CN110506201A - 粒子检测装置和粒子检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够逐个且连续地检测广范围的粒子的粒子检测装置和粒子检测方法。通过如下的粒子检测装置来解决这个课题，该粒子检测装置包括根据粒子的粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子的粒子分离流路和以分支形式连接于所述粒子分离流路的两个以上的粒子回收流路，该粒子检测装置的特征在于，所述粒子回收流路具备包括光阑和电检测器的粒子检测部。

Description

粒子检测装置和粒子检测方法
技术领域
本发明涉及一种粒子检测装置和粒子检测方法。
背景技术
在各种工业领域中将由无机物、有机物、金属等构成的固形物作为材料应用的情况下，例如作为一次原料以粉末形式提供，并且将粉末成形为球状粒子、或者成形为其它形状而作为产品来提供。关于这些材料(固形物)，考虑物理属性等进行设计以提高最终产品的性能。另外，也存在很多将球状粒子应用为最终产品的例子，例如列举粉碎用球(氧化铝、氧化锆、二氧化硅等)、液晶用间隔物(树脂、二氧化硅等)、色谱用分离材料、其它吸附剂等。关于像这样的粒子产品，一般而言，形状、尺寸、密度均匀对于作为最终形态的产品的特征有较大影响，从而现状是要求更均匀的粒子。
作为像这样的粒子的制造法，存在如下两种方法：开发从最初就制造均匀粒子的技术；以及从存在不均匀分布的粒子中取出需要的尺寸、密度、形状的粒子。前者是比较新的技术，需要更新制造设备，但是后者能够针对现行设备进行追加，因此比较容易添加到制造工艺中。作为后者的技术，如果是数十μm以上的粒子，则例如存在过滤分离法(也包括筛分分级)、重力分级法、离心分离法、旋流分离法等。
上述列举的分离或分级法对于数十μm以下的粒子、特别是10μm以下的粒子分离是非常困难的，并且一般而言是分批式的工艺，很难连续地分离。在分批式的工艺中，一次的处理量由分离收率决定，因此需要比较大的设备(初始原料的储存容器、提供设备、不需要的产品的回收容器)。例如，筛分分级法面向大量处理，但是需要逐渐地改变筛孔的尺寸，因此为分批式工艺。重力分级法基本上也是与筛分分级法同样的分批工艺，随着粒子尺寸变小而进行处理要花费巨大的时间。离心分离法、旋流分离法虽然适于高速处理，但是需要大型装置，从而不适于连续工艺。
但是，如果能够连续地分级，则能够将初始原料的准备量和制造量减小到极限。另外，在医疗方面，为了在利用抗原抗体反应进行检查时分离不与粒子所吸附的荧光物质发生反应的成分，存在被称为B/F分离的工序，在像这样的微小量的检查体检查中也利用了粒子分离。但是，此处使用的粒子分离大多是使用磁性粒子进行利用磁体的粒子分离和清洗，因此存在本工序花费时间的问题。
另外，作为分离更微小的粒子(DNA、疫苗等)的技术，也存在称为布朗棘轮(Brownian ratchet)的如下技术(非专利文献1)：使微小加工而成的钩状的突起有规律地排列，使用粒子的布朗振动来从成为主流的流动轨迹中分流(分离)出目标尺寸的DNA或疫苗。其中，在该方法中，作为分离模式，利用布朗振动而形成分流，因此分离速度慢，主要的流动形成是以电泳方式实施，分离花费时间、特别是对于直径1μm以上的粒子而言分离需要庞大的时间，并在该期间内受到干扰的影响等，由此存在不堪实用的问题。
另外，作为基于大小来对细胞进行分离或分级的方法，已知如下一种方法：通过使用FACS测定前向散射光，来测定细胞的大小并进行分离。FACS能够从大量的微颗粒、细胞中大致地分离目标物，但是由于细胞的形状、折射率的影响，因此难以准确地分离少量的微颗粒、细胞，并且不耐冲击的目标物有可能在分离时受到破坏。
存在用于从具有各种大小的粒子中分离特定大小的粒子的技术和装置，例如列举筛分分级法、重力分级法、离心分离法、电泳法等，但是各方法虽然适于分批式处理，但不适于连续的分离处理。
另一方面，近年来，有报告指出如下研究(非专利文献2至4)：通过使用利用微细加工技术制作出的宽度为数微米～数百微米的微小的流路结构(微流路)，来准确地分离微颗粒、细胞。一般而言，在微流路内，形成稳定的层流，能够以微米级任意地控制其流动的分布，因此能够利用这样的特征来准确且连续地分离微颗粒、细胞。
例如在专利文献1中报告了根据大小来准确且连续地分离细胞·微颗粒的捏流分选(Pinched Flow Fractionation)(下面记载为PFF)的方法。作为该方法的优点，列举以下几点等：不需要所述FACS中所需要的光学系统·信息处理系统等复杂的设备·装置，能够容易地进行连续的微颗粒、细胞分离；虽然是利用一个因素的分离，但是能够分离为多个分组(fraction)，也就是说，例如在以大小进行分离的情况下，不只是大的一方和小的一方这两个等级，能够基于大小分离为三组以上的群；以及通过进行流路的并行化等，能够进行大量·高速的微颗粒、细胞的分离。
关于PFF，是能够连续且精确地进行分离的技术，是着眼于以下内容而完成的，该内容是从多个分支向直径局部变细的流路(下面记载为狭窄流路)导入流体，并对粒子在垂直于流动的方向上的位置进行控制，之后在粒子流动至直径相对较粗的流路(下面记载为扩大流路)时，根据粒子在狭窄流路内的位置不同而流动施加于粒子的力的方向不同。如专利文献1中记载的那样，能够使用具有两个进口的结构，例如从一个进口流动含有目标粒子的溶液，从另一个进口流动不含目标粒子的溶液，由此能够实施PFF。
在PFF中，为了更高精度地进行分离，重要的是使粒子向狭窄流路的壁面排列，为此重要的是含有粒子的溶液(下面记载为样本溶液)的送液流量小于不含粒子的溶液(下面记载为鞘液)的送液流量，并且调整含有粒子的溶液的送液流量与不含粒子的溶液的送液流量之比、狭窄流路的宽度及其长度、扩大流路的宽度、狭窄流路与扩大流路的宽度之比、各流路的高度。
作为通过逐个地一个一个测定粒子从而能够准确地检测少数的粒子群的技术，已知有使用电检测的库尔特(Coulter)法(电感应区法；下面为ESZ)(例如参照非专利文献5)。关于该方法，从各检测单元获得的信息(信号(signal))与各粒子一一对应，因此能够对各个粒子进行评价，即使是在数量上所含比例较少的粒子也能够准确地测定，但是存在能够测定的粒径范围(动态范围)比较窄的问题。例如，关于ESZ，使用在使粒子通过被称为光阑的较小的孔时产生的电信号来计算粒径，但是一般认为其动态范围是光阑直径的2％～60％。另外，关于ESZ，在存在比光阑大的粒子的情况下，光阑因该粒子而发生堵塞，之后无法进行测定，因此需要通过具有光阑直径以下的直径的过滤器去除较大的粒子后进行测定。然而，在过滤操作中，由于经常发生粒子向过滤器基材的吸附，因此担心损失一部分样本。另外，还存在在该时间点能够获得定量结果的可能性减小的问题，因此准确地测定出了样本中的粒径分布的情况下是不期望进行过滤操作的。另外，需要反复使用进行粒子检测的部分，需要进行每次测定都进行清洗以没有样本残留那样的管理，从而操作变得繁杂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-205387号公报
非专利文献
非专利文献1：Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，96，23，13165-13169，1999.
非专利文献2：Analytical Chemistry，76，5465-5471，2004.
非专利文献3：Lab on a chip，5，1233-1239，2005.
非专利文献4：Lab on a chip，6，974-980，2006.
非专利文献5：R.W.De Blois.et al、The Review of Scientific Instruments、Volume 41、Number 7、pp909-916(1970)
非专利文献6：Lab on a chip，5，778-784，2005.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种能够逐个且连续地检测广范围的粒子的粒子检测装置和粒子检测方法。
用于解决问题的方案
本发明人们鉴于上述问题发现：通过在将粒子根据其粒径向垂直于流体流动的方向分离之后由检测器进行检测，能够进行具有较广的分布的粒子试样测定。
即，本发明涉及一种粒子检测装置，具有根据粒子的粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子的粒子分离流路和以分支形式连接于所述粒子分离流路的两个以上的粒子回收流路，所述粒子检测装置的特征在于，所述粒子回收流路具备包括光阑和电检测器的粒子检测部。
另外，在本发明中，可以是，存在于各粒子回收流路中的粒子检测部的光阑能够检测的粒径范围互不相同，也可以是，光阑能够检测的粒径范围的一部分相互重叠。
并且，在本发明中，设为如下的流路结构：调整所述粒子回收流路的条数、分支部的形状、宽度、高度、长度中的至少一个参数，使得某固定大小以上的大小的粒子不会混入。由此，能够避免光阑阻塞。另外，通过调整这些参数，能够使各粒子回收流路的光阑能够检测的粒径的粒子流入粒子回收流路。
在利用ESZ的粒子检测中，也寻求提供在确保定量性的同时更廉价的粒子检测装置。鉴于该问题发现：通过在由具有光阑的电检测器构成的粒子检测部上连接配置有电极的流体排出口，能够制造在确保定量性的同时更廉价且能够一次性使用的粒子检测装置。即，在上述的粒子检测装置中，也可以是，还包括以下特征：在所述粒子检测部的下游具备流体排出口，所述电检测器的电极被设置于液体排出口。
并且，在本发明中，所述粒子分离流路也可以设为利用了PFF原理的流路结构。具体地说，能够在粒子分离流路中形成利用了PFF原理的流路结构。由此，能够根据粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子。需要提供能够通过更简单的方法来利用PFF更高精度地分离粒子的粒子分离流路以及使用该流路的粒子分离方法，鉴于该问题，经研究发现能够通过使流路的材质变硬来抑制流路壁向外方向膨胀，由此不是提高一般设想的流动粒子的位置的准确度(Accuracy)，而是流动的粒子位置的精度(Precision)提高。基于该发现，实现了能够利用PFF更高精度地分离粒子的粒子分离流路、具备该粒子分离流路的粒子检测装置以及利用该粒子分离流路和/或粒子检测装置的粒子的分离或检测方法的发明。此外，此处的“准确度”表示距扩大区域壁面的粒子位置的理论值与测定值之间的偏离程度，“精度”表示距扩大区域壁面的粒子位置在多次测定时具有何种程度的再现性。
在此，本说明书中的硬度是指计示硬度(使用A型硬度计)，通过施加了固定载荷时的物质的变形量进行定义，硬度越大则该变形量越小。
在PFF中，在粒子向狭窄流路壁面排列的送液条件中，在扩大流路内的粒子位置能够根据粒子的粒径、狭窄流路宽度以及扩大流路宽度进行预测。然而，一般而言，有流体流动的微流路内壁面始终受到流体的剪切力，因此在送液过程中被施加向微流路扩大方向的力。因而，在扩大流路内的粒子位置的预测中需要考虑因送液引起的各流路的膨胀。
在是由包括聚二甲基硅氧烷(下面记载为PDMS)的具有弹性的硅树脂制成的流路的情况下，能预想到送液引起的各流路的膨胀、特别是狭窄流路的宽度容易受到影响，因此可以说通过使用不易膨胀的材料、即变为硬度更大的树脂，能够更准确地预测在扩大流路内的位置。此外，关于深度方向，没有特别地限定，可以是进行膨胀的材料。此处所说的狭窄流路的宽度是指流路的在垂直于狭窄流路的内壁16a的壁面的方向(下面记载为宽度方向)上的长度，深度是指流路的在垂直于宽度方向的方向(下面记载为深度方向)上的长度。然而，该方法是提高粒子位置的“准确度”，认为与提高使所流动的所有粒子每次都流过固定的位置这样的“精度”无关。
然而，在本发明中发现，通过增大流路的硬度从而粒子流动的位置的精度提高。认为这是由于，通过抑制各流路的膨胀，能够防止因流路的扩展引起的流速的不均，从而使粒子高精度地向狭窄流路的壁面排列。
本发明人们进一步对利用PFF原理的流路结构进行了各种研究的结果发现，在粒子分离流路中，通过设为扩大流路的内壁17a以向粒子滑流的壁面侧流路宽度不扩大的方式与狭窄流路的内壁16a进行连接的结构，能够分离纳米～微米尺寸的粒子。即，本发明涉及一种构成为扩大流路的内壁17a相对于狭窄流路的内壁16a不向用于导入含有粒子的样本溶液的端口14a侧扩大的粒子分离流路、具备该粒子分离流路的粒子检测装置以及使用了所述粒子分离流路或粒子分离装置的粒子的分离和/或检测方法。
并且，通过狭窄流路的粒子滑流的壁面侧的内壁16a与扩大流路的同侧(粒子滑流的壁面侧)的内壁17a在平面内连接，能够更高精度地分离粒子。还发现：通过使流路宽度朝向没有粒子滑流的壁面侧逐渐增大，也就是说通过在狭窄流路16的壁面与扩大流路17的壁面之间尽可能不设置角度，使粒子的分离精度更高。
一般地，微流路内是相比于惯性力而粘性力处于支配地位的空间，在雷诺数为2300以上那样的湍流条件下使流体流动并不简单，因此前提是微流路内的流体以层流方式流动。这是因为，在如雷诺数为2300以上那样使流体流动的情况下，需要使流体以数m/sec以上的高流速向微流路内流动，因此压力损失为远超数MPa的值，从而给予送液泵的压力负荷、流路的断裂等成为问题，难以进行送液。因而，虽然并不意图在理论上进行限定，但是在利用PFF的流路内，流体基本上也是以层流方式流动，因此考察出本发明的效果不是通过在微流路内产生湍流而获得的。
另一方面，在PFF中，在粒子从狭窄流路侵入到扩大流路时，由于流路的宽度大幅变化，因此在扩大流路的位于狭窄流路侧的入口处，流速分布显著地变化。因而，在本发明中，发现了由于该显著的流速分布变化而在流路内、特别是在流路宽度变化的扩大区域入口附近的壁面附近有可能产生涡流。因此，虽然并不意图在理论上进行限定，但是认为通过尽可能地降低该涡流，能够抑制排列到壁面附近的粒子因涡流的影响而扩散，从而能够进行更微小的粒子的分离。
另外，作为本发明的其它方式，还列举一种用于检测流体中含有的粒子的方法，其特征在于，
根据粒子的粒径，向垂直于流体流动的方向分离粒子，
将分离后的粒子向两个以上的流路分割，
通过电检测器来检测所述粒子，所述电检测器包括以夹持设置于所述流路的光阑的方式配置的电极。
在所述方法中，可以是，所述电检测器能够检测的粒径范围根据所述电检测器被设置的流路而不同，也可以是，能够检测的粒径范围的一部分根据所述电检测器被设置的流路而相互重叠。另外，也可以是，通过调整条数、分支部的形状、宽度、高度、长度中的至少一个参数而设为某固定大小以上的大小的粒子不会混入的流路结构，来将粒子向两个以上的流路分割，或者利用PFF原理来分离粒子。作为一例，通过驱动本发明的粒子检测装置来实施本发明的方法。
发明的效果
根据本发明，能够高精度且连续地检测具有更广的粒径分布的样本，与分批处理的分离技术相比，能够进行大量的粒子样本的测定。
附图说明
[图1]图1(a)、(b)是示出本发明的一个实施方式的图，示出针对粒子分离流路110应用流体动力过滤(Hydrodynamic Filtration：HDF)并具备用于检测分离后的粒子的粒子检测部103a、103b的微芯片(microchip)10。图1(a)是微芯片10的顶视图，图1(b)是图1(a)中的区域190的放大图。
[图2]图2(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出将两个粒子检测部103以串联方式配置的情况下的方式。图2(b)是示意性地示出在一个粒子连续通过两个粒子检测部103的情况下测定出的电流值的经时变化的情形的图，上侧的曲线表示由上游侧的粒子检测部103测定出的电流值，下侧的曲线表示由下游侧的粒子检测部103测定出的电流值。在此，为了方便，使两个粒子检测部103的曲线在纵轴上的位置错开，但是实际上成为粒子不通过时的基线的电流值大致相同。
[图3]图3(a)是示出本发明的一个实施方式的图，是将两个光阑以串联方式配置的情况，与图2不同，示出仅使用一对电极的情况下的方式。图3(b)是示意性地示出在粒子连续通过两个光阑的情况下测定出的电流值的经时变化的情形的图。
[图4]图4(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出针对一个粒子回收流路102以并联方式设置有多个粒子检测部103的情况下的方式。图4(b)示出图4(a)的等效电路。
[图5]图5(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出针对一个粒子回收流路102以并联方式设置有多个粒子检测部103的情况下的方式，示出多个粒子检测部103是通过从流体的下游侧的电极施加电压来降低多个粒子检测部103之间的电干扰的方式。图5(b)示出图5(a)的等效电路，示出多个粒子回收流路102相独立的情形。
[图6]图6是示出本发明的一个实施方式的图，示出针对一个粒子回收流路102以并联方式设置多个光阑并在各光阑的下游配置电极、但是通过使上游的电极共用由此能够作为更低成本的装置利用的方式。
[图7]图7示出使用了中继流路60和电极插入口59的用于更廉价地制作粒子检测部103的方式。
[图8]图8(a)～(c)是示出本发明的一个实施方式的图，示出在粒子分离流路110中应用了HDF的方式。图8(a)示出粒子回收流路102为两个的流路，图8(b)示出粒子回收流路102为三个的流路，图8(c)示出粒子回收流路102为三个且在粒子分离流路110具有分支流路105的流路。
[图9]图9(a)是示出图8(b)的分支部110A中的流体的流动的图，图9(b)示出图9(a)的直线流路部分的放大图。
[图10]图10(a)是示出层流条件下直线流路内的粒子的流动的图，图10(b)示出粒子扩散流路110B中的粒子的流动的轨道。
[图11]图11是示意性地示出PFF原理的图。示出从两个分支导入的流体的运动状态和粒子分离的情形。
[图12]图12(a)～(c)是示出本发明的一个实施方式的图，示出在粒子分离流路110中应用了PFF的方式。图12(a)示出粒子回收流路102为两个的流路，图12(b)示出粒子回收流路102为三个的流路，图12(c)示出图12(a)、(b)的区域21的放大图。
[图13]图13(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出在粒子分离流路110中应用了AsPFF的方式。图13(b)和(c)示出图13(a)的区域21的放大图。
[图14]图14(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出在粒子分离流路110中应用AsPFF且扩大流路17的位于狭窄流路壁面16b侧的壁面逐渐扩大的情况下的方式。图14(b)示出图14(a)的区域21的放大图。
[图15]图15是示出本发明的一个实施方式的图，示出由两个光阑构成粒子检测部103、各个光阑的下游连接至出口(outlet)且各出口还作为电极插入口59发挥功能的方式。
[图16]图16(a)示出实施例1中使用的微芯片10的概要图。图16(b)示出图16(a)的区域21的放大图。
[图17]图17是示出在实施例1中由粒子检测部102a检测出的0.1μm、0.2μm粒子的电信号的一例的图。
[图18]图18是示出在实施例1中由粒子检测部102c检测出的0.2μm、0.5μm粒子的电信号的一例的图。
[图19]图19(a)、(b)是示出在实施例1中由粒子检测部102b检测出的0.5μm、1.0μm、2.0μm粒子的电信号的一例的图，图19(a)示出0.5μm、1.0μm粒子的电信号，图19(b)示出2.0μm粒子的电信号。
[图20]图20示出根据实施例1中的测定结果制作出的混合粒子样本的粒度分布。
[图21]图21示出根据比较例1中的测定结果制作出的混合粒子样本的粒度分布。
[图22]图22示出根据实施例2中的测定结果制作出的抗体聚集体样本的粒度分布。
[图23]图23(a)是示出本发明的一个实施方式的图，示出在粒子分离流路110中利用HDF分离粒子之后具备三个粒子回收流路和在各粒子回收流路设置有两个粒子检测部的方式。图23(b)示出区域21的放大图。
[图24]图24示出根据实施例3中的测定结果制作出的混合粒子样本的粒度分布。
[图25]图25是示出本发明的概要的图，是示出使粒子50流入光阑53a或53b并通过在两个流体排出口配置的电极54a、54b来基于ESZ原理进行粒子检测的方式的图。
[图26]图26示出用于实施本发明的其它方式的微芯片10。图26(a)、(b)是微芯片10的顶视图，图26(c)示出其等效电路。
[图27]图27示出用于实施本发明的其它方式的微芯片10。图27(a)是微芯片10的顶视图，图27(b)示出粒子检测部的放大图，图27(c)示出其等效电路。
[图28]图28示出实施例4中的粒子检测部103的电流值变化的测定情形的一部分。
[图29]图29是将实施例4的测定结果汇总成直方图所得到的图。
[图30]图30示出具备本发明的用于执行连续粒子分离法的粒子分离流路的实施方式的微芯片10，图30的(a)是图30的(b)中的A向视图，图30的(b)是图30的(a)中的B-B线的截面图，图30的(c)是图30的(a)中的区域21的放大图。
[图31]图31的(a)是使用由硬度70的材料制成的微芯片10分离2μm粒子的分离评价(实施例5)、(b)是使用由硬度60的材料制成的微芯片10分离2μm粒子的分离评价(实施例6)、(c)是使用由硬度44的材料制成的微芯片10分离2μm粒子的分离评价(实施例7)、(d)是使用由硬度30的材料制成的微芯片10分离2μm粒子的分离评价(比较例2)。
[图32a-c]图32(a)～(c)示出具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的微芯片10。图32(a)是微芯片10的顶视图，是图32(b)中的A向视图。图32(b)是图32(a)中的B-B线的截面图，图32(c)是图32(a)中的区域21的放大图。
[图32d-g]图32(d)～(g)是示出使用图32(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图32(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图32(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图32(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图32(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图33a-c]图33(a)～(c)示出现有技术的微芯片10，作为本发明所涉及的图32的微芯片10的比较而示出。图33(a)是微芯片10的顶视图，是图33(b)中的A向视图。图33(b)是图33(a)中的B-B线的截面图，图33(c)是图33(a)中的区域21的放大图。
[图33d-g]图33(d)～(g)是示出使用图33(a)～(c)所示的现有技术的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图33(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图33(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图33(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图33(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图34a-c]图34(a)～(c)示出在具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的图33的微芯片10中将扩大流路的扩大的壁面反过来设计而成的用于比较的微芯片10。图34(a)是微芯片10的顶视图，是图34(b)中的A向视图。图34(b)是图34(a)中的B-B线的截面图，图34(c)是图34(a)中的区域21的放大图。
[图34d-g]图34(d)～(g)是示出使用图34(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图34(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图34(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图34(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图34(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图35a-c]图35(a)～(c)示出具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的微芯片10。图35(a)是微芯片10的顶视图，是图35(b)中的A向视图。图35(b)是图35(a)中的B-B线的截面图，图35(c)是图35(a)中的区域21的放大图。如图35(c)所示那样构成为扩大流路的流路宽度逐渐地扩大。
[图35d-g]图35(d)～(g)是示出使用图35(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图35(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图35(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图35(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图35(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图36a-c]图36(a)～(c)示出在具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的图35的微芯片10中将扩大流路的扩大的壁面反过来设计而成的用于比较的微芯片10。图36(a)是微芯片10的顶视图，是图36(b)中的A向视图。图36(b)是图36(a)中的B-B线的截面图，图36(c)是图36(a)中的区域21的放大图。
[图36d-g]图36(d)～(g)是示出使用图36(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图36(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图36(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图36(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图36(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图37a-d]图37(a)～(d)示出具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的微芯片10。图37(a)是微芯片10的顶视图，是图37(b)中的A向视图。图37(b)是图37(a)中的B-B线的截面图，图37(c)是图37(a)中的区域21的放大图。图37(d)是将狭窄流路16与扩大流路17的连接点(扩大开始点)进一步放大示出的图。如图37(d)所示那样在斜坡部分40具有由流路壁面41a、41b(均为长度50μm)构成的局部的凹部。
[图37e-h]图37(e)～(h)是示出使用图37(a)～(d)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图37(e)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图37(f)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图37(g)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图37(h)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图38]图38是示出使用对图35的微芯片10仅变更狭窄流路16的宽度和流路13的深度后的微芯片10分离出0.1μm荧光聚苯乙烯珠和0.2μm荧光聚苯乙烯珠的图。图38(a)是分离出的0.1μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图38(b)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。
[图39]图39示出以在具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的图32的微芯片10中设置多个出口15a、15b以及15c的方式进行改进后的微芯片10。图39的(a)是微芯片10的顶视图，是图39的(b)中的A向视图。图39的(b)是图39的(a)中的B-B线的截面图，图39的(c)是图39的(a)中的区域21的放大图。
[图40]图40(a)～(c)示出针对具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的图35的微芯片10的扩大流路施加了认为不对分离能力产生影响的变更后的微芯片10。
[图41a-c]图41(a)～(c)示出以在具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的实施方式的图32的微芯片10中使扩大流路壁面17a向17b侧延伸的方式设计而成的用于比较的微芯片10。图41(a)是微芯片10的顶视图，是图41(b)中的A向视图。图41(b)是图41(a)中的B-B线的截面图，图41(c)是图41(a)中的区域21的放大图。
[图41d-g]图41(d)～(g)是示出使用图41(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图41(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图41(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图41(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图41(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
[图42a-c]图42(a)～(c)示出以在具备本发明的用于实施连续粒子分离方法的粒子分离流路的实施方式的图35的微芯片10中使扩大流路的壁面17a、17b逐渐地扩大的方式设计而成的用于比较的微芯片10。图42(a)是微芯片10的顶视图，是图42(b)中的A向视图。图42(b)是图42(a)中的B-B线的截面图，图42(c)是图42(a)中的区域21的放大图。
[图42d-g]图42(d)～(g)是示出使用图42(a)～(c)所示的本发明所涉及的微芯片10分离出0.2μm荧光聚苯乙烯珠和0.5μm荧光聚苯乙烯珠的图。图42(d)是分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像，图42(e)是分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像。图42(f)是绘制分离出的0.2μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图，图42(g)是绘制分离出的0.5μm荧光聚苯乙烯珠的积分荧光图像的检测线20上的荧光分布所得到的曲线图。
具体实施方式
下面，使用附图详细地说明用于实施本发明的方式。但是，本发明能够以不同的方式实施，并不仅仅限定于下面示出的实施方式、实施例的例示。
<粒子检测装置>
基于图1说明本发明的实施方式的详细内容，图1是示出本发明的粒子检测装置的装置结构的一个实施例的示意图。从流路结构制作上的容易度出发，期望微芯片10中的流路的截面为矩形，但是也可以是圆形、椭圆形、多边形等的截面，并且还可以是局部为矩形以外的形状。另外，从制作的容易度出发，优选的是流路高度是均匀的，但是也可以是深度局部不同。粒子检测装置包括能够根据粒子的粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子的粒子分离流路和以分支形式连接于该粒子分离流路的两个以上的粒子回收流路。
该微芯片10是用于根据粒子的大小来分离粒子并通过使用适当的检测系统来测定粒径和粒径分布的微芯片，例如具有通过由PDMS等高分子(聚合物)材料形成的两张平板状的基板11和基板12来形成的平板状的结构。
此外，作为在制作微芯片10时使用的技术，例如模塑、压花这样的使用铸模的制作技术在能够准确且容易地制作流路结构方面是优选的，但是除此以外还能够使用湿蚀刻、干蚀刻、纳米压印、激光加工、电子束直接绘图、机械加工等制作技术。
含有粒子的样本从作为流体导入口的进口14被导入，通过送液部向流路下游输送，通过粒子导入流路101、粒子分离流路110、粒子回收流路102a或102b、各自对应的粒子检测部103a或103b后流出到作为流体排出口的出口104a或104b。在粒子分离流路110中，根据粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子，分离后的粒子向粒子回收流路102a或102b流动。在经过粒子回收流路102a或102b而到达的粒子检测部103a、103b中被进行电检测。此时，粒子检测部103a、103b的内部被含有电解质的溶液充满，经由与电极54a、54b分别连接的导线55而与电测定器56、电源57连接。在粒子检测时，通过电源57使任意值的电流流动，经由光阑53形成了闭路。并且，电测定器56与分析部61连接，在分析部61中对从电测定器56获得的检测信号进行计算，并制作粒径分布。
含有粒子的样本是含有设为测定对象的粒子的流体。本发明中的粒子的粒径例如处于1nm～100μm的范围，优选为10nm～10μm的范围，本发明中的粒子例如包括核酸、蛋白质、膜泡、细胞外膜泡、无机粉末、金属胶体、高分子粒子、病毒、细胞、细胞群、蛋白质凝集体等。另外，本发明中的流体是导电性的流体，优选为含有电解质的水溶液，也能够使用导电性的油、脂。另外，也可以向所述水溶液中加入表面活性剂等添加物。
进口14只要是能够保持含有粒子的样本的结构即可，优选为凹型结构。另外，作为材质，可以使用偏析物少的金属、玻璃、陶瓷，但是为了低成本地进行制造而优选由高分子材料形成。粒子导入流路101形成于进口14与粒子分离流路110之间。粒子导入流路101是为了辅助粒子分离流路110中的粒子分离而配置的，但是也可以省略以使微芯片10小型化。
送液部可以使用注射泵、蠕动泵(peristaltic pump)、压送泵等利用压力梯度进行送液的方法，也可以使用电渗流泵以抑制微芯片10的流路截面处的不均匀的速度分布。在该情况下，自泵起连接的配管直接连接至进口14，由此通过向进口14内所保持的样本施加压力来进行送液。另外，也可以是将泵经由配管连接至出口，通过施加负压来抽吸微芯片10的流路内的流体，从而进行送液。并且，也可以是通过使进口14的液面高于出口104a或出口104b的液面，来利用液面差进行送液，在该情况下，不需要送液部。为了更加定量地进行测定，优选利用压力梯度来使粒子通过，通过脉动更少的压送泵进行送液的方式是最优选的。
优选的是，送液部的流量根据流路的截面积、光阑的截面积而设定为任意的值，作为一例，优选设定于0.1μL/hour至1mL/hour之间。
<粒子回收流路>
按照扩展能够测定的粒径范围(动态范围)的观点，设置两个以上的粒子回收流路102。在此，粒子检测部103设置于粒子回收流路102的内部或下游，用以检测流入到粒子回收流路102的粒子。针对一个粒子回收流路102需要设置至少一个粒子检测部103，也可以设置两个以上的粒子检测部103(图2～6)。在针对一个粒子回收流路102设置两个以上的粒子检测部的情况下，可以是针对一个粒子回收流路以串联方式设置(图2、3)，也可以是粒子回收流路进行分支而以并联方式设置(图4～6)。另外，还能够进一步设置用于回收能够测定的粒径范围之外的粒子的流路。在针对一个粒子回收流路102设置有两个以上的粒子检测部103的方式中，也可以是所述两个以上的粒子检测部103以串联方式配置(图2、3)。例如在两个粒子检测部103以串联方式配置的情况下，能够根据由通过两个粒子检测部103后的同一粒子生成的信号的间隔来计算粒子在流路内的通过速度，粒子的通过速度一般与回收流路102的流量成比例，因此能够估算回收流路内的流体的流量。此时，如图2所示那样，对电极施加的电压优选为从上游侧的光阑53’的上游侧的电极和下游侧的光阑53”的下游侧的电极施加的方式。在从上游侧的光阑53’的下游侧的电极54b’或下游侧的光阑53”的上游侧的电极54a”施加电压的情况下，在所述两个电极之间产生电压降，一个光阑的电流值变化影响另一个光阑的电流值，因此需要在考虑这些影响的同时进行测定。因而，在使用包括两个或两个以上的光阑的粒子检测部103的情况下，也可以是如图3所示那样仅使用上游侧的光阑53’的上游侧的电极54a’和下游侧的光阑53”的下游侧的电极54b”来进行测定。此外，也可以如图7所示那样，在粒子检测流路的上游和下游各设置经由中继流路60而与光阑流体式连接且电连接的电极插入口59，或者在光阑的上游和下游各设置经由中继流路60而与光阑流体式连接且电连接的电极插入口59，通过使电极54浸渍于电极插入口59，来利用ESZ进行粒子检测。
另外，在针对一个粒子回收流路102设置有两个以上的粒子检测部103的方式中，也可以是所述两个以上的粒子检测部103以并联方式配置(图4～6)。通过本方式能够获得处理量与并联的粒子检测部103的数量成比例地增加的优异效果。此时，用于进行电检测的电极54以夹持各光阑的方式配置，只要是粒子检测部103的数量的两倍数量，就能够进行测定。另一方面，如图6所示，针对各光阑而言在上游侧配置一个电极、在下游侧配置与粒子检测部103的数量相应数量的电极的方式也能够进行测定，从通过减少电极数量所产生的低成本化的观点出发，这个方式更优选。在此，在将粒子检测部103并联化并向各光阑同时施加电压的情况下，当对以夹持各光阑的方式配置的多个电极对同时施加电压时，如图4所示，等效电路变得复杂，由于某个光阑的电流值变化影响其它光阑的电流值，因此需要考虑这些影响。另一方面，在希望通过各光阑逐个地施加电压并分别逐个地检测的情况下，能够通过使不进行测定的光阑不连接至地、机架(chassis)而为开路状态来实施，从而不会产生上述的对其它光阑的影响。此时，为了形成开路的状态，可以在电极54与电源57之间使用开关电路，也可以是通过继电器方式、光电耦合器(PhotoMOS)方式来形成开路的状态。粒子检测部103优选为构建在测定时极力不产生电磁噪声影响的测定系统，关于这一点，对于开关电路，相比于使用电磁体的继电器方式，更优选光电耦合器那样的使用光电流的方式。但是，如图5那样，在从光阑的下游侧的电极朝向上游侧施加电压的情况下，某个光阑的电流值变化不影响其它光阑的电流值，因此也可以使用本方式。
粒子检测部103包括光阑53和电检测器。光阑53是指形成在流路内的比流路直径小的孔，由粒子检测流路62和光阑形成构造52规定。光阑的截面形状根据其制造工序而可以取得各种形状，通过利用蚀刻、激光照射的加工取得圆、椭圆的形状，在利用光刻和软光刻(soft lithography)来由聚二甲基硅氧烷(下面为PDMS)等高分子材料成形的情况下，为矩形或梯形。虽然只要光阑的截面积大于要测定的粒子即可，但是一般认为能够利用ESZ测定的粒径范围是光阑截面积的2％～60％，因此需要根据设想为流入的粒子的大小进行设计。另外，如图2、3、15、25以及27(b)所示，可以通过两个光阑构成粒子检测部103。另外，也可以如图4～6所示那样设为如下结构：由于具备多个粒子检测部而构成多个光阑，各个光阑的下游连接至出口，各出口还作为电极插入口59发挥功能。在该情况下，如果光阑的体积大致相同，则从各光阑获得的信号大致相同。即，能够检测流向各光阑上游的回收流路的全部粒子，按照浓度的定量测定这个观点，可以说是优选的方式。另外，在一个方式中，在针对一个粒子回收流路102以并联方式配置至少两个以上的粒子检测部103的情况下，在进行分支的粒子回收流路的各个末端连接流体排出口(图25)。在该情况下，电极54a、54b能够以其顶端浸渍于流体排出口内的含有电解质的溶液内的方式进行配置，从电源提供的电流自一个电极54a或54b通过光阑53a或53b并通过分支部110后，通过另一个光阑并流向另一个电极。根据该方式，能够减少电极的数量，并能够将电极仅配置在流体排出口。利用ESZ进行的粒子检测的灵敏度与光阑至电极之间的流路电阻成比例地降低，因此在根据所获得的信号计算粒径的情况下，需要考虑到该信号降低(参照式(1))。此时，L设为形成光阑的流路的长度，de设为光阑的等效直径，L’设为中继流路60的长度，de’设为中继流路60的等效直径。另外，优选的是根据其流路结构适当地考虑基于式(1)的信号降低，也可以是未必与式(1)完全一致的式子。
[式1]
粒子检测部103的电检测器主要包括电极54、经由导线55而与电极54连接的电测定器56以及电源57。两个电极54以夹持光阑53的方式配置。电测定器56只要是探测电特性即可，列举电流测定器、电压测定器、电阻测定器、电荷量测定器，在ESZ的测定中使用电流测定器是最优选的。另外，使用IV放大器进行电流电压转换之后提高增益来检测微小的电流值变化在检测更微小的粒子方面是优选的。另外，为了无遗漏地检测通过了光阑内的粒子，电测定器56的采样时间间隔优选为充分地短于粒子通过光阑所需要的时间，优选为一秒内采样一万次以上，更优选为一秒内采样两万次以上。
在多个粒子检测部103的光阑53a、53b各自的截面积或体积相同的情况下，从两个光阑获得的信号大致相同。即，能够同样地检测流向两个光阑的全部粒子，根据浓度的定量测定的观点，是优选的。
另外，也可以如图26(a)所示那样在粒子导入流路101设置分支流路101d，或者如图26(b)所示那样设置三条粒子回收流路(102a、102b、102c)，在其末端的流体排出口104c还配置有一个电极。在该情况下，等效电路如图26(c)所示那样，所追加的电极与光阑53a以串联方式连接，与光阑53b以并联方式连接。因而，在粒子通过光阑53a的情况下，流向追加的电极的电流值减少，但是在粒子通过光阑53b的情况下，流向追加的电极的电流值增大，因此通过向追加的电极也事先连接其它的电测定器56’，并与电测定器56同时地进行电测定，能够判别粒子通过了哪个光阑。
电源57使用直流或交流电源，但是优选的是选择在测定时更不易产生噪声影响的电源，从成本方面出发，优选使用例如干电池等廉价且低噪声的直流电源。另外，电极的材料只要是电阻小的材质即可，没有限制，能够使用金属、无机化合物、有机化合物，但是从耐久性和成本方面出发，优选为金属。
在分析部61中，能够具备用于运算测定结果的运算装置和用于记录测定结果或源自于该测定结果的运算结果的记录介质。或者，这些运算装置和记录介质可以与电测定器56一体化，也可以是能够与电测定器56连接的外部装置。在记录于记录介质的数据中包括采样得到的电流值、粒子通过时产生的电流值变化、以及根据该电流值变化计算出的粒径、粒子数、粒子浓度、检测时间或从测定开始时起的经过时间。
<粒子分离流路>
<流体动力过滤(HDF)>
当在粒子分离流路110所使用的分离方法中使用流体动力过滤(HydrodynamicFiltration：HDF)的情况下，粒子分离流路110的上游部的末端与粒子导入流路101连接、流体流出的下游部的末端经由分支部110A而与粒子回收流路102连接即可(图8)。此时，分支部110A需要与至少两个以上的粒子回收流路102流体式连接以分离粒子，需要考虑包括粒子回收流路的下游的流体力学阻力来设定各流路、光阑的截面积、体积。在例如图8(b)、图9那样设置有三个回收流路102的情况下，当将流向各回收流路的流量设为Qa、Qb、Qc时，根据流路的宽度w、高度h、长度L计算各流量的比，具体地说，根据哈根泊肃叶公式，按照下述式(2)计算直线流路内的流量。
[式2]
另外，如放大图9(b)那样，在层流条件下在微芯片的流路内的速度分布为抛物线，一般用下述式(3)中的u(r)表示(此时，w0表示圆管的半径，r表示距圆管中心的距离，μ表示粘度，L表示圆管的长度，ΔP表示压力损失。)。
[式3]
由距流路壁面的任意距离w1和w2分隔的抛物线内的面积Sa、Sb、Sc之比与流向各回收流路的流量Qa、Qb、Qc之比相等。此时，流路内存在的粒子中的、粒子的中心或重心位置存在于相比于w1而言更接近流路壁面的位置的该粒子流入回收流路102a，存在于相比于w2而言更接近流路壁面的位置的粒子流入回收流路102b，存在于w1与w2之间的粒子流入回收流路102c。因而，流向回收流路102a、102b的最大的粒子的半径分别为w1、w2，因此在光阑的截面形状呈圆形的情况下，需要将光阑的半径设为w1或w2以上，在光阑的截面形状呈大致圆形、椭圆形的情况下，需要将通过大致圆形或椭圆形的中心或重心的最小半径设为w1或w2以上。另外，在光阑的截面形状呈矩形的情况下，需要两组相向的边分别为w1或w2的2倍以上的长度。除此之外，在光阑的截面形状呈多边形的情况下，需要将其内切圆的半径设为w1或w2以上。
在此，也可以采用在粒子分离流路110的除末端以外的位置设置多个分支部110A(在图8中没有图示)并设置一个以上的分支流路105的方式(图8(c))。分支流路105可以仅设置于一个流路壁面侧，也可以设置于流路壁面的两侧。另外，一个以上的分支流路105可以在下游的回收流路102处同时合流，也可以采用逐渐合流的方式。
并且，也可以在粒子分离流路110的分支部110A(在图10中没有图示)的流体上的上游侧形成粒子扩散流路110B(图10(b))。粒子扩散流路110B的流体上的上游侧与粒子导入流路101连接，流体上的下游侧与分支部110A连接。另外，在不使用粒子导入流路101的方式的情况下，粒子扩散流路110B的流体上的上游侧直接连接至进口。
粒子扩散流路110B优选采用从流体上的上游侧朝向下游侧流路的宽度或高度扩大、或者宽度和高度两方扩大的结构。对此，在粒子扩散流路110B的流路宽度方向上存在多个粒子回收流路、或者在高度方向上存在多个粒子回收流路中所优选的方式不同，在使用一般的利用光刻和软光刻的微芯片的流路形成技术的情况下，在其制作的容易度方面优选流路的宽度扩大的结构。
在该粒子扩散流路110B中，利用每单位时间的粒子的布朗运动、也就是说扩散距离与粒子的粒径的平方根成反比例的特征，在粒子流动于粒子扩散流路110B时，粒子根据其粒径向流路扩大的方向扩散，因此在扩大的流路壁面附近，粒径小的粒子的存在概率变高，能够获得浓缩效果。在此，在使流路宽度扩大方面，图10的流路壁面a与粒子扩散流路壁面a连接的角度θa、流路壁面b与粒子扩散流路壁面b连接的角度θb需要小于180°。另外，在由流路壁面a、流路壁面b包围的流路内的流速为1m/秒以上那样的高流量的条件下，担心在扩大部分处产生涡流，因此优选的是以小于1m/秒那样的比较低的低流量的条件进行送液、或者使角度θa、θb大于90°。另一方面，在粒子流入粒子扩散流路110B时，粒子与其重量相应地受到向粒子流动的方向(流体动力的下游方向且分支部110A存在的方向)的惯性力。也就是说，在粒子的密度相同的情况下，粒径越大的粒子越受到接近流路中央的方向上的惯性力，因此粒径小的粒子在流路壁面的存在比例更高，有助于HDF中的分离能力的进一步提高。另外，角度θa、θb也可以是不对称的，可以将一个壁面呈大致直线地连接，仅将相对置的另一个壁面以小于180°的角度扩大并进行连接。
在粒子分离流路110中使用的分离方法中使用了HDF的情况下，图8中的粒子检测部103a、103b能够检测的粒径范围可以是彼此完全相同的，但是优选设定为能够测定不同的粒径范围以测定具有广的粒径范围的样本，其一部分彼此重叠在能够检测没有完全分离的粒子从而能够获得鲁棒性更好的结果方面更为优选。如图8(a)所示，在粒子回收流路102有两条的情况下，关于能够由粒子检测部103a、103b检测的粒径范围，可以将粒子检测部103a设定为大的粒径范围，将粒子检测部103b设定为小的粒径范围，反过来也是没有问题的。但是，需要基于HDF理论进行设定以避免光阑被粒子堵塞。
在根据粒子的计数数量进行的浓度换算中，由于使用所设定的送液部的流量和式(2)或(3)来计算流向各粒子回收流路102的流量，因此通过将流向各粒子回收流路102的流量除以每个测定时间内的粒子的计数数量，来计算粒子浓度。另外，流路内的粒子中心或重心位置不可能位于距流路壁面比粒子的粒子半径更近的位置，因此流路壁面附近的粒子浓度相对变低。因而，可以根据粒径考虑从壁面到与粒子半径相应的位置的部分来进行浓度校正。在该情况下，可以使用式(3)计算从壁面到与粒子半径相应的位置的部分的流量，并计算相对于流向各粒子回收流路102的流量的比例，进行与计算出的比例相应的校正。
<捏流分选(PFF)>
在图12中示出在本发明的粒子检测装置的粒子分离流路110中使用利用了捏流分选(PFF)原理的流路的情况下的结构的一例。在使用利用了PFF原理的流路的情况下，粒子分离流路110包括分支流路18a、分支流路18b、狭窄流路16以及扩大流路17。用于保持含有粒子的流体100P和不含粒子的流体100N的进口14a、14b分别与分支流路18a、分支流路18b流体式连接。分支流路18a、分支流路18b在其下游处合流，并与狭窄流路16的上游侧流体式连接。之后，基于PFF原理，在与狭窄流路16的下游连接的扩大流路17中进行粒子分离。扩大流路17的流路宽度在规定的位置处变为固定，通过在扩大流路17的下游处流体式连接的回收流路102a、102b来回收粒子，通过在回收流路的下游处连接的检测部103a、103b来检测粒子。在此，回收流路设置几条都可以，但是根据流路的小型化、低成本化的观点，优选设为五条以下，最优选为三条以下。
图11示出图12～14、图30、图32～37、图39、图41～42的微芯片中的流路合流而形成的狭窄流路和扩大流路的一例。具体地说，是图12(a)中的区域21的放大图。另外，流体100P和斜线所示的流体100N分别是含有粒子的流体和不含粒子的流体，粒子300a、300b分别表示相对较大的粒子和相对较小的粒子。
另外，在图11中，箭头200表示狭窄流路16与扩大流路17的边界处的流线的分布，箭头210a、210b分别表示大的粒子300a和小的粒子300b的运动向量。
首先，使用注射泵等从两个进口14a、14b分别连续地提供含有粒子的流体100P和不含粒子的流体100N。此时，在流路13内，各个流体保持着稳定的层流进行流动。
而且，通过调节含有粒子的流体100P和不含粒子的流体100N的流量，使得狭窄流路16内的流体100P的宽度(从流路壁面到流体100P与流体100N的界面的距离)小于设为分离对象的最小粒子的粒径。通过该操作，设为分离对象的全部粒子沿着狭窄流路的内壁16a流动，从而能够根据粒子的大小来使粒子在垂直于狭窄流路的内壁16a的壁面的方向上的位置固定。
然后，在狭窄流路16与扩大流路17的边界处，流线如分布200所示那样扩展，因此狭窄流路16内的任意的流线间的距离在扩大流路17中被扩大。
因而，粒子在与狭窄流路16内的流动垂直的方向上的位置根据粒子的大小而各不相同，因此在狭窄流路16与扩大流路17的边界处，大的粒子300a的运动向量210a与小的粒子300b的运动向量210b的方向之间产生差异，在接下来的扩大流路17中，按照粒子的大小的位置差异被扩大，从而能够进行分级。
此外，通过使用适当的检测系统沿着扩大流路17中的检测线20观察分离后的粒子，能够调查粒子的粒径和粒子群的粒径分布。
在使用基于PFF原理的粒子分离流路110的情况下，优选的是粒子分离流路的流路壁由不易向外侧方向膨胀的材料形成。因此，作为制作包括粒子分离流路的微芯片10的情况下的材质，优选的是流路的壁面由不易膨胀的材料形成，但是优选的是至少流路的壁面由不易在流路的宽度方向上膨胀的材料形成。更具体地说，优选为由计示硬度为40以上的材料形成，更优选为由计示硬度为60以上的材料形成。作为能够使用的材料，能够使用PDMS、丙烯酸等各种聚合物材料、玻璃、有机硅、陶瓷、不锈钢等各种金属等。能够优选使用计示硬度40以上、更优选使用计示硬度60以上的PDMS、丙烯酸树脂等各种聚合物材料、玻璃、有机硅、陶瓷、不锈钢等。也能够将这些材料中的任意两种材料组合使用。其中，为了廉价地制作流路本身并提供一次性的装置，优选为至少一部分使用聚合物材料，更优选为整体由聚合物材料形成。作为这样的材料，优选为计示硬度40以上的PDMS、丙烯酸树脂等，更优选为计示硬度60以上。
另外，关于流路的深度方向，可以由发生膨胀的材料形成。由于在制作流路方面，改变流路的宽度方向、深度方向上的膨胀的程度很麻烦，因此通过硬度30、44、60、70的PDMS来制作上述的微芯片10，但是硬度能够设定为任意的值，优选使用硬度40以上的PDMS，更优选使用硬度60以上的PDMS。在此，如上述那样，本说明书的硬度是指计示硬度(使用A型硬度计)，通过施加了固定载荷时的物质的变形量进行定义，硬度越大则该变形量越小。
关于硬度试验，遵照JIS K 6249的标准规格，通过JIS K 6253的5(计示硬度试验)来进行评价。关于试验，期望的是将A型计示硬度试验机安装于具有压入深度0.000mm～2.500mm的测定范围的由长度测定器和位移装置构成的压入深度测定装置，在长度测定系统中使用千分尺。长度测定器(千分尺的主轴顶端)以与推针在垂直同轴上接触的方式固定，使主轴移动来对推针施加位移。使硬度试验机的推针按照从100到0的各显示移位，或者验证硬度试验机的针对已知的压入深度值的指示值。优选为在包括指示值100和0的至少四个位置实施压入深度的验证。
在此，具备基于PFF原理的粒子分离流路110的微芯片10通过在基板11的下表面11a形成流路13并与下表面基板12重叠来形成。流路的深度能够设定为10nm到1cm内的任意的值，但是从制作的容易度出发优选设定为从亚微米到数十微米(μm)的值。
流路13具有进口14a、14b和出口15，进口14a、14b分别是含有粒子的流体和不含粒子的流体的流体导入口，出口15是流体的出口。
另外，流路13的一端形成为至少两个分支流路(18a、18b)，流路13还包括两个具有不同形状的狭窄流路16、扩大流路17。能够将狭窄流路16与扩大流路17的连接部称为扩大开始点，如图12(c)所示，流路宽度在扩大开始点处改变。扩大流路17只要是流路宽度大于狭窄流路16的流路宽度即可，可以是任意的形状。在此，分支流路18a、18b分别连接于进口14a、14b，并且扩大流路17连接于出口15。
此外，流路13的总长度、也就是说从进口14a、14b所在的一端到出口15所在的另一端为止的长度能够设定为1μm以上的任意的值，但是从流路制作的容易度和压力损失的观点出发，优选设定为数μm～数十mm左右。
另外，狭窄流路16、扩大流路17的长度能够设定为10nm以上的任意的值，但是从流路制作的容易度和压力损失的观点出发，优选设定为亚微米～数十毫米(mm)左右。另外，从实现粒子的排列的观点出发，优选的是狭窄流路16的长度的下限为1μm以上，更优选为10μm以上，优选的是狭窄流路16的长度的上限为500μm以下，更优选为100μm以下。
狭窄流路16的宽度是指流路的垂直于狭窄流路的内壁16a的壁面的方向上的长度。狭窄流路16的宽度只要满足小于扩大流路17的宽度这个条件即可，能够设定为10nm以上的任意的值。另外，从实现粒子的排列的观点出发，优选的是狭窄流路16的宽度的下限为1μm以上，更优选为10μm以上，优选的是宽度的上限为100μm以下，更优选为20μm以下。
此外，扩大流路17的出口埠15可以设置多个，通过基于“非对称捏流分选(Asymmetric Pinched Flow Fractionation(AsPFF))”(非专利文献6)的原理，使大量的流体流向一部分的出口埠，由此也能够提高分离能力。更具体地说，是如下的原理：适当地设计流路的阻力值，并且根据狭窄流路16的流路宽度和粒径的关系，能够将某特定尺寸的粒子仅导入到特定的出口埠。
此外，在具有多个出口的连续粒子分离装置及其方法的情况下，将流路网络整体视为电阻电路的类比，通过进行适当的设计，能够达成任意的流量分配比，因此期望基于这样的考量来进行设计。
作为用于达成流路内部的期望的流量条件的导入量的调节方法，使用注射泵等从导入口导入溶液在操作上简单，是优选的，但是也能够使用利用蠕动泵等其它泵的方法、利用储气罐、压力装置等的恒压送液方法、利用电渗流、离心力等的送液方法等。另外，也能够使用从出口施加负压的压力装置。此外，期望送液压力处于能够稳定地进行送液的范围，从流路、送液泵自身的耐久性的观点出发，优选为20MPa以下。
此外，为了达成粒子的稳定且有效的分离，优选的是在流路内保持稳定的层流，具体地说，优选的是在雷诺数为1000以下的条件下进行送液操作。其中，在使用直径1mm以下的流路结构的情况下，形成湍流比较困难，容易达成那样的条件。
另外，分支流路18a、18b的宽度使用100μm的宽度，但是这些值能够分别设定为10nm以上的任意的值。
此外，含有粒子的流体和不含粒子的流体都可以由相同的流体形成，另外，也可以分别由两种以上的不同的流体形成。
导入到流路13内的粒子通过流动而向下游方向移动，但是此时通过适当地调节从两个进口14a、14b导入的流体的流量，在流路13中的狭窄流路16内，能够根据粒子的大小来控制粒子在垂直于狭窄流路的内壁16a的壁面的方向上的位置。在此，为了使样本溶液中的粒子向狭窄流路的壁面排列，而使鞘液相对于样本溶液的流量之比优选为1以上，更优选为10以上，最优选为50以上。此外，样本溶液与鞘液的流量之和优选设定为不使送液压力过大，狭窄流路内的流速优选为10m/sec以下，最优选为2m/sec以下。
<非对称捏流分选(AsPFF)>
在本发明的粒子检测装置中，也可以基于AsPFF原理来在粒子分离流路110形成扩大流路17。在该情况下，如图13和14所示，可以在扩大流路17设置排出流路22，在提高粒子的分离能力方面，该方式更为优选。排出流路22与出口23连接，用于排出或回收流体。优选设计为50％以上的流体流向排出流路，更优选设计为70％以上的流体流向排出流路。
并且，关于狭窄流路16与扩大流路17连接的结构，可以如图13(b)、(c)所示那样在扩大开始点处流路宽度阶梯式地扩大，也可以如图12(c)、图14(b)所示那样构成为流路宽度逐渐地扩大。在流路宽度逐渐地扩大的情况下，可以是扩大流路的壁面17b以描绘直线的方式扩大而形成斜坡40，也可以是以描绘曲线的方式扩大。在扩大流路17的流路宽度阶梯式地扩大或直线式地扩大的情况下，能够通过狭窄流路的壁面16a、16b与紧连着该壁面的扩大流路17的壁面17a、17b之间的角度24a、24b来规定扩大流路。例如，阶梯式地扩大的情况下的角度24a、24b为90°。在扩大流路17的壁面直线式地逐渐扩大的情况下，角度24a、24b表示在90°～180°内。扩大流路的壁面只要是与狭窄流路的流路宽度相比扩大即可。在壁面17b阶梯式地扩大的情况下、或在其角度24b接近90°的情况下，角度24a可以超过180°，例如可以为210°、225°(图41)。在一个方式中，扩大区域的壁面的角度24a、24b能够独立地取得90°～180°间的任意的角度，作为一例，能够取得120°、135°、150°、180°。但是，即使在扩大流路壁面17b相对于狭窄流路壁面16b的角度24b为90°或小于90°的情况下，只要其是局部结构且实质上是逐渐地扩大那样的结构，则大部分的流体逐渐地向出口23的方向流动，因此几乎不会受到涡流、粒子扩散的影响，因此也可以使用这样的结构(参照图40(a)-(c))。在扩大流路的壁面17b以描绘曲线的方式扩大的情况下，从防止涡流的观点出发，优选为扩大开始点处的切平面与狭窄流路的壁面一致。
在本发明的其它方式中，其特征在于，在上述的微芯片10等的粒子分离装置中，在扩大流路17的壁面中，向狭窄流路16中的粒子滑流的壁面16a侧流路宽度不扩大，而向狭窄流路16中的没有粒子滑流的壁面16b侧流路宽度扩大。从向粒子滑流的壁面侧流路宽度不扩大的观点出发，角度24a、24b中的粒子滑流的壁面侧的角度24a为180°或180°以上(最大不到270°)，优选为180°，另一方面，另一个壁面的角度24b为90°～180°的任意的角度、例如120°、135°、150°、180°。通过像这样构成，能够抑制狭窄流路的出口与扩大流路的入口部分处的涡流的产生、粒子扩散所引起的分离能力降低的影响。
即使扩大流路的壁面17a、17b如图37(d)、图40(a)-(c)的虚线部所示那样在垂直于壁面17a、17b的方向上存在凹部、凸部，但只要该情况对于流体中的粒子的流动没有较大影响，则即使存在凹部、凸部也不影响分离。另外，即使是如微芯片10的制造上的缺陷那样的具有不规则形状的部分，也同样地只要是对于流体中的粒子的流动没有较大影响，则采用这样的结构也没有问题，而不是将像这样的结构排除。
也能够将狭窄流路16中的粒子滑流的壁面16a称为样本溶液侧狭窄流路壁面16a，也能够将狭窄流路16中的没有粒子滑流的壁面16b称为鞘液侧狭窄流路壁面16b。另外，能够将样本溶液侧狭窄流路壁面16a侧的扩大流路壁面称为样本溶液侧狭窄流路壁面17a，并且能够将鞘液侧狭窄流路壁面16b侧的扩大流路壁面称为鞘液侧扩大流路壁面17b。
另外，在图11中示出狭窄流路壁面与扩大流路壁面分别以直线进行彼此结合的方式，但是也可以是任一方或两方为曲线。但是，关于所述狭窄流路与扩大流路的壁面的连接结构，虽然在样本溶液侧、鞘液侧壁面都能够充分地看到效果，但是也如基于使粒子向样本溶液侧排列的PFF原理推测的那样，将粒子滑流的壁面直线式地连接能够更高精度地进行粒子分离，通过如上述那样进一步改进鞘液侧壁面的结构，进一步提高粒子的分离精度。
排出流路22可以在利用AsPFF分离粒子的情况下使用，优选的是对排出流路的宽度、高度、长度进行设计以使流向扩大流路17的流体的至少一部分流向排出流路22。更优选的是设计成相同程度的流体流向排出流路22，最优选的是设计成2倍以上的流体流向排出流路22。
另外，图32所示的排出流路22表示设计于与流体在狭窄流路16中流动的方向垂直的方向上的方式，但是也可以是设计在平行方向上，可以是设定为任意的角度。在将排出流路设计于与流体在狭窄流路16中流动的方向垂直的方向上的鞘液侧壁面17b的情况下，可以将排出流路配置在扩大流路的扩大开始点处(图32(c))，也可以将排出流路远离扩大开始点地配置(图35(c))。在设计于平行方向上的情况下，在狭窄流路16中以高流速流过来的粒子在扩大区域内急剧地变为低流速，因此粒子因惯性力的影响而受到与其质量相应的力。此时，应当通过该惯性力进行排列的粒子的位置产生偏差，从而分离的精度变差。因而，排出流路22更优选为设计在与狭窄流路16中的流体流动的方向垂直的方向上。
在扩大流路17的下游连接的多个粒子回收流路102至少需要设置两个，优选为根据想要测定的粒径范围任意地增加粒子回收流路102的数量。各粒子回收流路102至少有一个粒子检测部103，也可以设置多个。
扩大流路17也可以通过还具有在HDF一项中记载的作为粒子扩散流路110B的功能，而被赋予进一步促进粒子的分离能力的功能，但是在该情况下，扩大流路的长度需要具有粒子能够扩散的足够的长度，需要至少为1μm以上。扩大流路17的流路长度能够根据扩大的流路宽度和角度24a、24b决定为任意的值。
另外，也可以不使用扩大流路而在狭窄流路16的下游直接设置多个粒子回收流路102。
在粒子分离流路110使用了利用PFF原理的流路的情况下，关于粒子，从狭窄流路壁面16a侧朝向16b侧能够存在的粒子的直径变大，因此例如在图12(a)的情况下，优选的是以粒子检测部103a检测小径粒子、粒子检测部103b检测大径粒子的方式设定光阑的截面积。另外，在图12(b)的情况下，优选的是以粒子检测部103a检测小径粒子、粒子检测部103c检测中径粒子、粒子检测部103b检测大径粒子的方式设定光阑的截面积。也就是说，优选的是以越接近狭窄流路壁面16a的粒子检测部103能够检测越小的粒子的方式设定光阑的截面积。例如，也可以是，在要检测0.1μm～2.0μm的粒子时，在图12(b)、图13(a)、图14(a)的情况下，在粒子检测部103a中，设置光阑截面积为0.4μm2(宽度1μm、高度0.4μm的矩形状的光阑、或半径0.36μm的圆形状的光阑)的光阑以能够检测直径0.1μm～0.3μm的粒子，在粒子检测部103c中，设置光阑截面积为2μm2(宽度2μm、高度1μm的矩形状的光阑、或半径0.8μm的圆形状的光阑)的光阑以检测直径0.2μm～0.8μm的粒子，在粒子检测部103b中，设置光阑截面积为14μm2(宽度3.5μm、高度4μm的矩形状的光阑、或半径2.1μm的圆形状的光阑)的光阑以检测直径0.4μm～2.0μm的粒子。
另外，在粒子分离流路110中使用利用了PFF原理的流路的情况下，由送液部设定的流量优选设定在0.1μL/hour至1mL/hour之间，不含粒子的流体100N的流量优选为比含有粒子的流体100P多2倍以上。关于不含粒子的流体100N的流量优选为含有粒子的流体100P的几倍以上，依赖于狭窄流路16的流路宽度和想要分离的粒子的直径，例如在想要分离的粒子的直径为狭窄流路16的流路宽度的1/4的情况下，不含粒子的流体100N的流量优选为含有粒子的流体100P的3倍以上，在想要分离的粒子的直径为狭窄流路16的流路宽度的1/10的情况下，不含粒子的流体100N的流量优选为含有粒子的流体100P的流量的9倍以上。也就是说，在狭窄流路16的流路宽度为想要基于PFF原理分离的粒子的直径的N倍的情况下，优选为不含粒子的流体100N的流量比含有粒子的流体100P多N-1倍以上。如果是所述流量比，则成为想要分离的粒子在狭窄流路的壁面16a上滑流，因此能够基于PFF原理进行粒子分离。
并且，也可以是，在粒子分离流路110使用利用了PFF原理的流路的情况下，不需要使含有粒子的流体100P中包含的粒子全部在狭窄流路壁面16a上滑流，而仅使具有相对较大的粒径的粒子在狭窄流路壁面16a上滑流。例如在图12(b)、图13(a)、图14(a)的情况下，如果使由用于检测小粒径的粒子的粒子检测部103a能够检测的最大粒径以下的粒子向狭窄流路壁面16a滑流，则虽然最大粒径以下的粒子未在狭窄流路壁面16a上排列，但是也能够通过粒子检测部103a基于ESZ原理来制作其分布。即，即使存在通过PFF没有完全分离的粒子，也能够通过粒子检测部制作其粒径分布，因此能够获得ESZ补偿PFF的分离能力的优异效果。
另外，即使是在只使由检测小粒径的粒子的粒子检测部103a能够检测的最大粒径以上的粒子向狭窄流路壁面16a滑流的流量条件下，通过基于上述的HDF理论设定流路阻力以避免使粒子检测部103a的光阑堵塞的粒径的粒子流入，也能够进行设为本发明的目标的具有广的粒径分布的样本的测定。即，能够获得如下的优异效果：通过利用PFF进行的中粒径、大粒径粒子的分离、利用HDF进行的小粒径粒子的分离以及利用ESZ进行的精确的粒径分布的制作，能够进行具有广的粒径分布的样本的测定。此时，PFF中的扩大流路17还同时发挥上述的粒子扩散流路110B的作用，因此能够获得促进每单位时间的扩散距离大的小粒径粒子的分离这样的优异效果。另外，在本方式中，小粒径粒子也流入粒子检测部103c，根据情况，也流入粒子检测部102b，因此向粒子检测部103a流入的小粒径粒子为含有粒子样本的流体100P的一部分。只要发挥粒子扩散流路110B的作用的扩大流路17的长度是足够小粒径粒子扩散的距离，则其流入量与根据粒子回收流路102a及其下游的流路结构计算出的流量成比例，因此能够根据其计算值进行定量。在此，关于扩大流路17的长度中的“足够小粒径粒子扩散的距离”，如果不含粒子的流体100N的流量与含有粒子的流体100P的流量之和为0.1μL/hour至1mL/hour的范围，则优选为1μm以上，更优选为100μm以上。
在具有多个出口的连续粒子分离装置及其方法的情况下，将流路网络整体视为电阻电路的类比，通过进行适当的设计，能够达成任意的流量分配比，因此期望基于这样的考量来进行设计。例如，基于上述的AsPFF原理，也可以如图32、33所示那样以使大部分的流体流过的方式在扩大流路17的一部分设计排出流路22，并设置排出用的出口23。在该情况下，可以从出口15、或如图39(a)的出口15a、15b、15c那样设置多个的出口中的任意的出口回收目标物。特别是在要从包括具有多个大小的物质的样本中分离并回收特定大小的粒子的情况下，出口15的数量根据目标而被设定为任意的数量，但是在回收这个方面优选设定为至少两个以上。另一方面，在分离之后不回收、例如只是对分离后的粒子进行检测即可的情况下，使用荧光、明视场像的检测系统等在检测线20处进行检测即可，在该情况下，出口的数量可以为一个。
在图32中示出具备本发明的连续分级方法的实施方式的微芯片10，图32(a)是图32(b)中的A向视图，图32(b)是基于图32(a)中的B-B线的截面图。图32中的微芯片10的流路13在任何位置处截面形状都为矩形，流路深度都是均匀的。像这样，为了在截面处根据粒子的大小来分离粒子，并且从流路结构的制作上的容易度出发，期望截面形状为矩形，但是也可以是圆形、椭圆形、多边形等的截面，并且还可以是局部为矩形以外的形状。从使粒子沿着狭窄流路的壁面滑流的观点出发，优选的是粒子滑流的壁面为平面。同样地，关于流路结构的深度，从其制作上的容易度出发，优选为是固定的，但是也可以是深度局部不同。
实施例
制造实施例：粒子检测装置的制造
具备本发明的粒子检测装置的实施方式的微芯片10是使用一般的光刻和软光刻技术制成的。如下面那样示出具体的过程。
在向4英寸硅晶圆(株式会社Philtech)上滴下光致抗蚀剂SU-83005(Microchem社)之后，使用旋涂机(Spin coater)(MIKASA公司)形成了光致抗蚀剂薄膜。此时，根据目标膜厚，向SU-8 3005添加了稀释剂Cyclopentanone(东京应化工业公司)。接着，使用光刻机(Mask Aligner)(USHIO电机公司)和形成有任意图案的铬掩模来将流路图案形成于光致抗蚀剂膜，使用SU-8Developer(Microchem公司)来对流路图案进行显影，由此制成想要使用的流路的铸模。
接着，向制成的铸模流入未固化的LSR7070FC(迈图(Momentive Performance)公司)并以80℃加热两个小时，由此制成被转印有流路的形状的聚二甲基硅氧烷(PDMS)。将固化后的PDMS小心地自铸模剥离，通过切断机形成为任意的大小之后，使用冲床(puncher)形成了流路的进口、出口。在通过氧等离子体产生装置(Meiwafosis公司)对剥离的PDMS和载玻片(松浪玻璃公司)进行表面处理之后，将PDMS与载玻片粘贴在一起，由此制成微芯片10。
电检测实施例：利用ESZ进行的粒子的电检测
制成的微芯片10被载置到基板上，向微芯片10内的多个粒子检测部103连接电极。电极由一对铂金线形成，一个电极经由导线被连接至可编程电流放大器CA5350(NF电路公司)，并经由AD转换器被连接至PC，利用LabView对发送过来的数字的信号进行分析。另外，被连接至粒子检测部103的电极中的另一方经由导线被连接至9V的干电池。
各进口经由特氟龙管被连接至压力泵P-PumpBasic(Dolomite公司)，以固定的流量进行送液。
样本调制实施例：使用了标准粒子的情况
在使用标准粒子作为含有分离对象的粒子的流体100P中的粒子的情况下，
作为0.1μm粒子，使用了聚苯乙烯标准粒子3100A(ThermoFisher制造)，作为0.2μm粒子，使用了聚苯乙烯标准粒子3200A(ThermoFisher制造)，
作为0.5μm粒子，使用了聚苯乙烯标准粒子3500A(ThermoFisher制造)，
作为1.0μm粒子，使用了聚苯乙烯标准粒子4009A(ThermoFisher制造)，
作为2.0μm粒子，使用了聚苯乙烯标准粒子4202A(ThermoFisher制造)。
作为含有分离对象的粒子的流体100P，使用了含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液(磷酸缓冲液)。含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液是在实验前使用孔径0.1μm的针头过滤器(默克密理博(Merckmillipore)公司制造)进行异物去除后使用的。
样本调制实施例：使用了抗体聚集体的情况
将独特制成的小鼠单克隆抗体通过含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液调制成0.66mg/mL，利用干燥机在摄氏90度下加热15分钟，由此人工制成抗体聚集体。
粒子分离检测
实施例1：在利用AsPFF进行的粒子分离后通过由三个粒子回收流路和在各粒子回 收流路设置两个的粒子检测部进行粒子检测的粒子检测装置进行0.1μm、0.2μm、0.5μm、1.0 μm、2.0μm标准粒子混合样本的检测
基于上述的制造实施例将图16所示的微芯片10制作为粒子检测流路，基于上述的样本调制实施例进行了调制。0.1μm、0.2μm、0.5μm、1.0μm、2.0μm标准粒子通过含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液分别调制成为5μg/mL的浓度。因而，样本中所含的聚苯乙烯粒子整体的浓度调制成为25μg/mL。
此时，关于微芯片10的各流路，流路13的高度除了粒子检测部103a、粒子检测部103c以外全部设为4.5μm，在流路13的端部设置有贯通于基板11的上表面的进口14a、14b、出口104a、104a’、104b、104b’、104c、104c’、23(各个孔的直径为2mm)。另外，关于流路13，设为分支流路18a(宽度20μm、长度1.5mm)、分支流路18b(宽度40μm、长度500μm)、狭窄流路16(宽度6μm、长度20μm)、扩大流路17(扩大角度135度、最大扩大时流路宽度600μm、长度0.5mm)、排出流路22(宽度500μm、长度1.7mm)、粒子回收流路102a(宽度75μm、长度4mm)、粒子回收流路102c(宽度140μm、长度7.5mm)、粒子回收流路102b(宽度512μm、长度3.75mm)。另外，粒子检测部102a的两个光阑均设为宽度1μm、高度0.4μm、长度10μm，粒子检测部102c的两个光阑均设为宽度2μm、高度0.8μm、长度10μm，粒子检测部102b的两个光阑均设为宽度3.5μm、高度4.5μm、长度20μm。各粒子检测部的形状与图15相同，并且根据光阑电阻和从光阑起直到插入有电极的出口为止的流路的电阻比，在式(1)中计算出的k值设为2.6。
使用上述的微芯片10，以2.5μL/hour的流量向进口14a输送调制出的粒子悬浊液，以10μL/hour的流量向进口14b输送含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS。接着，基于上述的电检测实施例，对流入三个各粒子回收流路102的粒子进行了一分钟的检测。在图17中示出此时的粒子回收流路102a的粒子检测部103a的电流值变化的测定的情形的一部分，在图18中示出粒子回收流路102c的粒子检测部103c的电流值变化的测定的情形的一部分，在图19中示出粒子回收流路102b的粒子检测部103b的电流值变化的测定的情形的一部分。基于图17，通过粒子检测部103a确认出0.1μm、0.2μm标准粒子的电流值变化，基于图18，通过粒子检测部103c确认出0.2μm、0.5μm标准粒子的电流值变化，基于图19，通过粒子检测部103b确认出1.0μm、2.0μm标准粒子的电流值变化。
另外，当将测定结果汇总于一个直方图时成为图20那样，确认出即使是混合粒子，峰也是分离的。另外，根据测定结果得到的0.1μm标准粒子的浓度为5.41μg/mL，0.2μm标准粒子的浓度为3.52μg/mL，0.5μm标准粒子的浓度为6.29μg/mL，1.0μm标准粒子的浓度为5.02μg/mL，2.0μm标准粒子的浓度为5.92μg/mL。另外，根据测定结果得到的0.1μm标准粒子的平均粒径为0.107μm，0.2μm标准粒子的平均粒径为0.192μm，0.5μm标准粒子的平均粒径为0.52μm，1.0μm标准粒子的平均粒径为0.98μm，2.0μm标准粒子的平均粒径为2.05μm。
从以上确认出，使用本发明且使用截面积不同的多个光阑、即具有多个能够检测的粒径范围的粒子检测部103，即使是具有0.1μm～2μm这样广的分布的样本也能够进行准确的粒径测定。
比较例1：使用基于激光衍射散射法(LD)的粒子检测装置进行0.1μm、0.2μm、0.5μ m、1.0μm、2.0μm标准粒子混合样本的检测
与实施例1同样地调制混合粒子样本，并通过Aggregates Sizer(岛津制作所)进行了测定。
如示出测定结果的图21那样，确认出0.2μm和2μm的峰消失，0.1μm的峰增大，因此难以进行混合粒子样本的准确的测定。
实施例2：在利用AsPFF进行的粒子分离后通过由三个粒子回收流路和在各粒子回 收流路设置两个的粒子检测部进行粒子检测的粒子检测装置进行抗体聚集体样本的检测
使用与实施例1相同的微芯片10，对基于样本调制实施例制成的抗体聚集体进行了同样的测定。
如示出测定结果的图22那样确认出，在抗体聚集体中也能够进行测定。
实施例3：在利用HDF进行的粒子分离后通过由三个粒子回收流路和在各粒子回收 流路设置两个的粒子检测部进行粒子检测的粒子检测装置进行0.1μm、0.5μm、2.0μm标准粒 子混合样本的检测
基于上述的制造实施例将图23所示的微芯片10制作为粒子检测流路，基于上述的样本调制实施例进行了调制。0.1μm、0.5μm、2.0μm标准粒子通过含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液分别调制成为5μg/mL的浓度。因而，样本中所含的聚苯乙烯粒子整体的浓度调制成为15μg/mL。
此时，关于微芯片10的各流路，流路13的高度除了粒子检测部103a、粒子检测部103c以外全部设为4.0μm，在流路13的端部设置有贯通于基板11的上表面的进口14a、出口104a、104a’、104b、104b’、104c、104c’、23(各个孔的直径为2mm)。另外，关于流路13，设为粒子导入流路101(宽度20μm、长度1.5mm)、狭窄流路16(宽度6μm、长度20μm)、扩大流路17(扩大角度135度、最大扩大时流路宽度800μm、长度0.5mm)、粒子回收流路102a(宽度75μm、长度4mm)、粒子回收流路102c(宽度140μm、长度7.5mm)、粒子回收流路102b(宽度512μm、长度3.75mm)。另外，粒子检测部102a的两个光阑均设为宽度1μm、高度0.4μm、长度5μm，粒子检测部102c的两个光阑均设为宽度3μm、高度1.2μm、长度5μm，粒子检测部102b的两个光阑均设为宽度3.5μm、高度4.0μm、长度20μm。各粒子检测部的形状与图15相同，并且根据光阑电阻和从光阑起直到插入有电极的出口为止的流路的电阻比，在式(1)中计算出的k值设为3.0。
使用上述的微芯片10，以2.5μL/hour的流量向进口14a输送调制出的粒子悬浊液，以4μL/hour的流量向进口14b输送含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS。接着，基于上述的电检测实施例，对流入三个各粒子回收流路102的粒子进行了一分钟的检测。此时的粒子回收流路102a的粒子检测部103a的电流值变化的测定的情形与图17同样地能够确认出0.1μm标准粒子，粒子回收流路102c的粒子检测部103c的电流值变化的测定的情形与图18同样地能够确认出0.5μm标准粒子，粒子回收流路102b的粒子检测部103b的电流值变化的测定的情形与图19同样地能够确认出2.0μm标准粒子。
另外，当将测定结果汇总于一个直方图时成为图24那样，确认出即使是混合粒子，峰也是分离的。另外，根据测定结果得到的0.1μm标准粒子的浓度为4.41μg/mL，0.5μm标准粒子的浓度为3.66μg/mL，2.0μm标准粒子的浓度为6.08μg/mL。另外，根据测定结果得到的0.1μm标准粒子的平均粒径为0.112μm，0.5μm标准粒子的平均粒径为0.470μm，2.0μm标准粒子的平均粒径为2.09μm。
从以上确认出，使用本发明且使用截面积不同的多个光阑、即具有多个能够检测的粒径范围的粒子检测部103，即使是具有0.1μm～2μm这样广的分布的样本也能够进行准确的粒径测定。
粒子检测
实施例4：由粒子检测部进行0.5μm、1.0μm、2.0μm标准粒子混合样本的检测
将图1所示的微芯片10的粒子检测部103a、103b如图25那样构成，并基于上述的制造实施例制成。另外，基于上述的样本调制实施例调制出样本。0.5μm、1.0μm、2.0μm标准粒子通过含有0.05％(v/v)Tween-20的1×PBS溶液分别调制成为5μg/mL的浓度。因而，样本中所含的聚苯乙烯粒子整体的浓度调制成为15μg/mL。此时，关于微芯片10的各流路，流路的高度全部设为4.5μm，在流路的端部设置有贯通于基板11的上表面的进口14a、流体排出口104a、104b(各个孔的直径为2mm)。另外，粒子检测部102的两个光阑均设为宽度3.5μm、长度20μm。另外，根据光阑电阻和从光阑起直到插入有电极的出口为止的流路的电阻比，在式(1)中计算出的k值设为2.6。
取代压力泵P-PumpBasic(Dolomite公司)，而将注射泵(KDS公司)连接至进口14a，除了以固定的流量输送的点以外，如上述那样同样地进行了电检测。此时，调制出的粒子悬浊液以2.5μL/hour的流量进行了输送。接着，基于上述的电检测实施例，对流入各光阑的粒子进行了一分钟的检测。在图28中示出此时的粒子检测部103的电流值变化的测定的情形的一部分。如图28那样确认出0.5μm、1.0μm、2.0μm标准粒子的电流值变化。
另外，当将测定结果汇总于直方图时成为图29那样，确认出即使是混合粒子，峰也是分离的。另外，根据测定结果得到的0.5μm标准粒子的浓度为5.24μg/mL，1.0μm标准粒子的浓度为4.38μg/mL，2.0μm标准粒子的浓度为7.86μg/mL。另外，根据测定结果得到的0.5μm标准粒子的平均粒径为0.511μm，1.0μm标准粒子的平均粒径为0.991μm，2.0μm标准粒子的平均粒径为2.145μm。
根据以上内容确认出，使用本发明，无需在流路内图案形成电极就能够进行准确的粒径测定。
利用PFF进行的粒子分离中的流路硬度的影响
实施例5：计示硬度70
设为按照图30的附图详细地说明本发明的连续粒子分级方法的实施方式。
使用LSR7070(Momentive公司制造、硬度70)制成了微芯片10。微芯片10具有由两张平板状的基板11和基板12形成的平板状的结构。
在基板11的下表面11a形成有流路13，入口侧埠14a、14b、出口15(各个孔的直径为2mm)、流路13整体的长度、也就是说从进口14a、14b所在的一端到出口15所在的另一端为止的长度为19mm。
制作出流路18至流路17的深度全部为20μm的分支流路18a、18b(宽度100μm、长度800μm)、狭窄流路16(宽度20μm、长度50μm)、扩大流路17(宽度500μm、长度10mm)的流路。
关于含有粒子的流体100P，使用0.5wt％Tween-80水溶液稀释为直径2μm的荧光聚苯乙烯-二乙烯基苯粒子(Fluoro-Max；ThermoScientific公司制造)1μg/mL并进行了使用。关于不含粒子的流体100N，使用了0.5wt％Tween-80水溶液。
通过注射泵调节流量来分别将流体100P从进口14a以20μL/h的流量输送、将流体100N从进口14b以1000μL/h的流量输送。将通过检测线20的荧光粒子的轨迹由荧光显微镜拍摄为运动图像，通过对总计100个粒子测定图30(c)的距下侧壁面的通过坐标来评价分离能力。作为测量位置的检测线20设为从狭窄流路16的右端(扩大开始点)起的150μm的位置。
在图31的(a)中示出表示测定结果的曲线图。横轴为检测线20上的通过坐标，纵轴为各坐标的计数数量。与比较例2相比可知，粒子分布较窄，分离精度较高。
实施例6：计示硬度60
除了将制作微芯片10所使用的材料变更为LSR7060(MOMENTIVE公司制造、硬度60)的点以外，与实施例5同样地进行了粒子的分离评价。在图31的(b)中示出表示测定结果的曲线图。与比较例2相比可知，粒子分布较窄，分离精度较高。
实施例7：计示硬度44
除了将制作微芯片10所使用的材料变更为SILPOT184(TORAY公司制造、硬度44)的点以外，与实施例5同样地进行了粒子的分离评价。在图31的(c)中示出表示测定结果的曲线图。与比较例2相比可知，粒子分布较窄，分离精度较高。
比较例2：计示硬度30
除了将制作微芯片10所使用的材料变更为LSR7030(MOMENTIVE公司制造、硬度30)的点以外，与实施例5同样地进行了粒子的分离评价。在图31的(d)中示出表示测定结果的曲线图。与实施例5相比可知，粒子分布较广，分离精度较低。基于以上的结果，使用硬度40以上的材料能够提高分离精度。
粒子分离观察实施例：粒子的分离和荧光图像的获取
使用取代LSR7070FC(迈图(Momentive Performance)公司)而使用SYLGARD SILICONE ELASTOMER KIT(道康宁东丽(Dow Corning Toray)公司)调整后的未固化的硅氧烷单体与聚合引发剂的混合物(重量比10:1)，除此之外使用通过制造实施例所记载的过程制成的微芯片，并使用直径0.2μm和直径0.5μm的粒子验证了分离。作为0.2μm粒子，使用了荧光聚苯乙烯珠FluoresbriteDG(Polyscience公司制造；吸收极大波长480nm、荧光极大波长520nm)，作为0.5μm粒子，使用了荧光聚苯乙烯珠FluoresbriteBB(Polyscience公司制造；吸收极大波长360nm、荧光极大波长407nm)。作为含有分离对象的粒子的流体100P，使用0.05％(v/v)Tween-20水溶液将直径0.2μm的荧光聚苯乙烯粒子调制成为3.3ng/mL、将直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子调制成为7.5ng/mL。作为不含分离对象的粒子的流体100N，使用了0.05％(v/v)Tween-20水溶液。在此，所使用的0.05％(v/v)Tween-20水溶液是在实验前使用孔径0.45μm的针头过滤器(默克密理博(Merckmillipore)公司制造)进行异物去除后使用的。通过注射泵(KDScientific公司)调节流量，分别将流体100P以5μL/h的流量从进口14a输送、将流体100N以90μL/h的流量从进口14b输送。此外，各流量采用了使两种粒子的分离最好的条件。将各流体导入微芯片10，一边导入一边通过各自对应的波长的光分别获取荧光图像。荧光图像是使用倒立型显微镜IX71(奥林巴斯公司)通过汞灯向观察区域照射规定的激发光并通过数字CMOS摄像机ORCA-FLASH(滨松光子学公司)在两秒期间拍摄图像获取区域30而获取到的。在对0.2μm的粒子和0.5μm的粒子分别制作出荧光图像之后，对检测线20的荧光分布进行了分析。荧光分布的横轴为检测线20上的坐标，纵轴表示各坐标的相对荧光亮度。此外，检测线20设定于从分支点31起的向出口15的方向200μm的下游处，将坐标0设为扩大区域壁面17a侧。另外，图像获取区域30设定为将检测线20纳入到获取图像内。
利用PFF进行的粒子分离中的流路结构的影响
实施例8：向粒子滑流的壁面16a侧流路宽度不扩大而向没有粒子滑流的壁面16b 侧流路宽度阶梯式地扩大、并且在扩大流路17的扩大开始点19配置有排出流路的粒子分离 装置
将图32(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作为粒子分离装置。图32(a)是微芯片10的顶视图，是图32(b)中的A向视图。图32(b)是图32(a)中的B-B线的截面图，图32(c)是图32(a)中的区域21的放大图。
在基板11的下表面11a，以在与基板12叠加时形成流路13的方式进行了加工。流路13的深度全部设为3.5μm。在流路13的端部设置有贯通于基板11的上表面的进口14a、14b、出口15、23(各个孔的直径1.5mm)。另外，流路13包括分支流路18a(宽度20μm、长度1.5mm)、分支流路18b(宽度40μm、长度500μm)、狭窄流路16(宽度3.3μm、长度20μm)、扩大流路17(宽度215μm、长度6.15mm)、排出流路22(宽度300μm、长度1.3mm)的流路。
使用上述的图32(a)～(c)所示的微芯片10，按照分离观察实施例，获得了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像(图32(d)和(e))。在图32(f)、图32(g)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果能够确认出直径0.2μm、0.5μm的粒子大致完全分离的情形。
比较例3：向粒子滑流的壁面16a侧流路宽度阶梯式地扩大、向没有粒子滑流的壁 面16b侧流路宽度阶梯式地扩大、并且在扩大流路17的扩大开始点19配置有排出流路的粒 子分离装置
将图33(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用被设计成与实施例8的微芯片10相比只有狭窄流路16与扩大流路17的角度24a、24b为90°且从狭窄流路壁面16a到扩大流路壁面17a的宽度为50μm的点与实施例8不同的微芯片10，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为5μL/h、80μL/h的点以外与实施例8相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例8同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图33(d)、图33(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图33(f)、图33(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果可知，能够看到本比较例中的直径0.2μm、0.5μm粒子的分离有局部重叠，因此性能比实施例8差。
比较例4：向粒子滑流的壁面16a侧流路宽度阶梯式地扩大并且在扩大流路17的扩 大开始点19配置排出流路22、向没有粒子滑流的壁面16b侧流路宽度不扩大的粒子分离装 置
将图34(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用与实施例8的微芯片10相比除了设计成为狭窄流路16与扩大流路17之间的角度24a为90°、角度24b为180°的点以外与实施例8同样的微芯片10，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为5μL/h、80μL/h的点以外与实施例8相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例8同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。另外，由于将角度24a设为90°、将角度24b设为180°，因此使用了具有如下流路结构的微芯片10：扩大流路17位于与狭窄流路垂直的方向上，排出流路22位于与狭窄流路平行的方向上。也就是说，本比较例是将实施例8的狭窄流路16与扩大流路17的连接部分的结构上下翻转后的结构且是用于进行比较的结构。在此，在设为将扩大流路17配置在与狭窄流路22平行的方向上也就是说配置在与实施例8相同的方向上、将排出流路22配置于垂直方向且是与实施例8上下翻转后的位置的流路结构的情况下，粒子流向了大部分流体流过的排出流路22。即，在该配置的情况下，无法获得利用排出流路22的分离能力提高的效果。因此，为了设为具有与实施例8相同的粒子分离能力的流路结构，而形成为图34(a)～(c)所示的流路结构。
在图34(d)、图34(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图34(f)、图34(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果可知，能够看到本比较例中的直径0.2μm、0.5μm粒子的分离有局部重叠，性能相比于实施例8大幅变差，与比较例3相比也差。
实施例9：向有粒子滑流的壁面16a侧流路宽度不扩大而向没有粒子滑流的壁面 16b侧流路宽度逐渐地扩大、并且在扩大流路17的扩大结束点19配置有排出流路22的粒子 分离装置
将图35(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用与实施例8的微芯片10相比除了狭窄流路16与扩大流路17之间的角度24a为180°、角度24b为135°、扩大区域的斜坡部分40的长度为将排出流路的长度设为500μm以使流向出口15和出口23的流体的比与实施例8同等的点以外具有与实施例9相同的结构的微芯片10，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为3μL/h、90μL/h的点以外与实施例8相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例8同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图35(d)、图35(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图35(f)、图35(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果可知，关于本实施例中的直径0.2μm、0.5μm粒子的分离，能够确认出完全分离，分离性能比实施例8的分离性能优异。
比较例5：向粒子滑流的壁面16a侧流路宽度逐渐地扩大并且在扩大流路17的扩大 结束点配置排出流路22、向没有粒子滑流的壁面16b侧流路宽度不扩大的粒子分离装置
将图36(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用与实施例9的微芯片10相比除了设计成为狭窄流路16与扩大流路17之间的角度24a为135°、角度24b为180°的点以外与实施例9同样的微芯片10，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为3μL/h、95μL/h的点以外与实施例10相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例9同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。另外，由于将角度24a设为135°、将角度24b设为180°，因此使用了具有如下流路结构的微芯片10：扩大流路17位于与狭窄流路16垂直的方向上，排出流路22位于与狭窄流路16平行的方向上。也就是说，本比较例是将实施例9的狭窄流路16与扩大流路17的连接部分的结构上下翻转后的结构且是用于进行比较的结构。在此，在设为将扩大流路17配置在与狭窄流路22平行的方向上也就是说配置在与实施例9相同的方向上、将排出流路22配置于垂直方向且是与实施例8上下翻转后的位置的流路结构的情况下，粒子流向大部分流体流过的排出流路22。即，在该配置的情况下，无法获得利用排出流路22的分离能力提高的效果。因此，为了设为具有与实施例9相同的粒子分离能力的流路结构，而形成为图36(a)～(c)所示的流路结构。
在图36(d)、图36(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图36(f)、图36(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果可知，关于本比较例中的直径0.2μm、0.5μm粒子的分离，能够确认出是不完全分离，分离性能比实施例9的分离性能差。
实施例10：在实施例9的粒子分离装置的斜坡部分40处具有凹部的粒子分离装置
将图37(a)～(d)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。该微芯片10使用如下的微芯片10，将其它的实验条件设定为与实施例10相同，进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证，其中，上述的微芯片10的结构与实施例8大致相同，但是在扩大区域的斜坡部分40的一部分处，如示出狭窄流路16与扩大流路17的连接部分的放大图的图37(d)所示那样，在鞘液侧狭窄流路壁面16b与斜坡部分40之间具有由流路壁面41a、41b(均为长度50μm)构成的局部的凹部。此外，与实施例9同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图37(e)、图37(f)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图37(g)、图37(h)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。从这些结果可知，关于本比较例中的直径0.2μm、0.5μm粒子的分离，能够确认出完全分离，分离性能与实施例9的分离性能大致同等。
根据目前为止的结果，可以说优选的是鞘液侧的狭窄流路壁面16b与扩大流路壁面17b之间的角度24b大于90°，但是即使是90°、或90°以下的角度，只要该部分是局部的凹部结构且该凹部结构小于扩大流路、排出流路的宽度，则从利用PFF进行粒子分离的观点来看，实质上能够视为流体的流动与在鞘液侧的狭窄流路壁面16b的下游侧仅存在斜坡部分40的情况是大致等效的，从而可以说能够发挥同等的分离性能。
实施例11：变更实施例9的粒子分离装置的狭窄流路宽度、流路13的深度后的粒子 分离装置
将除了将狭窄流路16的宽度变更为2μm、将流路13的深度变更为2μm的点以外具有相同结构的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用该微芯片10对0.1μm和0.2μm粒子的分离进行了验证。作为要分离的粒子，使用直径0.2μm的荧光聚苯乙烯珠FluoresbriteDG(Polyscience公司制造；吸收极大波长480nm、荧光极大波长520nm)和直径0.1μm的荧光聚苯乙烯珠FluoresbriteBB(Polyscience公司制造；吸收极大波长360nm、荧光极大波长407nm)，直径0.2μm的荧光聚苯乙烯粒子稀释为3.3ng/mL，直径0.1μm的荧光聚苯乙烯粒子稀释为67ng/mL，并用于实验。另外，样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为0.5μL/h、75μL/h。此外，与实施例9同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图38(a)、图38(b)中分别示出直径0.1μm、直径0.2μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像。观察直径0.1μm的粒子向流向出口15的扩大流路17流动、0.2μm的粒子向流向出口23的排出流路22流动的情形，确认出100nm左右的微小粒子也能够通过本发明记载的内容进行分离、回收。
实施例12：扩大流路壁面17a去向壁面17b而缩小、向没有粒子滑流的壁面16b侧流 路宽度阶梯式地扩大、并且在扩大流路17的扩大开始点19配置有排出流路的粒子分离装置
将图41(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用与实施例8的微芯片10相比除了设计成为狭窄流路16与扩大流路17之间的角度24a为210°、角度24b为90°的点以外与实施例8同样的微芯片10，并使用压力泵P-PumpBasic(Dolomite公司)来作为送液泵，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为1090mbar、1200mbar的点以外与实施例8相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例8同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图41(d)、图41(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图41(f)、图41(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。根据这些结果，能够确认出通过本比较例能够进行直径0.2μm、0.5μm粒子的分离。根据本结果暗示了不使扩大流路壁面17a扩大是理想的。
比较例6：扩大流路壁面17a、17b均扩大且在扩大流路17的扩大结束点配置有排出 流路22的粒子分离装置
将图42(a)～(c)所示的微芯片10基于上述的制造实施例制作成粒子分离装置。使用与实施例8的微芯片10相比除了设计成为狭窄流路16与扩大流路17之间的角度24a、24b为165°的点以外与实施例8同样的微芯片10，并使用压力泵来作为送液泵，在除了样本溶液和鞘液的流量条件分别设定为1070mbar、1200mbar的点以外与实施例8相同的实验条件下，同样地进行了直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的分离的验证。此外，与实施例8同样地，各流量采用使两种粒子的分离最好的条件，用于分离的评价。
在图42(d)、图42(e)中分别示出直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的积分图像，在图42(f)、图42(g)中分别示出表示直径0.2μm、直径0.5μm的荧光聚苯乙烯粒子的检测线20上的荧光分布的曲线图。根据这些结果，能够确认出通过本比较例直径0.2μm、0.5μm粒子的分离不完全。根据本结果也暗示了不使扩大流路壁面17a扩大是理想的。
附图标记说明
10：微芯片；11：基板；11a：下表面；12：下表面基板；13：流路；14、14a、14b：进口；15、15a、15b、15c：出口；16：狭窄流路；16a：样本溶液侧狭窄流路壁面；16a：狭窄流路16的内壁；16b：鞘液侧狭窄流路壁面；17：扩大流路；17a：样本溶液侧扩大流路壁面；17b：鞘液侧狭扩大路壁面；18a、18b：分支流路；19：扩大开始点；20：检测线；21：区域；22：排出流路；23：出口；24a、24b：角度；30：图像获取区域；31：分支点；40：斜坡部分；41a、41b：流路壁面；50：粒子；51：粒子流动的方向；52：光阑形成构造；53、53’、53”：光阑；54、54a、54b、54a’、54b’、54a”、54b”：电极；55：导线；56：电测定器；57：电源；58：导电性溶液；59：电极插入口；60：中继流路；61：分析部；62：粒子检测流路；100：流体；100P：含有粒子的流体；100N：不含粒子的流体；101：粒子导入流路；101d：分支流路；102a～c：粒子回收流路；102a’～c’：分支流路；103a～c：粒子检测部；103a’～c’：粒子检测部；104a～c：出口；105：分支流路；110：粒子分离流路；110A：分支部；110B：粒子扩散流路；120：分支部；190：区域；200：流线的布局；210a、b：向量；300a、b：粒子。

Claims (21)

1.一种粒子检测装置，包括根据粒子的粒径向垂直于流体流动的方向分离粒子的粒子分离流路和以分支形式连接于所述粒子分离流路的两个以上的粒子回收流路，所述粒子检测装置的特征在于，
所述粒子回收流路具备包括光阑和电检测器的粒子检测部。
2.根据权利要求1所述的粒子检测装置，其特征在于，
存在于各粒子回收流路中的粒子检测部的光阑能够检测的粒径范围互不相同。
3.根据权利要求1或2所述的粒子检测装置，其特征在于，
存在于各粒子回收流路中的粒子检测部的光阑能够检测的粒径范围的一部分相互重叠。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的粒子检测装置，其特征在于，
具有如下的流路结构：调整所述粒子回收流路的条数、分支部的形状、宽度、高度、长度中的至少一个参数，使得某固定大小以上的大小的粒子不会混入。
5.根据权利要求1～4中的任一项所述的粒子检测装置，其特征在于，
所述粒子分离流路包括在一个末端处具备流体导入口的两个以上的分支流路以及该分支流路合流而形成的流路，所述粒子分离流路从至少一个分支流路的流体导入口被导入含有分离对象的粒子的流体。
6.一种用于检测流体中含有的粒子的方法，其特征在于，
根据粒子的粒径，向垂直于流体流动的方向分离粒子，
将分离后的粒子向两个以上的流路分割，
通过电检测器来检测所述粒子，所述电检测器包括以夹持设置于所述流路的光阑的方式配置的电极。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述电检测器能够检测的粒径范围根据所述电检测器被设置的流路而不同。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，
所述电检测器能够检测的粒径范围的一部分根据所述电检测器被设置的流路而相互重叠。
9.根据权利要求6～8中的任一项所述的方法，其特征在于，
通过调整所述流路的条数、分支部的形状、宽度、高度、长度中的至少一个参数而设为某固定大小以上的大小的粒子不会混入的流路结构，来将粒子向两个以上的流路分割。
10.根据权利要求6～9中的任一项所述的方法，其特征在于，
所述粒子分离流路包括在一个末端处具备流体导入口的两个以上的分支流路以及该分支流路合流而形成的流路，所述粒子分离流路从至少一个分支流路的流体导入口被导入含有分离对象的粒子的流体。
11.根据权利要求1所述的粒子检测装置，其特征在于，
在所述粒子检测部的下游具备流体排出口，
所述电检测器的电极被设置于流体排出口。
12.根据权利要求1所述的粒子检测装置，其特征在于，
在所述粒子分离流路中，流路的壁由不易向外侧方向膨胀的材料构成。
13.根据权利要求12所述的粒子分离装置，其特征在于，
所述材料为计示硬度40以上的材料。
14.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
在所述粒子分离流路中，在流路的壁不易向外侧方向膨胀的条件下进行粒子分离。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
含有分离对象的粒子的流体的流量小于其它流体的流量。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
含有分离对象的粒子的流体与被导入到其它分支流路中的流体在以合流方式形成的流路中形成层流。
17.根据权利要求1所述的粒子检测装置，其特征在于，
所述粒子分离流路包括在一个末端侧具备流体导入口且在另一个末端侧与其它分支流路合流的两个以上的分支流路、该两个以上的分支流路合流而形成的狭窄流路以及与狭窄流路的另一个末端连接且流路宽度被扩大了的扩大流路，所述两个以上的粒子回收流路与扩大流路连接，在从一个分支流路的流体导入口导入含有分离对象的粒子的流体并从另一个分支流路的流体导入口导入不含分离对象的粒子的流体的情况下，粒子沿着狭窄流路的壁面滑流，在所述扩大流路的壁面中，向粒子滑流的壁面侧流路宽度不扩大，向没有粒子滑流的壁面侧流路宽度扩大。
18.根据权利要求17所述的粒子分离装置，其特征在于，
向没有粒子滑流的壁面侧流路宽度逐渐地扩大。
19.根据权利要求17所述的粒子分离装置，其特征在于，
向没有粒子滑流的壁面侧扩大流路的流路宽度逐渐地扩大，且狭窄流路壁面与扩大流路壁面之间的角度24b为90°以上。
20.根据权利要求19所述的粒子分离装置，其特征在于，
向没有粒子滑流的壁面侧扩大流路的流路宽度逐渐地扩大，且狭窄流路壁面与扩大流路壁面之间的扩大的角度24b为135°以上。
21.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，
在粒子滑流的壁面侧在抑制涡流的产生和粒子扩散的条件下进行粒子分离。
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