワーク全体を抵抗回路のアナロジーとしてみなし、適切な設計を行うことで、任意の流量分配比を達成することができるため、そのような考えに基づいた設計を行うことが望ましい。例えば、前述のＡｓＰＦＦの原理に基づいて、図３２、３３に示すように、大半の流体が流れるように拡大流路１７の一部にドレイン流路２２を設計し、ドレイン用のアウトレット２３を設けてもよい。その場合も、目的物をアウトレット１５、または図３９（ａ）のアウトレット１５ａ、１５ｂ、１５ｃのように複数設けたアウトレットの任意のアウトレットから回収するようにしてもよい。特に、複数の大きさをもつ物質を含むサンプルから特定の大きさの粒子を分離し回収しようとする場合、アウトレット１５の数は目的に応じて任意の数に設定されるが、回収するという点で少なくとも２以上に設定されることが好ましい。一方で、分離した後に回収せず、例えば分離された粒子を検出するのみでよい場合は、検出ライン２０で蛍光や明視野像の検出系等を用いて検出すればよく、この場合、アウトレットの数は１つであってもよい。
　図３２には、本発明による連続分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０が示されており、図３２（ａ）は図３２（ｂ）におけるＡ矢視図であり、図３２（ｂ）は図３２（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図である。図３２におけるマイクロチップ１０の流路１３は、どの地点においても断面形状が矩形であり、流路深さは均一である。このように断面形状は、粒子を断面においてその大きさによって分離するために、また、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。狭窄流路の壁面に沿って粒子を滑流させる観点から粒子が滑流する壁面は平面であることが好ましい。同様に流路構造の深さはその作製上の容易さから一定であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
製造実施例：粒子検出装置の製造
　本発明による粒子検出装置の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
　４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ－８　３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ－８　３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ－８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
　続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。
電気検出実施例：ＥＳＺによる粒子の電気的検出
　作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
　各インレットは、テフロンチューブを介してプレッシャーポンプＰ-ＰｕｍｐＢａｓｉc（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）へ接続し、一定の流量で送液した。
サンプル調製実施例：標準粒子を用いた場合
　分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐ中の粒子として標準粒子を用いる場合、
０．１μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３１００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）０．２μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．５μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３５００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
１．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４００９Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
２．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４２０２Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
を用いた。分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）を用いた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液は、実験前にポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから用いた。
サンプル調製実施例：抗体凝集体を用いた場合
　独自に作製したマウスモノクローナル抗体を、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により０．６６ｍｇ／ｍＬへ調製し、乾燥機にて摂氏９０度で１５分加熱させることで人為的に抗体凝集体を作製した。
粒子分離検出
実施例１：ＡｓＰＦＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
　図１６で示されるマイクロチップ１０を、粒子検出流路として上述の製造実施例に基づき作製し、上述のサンプル調製実施例に基づき調製した。０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は２５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
　この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて４．５μｍとし、流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、１４ｂ、アウトレット１０４ａ、１０４ａ’、１０４ｂ、１０４ｂ’、１０４ｃ、１０４ｃ’、２３（それぞれ穴の径２ｍｍ）を設けた。また流路１３は、分岐流路１８ａ（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、分岐流路１８ｂ（幅４０μｍ、長さ５００μｍ）、狭窄流路１６（幅６μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅６００μｍ、長さ０．５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅５００μｍ、長さ１．７ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅５１２μｍ、長さ３．７５ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅１μｍ、高さ０．４μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅２μｍ、高さ０．８μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、高さ４．５μｍ、長さ２０μｍとした。各粒子検出部の形状は図１５と同様であり、また式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、２．６とした。
　上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した粒子懸濁液を２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを１０μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子回収流路１０２ａの粒子検出部１０３ａの電流値変化の測定の様子の一部を図１７に示し、粒子回収流路１０２ｃの粒子検出部１０３ｃの電流値変化の測定の様子の一部を図１８に示し、粒子回収流路１０２ｂの粒子検出部１０３ｂの電流値変化の測定の様子の一部を図１９に示した。図１７より粒子検出部１０３ａでは０．１、０．２μｍ標準粒子が、図１８より粒子検出部１０３ｃでは０．２、０．５μｍ標準粒子が、図１９より粒子検出部１０３ｂでは１．０、２．０μｍ標準粒子の電流値変化が確認された。
　また、測定結果１つのヒストグラムへまとめると図２０の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の濃度は、５．４１μｇ／ｍＬであり、０．２μｍ標準粒子の濃度は、３．５２μｇ／ｍＬであり、０．５μｍ標準粒子の濃度は、６．２９μｇ／ｍＬであり、１．０μｍ標準粒子の濃度は、５．０２μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、５．９２μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１０７μｍであり、０．２μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１９２μｍであり、０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．５２μｍであり、１．０μｍ標準粒子の平均粒径は、０．９８μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．０５μｍであった。
　以上から、本発明を用いて、複数の断面積の異なるアパーチャ、すなわち複数の検出可能粒子径範囲をもつ粒子検出部１０３を用いて、０．１～２μｍという広範な分布を持つサンプルでも、正確な粒子径測定が可能であること確認した。
比較例１：レーザー回折散乱法（ＬＤ）による粒子検出装置を用いた０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
　実施例１と同様にして混合粒子サンプルを調製し、ＡｇｇｒｅｇａｔｅｓＳｉｚｅｒ（島津製作所社）により測定を行った。
　測定結果を示す図２１の通り、０．２と２μｍのピークが消失し、０．１μｍのピークが増大していることから、混合粒子サンプルでの正確な測定は難しいことが確認された。
実施例２：ＡｓＰＦＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、抗体凝集体サンプルの検出
　実施例１と同じマイクロチップ１０を用い、サンプル調製実施例に基づいて作製した抗体凝集体を同様に測定した。
　測定結果を示す図２２の通り、抗体凝集体においても測定が可能であることを確認した。
実施例３：ＨＤＦによる粒子分離後に、３つの粒子回収流路と、各粒子回収流路に２つ設置された粒子検出部により粒子検出を行う粒子検出装置による、０．１、０．５、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
　図２３で示されるマイクロチップ１０を、粒子検出流路として上述の製造実施例に基づき作製し、上述のサンプル調製実施例に基づき調製した。０．１、０．５、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は１５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。
　この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて４．０μｍとし、流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、アウトレット１０４ａ、１０４ａ’、１０４ｂ、１０４ｂ’、１０４ｃ、１０４ｃ’、２３（それぞれ穴の径２ｍｍ）を設けた。また流路１３は、粒子導入流路１０１（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、狭窄流路１６（幅６μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅８００μｍ、長さ０．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅５１２μｍ、長さ３．７５ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅１μｍ、高さ０．４μｍ、長さ５μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅３μｍ、高さ１．２μｍ、長さ５μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、高さ４.０μｍ、長さ２０μｍとした。各粒子検出部の形状は図１５と同様であり、また式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、３．０とした。
　上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した粒子懸濁液を２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを４μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子回収流路１０２ａの粒子検出部１０３ａの電流値変化の測定の様子は図１７と同様に０．１μｍ標準粒子が確認され、粒子回収流路１０２ｃの粒子検出部１０３ｃの電流値変化の測定の様子は図１８と同様に０．５μｍ標準粒子が確認され、粒子回収流路１０２ｂの粒子検出部１０３ｂの電流値変化の測定の様子は図１９と同様に２．０μｍ標準粒子が確認された。
　また、測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図２４の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の濃度は、４．４１μｇ／ｍＬであり、０．５μｍ標準粒子の濃度は、３．６６μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、６．０８μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．１μｍ標準粒子の平均粒径は、０．１１２μｍであり、０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．４７０μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．０９μｍであった。
　以上から、本発明を用いて、複数の断面積の異なるアパーチャ、すなわち複数の検出可能粒子径範囲をもつ粒子検出部１０３を用いて、０．１～２μｍという広範な分布を持つサンプルでも、正確な粒子径測定が可能であることを確認した。
粒子検出
実施例４：粒子検出部による、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子混合サンプルの検出
　図１で示されるマイクロチップ１０の粒子検出部１０３ａ、ｂを図２５のように構成し、上述の製造実施例に基づき作製した。また、上述のサンプル調製実施例に基づきサンプルを調製した。０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子は、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液により、それぞれ５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製した。従って、サンプル中に含まれるポリスチレン粒子全体の濃度は１５μｇ／ｍＬとなるよう調製した。この時、マイクロチップ１０の各流路について、流路の高さはすべて４．５μｍとし、流路の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、流体排出口１０４ａ、１０４ｂ（それぞれ穴の直径２ｍｍ）を設けた。また、粒子検出部１０２の２つのアパーチャは、どちらも幅３．５μｍ、長さ２０μｍとした。また、式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、２．６とした。
　プレッシャーポンプＰ-ＰｕｍｐＢａｓｉc（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）の代わりに、シリンジポンプ（ＫＤＳ社）をインレット１４ａへ接続し、一定の流量で送液した点以外は同様にして、上述の通り電気的検出を行った。この時、調製した粒子懸濁液は２．５μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき各アパーチャへ流入した粒子を１分間検出した。この時の、粒子検出部１０３の電流値変化の測定の様子の一部を図２８に示した。図２８の通り、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子の電流値変化が確認された。
　また、測定結果をヒストグラムへまとめると図２９の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。また、測定結果から得られた０．５μｍ標準粒子の濃度は、５．２４μｇ／ｍＬであり、１．０μｍ標準粒子の濃度は、４．３８μｇ／ｍＬであり、２．０μｍ標準粒子の濃度は、７．８６μｇ／ｍＬであった。また、測定結果から得られた０．５μｍ標準粒子の平均粒径は、０．５１１μｍであり、１．０μｍ標準粒子の平均粒径は、０．９９１μｍであり、２．０μｍ標準粒子の平均粒径は、２．１４５μｍであった。
　以上から、本発明を用いて、流路内に電極をパターニングすることなく、正確な粒子径測定が可能であること確認した。
ＰＦＦによる粒子分離における流路硬さの影響
実施例５： デュロメータ硬さ７０
　　本発明による連続粒子分級方法の実施の形態を図３０の図面に従って詳細に説明するものとする。
　　ＬＳＲ７０７０（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ社製、硬さ７０）を用いてマイクロチップ１０を作製した。マイクロチップ１０は、２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有している。
　　基板１１の下面１１ａには、流路１３が形成されており、入り口側ポート１４ａ、１４ｂ、アウトレット１５（それぞれ穴の径２ｍｍ）、流路１３の全体の長さ、つまり、インレット１４ａ、１４ｂのある一方の端から、アウトレット１５のあるもう一方の端までの長さは１９ｍｍである。
　　流路１８から流路１７の深さはすべて２０μｍで分岐流路１８ａ、１８ｂ（幅１００μｍ、長さ８００μｍ）、狭窄流路１６（幅２０μｍ、長さ５０μｍ）、拡大流路１７（幅５００μｍ、長さ１０ｍｍ）の流路を作製した。
　　粒子の入っている流体１００Ｐは０．５ｗｔ％ ツイーン８０水溶液を用いて、直径２μｍの蛍光ポリスチレン－ジビニルベンゼン粒子（Ｆｌｕｏｒｏ－Ｍａｘ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μｇ／ｍＬに希釈し用いた。粒子の入っていない流体１００Ｎは０．５ｗｔ％ツイーン８０水溶液を用いた。
　　流体１００Ｐをインレット１４ａから、流体１００Ｎを１４ｂからシリンジポンプにより流量を調節してそれぞれ２０、１０００μL／ｈの流量で送液した。検出ライン２０を通過する蛍光粒子の軌跡を蛍光顕微鏡で動画に撮影し、粒子計１００個について図３０（ｃ）の下側壁面からの通過座標を測定することにより分離能を評価した。計測位置である検出ライン２０は狭窄流路１６の右端（拡大開始点）から１５０μｍの位置とした。
　　図３１（ａ）に測定結果を示したグラフを示す。横軸は検出ライン２０上の通過座標であり、縦軸は座標ごとのカウント数である。比較例２と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
実施例６：デュロメータ硬さ６０
　　マイクロチップ１０の作製に使用した素材をＬＳＲ７０６０（ＭＯＭＥＮＴＩＶＥ社製、硬さ６０）へ変更した点以外は実施例５と同様にして粒子の分離評価を行った。図３１（ｂ）に測定結果を示したグラフを示す。比較例２と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
実施例７：デュロメータ硬さ４４
　　マイクロチップ１０の作製に使用した素材をＳＩＬＰＯＴ１８４（ＴＯＲＡＹ社製、硬さ４４）へ変更した点以外は実施例５と同様にして粒子の分離評価を行った。図３１（ｃ）に測定結果を示したグラフを示す。比較例２と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
比較例２：デュロメータ硬さ３０
　マイクロチップ１０を作製するのに使用した素材をＬＳＲ７０３０（ＭＯＭＥＮＴＩＶＥ社製、硬さ３０）へ変更した点以外は実施例５と同様にして粒子の分離評価を行った。図３１（ｄ）に測定結果を示したグラフを示す。実施例５と比べて粒子分布が広く、分離精度が低いことがわかる。以上の結果を持って硬さ４０以上の素材を用いると分離精度を高めることが出来る。
粒子分離観察実施例：粒子の分離及び蛍光画像の取得
　ＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）の代わりに、ＳＹＬＧＡＲＤ　ＳＩＬＩＣＯＮＥ　ＥＬＡＳＴＯＭＥＲ　ＫＩＴ（東レ・ダウコーニング社）を用いて調整した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤の混合物（重量比１０：１）を用い、その他は製造実施例に記載の手順で作製したマイクロチップを用いて、直径０．２μｍ及び直径０．５μｍの粒子を用いて分離を検証した。０．２μｍ粒子として、蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＤＧ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長４８０ｎｍ、蛍光極大波長；５２０ｎｍ）、０．５μｍ粒子として蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＢＢ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長３６０ｎｍ、蛍光極大波長；４０７ｎｍ）を用いた。分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液を用い、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子を３．３ｎｇ／ｍＬ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子を７．５ｎｇ／ｍＬになるように調製した。分離対象の粒子を含有しない流体１００Ｎとしては０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液を用いた。ここで、用いた０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液は実験前にポアサイズ０．４５μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから用いた。シリンジポンプ（ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により流量を調節し、流体１００Ｐをインレット１４ａから、流体１００Ｎをインレット１４ｂから、それぞれ５、９０μL／ｈの流量で送液した。なお、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用した。各流体をマイクロチップ１０に導入し、導入しながら、それぞれ対応する波長の光で別々に蛍光画像を取得した。蛍光画像は、倒立型顕微鏡ＩＸ７１（オリンパス社）を用いて水銀ランプで所定の励起光を観察領域へ照射し、デジタルＣＭＯＳカメラＯＲＣＡ－ＦＬＡＳＨ（浜松ホトニクス社）で画像取得エリア３０を２秒間にわたり撮影することで取得した。０．２μｍの粒子及び０．５μｍの粒子でそれぞれ蛍光画像を作成後、検出ライン２０の蛍光プロファイルを解析した。蛍光プロファイルの横軸は検出ライン２０上の座標であり、縦軸は座標ごとの相対蛍光輝度を示している。なお、検出ライン２０は分岐点３１からアウトレット１５の方向へ２００μｍ下流地点に設定し、座標０を拡大領域壁面１７ａ側とした。また画像取得エリア３０は検出ライン２０が取得画像内に収まるよう設定した。
ＰＦＦによる粒子分離における流路構造の影響
実施例８：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
　図３２（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作成した。図３２（ａ）はマイクロチップ１０の上面図であり、図３２（ｂ）におけるＡ矢視図である。図３２（ｂ）は図３２（ａ）におけるＢ－Ｂ線による断面図であり、図３２（ｃ）は図３２（ａ）における領域２１の拡大図である。
　基板１１の下面１１ａには、基板１２を重ね合わせた際に流路１３を形成するように、加工を行った。流路１３の深さはすべて３．５μｍとした。流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、１４ｂ、アウトレット１５、２３（それぞれ穴の径１．５ｍｍ）を設けた。また流路１３は、分岐流路１８ａ（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、分岐流路１８ｂ（幅４０μｍ、長さ５００μｍ）、狭窄流路１６（幅３．３μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（幅２１５μｍ、長さ６．１５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅３００μｍ、長さ１．３ｍｍ）の流路からなった。
　上述の図３２（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を用いて、分離観察実施例にしたがって、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像を得た（図３２（ｄ）及び（ｅ））。直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０における蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３２（ｆ）、図３２（ｇ）に示す。これらの結果から直径０．２、０．５μｍの粒子がほぼ完全に分離している様子が確認できた。
比較例３：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅が段状に拡大し、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
　図３３（a）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例８のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａ、２４ｂが９０°で、狭窄流路壁面１６ａから拡大流路壁面１７ａまでの幅が５０μｍとなる点のみが実施例８と異なるよう設計したものを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ５、８０μL／ｈとなるよう設定した点以外は実施例８と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例８と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３３（ｄ）、図３３（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３３（ｆ）、図３３（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、部分的に重複が見られるため、性能が実施例８と比べて劣っていることがわかる。
比較例４：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路２２が配置され、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅は拡大しない粒子分離装置
　図３４（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例８のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが９０°、２４ｂが１８０°となるよう設計した点以外は実施例８と同様のマイクロチップ１０を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ５、８０μL／ｈとなるよう設定した点以外は実施例８と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例８と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度２４ａを９０°、２４ｂを１８０°としたため、拡大流路１７が狭窄流路に対して垂直方向に、ドレイン流路２２が狭窄流路に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ１０を用いた。つまり、本比較例は実施例８の狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路１７を狭窄流路２２に対して平行方向に、つまり実施例８と同じ方向に配置し、ドレイン流路２２が垂直方向で、実施例８とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路２２へ粒子が流れた。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路２２による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例８と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図３４（ａ）～（ｃ）に示す流路構造とした。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３４（ｄ）、図３４（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３４（ｆ）、図３４（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、部分的に重複が見られ、性能が実施例８と比べて大きく劣り、比較例３と比べても劣っていることがわかる。
実施例９：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、徐々に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置された粒子分離装置
　図３５（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例８のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが１８０°、２４ｂが１３５°で、拡大領域のスロープ部分４０の長さが１／√２ｍｍで、アウトレット１５と２３へ流れる流体の比が実施例８と同等になるよう、ドレイン流路の長さを５００μｍとした点以外は実施例９と同じ構造をもつマイクロチップ１０を用い、また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ３、９０μL／ｈとなるよう設定した点以外は実施例８と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例８と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３５（ｄ）、図３５（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３５（ｆ）、図３５（ｇ）に示す。これらの結果から、本実施例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、完全な分離が確認でき、分離性能が実施例８よりも優れていることがわかる。
比較例５：粒子が滑流する壁面１６ａ側に向けて徐々に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置され、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて流路幅は拡大しない、粒子分離装置
　図３６（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例９のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが１３５°、２４ｂが１８０°となるよう設計した点以外は実施例９と同様のマイクロチップ１０を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ３、９５μL／ｈとなるよう設定した点以外は実施例１０と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例９と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度２４ａを１３５°、２４ｂを１８０°としたため、拡大流路１７が狭窄流路１６に対して垂直方向に、ドレイン流路２２が狭窄流路１６に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ１０を用いた。つまり、本比較例は実施例９の狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路１７を狭窄流路２２に対して平行方向に、つまり実施例９と同じ方向に配置し、ドレイン流路２２が垂直方向で、実施例８とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路２２へ粒子が流れることになった。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路２２による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例９と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図３６（ａ）～（ｃ）に示す流路構造とした。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３６（ｄ）、図３６（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３６（ｆ）、図３６（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、不完全なものであることが確認でき、分離性能が実施例９よりも劣っていることがわかる。
実施例１０：実施例９の粒子分離装置のスロープ部分４０に、凹部を有する粒子分離装置
　図３７（ａ）～（ｄ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ１０は、実施例８とほぼ同じ構造であるが、拡大領域のスロープ部分４０の一部には、狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部分の拡大図を示す図３７（ｄ）に示すように、シース液側狭窄流路壁面１６ｂとスロープ部分４０との間に、流路壁面４１ａ、４１ｂ（共に長さ５０μｍ）により構成される部分的な凹部をもつマイクロチップ１０を用い、その他の実験条件は実施例１０と同じになるよう設定し、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例９と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３７（ｅ）、図３７（ｆ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図３７（ｇ）、図３７（ｈ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離は、完全な分離が確認でき、分離性能が実施例９とほぼ同等であることがわかる。
　ここまでの結果から、シース液側の狭窄流路壁面１６ｂと拡大流路壁面１７ｂとの角度２４ｂは、９０°よりも大きくすることが好ましいといえるが、たとえ９０°、またはそれ以下の角度であっても、それが部分的な凹部構造であって、かつその凹部構造が拡大流路やドレイン流路の幅よりも小さいのであれば、ＰＦＦによる粒子分離の観点からいえば、実質的にはシース液側の狭窄流路壁面１６ｂの下流側にスロープ部分４０のみが存在する場合と流体の流れはほぼ等価であるとみなすことができ、同等の分離性能を発揮できるといえる。
実施例１１：実施例９の粒子分離装置の狭窄流路幅、流路１３の深さを変更した粒子分離装置
　狭窄流路１６の幅を２μｍ、流路１３の深さを２μｍへ変更した点以外は同じ構造をもつマイクロチップ１０を粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ１０を用いて、０．１と０．２μｍ粒子の分離を検証した。分離する粒子としては、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＤＧ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長４８０ｎｍ、蛍光極大波長；５２０ｎｍ）と、直径０．１μｍの蛍光ポリスチレンビーズＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅＢＢ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製；吸収極大波長３６０ｎｍ、蛍光極大波長；４０７ｎｍ）を用い、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子は３．３ｎｇ／ｍＬに希釈し、直径０．１μｍの蛍光ポリスチレン粒子は６７ｎｇ／ｍＬに希釈し実験に用いた。また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ０．５、７５μL／ｈとなるよう設定した。なお、実施例９と同様に各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．１μｍ、直径０．２μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図３８（ａ）、図３８（ｂ）に示す。直径０．１μｍの粒子がアウトレット１５へ流れる拡大流路１７へ、０．２μｍの粒子がアウトレット２３へ流れるドレイン流路２２へそれぞれ流れる様子を観察し、１００ｎｍ程度の微小な粒子においても、本発明記載の内容で分離、回収可能であることを確認した。
実施例１２：拡大流路壁面１７ａが１７ｂへ向けて縮小し、粒子が滑流しない壁面１６ｂ側に向けて、段状に流路幅が拡大し、かつ拡大流路１７の拡大開始点１９にドレイン流路が配置された粒子分離装置
　図４１（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例８のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａが２１０°、２４ｂが９０°となるよう設計した点以外は実施例８と同様のマイクロチップ１０を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプＰ－ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ１０９０、１２００ｍｂａｒとなるよう設定した点以外は実施例８と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例８と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図４１（ｄ）、図４１（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図４１（ｆ）、図４１（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離が可能であることが確認できた。本結果から、拡大流路壁面１７ａは拡大させないことが好ましいことが示唆された。
比較例６：拡大流路壁面１７ａ、１７ｂが共に拡大し、かつ拡大流路１７の拡大終了点にドレイン流路２２が配置された粒子分離装置
　図４２（ａ）～（ｃ）で示されるマイクロチップ１０を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例８のマイクロチップ１０と比較して、狭窄流路１６と拡大流路１７との角度２４ａ、２４ｂが１６５°となるよう設計した点以外は実施例８と同様のマイクロチップ１０を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ１０７０、１２００ｍｂａｒとなるよう設定した点以外は実施例８と同じ実験条件で、同様に直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例８と同様に、各流量は最も２つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
　直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の積算画像をそれぞれ図４２（ｄ）、図４２（ｅ）に、直径０．２μｍ、直径０．５μｍの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン２０の蛍光プロファイルを示したグラフをそれぞれ図４２（ｆ）、図４２（ｇ）に示す。これらの結果から、本比較例での直径０．２、０．５μｍ粒子の分離が不完全であることが確認できた。本結果からも、拡大流路壁面１７ａは拡大させないことが好ましいことが示唆された。
　１０　　マイクロチップ
　１１　　基板
　１１ａ　　下面
　１２　　下面基板
　１３　　流路
　１４、１４ａ、１４ｂ　　インレット
　１５、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ　　アウトレット
　１６　　狭窄流路
　１６ａ　　サンプル液側狭窄流路壁面
　１６ａ　　狭窄流路１６の内壁
　１６ｂ　　シース液側狭窄流路壁面
　１７　　拡大流路
　１７ａ　　サンプル液側拡大流路壁面
　１７ｂ　　シース液側狭拡大路壁面
　１８ａ、１８ｂ　　分岐流路
　１９　　拡大開始点
　２０　　検出ライン
　２１　　領域
　２２　　ドレイン流路
　２３　　アウトレット
　２４ａ、２４ｂ　　角度
　３０　　画像取得エリア
　３１　　分岐点
　４０　　スロープ部分
　４１ａ、４１ｂ　　流路壁面
　５０　　粒子
　５１　　粒子の流れる方向
　５２　　アパーチャ形成構造
　５３、５３’、５３’’　　アパーチャ
　５４、５４ａ、５４ｂ、５４ａ’、５４ｂ’、５４ａ’’、５４ｂ’’　　電極
　５５　　導線
　５６　　電気測定器
　５７　　電源
　５８　　導電性溶液
　５９　　電極挿入口
　６０　　中継流路
　６１　　解析部
　６２　　粒子検出流路
　１００　　流体
　１００Ｐ　　粒子を含む流体
　１００Ｎ　　粒子を含まない流体
　１０１　　粒子導入流路
　１０１ｄ　　分岐流路
　１０２ａ～ｃ　　粒子回収流路
　１０２ａ’～ｃ’　　分岐流路
　１０３ａ～ｃ　　粒子検出部
　１０３ａ’～ｃ’　　粒子検出部
　１０４ａ～ｃ　　アウトレット
　１０５　　分岐流路
　１１０　　粒子分離流路
　１１０Ａ　　分岐部
　１１０Ｂ　　粒子拡散流路
　１２０　　分岐部
　１９０　　領域
　２００　　流線のプロファイル
　２１０ａ、ｂ　　ベクトル
　３００ａ、ｂ　　粒子

Claims (21)

  1. 　粒子がその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離される粒子分離流路と、前記粒子分離流路に分岐して接続された２以上の粒子回収流路とを含む粒子検出装置であって、前記粒子回収流路がアパーチャと電気検出器とを含む粒子検出部を備えることを特徴とする、前記粒子検出装置。
  2. 　各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲が互いに異なることを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
  3. 　各粒子回収流路にある粒子検出部のアパーチャで検出できる粒子径範囲の一部が、互いに重複していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の粒子検出装置。
  4. 　前記粒子回収流路の、本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
  5. 　前記粒子分離流路が、１の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
  6. 　流体中に含まれる粒子を検出する方法であって、
    　粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
    　分離された粒子を２以上の流路に分断し、
    　前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出することを
    　特徴とする、前記方法。
  7. 　前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記電気検出器の検出できる粒子径範囲の一部が設置している流路によって互いに重複していることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断することを特徴とする、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記粒子分離流路が、１の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記粒子検出部の下流に流体排出口を備え、
    　前記電気検出器の電極が、流体排出口に備えられていることを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
  12. 　前記粒子分離流路において、流路の壁が、外側方向に膨張しにくい素材で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
  13. 　前記素材が、デュロメータ硬さ４０以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の粒子分離装置。
  14.  前記粒子分離流路において、流路の壁が、外側方向に膨張しにくい条件で粒子分離が行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  15. 　分離対象の粒子を含有する流体の流量が、他の流体の流量よりも小さいことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  16. 　分離対象の粒子を含有する流体と、他の分岐流路に導入された流体とが、合流して形成される流路において層流を形成することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  17. 　前記粒子分離流路が、一方の末端側に流体導入口を備え、もう一方の末端側において他の分岐流路と合流する２以上の分岐流路、当該２以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び狭窄流路のもう一方の末端に接続し、流路幅が拡大された拡大流路を含み、前記２以上の粒子回収流路が拡大流路に接続されており、１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入した場合に、狭窄流路の壁面に沿って粒子が滑流し、前記拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大することを特徴とする、請求項１に記載の粒子検出装置。
  18. 　粒子が滑流しない壁面側に向けて、流路幅が徐々に拡大することを特徴とする、請求項１７に記載の粒子分離装置。
  19. 　粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が徐々に拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度２４ｂが９０°以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の粒子分離装置。
  20. 　粒子が滑粒しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が徐々に拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の拡大する角度２４ｂが１３５°以上であることを特徴とする、請求項１９に記載の粒子分離装置。
  21. 　粒子が滑流する壁面側で渦流れの発生や粒子拡散を抑制する条件で粒子分離がされることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
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