KR101656846B1 - 생물학적 분석들을 수행하기 위한 분석 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반응 챔버와 다수 세트들의 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 다중화 분석 장치를 제공하고, 이 반응 챔버는 마이크로채널(1)이며, 마이크로캐리어들(2)의 길이방향 이동은 규제되고, 마이크로캐리어들(2)은 적어도 두 개의 마이크로캐리어들이 서로 접촉하지 않고 마이크로채널(1)의 주연부와 접촉하지 않는 상태로 마이크로채널(1) 내에서 나란히 서있을 수 있도록 마이크로채널(1)의 형상에 관한 형상을 가지며, 바람직하게는 반응 챔버 내에서 관찰가능하다. 또한, 본 발명은 질량 전달을 개선시키고, 준비 및 분석의 실행을 단순화하며, 마이크로캐리어들(2)의 동일성 및 생물학적 반응들의 판독을 용이하게 하는 마이크로캐리어들(2)에 기초한 다중화 분석을 수행하기 위한 방법을 제공한다.

Description

생물학적 분석들을 수행하기 위한 분석 장치 및 방법 {ASSAY DEVICE AND METHOD FOR PERFORMING BIOLOGICAL ASSAYS}
본 발명은 생명 과학 산업의 분석 기술에 관한 것으로, 특히, 진단들, 게놈 연구 및 분자 생물학에 적용되는 다중화(multiplexing)에 관한 것이다. 본 발명은 마이크로제조 기술의 기술들 및 처리들과 반도체 기술로부터의 기술들 및 처리들을 사용한다.
생물학적 분석들은 생물학적 샘플 내의 타겟 분자들의 검출을 가능하게 한다. 통상적으로, 타겟 분자들의 검출은 특정 타겟들에 결하도록 설계된 검출 분자들(리간드들;ligand)로 기능화된 고체 표면들(예를 들어, 마이크로 어레이들 또는 벽들의 저부) 또는 나노캐리어 또는 마이크로캐리어 구조들을 사용함으로서 수행된다.
생물학적 분석 기술들의 한 가지 과제는 분석 동안 이루어지는 질량 전달의 가속화이다. 질량 전달 문제는 다수의 타겟 분자들이 단일 생물학적 샘플 내에서 동시에 고려되게 되는 다중화된 분석들에서 더욱 심화되며, 그 이유는 각 프로브의 상대 밀도가 단일 분석에서보다 낮기 때문이다.
질량 전달의 한계들을 극복하기 위해서, 마이크로채널 내에서 다중화된 분석들을 수행함으로써 타겟들과 프로브들 사이의 확산 거리를 감소시키는 것 같은 다양한 설정들이 개시되어 있다. 예로서, J.K.-K. Ng 등(2007)의 Anal. Chem Acta 582, 295쪽 내지 303쪽에는 비오틴-스트랩타비딘 결(biotin-streptavidin binding)을 통해 올리고뉴클레오타이드들로 기능화된 마이크로비드들을 포함하는 마이크로유체 장치가 개시되어 있다. 마이크로유체 장치는 가변 단면과, 단층 배열로 마이크로비드들을 포획하기 위한 댐(weir)을 구비하는 넓은 챔버로 구성된다. 상이한 마이크로비드들의 세트들이 순차적으로 도입되고 비기능화된 스페이서 비드들에 의해 분리된다. 이 문헌의 도 5a에서 볼 수 있는 바와 같이, 마이크로비드들은 스페이서 세트들의 입자들과의 입자 혼에 기인하여 규정되지 않은 경계들을 갖는 큰 그룹들을 형성한다. 비드들이 그들을 서로 구별할 크기, 형상 또는 코드 같은 어떠한 특성도 갖고 있지 않기 때문에, 다양한 세트들의 경계들은 알 수 없고, 샘플 내의 시료의 존재의 검출에 의해 분석 이후에만 드러나게 된다. 따라서, J.K.-K. Ng 등에 의해 설명된 설정은 샘플 내에 다수의 타겟들의 존재 또는 부재 사실을 신뢰성있게 결정하는 것이 불가능하기 때문에 다중화된 분석들을 위해서는 부적하다. 예로서, 연속적 세트들에 대응하는 다수의 시료들이 샘플 내에 존재하지 않는다면, 마이크로채널의 전체 부분에는 어떠한 신호도 기록되지 않을 것이다. 따라서, 이 부분이 실제로 얼마나 많은 세트들에 대응하는지를 정립하는 것이 곤란하다(따라서, 얼마나 많은 시료들이 실제 존재하지 않는지에 대한 어떠한 지표도 없다). 또한, 이들 세트들의 순서열 내의 위치가 신뢰성있게 정립될 수 없기 때문에 연속적 세트들과 반응하는 후속 시료들의 동일성을 정립하는 것이 어렵거나 심지어 불가능하다.
EP1712282A2, WO00/061198A1 및 WO04/025560A1은 그 이동이 마이크로채널 내에 규제되어 있는 것 같은 마이크로채널들 내측에 배치된 마이크로캐리어 요소들을 갖는 설정들을 개시한다. 분석들은 유체들을 관통 유동시킴으로서 수행된다. 이 유형의 설정은 확산 거리들이 작고 마이크로캐리어들에 대한 샘플의 이동이 타겟 분자들을 수용체 분자들의 부근으로 이동시키기 때문에 질량 전달에 효과적이다. 또한, 이 유형의 설정들은 필요한 시약들의 양을 감소시킴으로써 비용을 감소시킨다.
그러나, EP1712282A2 및 WO00/061198A1에서, 마이크로 채널 내의 마이크로캐리어들의 순서가 매우 중요하며, 그 이유는 이것이 마이크로캐리어들의 동일성을 규정하기 때문이다. WO2004025560A1에서, 마이크로캐리어들은 마이크로채널 내의 그 순서가 EP1712282A2에서만큼 중요하지 않도록 인코딩된다. 여전히, WO2004025560A1의 내용도 그 식별을 가능하게 하기 위해 마이크로캐리어들의 코드들의 특정 배치를 필요로 하는 제안된 디코딩 메커니즘의 요구들을 충족시키도록 마이크로캐리어들이 엄격하게 서로 전후로 정렬되어 있는 구성들을 개시하고 있을 뿐이다.
EP1712282A2, WO00/061198A1 및 WO04/025560A1은 디코딩 목적을 위해 그 순서를 제어하거나 그들을 정렬하도록 속박된 공간 내에 마이크로캐리어들의 극도로 제어된 도입을 필요로 하기 때문에, 실시 준비는 용이하지 않은 설정들을 개시하고 있다. 이런 구성들을 달성하기 위해서는 현미경, 마이크로조작(현미경적으로 제어된 힘들의 사용) 및/또는 마이크로제조 기술들을 수반하는 특수화된 방법들 및 특정 설정들이 필요하다.
사실, 마이크로캐리어들은 WO0061198A1에 설명된 것 같은 개별 마이크로캐리어들의 복잡한 마이크로조작을 수반하거나, 각 마이크로 캐리어의 정확한 위치가 제어될 필요가 없을 때에는 그들을 벌크로부터 WO04/025560A1에 기재된 것 같은 작은 마이크로채널 내로 안내하는 소정 유형의 펀늘 메커니즘을 수반하는 소정의 프로세스에 의해 마이크로채널 내에 도입될 필요가 있다. 펀늘 메커니즘은 실시시 구축이 더 간단하지만, 마이크로채널(1)의 진입부에 아치들이 형성되어 있으므로 폐색에 민감하다(도 14 및 도 15). 펀늘 접근법에 추가로, WO04/025560A1은 홈들을 갖는 하부 판 상에 비드들이 배치되어 있는 샌드위치 접근법에 의한 분석 스틱들의 제조를 제안하고 있다. 후속하여, 상부 판이 상단부 상에 배설되고, 하부 판에 부착된다.
종래 기술에 설명된 설정들을 준비하기 위해 필요한 정교성의 레벨의 한 가지 실용적 결론은 실험실 기술자에 의한 연구 용도를 위한 유연한 구성을 제조하기 위해 사용될 가능성을 감소시킨다는 것이다. 예로서, 마이크로캐리어들 상에 그 소유의 생화학 코팅 절차들을 사용하고(예로서, 개발 중인 생물학적 프로브들을 테스트하기 위해) 그후 이들을 설정에 도입하여 생물학적 분석들을 수행하기를 원하는 실험실 기술자에 의한 맞춤 제조된 준비를 가능하게 하는 것이 매우 곤란하다.
따라서, 마이크로캐리어들에 기초한 생물학적 다중화 분석들에서 질량 전달을 향상시키고, 설정의 준비를 위한 전체 절차를 단순화하여 생물학적 분석을 실행하고 필요한 판독들을 수행하는 분석 장치들 및 방법들에 대한 필요성이 본 기술 분야에 존재한다.
따라서, 본 발명의 일반적 목적은 생물학적 다중화된 분석들의 준비 및 수행을 위한 절차의 단순화 및 개선된 질량 전달을 가능하게 하는 방법 및 장치, 특히, 다중화된 분석들을 위한 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 마이크로채널의 단면에 대한 마이크로캐리어들의 형상 및 크기가 나란히 배열된 임의의 마이크로캐리어들 중 적어도 두 개가 마이크로채널의 전체 길이에 걸쳐 예를 들어 충전 동안 마이크로채널의 길이 방향으로 이동할 때 마이크로채널의 주연부와 접촉하지 않고, 그리고, 서로 접촉하지 않게 하는 것 같은 인코딩된 마이크로캐리어들(즉, 그 표면에 부착된 리간드들 같은 마이크로입자들)의 동시적 다수의 세트들을 포함하는 반응 챔버로서 마이크로채널을 제공한다. 바람직하게는 마이크로캐리어들은 마이크로채널 내에서 관찰될 수 있다. 또한, 이 설정은 여전히 유체들이 관통 유동할 수 있게 하면서 상기 마이크로채널 내의 상기 마이크로캐리어들의 길이방향 이동을 규제하기 위한 소정 수단을 포함한다. 통상적으로 하나 이상의 타겟 분자들을 포함하는 생물학적 샘플은 구속 또는 부동화된 마이크로캐리어들을 통해 유동되고, 그래서, 마이크로캐리어들은 생물학적 샘플의 유동을 추종하지 않는다. 마이크로캐리어들에 대한 샘플의 이동은 타겟 분자들이 수용체 분자들의 부근으로 이동시켜 결합 기회들을 증가시키고, 따라서, 질량 전달을 수행하기 위해 필요한 인큐베이션 시간을 감소시킨다. 분석의 수행에 독립적으로, 그리고, 그 위치에 독립적으로 다양한 세트들을 구별하기 위해, 마이크로캐리어들은 코드가 그 기능을 나타내도록 인코딩된다.
본 발명의 중요한 양태는 설정의 준비를 용이하게 하기 위한 마이크로채널의 단면에 관한 마이크로캐리어들의 상대적 형상 및 크기에 있다. EP1712282A2, WO00/061198A1 및 WO04/025560A1에 기재된 기존 기술은 마이크로유체 채널 내의 마이크로캐리어들의 배열의 엄격한 제어를 필요로 하고, 이는 이런 작은 크기(즉, 미크론 범위)의 대상물들의 조작이 진부하고, 현미경, 마이크로조작(현미경적으로 제어된 힘들의 사용) 및/또는 마이크로제조 기술들을 수반하는 특수화된 방법들 및 특정 설정들을 필요로 하기 때문에 달성이 쉽지 않다.
본 발명에서, 마이크로캐리어들은 마이크로채널의 내측에서 매우 더 높은 이동 자유도를 갖는다. 본 발명의 마이크로캐리어들의 형상 크기는 적어도 두 개의 마이크로캐리어들이 서로 접촉하지 않고, 그리고, 마이크로채널의 주연부에 접촉하지 않고 반응 챔버로서 기능하는 마이크로채널의 전체 길이에 걸쳐, 그리고, 특히, 그 진입부에서 나란히(side by side) 배치될 수 있도록 이루어진다. 이는 다양한 속도들로 마이크로채널의 길이 방향으로 이동하는 마이크로캐리어들이 그 길이방향 이동이 규제되는 지점까지 서로 통과할 수 있다는 것을 의미한다. 이 특징은 설정의 실용적 구성을 촉진하는 핵심이며, 이는 설정이 분석 수핵 직전의 연구 환경에서 준비될 때 특히 중요하고, 이는 마이크로캐리어들의 세트들의 혼합물들을 준비하는데 유연성을 가능하게 한다. 마이크로캐리어들의 크기보다 상대적으로 매우 더 넓은 마이크로채널의 사용은 진입부를 패색하는 마이크로채널의 진입부의 아치들을 형성할 가능성을 감소시키는 효과를 갖는다. 이는 추가적으로 마이크로 채널을 로딩하기 위해 좁은 펀늘 대신 확장형 입구를 사용하는 것을 가능하게 한다. 두 번째 장점은 마이크로채널 내측에 장애물들이 존재하는 경우, 마이크로캐리어들의 대부분을 차단할 기회들을 감소시키는 것으로 구성된다. 장애물들은 마이크로채널 내의 이물질(먼지) 또는 기포 같은 바람직하지 못한 요소들일 수 있거나, PDMS 같은 연성 폴리머들을 사용할 때 마이크로채널들의 적절한 강성도를 보증하기 위한 예를 들어, 필라들 같은 마이크로유체 채널의 마이크로제조를 촉진하기 위해 필요할 수 있는 내장 특징부들일 수 있다.
본 발명은 마이크로캐리어들에 기초하며, 다중화에 적합한 분석을 수행하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 이는
a) 반응 챔버로서 마이크로채널을 포함하는 분석 장치를 제공하고 인코딩된 마이크로캐리어들의 적어도 두 개의 세트들을 제공하는 단계로서, 마이크로캐리어들의 코드는 기능을 나타내고, 마이크로채널의 단면에 대한 상기 마이크로캐리어들의 형상 및 크기는 마이크로채널 전체 길이에 걸쳐 임의의 마이크로캐리어들 중 적어도 두 개가 서로 접촉하지 않고, 그리고, 마이크로채널의 주연부와 접촉하지 않고 나란히 서 있을 수 있게 하는, 단계와,
b) 상기 적어도 두 세트들의 인코딩된 마이크로캐리어들로 상기 마이크로채널을 적어도 부분적으로 충전하는 단계와,
c) 유체들의 관통 유동을 여전히 허용하면서 상기 마이크로채널의 길이 방향으로 상기 마이크로캐리어들의 이동을 규제하는 단계와,
d) 상기 마이크로캐리어들을 포함하는 상기 마이크로채널을 통해 하나 이상의 타겟 분자들을 잠재적으로 포함하는 샘플을 유동시키는 단계와,
e) 상기 마이크로캐리어들의 세트들을 식별하는 단계와,
f) 리간드와 타겟 분자 사이의 반응을 검출하고, 샘플 내의 타겟 분자의 존재 또는 부재를 추론하기 위해 특정 세트의 동일성과 반응의 존재 또는 부재를 상관시키는 단계를 포함한다.
다수의 우물부(well)들을 사용하는 것 같은 전통적 해법들에서, 기본적 교반 기술들을 사용하여 질량 전달이 향상되며, 여기서, 샘플 및 마이크로캐리어 요소들 양자 모두는 임의적으로 교반된다. 유동들이 층상인 마이크로 스케일들에서, 이 기술은 효율적 질량 전달을 보증하기 위한 핵심 요소인 샘플에 관한 마이크로캐리어들의 상대 이동을 단지 미소하게 증가시킨다. 본 발명은 샘플과 마이크로캐리어들의 이동들을 분리시킨다. 또한, 세장형 반응 챔버 설정 및 마이크로캐리어들 주변의 제한된 체적은 샘플이 최대수의 마이크로캐리어들과 근접하게 통과하는 것을 보증한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 분석의 달성되는 장점은 잠재적 수용체들과 관심 분자들을 접촉시키기 위한 확산에 대한 의존성을 감소시킴으로써 질량 전달을 가속시키는 것이다. 다른 장점들은 메커니즘의 단순성을 포함하며, 이는 질량 전달을 개선시키기 위한 형상적 배열들 및 마이크로채널들의 특성들에 의존한다. 또한, 이 설정은 예로서, 복잡한 분석들의 수행을 위해 추가적 단계들이 필요한 경우, 마이크로캐리어들의 취급을 위한 최소의 요건들로 유연한 유체 조작들을 가능하게 한다. 유체를 전후로 이동시키는 것이 바람직한 경우, 예로서, 유체의 속도가 신뢰성있게 제어될 수 없는 경우 또는 샘플이 희석되어 관련 분자들의 적절한 포착을 보증하기 위해 마이크로캐리어들과 수회 접촉 통과될 필요가 있는 경우에, 설정에 대한 미소한 개조가 필요하다.
본 발명은 반응이 마이크로캐리어 내에 동일 국지적(co-localized) 신호를 생성한다면, 다양한 반응들을 여전히 식별할 수 있으면서 다양한 마이크로캐리어들의 세트에 대한 다양한 기능들의 연계 및 분석시의 그 동시적 사용을 가능하게 하기 때문에, 다중화된 분석들에 적합하다. 이는 식별가능하며, 따라서, 그들이 보유하는 기능을 결정할 수 있게 하는 인코딩된 마이크로캐리어들을 사용함으로써 달성된다.
또한, 마이크로유체 설정은 생물학적 분석을 수행하기 위해 필요한 샘플의 양을 감소시킨다. 또한, 이는 마이크로캐리어들에 대한 어떠한 특정 조작도 수행할 필요 없이 마이크로채널을 통해 추가적 시약들 또는 세척 용액들이 유동될 수 있게 함으로써 임의의 필요한 추가적 분석 단계들의 실행을 용이하게 한다.
또한, 본 발명은 마이크로캐리어들이 반응 챔버로부터 수집되고 판독 장치로 이동될 필요가 있는 전통적인 마이크로캐리어 기반 접근법들에 비해 시험의 결과들을 획득하기 위해 필요한 전체적 조작들을 단순화한다. 사실, 마이크로채널들이 적어도 부분적으로 투명한 실시예들에서, 마이크로캐리어들은 세트들을 식별하고 생물학적 판독을 수행하기 위해 광학적 수단에 의해 마이크로채널 내측에서 직접적으로 관찰될 수 있다. 또한, 이러한 구성은 반응이 발생할 대 마이크로캐리어들을 관찰함으로써 동역학 정보의 가능성을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 조작을 용이하게 하고 마이크로채널 내의 마이크로캐리어들의 도입을 위해 필요한 숙련도 수준을 감소시킴으로써 분석 장치의 준비를 간단해지게 하며, 따라서, 분석 수행 직전에 준비되는(예로서, 연구 환경들에서) 맞춤 제조 구성들의 사용을 가능하게 한다.
본 발명은 주로 생명 과학 산업에서 사용될 수 있으며, 특히, 진단, 게놈 연구 및 분자 생물학에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 상세한 설명을 고려하면, 본 발명을 더 잘 이해할 수 있을 것이며, 상술한 것들 이외의 목적들을 명백히 알 수 있을 것이다. 이런 설명은 첨부 도면들을 참조한다.
도 1은 확장형 말단부(6)와 입구(5)에 연결되는 그 진입부(14)와, 정지 수단(4)(필터 구조체 형태) 및 출구(15)에 연결되는 그 진출부(16)를 갖는 반응 챔버(굵은 선으로 도시됨)로서의 마이크로채널(1)의 예시적 실시예를 도시한다. 도 1a는 상면도를 도시하고, 도 1b는 도 1a의 선 A-A를 통한 단면도를 도시한다.
도 2는 확장형 말단부(6)와 두 개의 입구들(5, 5')을 구비하는 진입부(14)를 갖는 마이크로채널의 예시적 실시예를 도시한다. 도 2a는 확장형 섹션(6) 및 두 개의 입구들(5, 5')을 갖는 마이크로채널(1)의 상면도를 도시하고, 도 2b는 도 2a의 선 A-A를 통한 단면도를 도시한다.
도 3은 확장형 말단부(6)와 하나의 입구(5)를 갖는 진입부(14)를 갖는 마이크로채널(1)의 예시적 실시예를 도시한다. 또한, 이 도면은 층상 유동들과 우물부(7) 내의 층상 와류(8)를 도시한다. 도 3a는 마이크로채널(1)의 상면도와 마이크로채널(1)의 일 말단부에서의 그 확장형 섹션(6)을 도시한다. 도 3b는 도 3a의 선 A-A를 통한 단면도를 보여주며, 와류(8)를 형성하는 유동(9)과 마이크로채널(1)에 대한 접근로를 제공하는 우물부(7) 및 입구(5)를 도시하고 있다.
도 4는 마이크로캐리어들(2)이 디스크형 형상을 가지며(즉, 원형 전방면을 갖는 웨이퍼 형태의 형상), 직사각형 단면을 갖는 마이크로채널(1) 내에 존재하는 예시적 실시예를 도시한다. 마이크로채널(1)은 두 개의 측벽들(101)과, 베이스(102)와 덮개(103)를 구비한다. 마이크로채널(1)의 단면은 마이크로캐리어들(2)이 단층 배열을 형성하고 그 회전 이동들이 규제되도록 이루어진다. 도 4a는 상면도를 도시하고, 도 4b는 도 4a의 선 A-A를 통한 단면도를 도시한다. 도 4c는 3-D 표현을 도시한다. 예시된 경우에서, 단층 배열은 엄격히 평면 내에 존재하지는 않지만(마이크로캐리어들(2)의 수직 위치는 도 4b에 도시된 바와 같이 미소하게 변함), 마이크로캐리어들(2)은 서로의 위로 이동할 수 없다. 마이크로캐리어들(2)의 다양한 충전 패턴들은 다양한 설정들을 예시한다.
도 5는 마이크로유체 채널(1) 내측의 마이크로캐리어들(2)의 단층 배열의 광각 영상을 포착하기 위한 어레이형의 센서(10), 예를 들어, CCD 또는 C-MOS 포토 센서의 사용을 예시한다.
도 6은 마이크로캐리어들(2)이 디스크형 형상을 가지고, 직사각형 단면을 갖는 마이크로채널(1) 내에 존재하는 예시적 실시예를 도시한다. 이는 마이크로캐리어들이 그 길이방향 이동이 규제되는 지점에 도달할 때까지 마이크로캐리어들이 비교적 자유롭게 운동(본 예에서는 2D 평면 내에서)하는 방식을 예시한다. 이는 이들이 서로 통과할 수 있게 하며, 장애물이 존재하는 경우에 다수의 마이크로캐리어들을 차단하는 위험을 감소시킨다. 도 6a는 상면도를 도시하고, 도 6b는 도 6a의 선 A-A를 통한 단면도를 도시한다. 도 6c는 3D 표현을 도시한다.
도 7은 디스크형 형상을 갖는 마이크로캐리어(2)와 마이크로캐리어(2)를 통한 횡단 구멍들(21)의 패턴 형태의 코드의 예시적 실시예를 도시한다. 마이크로캐리어(2)는 마이크로캐리어(2)가 상하 반전되는지를 결정하기 위해 사용되고 또한 코드 패턴의 시작 지점으로서도 기능하는 삼각형 배향 마크(20)를 나타낸다. 마이크로캐리어(2)는 주연부에 코딩 요소들을 구비하며, 따라서, 생물학적 판독을 위해 적합한 전용의 균일하고 평탄한 영역을 위해, 마이크로캐리어(2)의 중심 둘레에 표면의 상당한 부분을 남겨두게 된다.
도 8은 CCD 카메라에 의해 촬상된 두 개의 화상들을 도시하며, 이 두 개의 화상들은 간단한 다중화 분석에서 마이크로캐리어들(2)의 생물학적 판독을 예시한다. 두 세트들의 마이크로캐리어들(2)이 마이크로채널 내에 도입되며, 제 1 세트의 마이크로캐리어들(11)(하나의 구멍을 갖는 코드)은 DNA 프로브(P1)(5'-CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT-3')으로 기능화되고, 제2 세트의 마이크로캐리어들(12)(3개 구멍들을 갖는 코드)은 다른 DNA 프로브(P2)(5'-TGG GTA AGT TAG GGC GAT GG-3')로 기능화된다. 프로브(P1)와 상보적인 형광 라벨링된 DNA 타겟(T1)(5' Cy5-AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG-3')을 포함하는 용액이 그후 플러싱되고, 마이크로캐리어들(11)만이 반응된 DNA 프로브(P1)로 기능화된다(도 8a의 밝은 부분(백색광)과 도 8b의 형광 사이의 차이 참조).
도 9는 반응의 동역학에 대한 정보를 제공하기 위해 분석이 이루어지는 동안 시간에 걸쳐 생물학적 판독이 수행되는 방식을 예시한다. 또한, 이 도면은 장치가 수초(200 nM의 타겟 농도에서 수행됨)의 교배 반응들을 검출할 수 있기 때문에 질량 전달에 관해 매우 효율적이라는 것을 보여준다. 이 화상은 형광 하에서 CCD 카메라로 촬상되었다.
도 10은 디스크형 형상(도 7에 대해 상술된 것 같은)을 갖는 인코딩된 마이크로캐리어들(2)이 직사각형 단면을 갖는 마이크로채널(1) 내에 존재하는 다른 예시적 실시예를 도시한다. 마이크로채널(1)의 단면은 마이크로캐리어들(2)이 단층 배열(이들은 서로의 위로 이동할 수 없음)을 형성하고, 그들이 실질적으로 마이크로채널 내측에서 평탄하게 배치되도록 그 회전 운동들을 규제하도록 이루어진다.
도 11은 다중화를 위한 칩(13)을 예시한다. 상기 칩은 기능화된 마이크로캐리어들(2)의 다수의 세트들을 포함하는 다수의 마이크로채널들(1)을 포함한다. 마이크로채널들(1)은 입구(5) 및 출구(15)에 연결된다. 마이크로캐리어들(2)은 디스크형이며, 인코딩된다(도 10에 대해 상술한 것 같이).
도 12는 웨이퍼 형태를 갖는 마이크로입자들의 다양한 예들을 예시한다. 전방면은 디스크(좌측)의 형태, 정방형 형태(중앙) 또는 육각형 형태(우측)를 갖는다.
도 13은 마이크로캐리어들(2)이 디스크형 형상을 가지고 횡단 구멍들(21)의 패턴 및 L형 배향 마크(20)로 인코딩되는 예시적 실시예를 도시한다. 도 13a은 마이크로캐리어들의 밝은 부분(백색광) 화상을 도시한다. 도 13b는 샘플(9)을 유동시킨 이후 반응된 마이크로캐리어들을 노출시키는 형광 화상을 도시한다. 양 영상들은 샘플(9)의 유동 이후 촬상되었다.
도 14는 좁은 마이크로채널(1) 내로 마이크로캐리어들(2)을 안내하여 마이크로채널(1)의 진입부(14)를 폐색하는 펀늘로 아치들이 형성되는 방식을 도시한다.
도 15는 마이크로채널(1)의 진입부를 폐색하는 펀늘 구조로 형성된 마이크로캐리어들(2)의 아크의 화상을 도시한다.
도 16은 직사각형 또는 "근사 직사각형"인 형태들의 다양한 비제한적 예들을 도시한다. 이들은 이들이 웨이퍼의 형태일 때 마이크로캐리어들(2)을 위한 또는 마이크로채널들(1)을 위한 양호한 단면들을 예시한다.
도 17은 예시적 실시예의 두 개의 화상들을 도시한다. PDMS 몰딩 기술들을 사용하여 형성되고 유리 현미경 슬라이드(Nam-Trung Nguyen 및 Steve Wereley에 의해 마이크로유체의 원리 및 적용(Fundamentals and Applications of Microfluidics)에 개시된 바와 같이(ISBN:9781580533430, 챕터 3))에 접합된 칩(13)은 일 단부에서 입구(5)에 연결되고 다른 단부에서 출구(15)에 연결되는 마이크로채널(1)을 포함한다. 직사각형 필라들로 이루어진 필터 구조체로 구성된 정지 수단(4)은 마이크로채널(1)의 출구에 구축된다. 추가적으로, 원통형 필라들(17)이 마이크로채널(1) 내에 구축되어 부압의 인가시 마이크로채널의 높이를 안정화(즉, 압축되는 것을 피함)하는 것을 돕는다.
도 18은 아직 방출되지 않은 실리콘 마이크로입자들을 포함하는 웨이퍼의 화상을 도시한다. 마이크로입자들은 디스크형 형상을 가지며, 횡단 구멍들(21)의 패턴에 의해 인코딩되어 있다. 마이크로캐리어들은 50 미크론의 직경을 가지며, L형 배향 마크(20)를 포함한다.
본 발명을 수행하는 형태들
본 발명의 범주 내에서 이하의 정의들이 적용된다.
'다중화'는 각 분석의 결과들을 독립적으로 식별하는 기능을 갖는, 통상적으로, 다수의 화합물들 또는 분자들에 대해 다수의 분석들을 병렬적으로 수행하는 것을 지칭한다. 이들 분석들은 예를 들어, 생물학적 및/또는 화학적 특성으로 이루어질 수 있으며, 통상적으로 다수의 검출 대상 타겟 분자들과 이들 타겟 분자들을 검출하기 위한 보조제로서 기능하기 위한 다수의 포착 분자들을 수반한다. 상기 포착 분자들은 통상적으로 캐리어 물질들 상에 리간드들로서 부착되어 있다. 자둥화 분석에서 병렬적으로 수행되는 분석들의 수는 종종 다중화의 '레벨'이라 지칭되며, 단지 수개(2 또는 3) 내지 고도의 다중화 레벨들에 대하여 수천 수만까지의 범위일 수 있다. 후자는 일반적으로 마이크로어레이들 상에서 오늘날 통상적으로 수행되는 핵산 교배 분석들이지만, 이는 본 명세서에 개시된 분석 장치에 의해 수행될 수 있다.
'단일 분석'은 단 하나의 타겟 분자가 하나의 포착 분자에 의해 검출되는 것으로 고려되는 단일 분석의 수행을 지칭한다.
'반응 챔버'는 타겟 분자와 포착 분자 또는 리간드 사이의 생물학적 및/또는 화학적 반응이 이루어지는 공간을 지칭한다.
'마이크로채널' 또는 '마이크로유체 채널'은 폐쇄된 채널, 즉, 현미경 크기의 단면, 즉, 통상적으로 1 내지 500 마이크로미터, 바람직하게는 10 내지 500 마이크로미터, 더욱 바람직하게는 20 내지 300 마이크로미터, 더 더욱 바람직하게는 30 내지 300 마이크로미터인 최대 치수(단면의)를 갖는 유체들을 위한 세장형 통로를 지칭한다. 마이크로채널은 길이 방향을 가지며, 이는 반드시 직선일 필요는 없고, 마이크로채널 내에서 유체들이 안내되는 방향, 즉, 실질적으로, 층상 유동 체계를 가정하면 마이크로채널 내를 통과하는 유체의 속도 벡터들의 벡터 가산에 대응하는 방향에 대응한다. 마이크로채널은 일 단부에 진입부(14)를 가지고, 다른 단부에 진출부(16)를 가지며, 이들은 예를 들어, 유체들이 마이크로채널 내로 진입하고 각각 마이크로채널을 벗어나게 하는 마이크로채널 내의 개구들이다. 마이크로채널의 단면은 종종 그 길이 대부분에 걸쳐 일정하지만, 이 단면은 변할 수 있고, 통상적으로 입구(5)에 대한 연결, 출구(15)에 대한 연결, 하나 이상의 다른 마이크로채널들에 대한 연결 또는 다른 마이크로유체 구성요소(밸브 메커니즘 같은)에 대한 연결을 위해 적어도 진입부(14) 부근 또는 진출부(16) 부근에서 확장될 수 있다. 마이크로채널은 길이 방향에 의해 형성되는 라인이 임의의 형상 또는 길이를 가지고, 3차원적으로 연장하도록 연장될 수 있다(즉, 길이 방향으로의 연장부에 의해 형성되는 라인은 평면 내에 머무르지 않는다).
'단면'이라 설명할 때, 길이방향 축에 수직인 단면을 의미한다.
용어 '주연부'는 단면의 원주 또는 마이크로채널의 내부 주연부를 지칭한다.
'기능화된'은 하나 이상의, 그러나, 바람직하게는 하나의, 리간드가 그 표면에 부착되어 있는 입자 또는 마이크로입자를 지칭하며, 이는 주어진 타겟 분자(시료)를 위한 포착 또는 수용체 분자로서 기능할 수 있다. 용어 '분자'는 넓게 이해되어야 하며, 다수의 분자들, 입자들 또는 셀들을 마찬가지로 포함한다. 예로서, 타겟 '분자'는 바이러스 입자일 수 있고, 그리고/또는 포착 '분자'(리간드)는 항원-결합 단편들의 그룹일 수 있다. 다른 예로서, 타겟 '분자'는 DNA, RNA 또는 ssDNA 단편 같은 핵산일 수 있으며, 포착 '분자'는 전자와 교배되도록 설계된 DNA, RNA 또는 ssDNA 같은 다른 핵산일 수 있다. 또한, 하나의 타겟 분자를 특정하게 포착하기 위해, 다양한 포착 분자들이 필요할 수도 있다. 본 발명의 범주 내에서, 언급된 예들은 '포착 분자' 또는 '타겟 분자'로서 각각 한정(qualify)될 수 있다. 리간드들 및 타겟 분자들은 천연,성 또는 반성일 수 있다.
용어 '기능'은 주어진 타겟 분자와 결합 및/또는 반응하는 능력을 지칭하며, 따라서, 특정 리간드의 존재를 지칭한다.
용어들 '리간드', '포착 분자' 및 '수용체 분자'는 본 명세서에서 동의적으로 사용된다. 용어들 '타겟 분자' 및 '시료'도 동의적으로 사용되지만, 시료는 다수의 타겟 분자들을 포함할 수 있다.
'마이크로입자들'은 통상적으로 최대 치수가 100 nm 내지 300 마이크로미터, 바람직하게는 1㎛ 내지 200㎛인 현미경 크기의 임의의 유형의 입자들을 지칭한다.
'마이크로캐리어들'은 본 명세서에서 사용될 때 샘플 내의 시료를 분석 및/또는 그와 반응하도록 기능화된 마이크로입자들이다. 용어 '기능화된 마이크로캐리어'는 본 명세서에서 동의적으로 사용된다. 형상적 양태들 또는 마이크로제조 양태들 같은 그 기능에 연계하지 않은 양태들을 설명할 때, '마이크로캐리어들' 및 '마이크로입자들'은 본 명세서에서 동등한 것으로 간주될 수 있다.
'세트' 또는 '마이크로캐리어들의 세트'는 동일 기능화를 갖는 하나 이상의 마이크로캐리어들을 지칭한다. 세트는 단 하나의 마이크로캐리어 또는 하나보다 많은 마이크로캐리어들일 수 있다. 한 세트의 마이크로캐리어들은 둘 이상의 타겟 분자들을 포착하기 위해 하나보다 많은 포착 분자들을 보유할 수 있지만, 이는 여전히 하나의 기능이라 지칭된다. 서로 구별될 수 있는 두 개의 다른 세트들의 마이크로분자들은 동일 기능화를 가질 수 있다.
용어 '생물학적 판독'은 마이크로캐리어에 부착된 리간드가 타겟 시료와 결합 또는 반응되었는지 여부의 검출을 지칭한다. 또한, 생리학적 판독은 반응된 타겟 시료의 양을 나타내는 정량적 정보를 제공한다.
'코드'는 본 명세서에서 사용될 때, 특정 개체군(예를 들어, 주어진 기능을 갖는 마이크로캐리어들의 개체군)에 마이크로캐리어의 마이크로입자를 연계시키거나 마이크로입자 또는 마이크로캐리어를 식별하기 위해 사용되는, 관찰 또는 감지시 식별될 수 있는 마이크로입자 또는 마이크로캐리어의 임의의 속성 또는 특성이다. 마이크로캐리어 상의 코드는 그 위치에 독립적으로 또는 분석의 수행에 독립적으로 결정될 수 있으며, 즉, 이는 밝혀내고자 하는 타겟 시료의 존재를 필요로 하지 않는다. 통상적으로, 코드는 관찰시 마이크로입자 또는 마이크로캐리어의 광학적 또는 자기적 응답에 의해 특징지어진다. 이 응답은 전체로서 마이크로입자 또는 마이크로캐리어를 위해 규정될 수 있거나(예를 들어, 마이크로캐리어의 색상), 패턴화된 레이아웃을 초래하도록 마이크로입자 또는 마이크로캐리어 상에 또는 그 내에서 공간적으로 변조될 수 있다(예를 들어, 마이크로캐리어 상의 색상의 변조에 의해 얻어지는 바코드). 코드의 예들은 색상, 형상, 크기, 인쇄 또는 각인된 패턴들, 구멍들의 구성, 홀로그래픽 패턴들, 자기 서명들, 화학 조성, 광 투과 또는 반사 특성들의 변경, 양자 도트 방출 또는 표면에 부착된 파괴적으로 검출가능한 이물질들(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 폴리머들)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 '인코딩된 마이크로캐리어들' 및 '인코딩된 마이크로입자들'은 각각 본 명세서에서 코드를 갖는 마이크로캐리어들 및 코드를 갖는 마이크로입자들을 지칭한다. 본 발명의 마이크로캐리어들은 독립적으로 인코딩되며, 즉, 다수의 마이크로캐리어들(통상적으로 한 세트의 마이크로캐리어들)이 동일한 값을 갖는 코드를 보유할 수 있지만(즉, 마이크로캐리어들은 그 코드 단독에 기초하여서는 구별할 수 없다) 각 마이크로캐리어들은 그 소유의 코드를 보유한다. 본 발명의 인코딩된 마이크로캐리어들의 다양한 세트들은 마이크로채널 내의 마이크로캐리어들의 위치에 독립적으로, 그리고, 분석의 수행에 독립적으로 구별 및/또는 식별될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 '나란히' 배열되었다거나 '나란히' 서있다는 것은 마이크로채널의 형상과 둘 이상의 마이크로입자들의 형상에 관계를 부여하는 형상적 특성을 지칭한다. 하나 이상의 마이크로입자들은 이들이 (i) 마이크로채널 내측에 둘 이상의 마이크로입자들이 끼워진 것 같은 구조로 있을 때, (ii) 그 주어진 위치에서 단면을 교차할 때, (iii) 길이 방향(그 주어진 위치에서)을 따른 그 돌출된 표면들이 단면(그 주어진 위치에서)의 표면 내에서 중첩되고 수납되지 않을 때 마이크로채널 내의 주어지 위치에서 '나란히'배열되어 있다고 지칭된다. 일반적으로, 그 전체 길이에 걸쳐 일정한 단면을 갖지 않는 마이크로채널에서, 하나 이상의 마이크로입자들은 소정 위치들에서는 나란히 배열될 수 있지만, 다른 위치들에서는 그렇지 않다(비록, 이 일반적 규칙이 그 전체 길이에 걸쳐 마이크로 입자들이 나란히 서있게 할 수 있는 것을 필요로 하는 본 발명의 마이크로채널(1)에 적용되지 않지만). 마이크로입자들의 형상에 따라서, 둘 이상의 마이크로입자들은 그들이 특정 배향들로 있을 때에만 마이크로채널 내의 주어진 위치에서 나란히 서있는 것이 가능할 수 있다. 나란히 서 있을 때, 마이크로입자들은 그 사이에 거리를 갖거나 서로 접촉할 수 있다.
'웨이퍼의 형태'는 본 명세서에서 폭 및 길이 양자 모두보다 높이가 특히 더 작고(예를 들어, 적어도 2배 만큼) 마이크로입자가 두 개의 본질적으로 평행하고 본질적으로 평탄한 표면들(전방면들)을 상부 및 하부(도 12 참조)에 구비하는 경우의 마이크로입자의 특정 형상을 지칭한다. '디스크형' 형상은 원형 전방면을 갖는 웨이퍼 형태의 형상을 지칭한다.
마이크로채널
본 발명의 마이크로채널(1)은 바람직하게는 직선, 즉, 길이 방향이 직선을 따라 연장하지만, 사형 윤곽, 즉, 길이 방향이 점유면적을 제한하기 위해 아크들로 연결된 평행한 트랙들을 갖는 라인을 형성하도록 연장할 수도 있다. 마이크로채널(1)은 바람직하게는 본질적으로 평면형이지만, 또한, 삼차원적으로 연장할 수도 있다.
마이크로유체 채널(1)의 길이는 일반적으로, 통상 내부에 포함되어 있는 마이크로유체 칩(13)에 맞도록 원하는 점유면적에 따라, 그리고, 그 단면에 따라 변할 수 있다. 통상적으로 이는 1 mm 내지 500 cm, 바람직하게는 5 mm 내지 200 cm의 범위이다. 마이크로채널의 폭 및 높이는 바람직하게는 500 nm 내지 300 마이크로미터이다. 예로서, 사형 윤곽을 가지면서 작은 단면(예를 들어, 100 미크론 미만)을 갖는 마이크로채널(1)은 비교적 작은 점유면적(수 평방 센티미터) 내에서 수백 센티미터 같은 비교적 긴 길이를 달성할 수 있다. 예로서, 1 평방 센티미터에서, 50㎛ 단면을 갖는 100 cm 길이의 사형 마이크로채널(1)을 설치하는 것이 가능하다(표면의 절반이 마이크로채널(1)에 의해 점유되고 나머지 절반이 간격인 것으로 가정). 더욱 양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)은 실질적으로 직선이며, 2 mm 내지 10 mm의 길이, 200 미크론 내지 600 mm의 폭 및 10 미크론 내지 20 미크론의 높이를 갖는다.
본 발명의 마이크로채널(1)은 진입부(14)와 진출부(16)를 가지며, 이들은 각각 유체들(9)이 마이크로채널(1)에 진입하고 마이크로채널(1)을 벗어날 수 있게 한다. 또한, 진입부(14)는 마이크로채널(1) 내측에 마이크로캐리어들(2)을 도입하기 위해 사용되고, 통상적으로, 바람직하게는 확장형 말단부(6)를 통해 입구 우물부(5)에 연결된다. 본 발명의 마이크로채널(1)은 바람직하게는 후술될 바와 같이 정지 수단(4)에서 종결되며, 통상적으로, 유체들(9)을 출구(15)에 연결하는 다른 마이크로유체 채널(반응 챔버로서 기능하지 않음)에 의해 연장된다.
마이크로채널(1)은 바람직하게는 직사각형 또는 근사 직사각형(도 16 참조), 부등변 사각형 또는 유사 평행사변형인 단면을 갖는다. 마이크로채널은 통상적으로 두 개의 측벽들(101)과, 베이스(102)와, 덮개(103)를 갖는다. 측벽들은 바람직하게는 직선이며 베이스(저부면) 및 덮개(상부면)에 대해 각각 거의 90도의 각도로 배치되지만 반드시 그럴 필요는 없다. 측벽들은 오목형으로 또는 볼록형으로 굴곡질 수 있거나, 베이스 또는 덮개를 예로서, 45도 또는 60도의 비 직선인 각도로 연결할 수 있다. 통상적으로, 마이크로채널의 높이는 그 폭보다 특히 더 작다(예를 들어, 적어도 2배만큼). 다른 실시예에서, 베이스(102) 및/또는 덮개(103)는 예로서, 유체들(9)의 유동을 촉진하기 위해 미소하게 굴곡되거나 홈들 또는 돌기들을 갖도록 구성된다.
반응 챔버(1)로서 기능하는 본 발명의 마이크로채널(1)은 임의의 두 개의 마이크로캐리어들(2)이 서로 접촉하지 않고, 그리고, 그 전체 길이에 걸쳐, 특히, 그 진입부(14)에서 주연부와 접촉하지 않는 상태로 나란히 서 있을 수 있도록 적어도 두 세트들의 마이크로캐리어들(2)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 마이크로채널(1)은 임의의 두 개의 마이크로캐리어들(2)의 최대 돌출 표면의 가장 큰 연장부의 합보다 큰 그 단면 중 적어도 하나의 치수를 갖는다. 예로서, 직사각형 또는 근사 직 사각형 단면을 갖는 마이크로채널(1)과, 웨이퍼 형태의 마이크로캐리어들(2)에서, 상기 치수는 임의의 두 개의 마이크로캐리어들(2)의 폭들의 합보다 큰 마이크로채널(1)의 폭일 수 있다. 따라서, 마이크로채널(1)은 두 개의 마이크로입자들이 예를 들어 충전 동안 마이크로채널(1)의 길이 방향으로의 마이크로입자들의 이동을 방해하지 않는 상태로 나란히 배열될 수 있도록 하는 폭을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게, 폭은 마이크로입자들이 서로 접촉하지 않고, 마이크로채널(1)의 주연부와 접촉하지 않고 통과할 수 있도록 이루어지며, 이러한 접촉은 마찰에 기인하여 차단을 초래할 수도 있다. 양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)의 단면은 바람직하게는 마이크로채널(1)의 전체 길이에 걸쳐 일정하거나 실질적으로 일정하다. 다른 실시예에서, 마이크로채널(1)은 확장형 말단부(6)에 연결되고, 이 확장형 말단부에서는 마이크로캐리어들의 도입을 용이하게 하도록 통상적으로 진입부(14)에서 단면이 확장된다. 양호한 실시예에서, 직사각형 또는 실질적 직사각형 마이크로채널의 진입부(14)에서의 확장형 말단부(6)는 마이크로채널의 높이(즉, 베이스와 덮개 사이의 거리)를 바람직하게 실질적으로 일정하게 유지하면서 길이방향 축에 대한 측벽들(101)의 거리를 증가시킴으로써 이루어진다.
양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)은 실리콘, SU-8(에폭시계 포토레지스트), 폴리이미드(PI), 폴리디메틸실록산(PDMS), 실리콘 또는 다른 열 가소성 엘라스토머들(TPE), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 테플론(PTFE), 열가소성 엘라스토머들(TPE), Victrex PEEKTM, 폴리카보네이트, 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리스티렌(PS), 불화 에틸렌-프로필렌(FEP), 사이클릭 올레핀(Co)폴리머(COP 또는 COC) 또는 다른 열가소성 폴리머들, 석영, 유리 또는 니켈, 은 또는 금 같은 도금가능한 금속들, 가장 바람직하게는 투명 폴리머들로 이루어지거나 이들을 포함한다. 가장 바람직하게는, 마이크로채널은 사이클릭 올레핀(Co)폴리머로 이루어진다.
바람직하게는, 마이크로채널(1)은 적어도 하나의 측부에서 투명하다. 그에 의해, 마이크로입자들은 광학적 검사를 위한 대응 수단, 예를 들어, 현미경을 통해 쉽게 관찰될 수 있다. 이는 이들이 마이크로채널(1) 내에 배치될 때 광학적 기술들로 인코딩된 마이크로캐리어들(2)의 세트들의 용이한 식별 및 결정을 위해 본 기술 분야에서 사용되는 광학적 응답에 기초한 종래의 기술들에 의해 생물학적 판독의 결정을 가능하게 한다. 투명성을 제공하기 위한 적절한 재료는 예를 들어, SU-8, PDMS 또는 실리콘이다.
마이크로채널(1)은 문헌에 광범위하게 설명되어 있는 종래의 포토리소그래피 및/또는 스탬핑 및/또는 사출 성형 기술들을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, Marc J. Madou의 마이크로조립의 원리(Fundamentals of microfabrication)(ISBN:0849308267, 9780849308260), Nam-Trung Nguyen 및 Steve Werely의 마이크로유체의 원리 및 적용(Funamentals and Appplications of Microfluidics)(ISBN:9781580533430, 챕터 3)). 예로서, 마이크로채널(1)은 공지된 방법들에 의해 기판 내에 채널을 에칭하고 그후 이를 예를 들어, 유리로 이루어진 플레이트 또는 역시 기판 내에 에칭된 제2 채널로 밀봉함으로써 제조될 수 있다. 또한, 예로서, EP1276555B1에 개시된 것 같은 웨이퍼 상에 실리콘 마이크로입자들을 제조하기 위한 마이크로제조 기술들도 마이크로입자들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
고려되는 스케일들에서, 유동들은 층상이다. 샘플 내의 관련 타겟 분자들이 최대의 마이크로캐리어들(2)의 부근으로 통과하는 것을 보증하기 위해, 마이크로채널(1)은 마이크로캐리어들(2)이 샘플(9)이 관통 유동할 수 있게 하는 단면을 그들 둘레에 가능한 작게 개방시키도록 하는 방식으로 설계되어야 한다. 유량은 예를 들어, 마이크로캐리어들 둘레에 남겨진 개방 단면, 마이크로채널의 길이, 유체들을 이동시키는 힘(예를 들어, 인가되는 압력) 및 샘플의 유체 특성들(점성, 샘플이 보유하는 분자 크기 등)에 의해 제한될 것이다.
마이크로캐리어들 및 마이크로캐리어들의 세트들
마이크로채널(1)은 적어도 두 세트들의 마이크로캐리어들(2)을 동시에 보유하지만, 또한, 세 개, 네 개, 다섯 개, 열 개 또는 수백 개 또는 더 많은 마이크로캐리어들의 세트들을 포함할 수도 있다. 더 높은 레벨의 다중화를 위해(예로서, 핵산 교배 분석들을 위해), 마이크로채널은 수백 수천의 세트들을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, 작은 마이크로캐리어들(2)과 결부된 길고 넓은 마이크로채널들(1)에 의해 달성가능하다.
크기들, 형상들 및 재료와 마이크로입자들과 마이크로캐리어들 사이의 차이는 정의 부분에서 설명하였다.
본 발명의 마이크로입자들 또는 마이크로캐리어들(2)은 고처리량 스크리닝 기술 및 진단들에 일상적으로 사용되는 임의의 재료로 형성되거나 이들을 포함할 수 있다. 이들 재료들의 비제한적 예들은 라텍스, 폴리스티렌, 가교결합 덱스트란들, 폴리메틸스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 불화 에틸렌-프로필렌 및 유리, SiO2, 실리콘, PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), 금, 은, 알루미늄, 철 또는 다른 금속들, 또는 SU-8 같은 에폭시계 감광 재료들 같은 마이크로제조 또는 마이크로밀링에 일상적으로 사용되는 재료들을 포함한다. 마이크로입자들은 임의의 형상들 및 크기들로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 마이크로캐리어들(2)은 실리콘으로 이루어진다.
본 발명의 마이크로캐리어들(2)은 코드를 판독함으로써 그 기능이 결정될 수 있는 방식으로 인코딩된다.
마이크로입자들 및 마이크로캐리어들(2)은 바람직하게는 구형 형상 또는, 웨이퍼의 형태를 가지며, 웨이퍼의 형태라는 의미는 그 높이가 그 폭 및 그 길이 양자 모두 보다 특히 더 작고(예를 들어, 적어도 2배만큼), 그들이 두 개의 실질적으로 평행하며 실질적으로 평탄한 표면들(전면들)을 상부 및 하부에 갖는다는 것을 의미한다.
따라서, 웨이퍼의 형태를 갖는 마이크로캐리어들(2)이 상술한 바와 같이 직사각형 또는 근사 직사각형 단면을 갖는 마이크로채널(1) 내에 도입될 때, 이들은 그 전면들 각각 상에서 평탄하게 배치되고, 이들은 광학 수단에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 도 13은 웨이퍼형 마이크로캐리어들(2)의 예시적 실시예들을 도시한다. 주 표면은 임의의 형상을 가질 수 있으며, 비제한적인 예들은 정사각형, 직사각형, 원형, 삼각형 또는 육각형(도 12, 우측)이다.
양호한 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 원형 형태의 전면을 갖는 디스크형 형상을 가지며, 횡단 구멍들(21)의 패턴에 의해 인코딩되고, 이들은 또한 삼각형 또는 L형 부호 같은 비대칭적 배향 마크(20)를 포함한다. 코드와 형상의 이러한 조합은 영상 디코딩 기술들을 통한 용이한 식별을 가능하게 한다.
다른 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 예를 들어, 마이크로채널 내에서 이들을 부동화하기에 적합할 수 있는 자기 특성들을 갖는다.
각 세트의 마이크로캐리어들(2)은 통상적으로 동일하게 기능화된다. 마이크로캐리어들(2)은 서로에 대해서 상이한 크기 및 형상들을 가질 수 있다. 마이크로캐리어들(2)은 관찰가능한 적어도 하나의 속성 또는 특징, 즉, 코드에 의해 서로 구별가능하도록 인코딩된다. 비록, 모든 마이크로캐리어들(2)이 독립적으로 인코딩되지만, 주어진 세트의 마이크로캐리어들(2)은 동일한 코드를 공유하는 것이 바람직하다. 인코딩된 마이크로캐리어들(2)이 사용될 때, 이들은 제어된 방식이 아닌 임의의 적 순서로 도입될 수 있다.
마이크로캐리어들(2)은 화학적 및 생물학적 분석들을 위한 지지체들로서 기능한다. 이 기능에서, 마이크로캐리어들(2)은 그 표면에 부착된 하나 이상의 리간드들을 포함할 수 있으며, 관련 특정 시료들의 존재 또는 부재를 결정하도록 목표 시료들과 접촉할 수 있거나, 이들은 부착된 리간드 상에서 수행되는 조합 화학 반응들을 위한 지지체들로서 기능할 수 있다. 양호한 실시예에서, 각 마이크로캐리어는 그 표면에 부착된 하나의 리간드를 갖는다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 '하나의 리간드'는 수치적으로 하나의 분자를 의미하는 것이 아니며, 한가지 유형의 리간드를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 항체들, 관련 특정 분자들에 결합하도록 설계된 다른 단백질 및 DNA, RNA 또는 ssDNA 단편들 또는 애프터머(aptamer)들을 포함하는 큰 범위의 화학적 및 생물학적 기능기들이 본 발명의 마이크로입자들에 리간드들로서 부착될 수 있다. 이들 기능기들은 고처리량 스크리닝 기술들 및 진단들에 일상적으로 사용되는 모든 기능기들을 포함한다. 또한, 마이크로캐리어들(2)은 초기 반응제의 부착을 가능하게 하도록 다양한 방식으로 기능화될 수 있다. 마이크로캐리어들(2)에 부착된 리간드들을 위한 목표 시료들의 예들은 항원들, 항체들, 수용체들, 헵텐들, 효소들, 단백질들, 펩타이드들, 핵산들, 약물들, 호르몬들, 병원체들, 독소들, 셀들 또는 임의의 다른 관련 화학제들 또는 분자들을 포함한다.
마이크로캐리어들의 길이방향 이동을 규제하기 위한 수단
본 발명은 마이크로캐리어들(2)에 부착된 수용체들(8)과 유체(9) 내의 관련 분자들(3) 사이의 접촉 기회들을 향상시키기 위해 마이크로캐리어들(2)의 유동 속도에 상대적인 유동 속도를 증가시키기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 유체들(9)의 관통 유동을 허용하면서 길이방향인 유동 방향으로 마이크로캐리어들(2)의 이동을 규제하는 것이 중요하다. 규제 수단의 존재는 동일 장소에서 분석 및 판독을 수행하기 위한 실질적 정적 구성을 제공하여 더 신속한 질량 전달에 추가로 동역학적 판독을 가능하게 한다. 유동에 수직인 마이크로캐리어들(2)의 운동이 이루어질 수 있으며, 심지어 마이크로캐리어들(2)의 운동이 충분히 신속한 경우, 질량 전달의 속도에 대한 긍정적인 영향을 가질 수 있고, 그 이유는 이것이 포착 표면의 실제 크기를 증가시키기 때문이다(이는 예로서, 탭핑, 진동 또는 초음파분해를 통해 달성될 수 있는 교반의 형태이다).
마이크로캐리어들의 길이방향 이동의 규제는 다수의 방식들로 이루어질 수 있다. 예로서, 유체들(9)이 관통 유동할 수 있게 하지만, 마이크로입자들(2)의 통과는 차단하는 적어도 하나의 정지 수단(4)이 반응 챔버(1)의 단부에 사용될 수 있다. 상기 정지 수단(4)의 비제한적 예들은 그리드, 와이어, 메시 필터, 댐 구조, 하나 이상의 필라들, 마이크로채널의 단면의 감소, 정전기력들, 특히, 정전기력들을 사용하여 유지된 하나 이상의 마이크로입자들, 유전영동력들, 특히, 유전영동력들을 사용하여 유지된 하나 이상의 마이크로입자들, 자기 입자 등을 포함한다. 비강성 마이크로채널들(1)의 부분적 압축에 기초한 해결책들(즉, 예를 들어, PDMS 또는 파라핀 같은 연성 폴리머로 이루어진 마이크로채널들의 경우에, 마이크로채널의 형상 수축)도 정지 수단(4)으로서 사용될 수 있다. 정지 수단(4)은 고정되거나 제거가능할 수 있다. 제거가능한 정지 수단들, 예를 들어, 자기 입자들은 마이크로입자들의 교체 또는 마이크로입자들의 분석을 위해 유동(9)의 방향으로의 마이크로입자들(2)의 용이한 제거를 가능하게 한다. 그리드 같은 고정된 정지 수단(4)은 예를 들어, 이들을 분석하기 위해 마이크로입자들(2)을 제거하기 위한 레이저에 의한 제거에 의해 제거될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 마이크로캐리어들(2)이 자기 특성들을 갖는 경우, 마이크로캐리어들(2)은 자기장을 인가함으로서 부동화될 수 있다. 따라서, 정지 수단(4)의 존재는 불필요하다. 대안적 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 유전영동력들에 의해 부동화된다.
마이크로캐리어들의 규제 이동의 도움으로, 설정은 또한 세척 단계들, 추가적 시약들의 플러싱 및 바람직하게는 정적 모드에서 이루어지는 생물학적 판독을 용이하게 한다.
마이크로캐리어들에 관한 마이크로채널의 디자인
본 발명에 따라서, 마이크로채널(1)은 마이크로채널(1)의 전체 길이에 걸쳐, 특히, 진입부(14)에서, 임의의 마이크로캐리어들(2) 중 적어도 두 개가 서로 접촉하지 않고, 주연부와 접촉하지 않는 상태로 나란히 배열될 수 있게 하는 단면을 갖는다. 엄격히 말하면, 반응 챔버(1)로서 기능하는 본 발명의 마이크로채널(1)은 마이크로채널 내에 구축될 수 있는 임의의 정지 수단에서 종결한다(예를 들어, 필터 또는 메시 구조체 또는 단면의 감소 등)는 것을 주의하여야 한다. 이는 정지 수단(4)을 포함하는 임의의 마이크로유체 부분이 본 발명의 마이크로채널(1)의 일부로서 고려되지 않으며, 따라서, 둘 이상의 마이크로캐리어들(2)이 나란히 서 있게 할 필요가 없다는 것을 의미한다. 명료성을 위해, 정지 수단(4) 이후 마이크로채널이 이어질 때, 이 부분은 예로서, 유체들이 출구를 통해 벗어날 수 있게 하기 위한(도 1 참조) 본 발명의 마이크로채널(1)(반응 챔버로서 기능하는)에 연결된 다른 마이크로채널(반응 챔버로서 기능하지 않음)로서 고려된다.
마이크로채널(1)의 단면 및 마이크로캐리어들(2)의 형상이 적어도 두 개의 마이크로캐리어들이 서로 접촉하지 않고 주연부와 접촉하지 않는 상태로 나란히 서 있을 수 있게 한다는 사실은 그들이 반드시 서로 접촉하거나 주연부와 접촉하지 않아야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 비록, 이들이 여전히 마이크로채널(1) 내측에서 자유롭게 이동하거나, 이들이 그 길이방향 이동이 규제된 이후 정착할 때 그러할 수 있지만 이는 단지 마이크로채널(1) 및 마이크로캐리어들(2)의 각각의 형상들이 그들이 나란히 서 있을 때, 강제로 마이크로캐리어들(2)이 서로 접촉하거나 주연부와 접촉하게 만들지 않는다는 것을 의미한다.
서로 접촉하지 않고 마이크로채널(1)의 주연부와 접촉하지 않는 상태로 나란히 서있는 능력은 마이크로캐리어들(2)이 서로에 대해 또는 마이크로채널(1)의 벽들에 대해 마찰을 받지 않고 마이크로채널(1)의 길이 방향으로 다양한 속도들로 이동하는 경우 마이크로캐리어들(2)이 서로 통과할 수 있다는 것을 의미한다. 이 구성은 두 개의 마이크로캐리어들(2)이 진입부(14)에서 나란히 서있을 때 아치들을 형성하기가 매우 더 어렵고, 특히, 두 개보다 많은 마이크로캐리어들이 나란히 서있을 수 있는 양호한 실시예들에서는 더더욱 어렵기 때문에, 마이크로채널(1)로의 진입부(14)의 폐색 기회들을 감소시킨다. 또한, 이는 마이크로캐리어들(2) 중 하나가 장애물에 부딪히는 경우 마이크로캐리어들(2)이 서로 통과할 수 있게 한다. 장애물들은 예로서, 이 방법이 분석 수행 직전에 연구 실험실 환경(제어된 설비 환경과는 반대로)에서 수행될 때 마이크로채널(1)내에 존재할 수 있는 이물질일 수 있다. 또한, 마이크로채널(1)의 제조를 용이하게 하거나 예로서, PDMS 같은 연성 폴리머들을 사용하여 마이크로채널들을 구축하는 경우 그 강성도를 보증하기 위해 마이크로유체 채널(1) 내에 구축되는 필라들 같은 장애물들이 구성될 수 있다. 마이크로유체 채널(1)을 포함하는 장치를 탭핑하는 것도 마이크로캐리어들(2)의 도입 동안 도움을 준다. 실리콘 마이크로입자들 같은 더 무거운 마이크로입자들이 사용될 때, 탭핑은 낮은 주파수들, 통상적으로 5 헤르쯔 미만의 주파수들로 이루어질 때 더욱 효율적이다.
더 양호한 실시예에서, 장애물들(예를 들어, 먼지들)에 대한 민감성 또는 아치들의 형성을 더 많이 감소시키기 위해 두 개보다 많은, 통상적으로 3(세 개) 내지 50(오십 개)의 마이크로캐리어들, 더욱 바람직하게는 3(세 개) 내지 12(열두 개)의 캐리어들(2)이 마이크로채널(1) 내에 나란히 배열될 수 있다.
양호한 실시예들에서, 마이크로캐리어들(2)은 그들이 마이크로채널(1)내에 있을 때 마찰을 감소시키도록 그들 사이의 접촉면을 최소화하는 형상을 갖는다. 통상적으로, 구형들 또는 디스크형들 같은 굴곡된 표면들을 갖는 형상들이 에지형 표면들(육면체 또는 다각형 형상들)에 비해 바람직하다.
양호한 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 영상에서 쉽게 식별할 수 있는 추가적 장점을 제공하는 디스크형 형상을 갖는다. 난형, 타원형 또는 근사 원형 형상 같은 전면을 갖는 웨이퍼 형태의 마이크로캐리어들(2) 같이 다른 마이크로캐리어들(2)과 접촉할 수 있는 굴곡된 표면들을 제공하는 다른 형상들도 고려된다.
단층 배열
매우 양호한 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)의 형상 및 마이크로채널(1)의 단면은 마이크로캐리어들(2)이 단층 배열을 형성하고 그들 둘레에 샘플(9)의 관통 유동을 위한 최소의 단면이 개방될 수 있게 하도록 선택된다. 본 명세서에서 사용될 때, "단층 배열"은 모든 마이크로캐리어들(2)이 그 식별을 위해(즉, 코드의 결정을 위해) 필요한 임의의 부분을 서로 가리거나 폐색하지 않는 상태로 직선으로 관찰할 수 있는 지점이 존재하는 공간적 구성을 지칭한다. 평탄하게 배설된(즉, 실질적으로 수평으로 연장하는 길이 방향을 갖는) 마이크로채널(1)의 경우에, 이는 마이크로캐리어들(2)이 마이크로채널(1) 내에 있을 때 마이크로캐리어들(2)이 서로의 위로 지나가거나 겹쳐지지 못한다는 의미이다. 마이크로채널(1)이 적어도 하나의 측부 상에서 투명한 경우, 단층 배열은 반응 챔버(1) 바로 내측의 간단한 광학적 수단에 의한 마이크로캐리어들의 식별 및 생물학적 판독을 용이하게 하기 때문에 더욱 바람직하다.
본 발명에 의해 제공되는 바와 같이 적어도 두 개의 마이크로캐리어들(2)이 나란히 존재할 수 있다는 사실과 결부되면, 이 구성은 샘플(9)의 관통 유동(예를 들어, 도 4 참조)을 위한 마이크로채널들 둘레의 단면을 여전히 최소화하면서 준-2차원 단층 배열을 형성한다. 도 4b에 예시된 바와 같이, 이는 단일 평면 내의 마이크로캐리어들(2)의 엄격한 정렬을 반드시 수반하는 것은 아니다. 바람직하게는, 두 개 이상, 통상적으로 3(세 개) 내지 50(오십 개) 마이크로캐리어들(2), 더욱 바람직하게는 3(세 개) 내지 12(열두 개)의 마이크로캐리어들(2)이 나란히 배치될 수 있다. 이 배열은 종래 기술에서 나타나는 바와 같이 서로 전후로 마이크로캐리어들(2)을 엄격하게 정렬하는 것보다 더 많은 샘플 유체(9)를 소비하지만, 준비가 더 용이하다.
바람직하게는, 유동 조건들의 균일성을 용이하게 하기 위해 마이크로캐리어들(2) 내에서 반응이 일어나는 영역에서 마이크로채널(1)의 단면은 일정하다.
마이크로캐리어들의 배향 및 식별
단층 배열과 결부하여 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 사용하여 작업할 때, 마이크로캐리어들(2)을 마이크로채널(1) 내에서 직접적으로 관찰할 때 그들을 적절히 위치설정 및/또는 배향하기 위해 마이크로캐리어들(2)을 능동적으로 조작할 필요 없이 코드들이 판독될 수 있는 방식으로 마이크로캐리어들(2)의 형상, 마이크로채널(1)의 형상 및 재료 및 디코딩 메커니즘을 선택하는 것이 더욱 바람직하다. 이는 예로서, 구형(따라서, 어떠한 특정 배향도 요구하지 않는)일 수 있는 전체 마이크로캐리어(2)의 크기 또는 색상 같은, 어떠한 특정 배향 또는 배치도 필요로하지 않는 인코딩 메커니즘들을 사용함으로써 예로서 달성될 수 있다.
대안적으로, 마이크로캐리어들의 형상은 마이크로채널(1) 내측에 있을 때 그 회전이 수동적으로 규제되도록, 즉, 형상적 속박으로 초래되는 것들 이외의 어떠한 외력들도 필요로하지 않고 규제되도록 이루어질 수 있으며, 그래서, 어떠한 코드도 관찰/감지 장치에 적절히 제공될 수 있다.
본 개념의 일 예시적 실시예는 하나 또는 양 면들 상에 존재하는 코드를 갖는 웨이퍼의 형태를 구비하는 마이크로 캐리어들(2)을 설계하고 적어도 베이스(102) 또는 커버(103) 중 어느 한쪽에서 투명 재료로 이루어진(도 8 참조) 직사각형 또는 근사 직사각형 단면을 갖는 마이크로 채널(1) 내측에 이들을 배치하는 것이다. 마이크로채널(1)의 높이는 바람직하게는 두 개의 마이크로캐리어들의 높이 미만이며, 이는 마이크로캐리어들(2)이 서로의 위로 지나갈 수 없게 하는 효과를 갖는다. 이 방식으로, 마이크로캐리어들은 단층 배열을 형성하며, 단지 상하반전될 수 있지만, 마이크로채널(1)의 평면을 관찰하도록 배치된(도 5 참조) 임의의 감지 장치에 대해 본질적으로 항상 평탄한 표면들 중 하나를 제시한다. 마이크로채널(1) 내로 흡입되는 유체(9)와 함께 수직 입구(5)를 통해 이루어지게 될 때(도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이)본 발명에 의해 제공되는 마이크로캐리어(2)의 크기에 비해 비교적 넓은 마이크로채널(1)을 사용함으로써 마이크로캐리어들(2)의 형상에 대한 이러한 추가적 속박은 실제로 그 로딩을 더 많이 어렵게 만들지는 않는다. 이런 마이크로채널(1)의 예시적 실시예들은 도 4 내지 도 6에서 볼 수 있다.
마이크로캐리어들(2)의 면 상에 임의의 코드가 존재하는 경우, 이는 장치에 제시된 정확한 표면(통계학적으로 그들 중 절반)을 갖는 모든 마이크로캐리어들에 대해 쉽게 관찰가능하다. 또한, 코드가 양 측부들 상에 존재하거나 관찰가능한 경우, 모든 마이크로캐리어들(2)이 이들을 배향하기 위한 어떠한 추가적 능동적 조작도 필요로 하지 않고 디코딩될 수 있다.
본 개념의 양호한 실시예는 코드가 양 측부들로부터 판독 및 해석될 수 있도록 마이크로캐리어들(2)을 횡단하는 코드들을 사용하는 것으로 이루어진다. 코딩 체계가 패턴화되는 경우(색상, 크기 등 같은 전체 표면의 비-국지적 특성과는 반대로), 배향을 나타내는 마커(즉, L 형상 마크 또는 삼각형 같은 비대칭성을 갖는 마크)와 조합될 필요가 있을 수 있다는 것을 주의하여야 한다. 도 7은 웨이퍼 형태의 마이크로캐리어(도면에서는 디스크형 마이크로캐리어) 상의 횡단 구멍들(21)을 사용하여 생성된 이런 코드의 예시적 실시예의 화상을 도시한다. 또한, 상기 인코딩 체계는 분석의 성능과는 독립적으로, 그리고, 마이크로채널 내에서의 그 위치에 독립적으로 마이크로캐리어들의 식별을 가능하게 한다.
평면 내의 마이크로캐리어들(2)의 배향 및 위치가 제어되지 않기 때문에, 상기 웨이퍼형 마이크로캐리어들(2)을 검출 및 디코딩하기 위한 양호한 방법은 영상을 구성하는 급속 스캐닝 시스템 또는 도 5에 예시된 것 같은 어레이형 센서(예를 들어, CCD 또는 C-MOS 포토 센서 어레이)를 사용하여 반응 챔버의 영상 또는 다수 영상들을 포착하고, 그후, 마이크로캐리어(2)의 위치를 검출하여 그 코드를 해석하도록 영상에 대해 분석 작업을 수행하는 것이다. 이 분석 작업은 통상적으로 마이크로캐리어들(2)의 위치의 검출을 위해 Hough 알고리즘 같은 형상 인식 알고리즘 및 그 배향에 독립적으로 그 코드를 해석하기 위한 마이크로캐리어(2)의 "가상 회전"을 포함한다. 영상에 대한 분석 작업은 또한 통상적으로 반응 챔버(1) 내의 이물질들 또는 기포들의 존재의 영향을 감소 또는 제거할 수 있다. 현미경으로 CCD(또는 C-MOS) 카메라에 의해 촬상된 "화상"이 이런 마이크로캐리어들(2)의 검출 및 디코딩을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 동일한 카메라는 또한 생물학적 판독(도 8에 도시된 바와 같이)을 위한 형광 신호의 판독을 위해 사용될 수도 있다.
마이크로채널 내로의 마이크로캐리어들의 도입
본 발명의 마이크로채널(1)은 마이크로채널(1) 내측으로 마이크로캐리어들(2)의 도입을 가능하게 하는 진입부(14)를 갖는다. 마이크로채널(1) 내로 마이크로입자들(2)을 도입시키는 전통적 방법은 이들을 진입부(14)에 연결된 입구(5)를 통해 마이크로채널(1) 내로 유동되는 버퍼 용액 내에 현탁시키는 것이다.
바람직하게는 마이크로채널(1)은 그 진입부(14)에 인접하게 확장형 섹션(6)을 구비하며, 이는 마이크로채널(1) 내로 마이크로입자들(2)을 도입시키기 위한 입구(5)로서 기능하는 하나 이상의 수직 벽들(7)에 연결된다(도 2 및 도 3 참조). 확장형 섹션(6)은 입구(5)로부터 마이크로채널(1) 내로 마이크로캐리어들(2) 및 유체들(9)의 안내를 가능하게 하는 펀늘을 형성한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 마이크로채널(1)은 특히 진입부(14)에서, 그 전체 길이에 걸쳐 마이크로채널(1) 내에서 적어도 두 개의 마이크로캐리어들(2)이 나란히 서 있을 수 있게 하는 마이크로캐리어들(2)의 형상에 대한 단면을 가지며, 그에 의해, 아치들의 형성에 의한 진입부(14)의 폐색 기회를 감소시킨다.
현탁액으로 마이크로채널들(1) 내로 마이크로입자들(2)을 도입할 때 조우하는 일반적 문제점은 유동(9)이 정지될 때(예로서, 하나의 용액으로부터 다른 용액으로 절환될 때), 잔여 마이크로입자들(2)이 가능하게는 이들이 층상 와류들(8)(도 3 참조)에 포획될 수 있는 영역들에서 우물부(7)의 바닥에 침전하는 경향이 있다는 것이다. 이는 이들이 제어된 방식으로 이동하기 어렵게 하며, 다양한 마이크로캐리어들(2)의 세트들이 혼합될 위험을 증가시키고, 이는 마이크로캐리어들(2)이 독립적으로 인코딩되는 경우에는 문제가 되지 않지만, 기존 기술에서 요구되는 것 같이 각 세트의 마이크로캐리어들(2)이 마이크로채널(1) 내에 제어된 방식으로 도입되는 것을 필요로 하는 경우에는 문제가 된다. 통상적으로, 마이크로입자들(2)이 완전히 침강하고 입구(5)의 바닥에 놓이게 되기 위한 시간이 주어진다. 그후, 이들은 버퍼 용액의 흡인, 그리고, 장치를 경사지게 함으로써 마이크로입자들(2) 상에 작용하는 중력들의 조합된 작용들 하에서 마이크로채널(1) 내로 이동된다. 이 방법은 실리콘 마이크로입자들(2) 같은 무거운 마이크로입자들에 대해 특히 효과적이다. 교반 및 요동은 이 프로세스를 추가로 도울 수 있다.
마이크로입자들이 제거될 수 없는 장소에서 침전이 발생한 마이크로입자들(2)의 문제를 극복하기 위해, 벽(7) 이외에, 헹굼 유동(9')을 위한 입구(5')로서 사용되는 제2 우물부(7')가 존재한다. 그에 의해, 마이크로입자의 침전을 방지하기 위해 마이크로입자들(2)을 도입하면서(도 2 참조) 마이크로채널(1)을 통해 흐르는 연속적(또는 마이크로 펄스형) 헹굼 유동(9')이 달성될 수 있다. 실리콘으로 이루어진 것 같이 마이크로입자들(2)이 무거울 때에는 장치를 기울어지게 함으로써 마이크로입자들(2) 상에 작용하는 중력이 이들을 원하는 방향으로 이동시키기에 충분하기 때문에 이는 일반적으로 불필요하다.
또한, 마이크로채널(1)의 확장형 말단부(6) 내에 또는 우물부(7) 내에 어떠한 입자들도 남지 않는 것을 보증하기 위해, 마이크로입자들의 도입 이후 마이크로입자 입구(5) 내에 세정 유체(9)(즉, 현탁된 마이크로입자들이 없는)를 플러싱하는 것도 고려된다. 또한, 이는 절차의 신뢰성을 추가로 증가시키기 위해 마이크로채널(1)의 확장형 말단부(6)의 광학적 검사와 조합될 수도 있다.
방법
제2 양태에서, 본 발명은 마이크로캐리어들에 기초한 다중화 분석을 수행하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 반응 챔버로서 마이크로채널(1)을 포함하는 분석 장치를 제공하고, 적어도 두 세트들의 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 제공하는 단계로서, 상기 마이크로캐리어들(2)의 코드는 기능을 나타내고, 상기 마이크로채널(1)의 단면에 대한 상기 마이크로캐리어들(2)의 형상 및 크기는 상기 마이크로채널(1)의 전체 길이에 걸쳐, 임의의 상기 마이크로캐리어들(2) 중 적어도 두 개가 나란히 서 있을 수 있게 하는, 단계와,
b) 상기 적어도 두 개 세트들의 인코딩된 마이크로캐리어들(2)로 상기 마이크로채널(1)을 적어도 부분적으로 충전하는 단계와,
c) 유체들(9)이 여전히 관통 유동할 수 있게 하면서 상기 마이크로채널(1)의 길이 방향으로 상기 마이크로캐리어들(2)의 이동을 규제하는 단계와,
d) 상기 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 상기 마이크로채널(1)을 통해 하나 이상의 타겟 분자들(3)을 잠재적으로 포함하는 샘플을 유동시키는 단계와,
e) 마이크로캐리어들(2)의 세트들을 식별하는 단계와,
f) 리간드와 타겟 분자 사이의 반응을 검출, 즉, 생물학적 판독을 수행하고, 반응의 존재 또는 부재를 특정 세트의 식별과 상관시켜 샘플 내의 타겟 분자(3)의 존재 또는 부재를 추론하는 단계를 포함한다. 이는 통상적으로, 마이크로캐리어들(2)의 식별과 상관된다.
마이크로채널(1), 마이크로캐리어들(2) 및 규제 수단(4)은 바람직하게는 상술한 것들이다. 결론적으로, 본 기술 분야의 숙련자는 본 발명의 제2 양태로서 본 명세서에 개시된 다중화 분석들을 수행하기 위한 방법의 단계들(a) 내지 (c)가 실제로 본 발명의 제1 양태의 다중화 분석 장치를 형성한다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 이들 두 양태들 각각의 설명들은 다른 양태의 맥락에서 이해될 수 있다.
다중화 목적들을 위해, 마이크로채널(1)은 바람직하게는 상이한 기능화를 각각 가지는 마이크로캐리어들(2)의 서로 다른 세트들로 로딩된다. 모든 세트들은 샘플이 유동되고 동시적으로 분석을 받게되기 이전에 반응 챔버 내에 존재한다. 하나보다 많은 기능화된 마이크로캐리어들(2)의 세트가 사용되고, 마이크로캐리어들의 위치가 제어될 필요가 없기 때문에, 다양한 마이크로캐리어들(2)의 세트는 서로 구별될 수 있어야 하며, 달리 말하면, 이들은 이들이 반응 챔버(1) 내에 있을 때 마이크로채널(1)내의 그 위치에 독립적으로 마이크로캐리어들(2)의 기능을 결정할 수 있는 방식으로 이루어져야 한다. 이는 기능을 나타내는 코드로 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 사용하여 달성된다. 코드들의 예들은 상술하였다. 다중화 기술들을 위해, 시료에 의해 생성되는 신호의 부재시에도, 즉, 분석의 수행에 독립적으로 마이크로캐리어들이 구별 및/또는 식별될 수 있는 것이 바람직하며(즉, 이 기술은 어느 세트의 마이크로캐리어가 속하는지를 드러내기 위해 시료의 존재에 의존하지 않아야 하며), 그 이유는 대응 타겟이 존재하지 않는 경우 세트들이 드러나지 않아서 렌더링 품질 제어가 어렵고, 또한, 사용될 수 있는 서로 다른 세트들의 수(즉, 다중화 레벨)를 크게 제한하는 실시예들이 존재하며, 이때, 반응이 각 세트를 위해 식별가능하여야만 하는 방법들에 의존할 필요가 있기 때문이다(형광 판독들의 경우에, 이는 통상적으로 다양한 플루오로포어(fluorophore)들을 사용하여 이루어지지만, 다중화의 레벨은 이때 그 스펙트럼 특성들에 의해 제한되며, 실제로, 이는 통상적으로 최대 5 또는 6 서로 다른 마이크로캐리어들의 세트들이 동시에 사용될 수 있다는 의미이다). 이는 물리적 인코딩 기술들을 사용하여 달성될 수 있다. 예로서, 마이크로캐리어들은 기능을 나타내는 코드 또는 속성 같은 관찰시 구별되는 속성으로 독립적으로 인코딩되거나, 다른 방식으로 생성될 수 있다.
제1 양태의 설명에서 상술한 코드들의 예들의 양호한 실시예에서, 본 방법의 마이크로캐리어들(2)은 디스크형 형상을 가지며, 더더욱 바람직하게는, 이들은 바람직하게는 배향 마크(20)를 포함하는 횡단 구멍들(21)을 포함하는 코드를 갖는다. 따라서, 마이크로채널(1)은 바람직하게는 직사각형 단면을 갖는 평탄한 형상을 구비하며, 마이크로캐리어들(2)은 마이크로채널(1) 내에서 단층으로 배열된다(도 6에서와 같이).
단계 (b)는 바람직하게는 확장형 섹션(6)을 통해 마이크로유체 채널(1)의 진입부(14)에 연결된 입구(5)를 통해 현탁된 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 유체(9)를 유동시킴으로써 달성될 수 있다. 상술한 바와 같이, 이 단계의 실제 구현은 마이크로유체 채널(1)의 단면이 적어도 두 개의 마이크로캐리어들이 그 전체 길이에 걸쳐 마이크로유체 채널(1) 내에서 나란히 서 있을 수 있도록 이루어진다는 사실에 의해 촉진된다. 또한, 단계 (b)는 마이크로채널을 포함하는 평가 장치의 탭핑에 의해 달성될 수도 있다. 이는 마이크로캐리어가 장애물에 의해 차단되는 경우가 발생할 때 설정의 형상에 의해 허용되는 바와 같이 마이크로캐리어들이 서로 통과할 수 있다는 사실을 촉진한다.
단계 (b)에 대하여, 마이크로채널의 벽들과 접촉하지 않고 두 개보다 많은 캐리어들이 나란히 배열될 수 있게 하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 3(세 개) 내지 50(오십 개) 마이크로캐리어들이 나란해질 수 있게 하는 것은 마이크로채널의 진입부 폐색의 위험들 및 마이크로채널 내에 존재할 수 있는 장애물 또는 이물질과 맞서는 것을 감소시킬 수 있게 하기 때문에 설정의 준비를 용이하게 한다.
단계 (c)는 상술한 규제 수단의 설명에서 설명된 바와 같이 규제 수단의 사용에 의해 이행된다. 마이크로캐리어들(2)은 여전히 유체들의 관통 유동을 허용하면서 그 길이 방향으로의 이동이 속박되거나 마이크로채널 내에서 부동화된다.
단계 (d)에서, 관련 분자(들)를 포함할 수 있는 샘플이 마이크로채널(1)을 통해 유동되고, 따라서, 마이크로캐리어들(2)과 긴밀하게 접촉한다. 이는 압력, 전기 전위(전기-삼투 유동), 모세관, 중력 또는 원심력을 포함하는 다수의 기술들을 사용하여 이루어질 수 있다. 양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)은 일 단부에서 하나 이상의 입구들(5)(상술된 바와 같음)에 연결되고, 다른 단부에서 하나 이상의 출구들에 연결되며, 이는 유체들이 하나 이상의 입구들과 하나 이상의 출구들 사이에 압력차를 인가함으로써 이동될 수 있게 하고, 따라서, 압력 구동식 유동(PDF)을 생성할 수 있게 한다. 양압들 및/또는 부압들(흡입)이 펌핑 또는 공압 메커니즘들을 사용하여 하나 이상의 입구들 및/또는 출구들에 인가될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 유체들(9)은 마이크로채널에 연결된 입구에 양압을 인가하고 및/또는 마이크로채널에 연결된 출구에 부압(흡입)을 인가함으로써 이동된다. 유체들(9)은 연속적 방식으로 유동될 수 있거나, 정지-유동 방식으로(즉, 마이크로채널 내의 이동하는 유체들(9)과 정적 유체들(9)의 순서열) 유동될 수 있다.
샘플(9)이 유동하는 속도와, 이에 따른, 관련 분자가 마이크로캐리어(2)에 근접 통과하는 시간은 타겟 분자들(3)의 확산 속도 및 타겟 분자(3)를 위한 수용체들(10)로 코팅된 마이크로캐리어들(2)의 농도에 기초하여 최적화될 수 있다.
마이크로캐리어들(2)이 반응 챔버 내에서 그 길이방향 이동이 규제되어 있기 때문에, 필요시 추가적 분석 단계들을 수행하는 것이 용이하다. 이는 마이크로캐리어들(2)의 어떠한 특정한 조작도 필요로하지 않고, 새로운 시약들의 세척 또는 추가를 수행하기 위해 순차적으로 또는 동시에 다양한 유체들(9)을 유동시킴으로써 간단히 이루어질 수 있다.
일 실시예에서, 샘플(9)은 마이크로채널(1) 내에서 전후로 유동된다. 바람직하게는, 이 이동은 동일 타겟 분자(3)를 위한 리간드들(10)을 갖는 두 개의 마이크로캐리어들(2) 사이의 평균 거리에 대응하는 거리로 이루어지도록 최적화된다. 샘플(9)이 전후로 이동되는 실시예는 정지 수단(4)의 작동 이전에 마이크로캐리어들(2)의 도입을 가능하게 하도록 마이크로채널(1)의 진입부(14) 부근에 "작동가능한" 정지 수단(4)을 사용함으로써(마이크로채널(1)의 일부의 압축 같은), 또는 마이크로입자들(2) 상에 작용하는 힘들(자기력들 같은)에 기초한 정지 수단(4)의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다른 실시예에서, 연동 펌프 같은 유체들을 작동시키기 위한 수단과 출구로부터 입구까지의 유체 연결부를 제공함으로써 전체 마이크로채널(1) 전반에 걸쳐 샘플(9)이 재순환된다.
샘플(9)의 재순환 또는 전후 운동은 샘플(9)의 속도를 제어하기 곤란한 상황 및/또는 매우 희석된 샘플들(9)의 경우에 유용하다.
식별 단계(e)는 샘플의 유동(단계 d) 이전, 이후 또는 도중에 수행될 수 있다. 또한, 이는 특히, 예를 들어, 양자의 목적들을 위해 사용되는 방법들을 조합함으로써, 예로서, 세트들을 식별하고 반응들을 검출하는 양자 모두를 위한 영상 포착 및 분석 같은 유사한 광학적 방법들의 사용에 의해 마이크로캐리어들(2)이 분석의 수행으로부터 독립적으로 식별가능할 때, 반응의 검출(단계 f)과 동시에 또는 그 이후에 수행될 수도 있다. 식별은 다수의 경로들로 이미 상술한 바와 같이, 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 사용하여 달성된다. 비록, 마이크로채널(1) 내의 그 위치가 제어되지 않지만, 본 발명의 마이크로캐리어들(2)의 다양한 세트들은 그들이 마이크로채널(1) 내에 있을 때 타겟 분자들의 존재에 의해 드러날 필요가 없는, 즉, 분석의 수행으로부터 독립적이고, 마이크로채널(1) 내의 그 위치에 독립적인 본질적 특성들에 기초하여, 예로서, 마이크로캐리어들의 형상에 의해 또는 구멍들의 형태의 코드에 의해 식별 및/또는 구별될 수 있다.
검출 단계 (f)는 분석이 진행될 때 반응의 진행에 대한 동역학적 정보를 취득하기 위해 샘플의 유동(단계 d) 동안 또는 최종 판독을 위해 단계(d) 이후에 수행될 수 있다. 또한, 샘플의 유동 전(단계 d)에 여러 세트들의 식별을 수행할 수 있다. 검출 단계는 마이크로캐리어들의 관찰(예를 들어, 광학적 검출) 또는 마이크로캐리어들의 감지(예를 들어, 자기 검출)을 수반할 수 있으며, 이들은, 예로서, 넓은 필드 관찰 기술들에 의해 다수가 동시에 또는 하나씩 수행될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 마이크로캐리어들(2)은 바람직하게는 상술한 마이크로캐리어들(2)인 것이 바람직하다.
분석의 수행에 추가로, 생물학적 판독이 이루어져 어떤 마이크로캐리어들(2)이 반응되었는지, 그리고, 선택적으로, 어느 정도로 반응되었는지(단계 f 참조)를 결정한다. 양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)은 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 부분 상의 적어도 일 측부를 관찰가능한 신호들이 횡단하게 함으로써 마이크로채널(1) 바로 내측의 마이크로캐리어들(2)의 관찰을 가능하게 하도록 설계된다. 많은 양호한 실시예에서, 마이크로채널(1)은 광학 관찰을 허용하도록, 적어도 일측 및 일 부분 상에서 투명하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 마이크로채널(1)은 또한 자기장들 또는 전자기 방사선에 대해 투과성일 수 있으며, 다양한 세트들의 식별을 위한 마이크로캐리어들의 자기 또는 전자기 감지를 가능하게 하고 및/또는 생물학적 판독을 수행할 수 있다(예를 들어, 자기 라벨들을 사용하여).
양호한 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 단층 배열을 가지며, 마이크로채널(1)은 적어도 하나의 측부에서 투명하여 모든 마이크로캐리어들(1)의 독립적인 간단한 직접적 광학적 관찰을 가능하게 한다. 마이크로캐리어들이 단층 배열로 존재하지 않는다면, 마이크로캐리어들이 (반)투명인 경우 더 복잡한 공초점(confocal) 광학 기술들이 사용될 수 있다.
생물학적 판독은 통상적으로 상보적으로 라벨링된 분자를 사용하여 광측정 응답(luminometric response) 또는 자기 응답 또는 다른 유형의 전기자기 응답에 의해 결합이 발생할 때 관찰가능한 신호, 바람직하게는 광학적으로 관찰가능한 신호를 생성함으로써 통상적으로 수행된다. 반응은 비색(colorimetric), 화학조명(chemiluminometric), 양자점 방출(quantum dots emission) 및/또는 형광 반응에 의해서 표시될 수 있다. 또한, 생물학적 판독은 반응에 의해 생성된 신호의 강도를 측정함으로써 정량적 정보(즉, 샘플 내에 존재하는 시료의 양에 대한 정보)를 제공할 수도 있다. 다수 세트들의 마이크로캐리어들이 반응 챔버에 사용될 때, 신호 생성 메커니즘은 마이크로캐리어 내에서 동일국소장소에 있고 용액의 벌크 내에 방출되지 않을 필요가 있다. 통상적으로, 반응은 리간드 및 타겟 분자(타겟 분자는 샘플 내에 존재)에 의해 형성된 복합체에 대해 부착되는 상보적 분자를 사용함으로써 드러난다. 대안적으로, 마이크로캐리어의 표면에 부착된 플루오로포어 및 쿠엔처(quencher)와, 표면에 결속된 플루오로포어를 남기면서 쿠엔처를 절단하여 마이크로캐리어의 표면 상에서 신호를 생성하도록 설계된 반응을 가질 수 있다. 또한, 생물학적 판독은 본 기술 분야에 공지된 라벨-프리 검출 기술들, 예로서, 표면 플라즈몬 공진(SPR) 또는 전기적 방법들(예를 들어, 전도성의 변화)를 수반할 수도 있다.
도 5에 예시된 바와 같이, 양호한 방법은 마이크로캐리어들(2)이 단층 배열로 존재하는 설정의 준비 및 반응이 이루어지는 영역에 직접적으로, 즉, 반응 챔버(1) 내에, 바람직하게는 마이크로캐리어들(2)을 이동시키지 않고 마이크로캐리어들(2)을 관찰하도록 센서, 바람직하게는 광학적 센서를 배치하는 것으로 구성된다. 센서는 한번에 다수의 마이크로캐리어들(2)을 관찰/감지하는 넓은 필드 센서(예를 들어, 현미경과 유사한 설정을 형성하도록 렌즈들 및 대물부들 같은 필요한 광학 수단과 결부된 CCD 또는 CMOS 광 센서 어레이) 또는 한번에 하나의 마이크로캐리어를 관찰/감지하는 좁은 필드 센서(예를 들어, 광다이오드, 광 멀티플라이어 또는 공초점 스캐너 또는 자기 센서)일 수 있다. 광학 센서들에 대하여, 마이크로채널(1)은 적어도 마이크로캐리어들이 관찰되는 측부가 투명할 필요가 있다. 바람직하게는, 넓은 필드 센서가 사용되어 반응 챔버(1) 내의 마이크로캐리어들(2)의 영상 또는 일련의 영상을 "포착"하고 영상 처리를 통해 반응들을 드러낸다. 이 기술은 인코딩 메커니즘이 유사한 광학장치로 검출될 수 있는 광학적 대비에 기초한다면(예로서, 횡단 구멍들에 기초한 인코딩 메커니즘을 사용함으로써), 마이크로캐리어들의 세트들을 식별하도록 코드들의 검출과 조합될 수 있다. 또한, 좁은 필드 센서가 사용될 수도 있지만 마이크로캐리어들(2) 모두가 통과하고 반응들을 드러내기 위해 분석될 수 있는 신호를 생성하도록 이동될 필요가 있다. 마이크로캐리어들(2)의 위치가 마이크로채널(1) 내에서 비교적 자유롭기 때문에, 좁은 필드 센서는 반응 챔버(1)를 스캐닝함으로써 영상을 구성하는 방식으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 다수의 좁은 필드 센서들이 동시에 마이크로채널(1)의 다수 구역들을 관찰하도록 사용될 수 있다. 또한, 반응의 검출을 위해 좁은 필드 센서와 함께 마이크로캐리어들(2)의 식별을 위해 넓은 필드 센서의 사용을 조합하는 것도 가능하다.
마이크로캐리어들(2)이 반응 챔버(1) 내에서 직접적으로 관찰되는 실시예들에서, 정지 수단(4)은 이동될 필요가 없으며, 마이크로캐리어들(2)은 검출 목적들을 위해 방출될 필요가 없지만, 마이크로채널(1)은 적어도 하나의 측부 및/또는 적어도 하나의 부분에서 투명하여 마이크로캐리어들(2)의 광학적 관찰을 가능하게 하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 실시예는 반응의 동역학적 판독을 가능하게 한다. 사실 분석이 진행됨에 따라 생물학적 지표들을 관찰하고, 따라서, 반응 동역학에 대한 적시적 정보를 취득하는 것이 가능하다(도 9 참조). 광학 센서들에 대한 대안으로서, 반응이 이루어질 때 마이크로캐리어들(2)의 방출 스펙트럼 또는 자기 서명을 변화시키도록 분석이 설계된다면 자기 센서들 또는 스펙트로메트릭 센서들 같은 다른 유형의 센서들도 사용될 수 있다. 이는 예로서, 형광 라벨들이 사용되는 것과 동일한 형태로 상보적 항체들에 부착된 "자기 라벨들"을 사용함으로써 달성될 수 있다.
다른 대안은 마이크로채널(1)의 다른 부분(관찰 부분 또는 윈도우)을 통해 분석의 종점에서 마이크로캐리어들(2)을 이동 또는 방출시키고, 형광 활성화 셀 정렬[Fluorescent-Activating Cells Sorting; FACS]에서 이루어지는 것과 유사하게 이들이 통과할 때 생물학적 신호들을 판독하거나, 대안적으로, 출구 우물부를 통해 마이크로캐리어들(2)을 구하고, 이들을 예로서, 형광 현미경 내에 위치된 현미경 슬라이드 내에서 관찰을 위한 다른 장치 내에 배치하는 것으로 구성된다. 이 방법은 단지 종점 생물학적 판독만을 가능하게 하며, 동역학적 판독은 불가능하다. 역시, 여기에서, 넓은 필드 센서(CCD 또는 C-MOS 광 센서 어레이 같은) 또는 좁은 필드 센서(광다이오드 같은)가 사용될 수 있다. 또한, 이는 마이크로캐리어들(2)의 세트들을 식별하기 위한 코드의 검출과 조합될 수 있다. 상기 목적을 위해, 예를 들어, 정지 수단(4)을 제거함으로서 또는 자기장을 제거함으로써 길이방향 이동의 규제가 상술한 바와 같이 제거되어야 한다.
단계 (f)에서, 생물학적 판독의 관찰은 단계 (e)에서 관찰된 바와 같은 마이크로캐리어(2)의 동일성과 상관된다. 두 관찰(즉, 동일성의 관찰 및 생물학적 신호의 관찰)들의 이러한 상관은 예를 들어, 두 개의 관찰들을 하나로 조합함으로써(즉, 동일 신호 또는 동일 광학 영상을 사용하여) 또는 두 개의 관찰들을 상관시키도록 마이크로캐리어들의 위치를 사용함으로써(즉, 마이크로캐리어(2)가 존재하는 동일 공간적 위치에 대응하는 두 신호들 또는 광학 영상들을 사용함으로써) 이루어질 수 있다. 마이크로캐리어들(2)의 정적 배열은 두 개의 관찰들이 시간적으로 분리될 수 있을 때, 예를 들어, 식별 단계 (e)가 샘플을 유동(단계 d)시키기 이전에 수행될 때 이러한 상관을 용이하게 한다. 양호한 실시예에서, 식별 단계(e)는 마이크로캐리어들(2)의 어떠한 비의도적 운동도 그 생물학적 신호와 마이크로캐리어들(2)의 동일성을 상관시키는 것을 방지하지 않는 것을 보증하도록 생물학적 판독 단계 (f)와 실질적으로 동시에 수행된다. 이는 예로서, 샘플의 유동(단계 d) 동안 또는 이후에 CCD 또는 C-MOS 카메라에 의해 두 영상들을 동시에 또는 매우 짧은 시간 내에 촬상함으로써 달성될 수 있다. 제1 영상, 통상적으로, 밝은 필드 영상은 마이크로캐리어들을 식별하기 위해 사용되고, 제2 영상, 통상적으로 형광 영상은 생물학적 판독을 수행하기 위해 사용된다. 대안적으로, 식별 및 생물학적 판독은 고유한 관찰(예로서, 동일 영상)에 기초한다. 고유한 관찰은 마이크로캐리어들(2)이 관찰 영역에서 방출되고 그들이 통과할 때 관찰되는 실시예들에 적용가능하다.
칩
다른 양태에서, 본 발명은 다중화를 위한 칩(13)을 제공한다. 상기 칩(13)은 본 발명의 제1 양태에 설명된 분석 장치를 포함한다. 예시적 칩(13)은 도 11에 도시되어 있다. 상기 칩(13)은 예로서, 진단 목적들을 위해 사용될 수 있다. 매우 양호한 실시예에서, 마이크로캐리어들(2)은 마이크로채널(1)로부터의 마이크로캐리어들(2)의 분리를 필요로하지 않고 관찰될 수 있다.
예 1
입구 우물부 및 출구 우물부에 연결된 마이크로채널을 포함하고, 필터 구조와 안정화 중앙 필라들을 포함하는 설정(도 17 참조)이 PDMS 성형 기술들을 사용하여 제조되고 유리 현미경 슬라이드에 결합된다(Nam-Trung Nguyen 및 Steve Wereley에 의해 마이크로유체의 원리 및 적용(Fundmentals and Applications of Microfluidics)(ISBN: 9781580533430, 챕터 3)에 설명된 바와 같이).
주연부 상의 횡단 구멍들의 패턴(코드로서 기능)을 갖는 디스크형 실리콘 마이크로캐리어들이 제조된다. 이는 10 마이크로미터의 두께와 50 마이크로미터의 직경을 갖는 수백만의 마이크로캐리어들을 제조할 수 있게 하는 웨이퍼 기반 마이크로제조 기술들을 사용하여 청정실 환경에서 이루어진다. 이 프로세스 흐름은 이하의 단계들로 구성된다.
1) SOI(실리콘-온-인슐레이트) 웨이퍼(4인치 직경, 380㎛ 두께 기판 웨이퍼, 1㎛ 두께의 BOX, 10㎛의 장치 층)을 제공
2) 통상적 포토리소그래피 기술들을 사용하여 마이크로캐리어들의 형상 및 그 코드(도 18 참조)를 묘사(감광성 보호 레지스트의 스핀 코팅, 마스크를 통한 UV 조사, 현상, 장치 층 전체를 통한 실리콘 에칭 및 최종적인 레지스트 박피)
3) 웨이퍼의 BOX 층의 에칭 제거에 의한 마이크로캐리어들의 리프트-오프(lift-off) 준비
4) 마이크로캐리어들의 상에서의 PECVD(플라즈마 보강 화학 기상 증착)에 의한 약 110nm의 두께의 산화물 층의 증착. 이 층은 실리콘 입자들 상의 적절한 형광 신호의 보증을 위해 필요하다(Bras, M. 등의 형광 DNA 마이크로어레이를 위한 실리콘/이산화실리콘 기판의 최적화. Biosensors & Bioelectronics, 2004, 20(4); 797 내지 806쪽; Volle, J.N. 등의 산화 실리콘 상의 형광 간섭에 의한 단백질 부동화의 개선된 감도의 검출. Biosensors & Bioelectronics, 2003. 19(5), 457 내지 464쪽)
5) 초음파 분해 하에서의 아세톤 같은 액체 용액 내로의 웨이퍼의 침지에 의한 기판으로부터의 마이크로캐리어들의 방출
이 절차는 다수의 서로 다른 코드들을 갖는 두 세트들의 마이크로캐리어들을 제조하기 위해 반복된다.
각 코드의 대략 300,000 마이크로캐리어들이 그후 교반과 함께 1시간 동안 실온에서 1 mL의 아세톤 내의 10% v/v(3-아미노프로필)트리에톡시실란과의 반응에 의해 표면 상의 1차 아민들로 기능화되었다. 마이크로캐리어들은 펠릿화되고, 1 mL의 10 mM 보레이트 버퍼, 0.1% Tween-20(BBST) 함유 150 mM NaCl pH 8.2 내에 재현탁되었다. 마이크로캐리어들의 표면 상의 아미노 그룹들은 BBST 내에 800μL의 10% v/v 글루타르알데히드에 의해 활성화되었다. 마이크로캐리어들은 1시간 동안 실온에서 이 용액 내에서 교반되었다. 활성화 단계에 후속하여, 마이크로캐리어들은 1 mL의 BBST에서 3회 세척되었다.
그후, 두 세트들의 마이크로캐리어들이 BBST 내에 500 nm 아미노 변형(5'- 또는 3'-) 올리고뉴클레오타이드(P1 또는 P2)의 용액을 추가함으로써 생물학적 프로브들 P1(5'-CAA CCC CAG CTA ATA TTA TT-3') 및 P2(5'-TGG GTA AGT TAG GGC GAT GG-3')로 각각 코팅되었다. 그후, 마이크로캐리어들이 1시간 동안 실온에서 이 용액 내에서 교반되었다. BBST에 의한 상술한 바와 같은 세척 단계들 이후, 비반응 기능 그룹들이 15분 동안 실온에서 BBST 내에서 35 mM 글리세린과의 반응에 의해 차단되었다. 마이크로캐리어들은 BBST로 2회 세척되고, 그후, 동일 버퍼 내에 보관되었다.
두 세트들의 마이크로캐리어들의 마스터 혼합물 현탁액이 위에서 준비된 바와 같은 각 세트로부터 마이크로캐리어 현탁액의 1μL의 전반적 혼합에 의해 준비되었다. 그후, 두 세트들의 기능화된 마이크로캐리어들의 혼합물이 입구에 마스터 혼합물 현탁액을 피펫팅하고, 출구에 부압을 인가하여 마이크로캐리어들의 마스터 혼합 현탁액을 마이크로채널 내로 흡입함으로써 마이크로채널 내에 로딩되었다. PDMS 마이크로채널은 친수성 거동을 개선시키기 위해 에탄올로 미리 애벌칠되었다.
P1과 상보적인 타겟들 T1(5'Cy5--AAT AAT ATT AGC TGG GGT TG-3')의 샘플 용액이 5 x SSPE(125 mM 포스페이트 버퍼, 745 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 7.4 포함) 내의 5' 단부에서 Cy5 플로오로포어로 라벨링된 200 nM 올리고뉴클레오타이드 T1의 용액을 제공함으로써 준비되었다.
입구 우물부로부터 임의의 잉여 용액을 제거한 이후, 이 샘플 용액이 입구 우물부에 추가되었고, 5분 동안 실온에서 채널을 통해 플러싱되었다. 타겟 시퀀스 T1을 플러싱한 이후, 잉여 용액이 입구 우물부로부터 제거되었고, 마이크로캐리어들은 1분 동안 실온에서 2 x SSC(15 mM 소듐 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 7)를 플러싱함으로써 세척되었다. 두 세트들의 마이크로캐리어들 상의 형광 신호가 유리 층을 통해 Cy5 필터 세트를 구비한 형광 현미경(Zeiss Axiovert 135) 상에서 관찰되었다. 도 8은 냉각된 CCD 카메라(Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG 카메라)에 의해 포착된 바와 같은 실험 결과들을 도시한다.
본 발명의 현재 양호한 실시예들 및 예들을 예시 및 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 첨부된 청구범위의 범주 내에서 달리 다양하게 구현 및 실시될 수 있다는 것을 분명히 이해하여야 한다.

Claims (34)

  1. 반응 챔버와, 적어도 두 세트들의 독립적으로 인코딩된 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 분석 장치에 있어서,
    상기 반응 챔버는 마이크로채널(1)이고,
    상기 마이크로채널(1)의 전체 길이에 걸쳐, 상기 마이크로채널(1)의 단면의 폭이 나란히 배열된 상기 마이크로캐리어(2)의 단면의 폭의 적어도 두 배이고,
    상기 분석 장치는 유체의 관통 유동을 여전히 허용하면서 상기 마이크로채널(1)의 길이 방향으로 상기 마이크로캐리어들(2)의 이동을 제한하기 위한 수단(4)을 포함하고,
    상기 마이크로채널(1) 내부에서 상기 마이크로캐리어들(2)의 회전 이동은 적어도 하나의 방향에 있어서, 상기 마이크로채널(1)의 단면에 대한 상기 마이크로캐리어들(2)의 형상에 의해 제한되고,
    상기 마이크로캐리어들의 코드는 기능을 나타내는 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로채널(1)은 적어도 하나의 측부 및/또는 적어도 하나의 부분 상에서 투명하여 상기 마이크로캐리어들(2)의 광학적 관찰을 가능하게 하는 분석 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마이크로채널(1)의 상기 단면은 직사각형이거나 근사 직사각형인 분석 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)은 상기 마이크로채널(1)의 전체 길이에 걸쳐 임의의 상기 마이크로캐리어들(2) 중 적어도 세 개가 서로 접촉하지 않고 상기 마이크로채널(1)의 주연부와 접촉하지 않는 상태로 나란히 있을 수 있게 하는 상기 마이크로채널(1)의 단면에 대한 형상을 갖는 분석 장치.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)은 상기 마이크로채널(1)의 내부에서 단층 구성으로 구속되는 분석 장치.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)은 웨이퍼의 형태를 갖는 분석 장치.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)은 횡단 구멍들(21)의 구성의 형태인 코드를 갖는 분석 장치.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)의 이동을 제한하기 위한 수단(4)은 댐 구조체, 하나 이상의 필라들, 상기 마이크로채널의 단면적의 감소, 그리드, 메시 필터, 유전영동력을 사용하여 유지된 하나 이상의 마이크로입자들 또는 자기장 내에 유지된 하나 이상의 자성 마이크로입자들인 분석 장치.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로캐리어들(2)은 자기장을 통해 또는 유전영동력을 사용하여 부동화되는 분석 장치.
  10. 삭제
  11. 마이크로캐리어들에 기초한 다중화 분석을 수행하는 방법에 있어서,
    a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 분석 장치를 제공하는 단계와,
    b) 상기 적어도 두 세트들의 인코딩된 마이크로캐리어들(2)로 상기 마이크로채널(1)을 적어도 부분적으로 충전하는 단계와,
    c) 유체의 관통 유동을 여전히 허용하면서 상기 마이크로채널(1)의 길이 방향으로 상기 마이크로캐리어들(2)의 이동을 제한하는 단계와,
    d) 상기 마이크로캐리어들(2)을 포함하는 상기 마이크로채널(1)을 통해 샘플(9)을 유동시키는 단계와,
    e) 상기 마이크로캐리어들(2)의 세트들을 식별하는 단계와,
    f) 상기 마이크로캐리어들(2)의 동일성과 상관하여 생물학적 판독을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (e)는 상기 반응 챔버(1) 내에서 직접적으로 상기 마이크로캐리어들(2)을 관찰함으로써 수행되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 단계 (f)는 단계 (d)와 동시에 수행되고 시간에 걸쳐 결과들을 제공하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 마이크로채널(1)은 적어도 하나의 측부 및 적어도 하나의 부분에서 투명하며, 단계 (f)는 광학 수단과 결합된 광 센서들의 어레이를 사용하여 수행되고, 상기 센서는 CCD 또는 C-MOS 광 센서인 방법.
  15. 삭제
  16. 제11항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (d) 이전에 수행되고, 및/또는 단계 (f)와 동시에 수행되는 방법.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분석 장치를 포함하는 다중화 분석들을 위한 칩.
  18. 삭제
  19. 삭제
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