WO2015151226A1 - 粒子分析装置及び粒子分析方法 - Google Patents

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particle
measurement
electrode
channel
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樹 高倉
佑介 後藤
悠 石毛
釜堀　政男
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株式会社日立製作所
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    • G01N2015/136—Scanning electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a particle analysis apparatus and a particle analysis method.
  • a field flow fractionation (FFF) method is known as a method for separating mixed particles in a liquid sample, and various polymers and fine particles can be separated according to size and shape (non-patent literature). 1).
  • the size of particles separable by the FFF method is in the range of about 1 nm to 100 ⁇ m.
  • liquid chromatography is widely used as a separation method similar to this, it is a method suitable for separation of various low molecules, and it is preferable to use the FFF method for separation of polymers and larger particles.
  • separation is performed by applying a force perpendicular to the flow direction to particles in a separation channel.
  • the particles are spatially distributed according to the balance between the diffusion force depending on the particle size and the particle shape and the acting force.
  • the fluid forms a parabolic flow field called Hagen-Poiseuille flow, and the particles flow at different speeds depending on their spatial distribution. That is, separation is performed reflecting the magnitude of the diffusive power of the particles.
  • an optical measuring instrument when measuring particles separated in a separation channel online in real time, an optical measuring instrument is mainly used as in the liquid chromatograph apparatus. Specifically, an absorbance detector, a differential refractive index detector, a light scattering detector, and a fluorescence detector are used as the optical measuring instrument. These detectors detect an averaged change in optical characteristics caused by a large number of particles existing on the optical path. Therefore, the number of particles cannot be counted. Moreover, when the density of the target particles contained in the sample is extremely dilute, the detector cannot be said to have sufficient detection sensitivity, and particle detection and quantitative measurement are difficult.
  • FIG. 1 shows the measurement principle of the resistance pulse method.
  • the electric resistance of the pore is changed by eliminating the electrolyte solution corresponding to the volume of the particles.
  • This change in electrical resistance can be detected by measuring the ionic current flowing between the electrodes 5 and 6 using an external circuit comprising the conducting wire 2, the voltage source 3 and the ammeter 4.
  • FIG. 2 shows how the ion current I 0 is modulated as the particles pass through the measurement system.
  • the current change ⁇ I and the volume v of the particles are
  • V is the effective volume of the pore.
  • the effective volume of the pore is a range in which the electric field distribution of the pore affects and functions as an electrical detection zone. If the volume of the particle is sufficiently smaller than the effective volume of the pore, the current change is approximately proportional to the volume of the particle.
  • the number of particles can be measured by counting current pulses generated when particles pass through the pores. In addition, since a change in electric resistance from one particle is detected, it is suitable for measurement of a sample having a small particle density.
  • the resistance pulse method by determining the pore diameter according to the size of the particle to be measured, it is possible to measure a sample having a particle diameter ranging from approximately 1 nm to 1 mm.
  • the particle counter using the resistance pulse method is also called a Coulter counter after the name of the creator of the measurement principle (Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 there is an example in which a mass spectrometer is connected as a detector whose flow rate is significantly smaller than that of the separation channel in the FFF device.
  • target particles can be detected with high sensitivity after separating mixed particles in a liquid sample by applying a particle detector based on the resistance pulse method to the detection unit of the FFF device.
  • the FFF device has a flow channel cross-sectional area that is at least 100 times larger than the pores of the particle detector, and therefore the preferred flow rate is different, so that the FFF device and the particle detector are simply connected. Was difficult.
  • the preferred flow rate of the separation channel is on the order of 0.5 to 5 ml / min, while in a particle detector having a pore with a diameter of 30 ⁇ m, for example, the preferred flow rate is 0.1 ml / min. Less than about, preferably less than 0.05 ml / min.
  • the particle size of the target particle is smaller, the pore size of the particle detector needs to be reduced accordingly, so that the flow rate of the particle detector is further reduced, and the deviation of the preferred flow rate becomes significant.
  • the separation channel cannot exert separation capability, and for a suitable flow rate in the separation channel, the particle detector accurately detects particles. Can not do it. Due to this problem, the particle analyzer as described above has not been realized.
  • Non-Patent Document 2 after most of the mobile phase liquid is discharged as a cross flow in the separation channel, a part of the mobile phase liquid is discarded using a splitter provided in the previous stage of the mass spectrometer, The amount of liquid flowing into the mass spectrometer is adjusted.
  • this method has the following problems specific to mass spectrometry. First, it is difficult to quantitatively analyze an object for a sample that is difficult to ionize or a sample in which a contaminant represented by a non-volatile salt affects ionization. Secondly, mass spectrometry is a destructive measurement because the object is decomposed into a smaller structure and ionized, and the object cannot be recovered and recovered. In light of these problems, it has been desired to realize a method for measuring nondestructively and with high sensitivity while maintaining particles in a mobile phase liquid, particularly for particulate samples.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and its main object is to provide a particle analyzer in which a separation channel based on the FFF method and a particle detector based on the resistance pulse method are connected online. It is to be.
  • the particles in the present invention refer to polymers, particulate substances, and aggregates thereof having a particle diameter in the range of 1 nm to 100 ⁇ m, preferably 10 nm to 10 ⁇ m.
  • the particles include, for example, proteins, carbon macromolecules, silica powder, metal colloids, polymer beads, viruses, cells and the like.
  • the separation unit in the present invention is a name including a separation channel based on the FFF method and an external device associated therewith.
  • the external device is a valve for adjusting the cross flow flow rate, a switching valve for performing a focusing operation, or the like in the cross flow method, for example, in the temperature gradient method, the upper surface of the separation channel.
  • a heat source for applying a temperature gradient to the bottom surface.
  • the flow path refers to the entire space through which the mobile phase liquid can pass. That is, the flow path includes a separation channel, a pore of the particle detector, a pipe connecting each part in the apparatus, and the like.
  • the flow path of the particle detector which has an electrode in the vicinity thereof and functions as a particle detector is called a measurement flow path.
  • auxiliary channels Those that are not are called auxiliary channels.
  • the outlet port is a cross section of the flow path at the end of the separation channel, and the particles are introduced into the downstream particle detector via the flow path connected to the outlet port.
  • the separation channel has a single or multiple outlet ports. That is, the separation channel is connected to a single flow path at the terminal portion or to a flow path divided into a plurality of parts.
  • the particle analyzer includes a liquid feeding part for sending out a mobile phase liquid, a sample introduction part for introducing a sample containing particles into the mobile phase liquid, and a separation channel based on a field flow fractionation method. Or it has a separation part which separates according to a shape, and a detection part which detects particles separated by a separation part.
  • the detection unit includes a plurality of divided flow paths, and at least one divided flow path is a measurement flow path.
  • the measurement channel includes a first electrode, and a second electrode as a counter electrode of the first electrode is disposed inside or outside the measurement channel.
  • the first electrode and the second electrode are connected to an electrochemical measurement unit, and the electrochemical measurement unit measures an ionic current, an electrical resistance, a potential, or an AC impedance in real time as an electrochemical characteristic between the electrodes. That is, each measurement channel functions as a particle detector based on the resistance pulse method.
  • the particle analysis method includes a step of introducing a sample containing target particles into a mobile phase liquid, and the particles in the mobile phase liquid in terms of time or space depending on the size or shape based on the field flow fractionation method. Separating the mobile phase liquid containing the separated particles into a plurality of flow paths arranged in parallel, and passing through at least one of the plurality of flow paths. Measuring particles based on a resistance pulse method.
  • the flow rate per particle detector is suitable for particle detection by the resistance pulse method while maintaining a suitable flow rate in the separation channel by the action of the divided flow path provided inside the detection unit. Optimized for flow rate.
  • a separation channel based on the FFF method and a particle detector based on the resistance pulse method can be connected, and particles can be separated and measured with higher sensitivity and non-destructiveness.
  • the conventional particle detector based on the resistance pulse method detects the volume of particles, it has been difficult in principle to determine the shape of particles having the same volume.
  • the present invention makes it possible to perform shape analysis, which was difficult with the conventional method, by performing particle detection after separating the particles based on the FFF method.
  • FIG. 1 Schematic of particle measurement based on resistance pulse method.
  • the cross-sectional schematic diagram which shows one Example of the form of a divided flow path The cross-sectional schematic diagram which shows one Example of the form of a divided flow path.
  • FIG. 1 It is the figure which compared and showed the result of the particle
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an embodiment of the configuration of the particle analyzer according to the present invention.
  • the mobile phase liquid is sent out by the liquid delivery unit 101, the sample liquid containing the measurement target particles is mixed with the mobile phase liquid in the sample introduction unit 102 installed downstream, and the mobile phase liquid containing the particles is separated by the separation unit 103.
  • Particles are temporally or spatially separated by size or shape inside the separation unit 103 and then introduced into the detection unit 105 through a connection pipe 104 provided via a single outlet port. It is electrically detected in the measurement channel.
  • FIG. 4 is an enlarged schematic view of the vicinity of the separation unit outlet of the present embodiment.
  • the particles flowing into the separation unit 103 are separated according to the size and shape based on the FFF method by the flow field F1 and the acting force E1, and are introduced into the connection pipe 104 via the outlet port 106 of the separation unit 103.
  • FIG. 6 is a schematic view showing another embodiment of the apparatus configuration of the particle analyzer according to the present invention.
  • the sample introduction unit 102 is directly attached to the separation unit 103.
  • Such an arrangement of the sample introduction part is widely used particularly for a separation channel using a cross flow method. It is clear that the same effect as that of the embodiment shown in FIG.
  • the configuration of the apparatus is divided into a liquid feeding section, a sample introduction section, a separation section, and a detection section, and each will be described individually.
  • a pump that can control the flow rate in the range of 0.1 to 10 ml / min and can stably supply the mobile phase liquid is preferably used.
  • a pump for example, a plunger pump or a syringe pump is suitable.
  • the sample introduction unit is preferably a sample injector commonly used in a liquid chromatograph apparatus. It is preferable to add to the sample liquid or mobile phase liquid in advance an additive that stabilizes the dispersed state of the particles.
  • the mobile phase liquid needs to contain an electrolyte in order to enable electrical measurement in the subsequent detection unit, and the concentration of the contained electrolyte is desirably sufficiently high as long as it does not affect the dispersion state of the particles.
  • the separation unit has a separation channel based on the FFF method and an external device associated therewith.
  • the separation channel can take several shapes.
  • a perspective schematic view of a typical example is shown in FIGS.
  • FIG. 7 shows a flat plate type separation channel, which separates particles using a flow field F1 formed by a flow path sandwiched between the top wall 11 and the bottom wall 12 and an acting force E1.
  • FIG. 8 shows a cylindrical separation channel, which separates particles using a flow field F2 formed by a flow path surrounded by a cylindrical wall 13 and an axially symmetric acting force E2.
  • the particles Depending on the balance between the acting force and the diffusing force of the particles, the particles have a spatial distribution concentrated on the inner wall in the direction of the acting force in the separation channel.
  • the average velocity of the particles is given in the flow field, so that the particles are separated according to size and shape.
  • the forces E1 and E2 acting on the particles in the separation channel may be any, direct or indirect, providing a spatial distribution depending on the size or shape of the particles. Examples of those that directly act on the particles include crossflow, centrifugal force, electric field, and magnetic field.
  • a method of using an indirect action a method of giving a temperature gradient perpendicular to the flow field is known. By combining some of these methods, the separation effect can be enhanced compared to the case of a single method.
  • the detection unit is divided into at least two flow paths in the upstream portion, and includes at least two electrodes. Of the divided flow paths, at least one is a measurement flow path provided with electrodes, and functions as a particle detector.
  • the other channel is an auxiliary channel, and the mobile phase liquid passing through this channel is not involved in particle detection.
  • the measurement channel is designed so that its cross-sectional area is at least larger than the cross-sectional area of the target particle.
  • Each measurement channel includes two electrodes, one of which may be provided as a common electrode outside the measurement channel.
  • An electrochemical measurement unit is connected to the electrodes, and the electrochemical measurement unit measures electrochemical characteristics between the electrodes.
  • a change in ion current, electrical resistance, potential, or AC impedance in the measurement channel is detected in real time as an electrical signal through the electrode.
  • the sampling time interval of the electrochemical measurement unit is desirably sufficiently shorter than the time required for the particles to pass through the electrical detection zone.
  • the detection unit can include a calculation device for calculating the measurement result and a recording medium for recording the measurement result or a calculation result derived therefrom.
  • the arithmetic device and the recording medium may be external devices that can be connected to the detection unit.
  • the data recorded on the recording medium includes an electric signal value of each pulse (at least the height of the pulse, preferably the time change of the electric signal value including the pulse) and the volume or particle size of the particle calculated from the electric signal value, The detection time of each pulse or the elapsed time from the start of measurement and the total number of detected pulses are included.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing an embodiment of electrode arrangement.
  • the first electrode 5 and the second electrode 6 are arranged along the flow direction in the measurement channel.
  • the space between the two electrodes acts as an electrical detection zone, and when the particles pass through this space, the current between the two electrodes changes.
  • the electrochemical property to be measured may be electrical resistance, potential, or AC impedance in addition to current.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing another embodiment of electrode arrangement.
  • the first electrode 5 and the second electrode 6 are arranged so as to sandwich the flow in a direction perpendicular to the flow direction in the measurement channel. Even in this arrangement, the same effect as the embodiment shown in FIG. 9 can be obtained.
  • FIG. 11 is a schematic view showing an example of the arrangement of measurement flow paths and electrodes arranged in parallel.
  • the single measurement flow path shown in FIG. 9 is arranged in parallel, and the electrodes are connected to the electrochemical measurement unit 7.
  • the flow rate passing through the particle detector in the detection unit can be increased by arranging the measurement flow paths 21 in parallel. Therefore, it is possible to increase the proportion of particles detected by the particle detector among the particles present in the mobile phase liquid, and this has the effect of improving the sensitivity of particle detection measurement.
  • FIG. 12 is a schematic view showing another embodiment of the arrangement of measurement flow paths and electrodes arranged in parallel.
  • the embodiment shown in FIG. 11 is modified so that only the first electrode 5 is present in each measurement channel 21 and then the common electrode is used as the second electrode outside the measurement channel. 8 is provided.
  • the common electrode 8 may be installed on either the upstream side or the downstream side of the measurement channel 21.
  • the same effect as the embodiment shown in FIG. 11 can be obtained with almost half the number of wires.
  • FIG. 13 is a schematic view showing another embodiment of the arrangement of the measurement flow paths and electrodes arranged in parallel.
  • the single measurement channels shown in FIG. 10 are arranged in parallel.
  • a pair of electrodes 5 and 6 provided in each measurement flow channel 21 is illustrated as being provided in a partition wall that separates adjacent measurement flow channels. 7), and the other electrode 6 may be provided on the bottom wall 12.
  • the electrical resistance between the electrodes in the measurement channel for measurement includes in parallel the electrical resistance due to the current path through the other measurement channel. Therefore, the volume of the electrical detection zone is effectively increased, and the sensitivity of particle measurement can be reduced as compared with the sensitivity in a single measurement channel.
  • the volume of the electrical detection band hardly increases because there is almost no contribution from the other measurement flow paths. Therefore, the decrease in the sensitivity of particle measurement is lower than in the configurations of FIGS. 11 and 12. There are few. That is, the same effect as the embodiment shown in FIG. 11 can be obtained while reducing the influence of crosstalk due to the arrangement of a large number of measurement channels.
  • the electrodes can all be arranged in the same plane, the flow path and the electrodes can be easily produced by using the conventional microfabrication technology. Therefore, when the number of measurement channels is sufficiently small, for example, 10 or less, the embodiment of FIG. 11 or FIG. 12 is preferable. On the other hand, when the number of measurement channels is large and the crosstalk between the channels affects the electrochemical measurement, the embodiment of FIG. 13 is preferable.
  • FIG. 5 is an enlarged schematic view of the vicinity of the detection unit entrance of the present embodiment.
  • the detection unit 105 is connected to the separation unit 103 via the connection pipe 104 as shown in FIGS. 3 and 6.
  • the total cross-sectional area S2 of the divided flow path 107 of the detection unit 105 is equal to or larger than the cross-sectional area S1 of the connection pipe 104.
  • FIG. 14 is a schematic view showing another embodiment of the device configuration of the particle analyzer according to the present invention.
  • FIG. 15 is an enlarged schematic diagram of a connection region between the separation unit and the detection unit of the embodiment illustrated in FIG. 14.
  • the connecting pipe 104 is not provided between the separation unit 103 and the detection unit 105, and the separation unit 103 and the detection unit 105 constitute an integrated separation detection unit 108. That is, the separation unit 103 includes a plurality of outlet ports 106, and the divided flow paths 107 correspond to each outlet port on a one-to-one basis.
  • the separation unit 103 and the detection unit 105 are connected by the connection pipe 104 as in the embodiment shown in FIGS. 3 and 6, the particles flowing out from the outlet port 106 of the separation unit 103 diffuse again inside the connection pipe 104. Therefore, information on the spatial distribution of the particles generated in the cross section of the separation channel is lost.
  • the particle detection that reflects the spatial distribution of particles in the separation channel can be performed by directly connecting the separation unit 103 and the detection unit 105 without using the connection pipe 104. And thus the spatial distribution of the particles can be measured.
  • the spatial distribution of the particles reflects the shape of the flow field in the separation channel, the magnitude of the particle diffusive force, and the force on the particle. Based on this information, the parameters of the separation channel, that is, the flow rate and the force applied to the particles can be optimized.
  • FIG. 16 is a schematic cross-sectional view of an embodiment of a divided flow path.
  • all the divided flow paths 107 are formed of the measurement flow paths 21.
  • the total amount of the sample liquid introduced into the apparatus can be measured. That is, the total number of particles can be measured.
  • This embodiment can be applied to any of the embodiments shown in FIGS. When applied to the embodiment shown in FIGS. 3 and 6, the effect of measuring the number density of target particles in the sample liquid can be obtained while improving the particle detection sensitivity by measuring the total number of particles.
  • the particles in the mobile phase liquid are introduced into the measurement channel while being spatially separated. Therefore, the effect of accurately measuring the spatial distribution of the particles in the separation channel can be obtained.
  • FIG. 18 to FIG. 21 are schematic cross-sectional views showing other embodiments in the form of divided flow paths.
  • the divided flow path 107 has at least one measurement flow path 21 and an auxiliary flow path 22.
  • FIG. 18 shows an embodiment in which the cross section of the flow path is circular, the central portion of the shaft is the measurement flow path 21 and the outer peripheral portion is the auxiliary flow path 22.
  • FIG. 19 shows an embodiment in which the channel cross section is circular, the circular cross section is divided into two coaxial regions, the outer peripheral portion is the measurement flow channel 21, and the central portion is the auxiliary flow channel 22.
  • FIG. 20 shows an embodiment in which the measurement channel 21 at the outer peripheral portion is further divided in the circumferential direction in the embodiment shown in FIG.
  • FIG. 21 shows an embodiment in which the flow path cross section is square, the bottom face portion is the measurement flow path 21, and the upper part is the auxiliary flow path 22.
  • FIG. 22 is a schematic perspective view showing an example in which the embodiment shown in FIGS. 18 to 21 is applied to the embodiment shown in FIG.
  • FIG. 22 shows an embodiment in which the separation channel is a flat plate type.
  • the spatial distribution of the particles concentrates in the vicinity of the inner wall in the direction in which the force E1 acting on the particles in the separation channel is directed, by arranging the measurement flow channel 21 along the wall surface, among the target particles, particularly large Particle size particles can be selectively introduced into the particle detector. Therefore, it is possible to obtain an effect of improving the detection sensitivity of the large particle size while simplifying the measurement by reducing the total number of detectors. Such measurement is particularly effective when selectively measuring particle agglomerates.
  • FIG. 23 and FIG. 24 are schematic cross-sectional views showing other examples of the shape of the divided flow path 107.
  • the divided flow path 107 includes the measurement flow path 21 and the auxiliary flow path 22, and the auxiliary flow path 22 includes a filter 23 at the inlet.
  • This filter is a filter having fine pores that pass through the mobile phase liquid and particles smaller than the cut-off diameter but cannot pass target particles larger than the cut-off diameter, and preferably passes through the filter 23. It is installed so as to have an inclination with respect to the flow direction so that the missing particles are promptly introduced into the measurement channel 21.
  • FIG. 23 shows an embodiment in which the filter 23 is added to the embodiment shown in FIG. 19, and FIG. 24 shows an embodiment in which the filter 23 is added to the embodiment shown in FIG.
  • the embodiment including the filter is applicable to all embodiments including the auxiliary flow path including FIG. 18 and FIG. Further, these examples can be applied to any of the embodiments shown in FIG. 3, FIG. 6, and FIG. When applied to these embodiments, all target particles having a particle size larger than the cut-off diameter are introduced into the particle detector. The effect which improves is acquired.
  • FIG. 25 is a schematic perspective view when a filter is applied to the embodiment shown in FIGS. 14 and 24.
  • the filter 23 is installed so as to cover the inlet of the auxiliary flow path 22.
  • the filter 23 is disposed so as to be inclined with respect to the flow direction so that particles having a particle size larger than the cutoff diameter that cannot pass through the filter 23 can be guided along the surface to the measurement channel 21.
  • the detection target particles can be introduced into the measurement channel while concentrating the detection target particles while reducing the flow rate per one measurement channel.
  • FIG. 26 is a diagram illustrating a temporal change in ion current measured by a certain particle detector in the detection unit.
  • the particles are large.
  • an electrical signal other than the ionic current that is, electrical resistance, potential, or alternating current impedance is measured, a decrease or increase in pulse-like signal is observed and analysis similar to the ionic current is possible. .
  • FIG. 27 is a graph in which the measurement results shown in FIG. 26 are plotted with the horizontal axis representing the retention time in the particle channel and the vertical axis representing the current peak value. Reflecting the difference in particle size and shape, the first particle, second particle, and third particle show different distributions, and spherical and non-spherical particles are distributed on different curves on the graph Will be. Therefore, information on the shape of particles that cannot be obtained only by resistance pulse measurement can be easily visually confirmed. In addition, by measuring standard particles of various sizes and shapes in advance, compare the measurement results of the target particles with the measured values obtained from the standard particles, and estimate the size and shape of the target particles Can do.
  • FIG. 28 is a diagram comparing the results of particle measurement according to the present invention with the results of measurement by a conventional method.
  • FIG. 28 (a) shows the time change of the measurement signal obtained by the optical measuring instrument attached to the subsequent stage of the separation channel in the conventional method.
  • FIG. 28B is an example of a histogram obtained by temporally fractionating the same plot as shown in FIG. 27, counting the number of current peaks included in each fraction, and using the horizontal axis as the retention time. It is.
  • the measurement result obtained by the conventional method shown in FIG. 28A represents the density of target particles
  • the measurement result obtained by the present invention shown in FIG. 28B represents the number of target particles.
  • the detection sensitivity for particles in a sample is determined by the background noise of the optical measuring instrument. Since the measurement signal is proportional to the number of particles contained in the unit volume of the particle, that is, the number density of the particles, the measurement signal from the particles is buried in the background noise for a sample with a very low number density of particles. As a result, particle detection becomes difficult.
  • the detection sensitivity for the particles in the sample is determined by the electric noise of the particle detector, and particles that generate an electric signal larger than the noise level, that is, particles larger than the detection limit particle size are always detected. can do. Therefore, it is clear that the measurement method of the present invention is superior to the conventional method in detection sensitivity for particles larger than the detection limit particle size.
  • FIG. 29 is a diagram showing temporal changes in ion current obtained by a plurality of particle detectors.
  • Each particle detector performs the analysis shown in FIG. 27 and FIG. 28B and integrates the analysis results obtained by the plurality of particle detectors, thereby increasing the number of particles to be analyzed. Thereby, the reliability of the measurement result of the size and shape of the target particle can be improved, and the sensitivity of particle detection can be improved.
  • the analysis results obtained by all the particle detectors are integrated. It is essential to do.
  • FIG. 30 is a diagram showing temporal changes in ion current obtained by a plurality of particle detectors in a configuration in which a separation unit and a detection unit are integrated.
  • FIG. 31 is a flowchart showing a process for optimizing separation parameters based on the spatial distribution of target particles obtained by the plurality of particle detectors described above.
  • FIG. 32 is a schematic diagram showing how the resolution of the separation channel is improved by the optimization of the separation parameter, and shows the optimized separation peak.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

　フィールドフローフラクショネーション法に基づく分離チャネルと抵抗パルス法に基づく粒子検出器とをオンラインで接続し、液体中の粒子を非破壊かつ高感度に測定する。分離チャネルを備える分離部に、複数の分割流路を備え、少なくとも１つの分割流路が電極を備えた測定用流路である検出部を接続する。電極は電気化学測定部に接続されていて、電気化学測定部により電極間の電気化学的特性を測定する。

Description

粒子分析装置及び粒子分析方法
　本発明は、粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。
　液体試料中の混合粒子を分離する手法としてフィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）法が知られており、様々な高分子・微粒子を大きさや形状に応じて分離することが可能である（非特許文献１）。ＦＦＦ法で分離可能な粒子のサイズはおよそ１ｎｍ～１００μｍの範囲である。これと類似した分離法として液体クロマトグラフィーも広く用いられているが、各種低分子の分離に適した手法であり、高分子やそれより大きな粒子の分離にはＦＦＦ法を用いることが好ましい。
　ＦＦＦ法は、分離チャネル中で粒子に流れ方向と垂直な力を作用させることで分離を行う。粒子は、粒径や粒子形状に依存した拡散力と、前記の作用力との釣り合いに応じて空間的に分布する。分離チャネル中では、流体はハーゲン・ポアズイユ流れと呼ばれる放物線状の流れ場を形成しており、粒子はその空間分布に応じて異なった速さで流される。すなわち、粒子の拡散力の大きさを反映した分離がなされる。
　ＦＦＦ装置において、分離チャネル中で分離した粒子をオンラインでリアルタイムに測定する場合には、液体クロマトグラフ装置と同様に主に光学測定器が用いられる。光学測定器として、具体的には、吸光度検出器、示差屈折率検出器、光散乱検出器、蛍光検出器が用いられる。これらの検出器は、光路上に存在する多数の粒子に起因する光学的特性の変化を平均化して検出するものである。したがって、粒子の個数を計数することはできない。また、試料中に含まれる対象粒子の密度が極めて希薄である場合には、上記検出器は十分な検出感度を有しているとはいえず、粒子の検出や定量測定は困難である。
　液体試料中の粒子の数を定量的かつリアルタイムに検出する方法として、抵抗パルス法に代表される電気測定法が有効である。図１に抵抗パルス法の測定原理を示す。粒子が電解質溶液で満たされたポア１を通過する際に、粒子の体積分の電解質溶液を排除することでポアの電気抵抗が変化する。この電気抵抗の変化は、導線２と電圧源３と電流計４からなる外部回路を用いて、電極５，６間を流れるイオン電流を測定することで検知することができる。図２に、上記測定系の粒子の通過に伴ってイオン電流Ｉ0が変調する様子を示す。電流変化ΔＩと粒子の体積ｖには、
式１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
の関係式がある。ここで、Ｖはポアの実効体積である。ポアの実効体積とは、ポアの電場分布が影響を与え、電気的検出帯として機能する範囲である。粒子の体積がポアの実効体積よりも十分小さい場合には、電流変化は粒子の体積にほぼ比例する。既知の大きさの粒子で校正を行うことで、式（１）を用いて粒子の大きさを決定することができる。
　抵抗パルス法では、粒子がポアを通過する際に発生する電流パルスを計数することで、粒子数を測定することが可能である。また、粒子１個からの電気抵抗変化を検出するため、粒子密度が希薄な試料の測定に適している。抵抗パルス法においては、測定対象粒子のサイズに合わせてポア径を決定することで、およそ１ｎｍ～１ｍｍの範囲にわたる粒径の試料を測定することができる。抵抗パルス法を用いた粒子計数装置は、測定原理の考案者の名前にちなんでコールターカウンターとも呼ばれる（特許文献１）。
　また、ＦＦＦ装置において、分離チャネルよりも大幅に流量の小さい検出器として質量分析装置を接続した例がある（非特許文献２）。
米国特許第２６５６５０８号明細書
Giddings, J. C.: Science 1993, 260, 1456-1465 Yang, I. et al.: Journal of Chromatography A 2014, 1324, 224-230
　抵抗パルス法に基づく粒子検出器をＦＦＦ装置の検出部に適用することで、液体試料中の混合粒子を分離した上で、高感度に標的粒子を検出することができると期待される。しかしながら、ＦＦＦ装置は、その流路断面積が粒子検出器のポアと比較して少なくとも１００倍以上大きく、それゆえ好適な流量が異なることから、ＦＦＦ装置と粒子検出器とを単純に接続することは困難であった。典型的なＦＦＦ装置において、分離チャネルの好適な流量は０．５～５ｍｌ／ｍｉｎ程度であり、一方で、例えば直径３０μｍのポアを有する粒子検出器において、その好適な流量は０．１ｍｌ／ｍｉｎ程度以下、好ましくは０．０５ｍｌ／ｍｉｎ以下である。また、対象粒子の粒径が小さいほど、それに応じて粒子検出器のポア径を小さくする必要が生じるため、粒子検出器の流量はさらに低下し、好適流量の乖離は著しくなる。このように、粒子検出器における好適な流量に対しては、分離チャネルは分離能力を発揮することができず、また分離チャネルにおける好適な流量に対しては、粒子検出器は正確に粒子を検出することができない。この課題により、上記のような粒子分析装置は実現されていない。
　非特許文献２では、分離チャネルにおいて移動相液体の大部分をクロスフローとして排出した上で、さらに質量分析装置の前段に設けられたスプリッターを用いて移動相液体の一部を廃棄することで、質量分析装置へ流入する液量の調整を行っている。しかし、この方法には以下のような質量分析法に特有の課題があった。第一に、イオン化が困難な試料や、不揮発性塩に代表される夾雑物がイオン化に影響を与えるような試料に対しては、対象物の定量分析が困難である。第二に、質量分析法は対象物をより小さな構造に分解してイオン化するため、破壊的な測定であり、対象物を復元・回収することはできない。これらの課題を踏まえ、特に粒子状の試料に対して、粒子を移動相液体中に保持したまま非破壊的かつ高感度に測定する方法の実現が望まれている。
　本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主な目的は、ＦＦＦ法に基づく分離チャネルと抵抗パルス法に基づく粒子検出器とを、オンラインで接続した粒子分析装置を提供することである。
　本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ～１００μｍ、好ましくは１０ｎｍ～１０μｍの範囲にあって、高分子、粒子状物質、及びそれらの凝集体をさす。粒子には例えば、たんぱく質、炭素巨大分子、シリカ粉末、金属コロイド、高分子ビーズ、ウイルス、細胞などが含まれる。
　本発明における分離部とは、ＦＦＦ法に基づく分離チャネル及びそれに付随する外部装置を含めた呼称である。外部装置とは、具体的には、例えばクロスフロー方式においては、クロスフロー流量を調整するためのバルブやフォーカシング操作を行うための切替バルブなどであり、例えば温度勾配方式においては、分離チャネルの上面と底面に温度勾配を与えるための熱源などである。
　本発明における流路とは、移動相液体が通過し得る空間すべてを指す。すなわち、流路には、分離チャネル、粒子検出器のポア、装置内の各部分を接続する配管などが含まれる。特に、粒子検出器の上流部において分割された流路のうち、粒子検出器の流路であって、その近傍に電極を備え、粒子検出器として機能するものを測定用流路と呼び、そうでないものを補助流路と呼ぶ。
　本発明における出口ポートとは、分離チャネルの終端における流路の断面であり、粒子は出口ポートに接続された流路を介して下流の粒子検出器に導入される。分離チャネルは単一、又は複数の出口ポートをもつ。すなわち、分離チャネルはその終端部において単一の流路に接続されるか、複数に分割された流路に接続される。
　本発明による粒子分析装置は、移動相液体を送り出す送液部と、移動相液体に粒子を含む試料を導入する試料導入部と、フィールドフローフラクショネーション法に基づく分離チャネルを備え粒子を大きさ又は形状によって分離する分離部と、分離部で分離された粒子を検出する検出部とを有する。検出部は、複数の分割流路を備え、少なくとも１つの分割流路が測定用流路である。測定用流路は第１電極を備え、第１電極の対向電極としての第２電極が測定用流路の内部又は外部に配置される。第１電極及び第２電極は電気化学測定部に接続され、電気化学測定部は電極間の電気化学的特性としてイオン電流、電気抵抗、電位、又は交流インピーダンスをリアルタイムに測定する。すなわち、各々の測定用流路が抵抗パルス法に基づく粒子検出器として機能する。
　また、本発明による粒子分析方法は、移動相液体に対象粒子を含む試料を導入する工程と、移動相液体中の粒子をフィールドフローフラクショネーション法に基づいて大きさ又は形状によって時間的又は空間的に分離する工程と、分離された粒子を含む移動相液体を並列に配置された複数の流路に分割して流す工程と、複数の流路のうち少なくとも１つの測定用流路を通過する粒子を抵抗パルス法に基づいて測定する工程と、を有する。
　本発明によれば、検出部の内部に設けられた分割流路の作用によって、分離チャネルにおける好適な流量を保ったまま、粒子検出器１つ当たりの流量が抵抗パルス法の粒子検出に好適な流量に最適化される。その結果、ＦＦＦ法に基づく分離チャネルと、抵抗パルス法に基づく粒子検出器との接続が可能になり、従来よりも高感度に、かつ非破壊で粒子を分離計測することができる。
　また、抵抗パルス法に基づく従来の粒子検出器は、粒子の体積を検出するものであるため、同体積の粒子における形状の判別には原理的な困難を伴っていた。本発明は、ＦＦＦ法に基づいて粒子を形状分離した上で粒子検出を行うことで、従来法では困難であった形状分析を可能とする。
　上記以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
抵抗パルス法に基づく粒子測定の概略図。 粒子通過時のイオン電流の変化を示す図。 本発明の装置構成例を示す模式図。 分離部出口付近の一例の拡大模式図。 検出部入口付近の一例の拡大模式図。 本発明の装置構成例を示す模式図。 平板型分離チャネルの斜視模式図。 円筒型分離チャネルの斜視模式図。 測定用流路における電極配置の一実施例を示す模式図。 測定用流路における電極配置の一実施例を示す模式図。 並列化した測定用流路及び電極の配置の一実施例を示す概略図。 並列化した測定用流路及び電極の配置の一実施例を示す概略図。 並列化した測定用流路及び電極の配置の一実施例を示す概略図。 本発明の装置構成例を示す模式図。 分離部と検出部の接続領域の拡大模式図。 分割流路の形態の一実施例の断面模式図。 分離部と検出部の接続形態の一実施例を示す模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分離部と検出部の接続形態の一実施例を示す斜視模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分割流路の形態の一実施例を示す断面模式図。 分離部と検出部の接続形態の一実施例を示す斜視模式図。 １つの粒子検出器で測定されたイオン電流の時間変化を示す図。 電流ピーク値と保持時間の関係を示す図。 本発明による粒子測定の結果と従来法による測定結果を比較して示した図であり、（ａ）は従来法による測定結果を示す図、（ｂ）は本発明による測定結果を示す図。 複数の粒子検出器で測定されたイオン電流の時間変化を示す図。 複数の粒子検出器で対象粒子の空間分布を反映して測定されたイオン電流の時間変化を示す図。 複数の粒子検出器で得られた対象粒子の空間分布に基づいて分離チャネルの動作条件を最適化するプロセスのフローチャート。 複数の粒子検出器で得られた対象粒子の空間分布に基づいて最適化された分離ピークを示す模式図。
　以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、以下に説明する実施例は一例であり、本発明の要旨を逸脱しない範囲で変形実施することが可能である。また、１つの例示的な態様と共に図示又は記述される特色を、他の態様の特色と組み合わせてもよい。各実施例の図面において、先行する実施例や従来の構造で説明した構成要素については同じ符号を付して対応関係を明確にしている。
　まず、本発明の粒子分析装置の全体的な構成を、図面を用いて説明する。
　図３は、本発明による粒子分析装置の装置構成の一実施例を示す模式図である。本装置は、送液部１０１によって移動相液体を送り出し、下流に設置された試料導入部１０２において測定対象粒子を含む試料液体を移動相液体に混合し、粒子を含む移動相液体を分離部１０３に導入する。粒子は分離部１０３の内部で大きさ又は形状によって時間的又は空間的に分離されたのち、単一の出口ポートを介して備えられた接続配管１０４を通って検出部１０５に導入され、検出部内の測定用流路において電気的に検出される。
　図４は、本実施例の分離部出口近傍の拡大模式図である。分離部１０３に流入した粒子は、流れ場Ｆ１と作用力Ｅ１によりＦＦＦ法に基づいて大きさや形状に応じて分離され、分離部１０３の出口ポート１０６を介して接続配管１０４に導入される。
　図６は、本発明による粒子分析装置の装置構成の他の実施例を示す模式図である。本実施例では、試料導入部１０２は分離部１０３に直接取り付けられている。このような試料導入部の配置は、特にクロスフロー方式を利用した分離チャネルに対して広く用いられている。このような分離部の構造においても、図３に示した実施例と同様の効果が得られることは明らかである。
　次に、装置の構成を、送液部と試料導入部、分離部、検出部に分けて、それぞれを個別に説明する。
　送液部には、好ましくは、０．１～１０ｍｌ／ｍｉｎの範囲で流量を制御でき、かつ安定的に移動相液体を供給できるポンプを用いる。このようなポンプとして、例えば、プランジャーポンプやシリンジポンプが好適である。試料導入部には、好ましくは液体クロマトグラフ装置で常用されるサンプルインジェクターを用いる。試料液体又は移動相液体には、粒子の分散状態を安定化するような添加剤をあらかじめ添加しておくことが好ましい。移動相液体は、後段の検出部における電気測定を可能にするために電解質を含む必要があり、含まれる電解質の濃度は粒子の分散状態に影響を与えない範囲で十分高いことが望ましい。
　分離部は、ＦＦＦ法に基づく分離チャネル、及びそれに付随する外部装置を有する。分離チャネルは、いくつかの形状を取りうる。代表的な例の斜視模式図を図７及び図８に示す。図７は平板型分離チャネルを示し、上面壁１１と底面壁１２に挟まれた流路で形成された流れ場Ｆ１と、作用力Ｅ１とを利用して粒子を分離する。図８は円筒型分離チャネルを示し、円筒壁１３に囲まれた流路で形成された流れ場Ｆ２と、軸対称な作用力Ｅ２とを利用して粒子を分離する。これらの作用力と粒子の拡散力の釣り合いに応じて、粒子は分離チャネル内で作用力が向く方向の内壁に集中した空間分布をとる。この空間分布に依存して流れ場の中で粒子の平均速度が与えられるため、粒子は大きさや形状に応じて分離される。分離チャネル内で粒子に作用する力Ｅ１及びＥ２は、直接的であれ間接的であれ、粒子の大きさ又は形状に依存した空間分布を与えるならば、いかなるものであってもよい。粒子に直接作用するものとしては、例えば、クロスフロー、遠心力、電場、磁場がある。間接的な作用を利用する方式として、流れ場に垂直な温度勾配を与える方式が知られている。これらの方式のいくつかを組み合わせることで、分離効果を単一方式の場合よりも高めることができる。
　検出部は、その上流部において少なくとも２つの流路に分割され、また少なくとも２つの電極を備える。分割された流路のうち、少なくとも１つが電極を備えた測定用流路であり、粒子検出器として機能する。他の流路は補助流路であり、この流路を通る移動相液体は粒子検出に関与しない。ここで、測定用流路は、その断面積が少なくとも対象粒子の断面積よりも大きくなるように設計される。各々の測定用流路は２つの電極を備えるが、そのうちの１つは測定用流路の外部に共通電極として設けられていてもよい。電極には電気化学測定部が接続されており、電気化学測定部は、電極間の電気化学的特性を測定する。具体的には、測定用流路におけるイオン電流、電気抵抗、電位、又は交流インピーダンスの変化が、電極を介して電気信号としてリアルタイムに検出される。粒子のリアルタイム検出を確実に行うため、電気化学測定部のサンプリング時間間隔は、粒子が電気的検出帯を通過するのに要する時間よりも十分短いことが望ましい。検出部は、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、検出部に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、各パルスの電気信号値（少なくともパルスの高さ、好ましくはパルスを含む電気信号値の時間変化）及び電気信号値から演算された粒子の体積又は粒径、各パルスの検出時刻又は測定開始時からの経過時間、検出されたパルスの総数が含まれる。
　次に、単一の測定用流路における電極の配置について、図面を用いて説明する。
　図９は、電極の配置の一実施例を示す模式図である。本実施例では、測定用流路内の流れ方向に沿うように、第１電極５と第２電極６を配置する。この時、２つの電極に挟まれた空間が電気的検出帯として作用し、この空間を粒子が通過する際に、２つの電極間の電流が変化する。測定対象とする電気化学的特性は、電流の他に、電気抵抗、又は電位、又は交流インピーダンスであってもよい。
　図１０は、電極の配置の他の実施例を示す模式図である。本実施例では、測定用流路内の流れ方向に垂直な方向に、流れを挟むように第１電極５と第２電極６を配置する。この配置においても、図９で示した実施例と同様の効果が得られる。
　次に、測定用流路を並列化したときの測定用流路及び付随する電極の配置について、図面を用いて説明する。
　図１１は、並列化した測定用流路及び電極の配置の一実施例を示す概略図である。本実施例では、図９に示した単一測定用流路を並列化した配置となっており、電極は電気化学測定部７に接続されている。このように、測定用流路２１を並列化することで、検出部において粒子検出器を通過する流量を増大させることができる。したがって、移動相液体中に存在する粒子のうち、粒子検出器において検出される粒子の割合を増加させることが可能となるため、粒子検出測定の感度を向上させる効果がある。
　図１２は、並列化した測定用流路及び電極の配置の他の実施例を示す概略図である。本実施例では、図１１に示した実施例を変形し、各測定用流路２１に存在する電極を第１電極５のみにした上で、測定用流路の外部に第２電極として共通電極８を備えている。この時、共通電極８は測定用流路２１の上流側と下流側のどちらに設置してもよい。本実施例では、特に測定用流路の数が多数であるときに、ほぼ半数の配線数で、図１１に示した実施例と同様の効果を得ることができる。
　図１３は、並列化した測定用流路及び電極の配置のもう一つの実施例を示す概略図である。この実施例は、図１０に示した単一測定用流路を並列化した配置となっている。図１３には、各測定用流路２１に設ける一対の電極５，６を隣接する測定流路同士を区分けする隔壁に設けるように図示しているが、一方の電極５を上面壁１１（図７参照）に設け、他方の電極６を底面壁１２に設けるようにしてもよい。
　先に挙げた図１１及び図１２の構成では、測定を行う測定用流路における電極間の電気抵抗には、他の測定用流路を介した電流経路に起因する電気抵抗が並列に含まれるため、実効的に電気的検出帯の体積が増大し、粒子測定の感度が単一の測定用流路での感度と比較して低下しうる。図１３に示した構成では、他の測定用流路による寄与がほとんどないため、電気的検出帯の体積はほとんど増大せず、したがって、粒子測定の感度の低下は図１１及び図１２の構成よりも少ない。すなわち、測定用流路を多数配置したことによるクロストークの影響を低減しながら、図１１で示した実施例と同様の効果を得ることができる。
　図１１及び図１２に示した実施例では、電極を全て同一平面内に配置できることから、従来の微細加工の技術を利用して容易に流路及び電極を作製することができる。したがって、測定用流路の個数が十分少ない、例えば１０個以下であるような場合には、図１１又は図１２の実施例が好ましい。一方、測定用流路の個数が多く、流路間のクロストークが電気化学測定に影響する場合には、図１３の実施例が好ましい。
　なお、図１１、図１２、図１３では、測定用流路を一軸に沿って一列に並べる構成を示したが、測定用流路を流れ方向に交わる面内に二次元的に配置する構成においても、同様の効果が得られることは明らかである。
　次に、分離部と検出部との接続形態について、図面を用いて説明する。
　図５は、本実施例の検出部入口近傍の拡大模式図である。検出部１０５は、本実施例においては図３及び図６で示したように接続配管１０４を介して分離部１０３と接続される。このとき、検出部１０５の分割流路１０７の総断面積Ｓ２は、接続配管１０４の断面積Ｓ１以上であることが好ましい。このような設計によって、測定用流路における流速を低下させ、対象粒子が電気的検出帯を通過するのに要する時間を長くすることができる。その結果、粒子測定の時間分解能を実効的に向上させることが可能となり、対象粒子の数え落としを防ぎ、また電気信号変化の測定精度を上げる効果が得られる。
　検出部１０５は、分離部１０３の下流部分に内包することも可能である。図１４は、本発明による粒子分析装置の装置構成の他の実施例を示す模式図である。図１５は、図１４に示した実施例の分離部と検出部の接続領域の拡大模式図である。
　本実施例では、分離部１０３と検出部１０５の間には接続配管１０４が備わっておらず、分離部１０３と検出部１０５は一体化した分離検出部１０８を構成する。すなわち、分離部１０３が複数の出口ポート１０６を備え、各出口ポートに対して分割流路１０７が１対１に対応する。図３及び図６に示した実施例のように分離部１０３と検出部１０５を接続配管１０４で接続した構成では、分離部１０３の出口ポート１０６から流出した粒子は接続配管１０４内部で再び拡散するため、分離チャネルの断面内で生じた粒子の空間分布の情報は失われる。一方で、本実施例によれば、分離部１０３と検出部１０５とを接続配管１０４を介さずに直接接続することで、分離チャネル内での粒子の空間分布を反映した粒子検出を行うことが可能となり、したがって、粒子の空間分布を測定することができる。粒子の空間分布は分離チャネル内での流れ場の形状、粒子の拡散力の大きさ、及び粒子にかかる力を反映している。これらの情報を基に分離チャネルのパラメータ、すなわち流量と粒子にかかる力を最適化することができる。
　図１６は、分割流路の形態の一実施例の断面模式図である。本実施例では、分割流路１０７がすべて測定用流路２１から成る形態となっている。本実施例によれば、装置に導入された試料液体の全量測定が可能である。すなわち、粒子の全数測定が可能である。本実施例は、図３、図６及び図１４に示したいずれの実施形態に対しても適用可能である。図３及び図６に示した実施形態に適用した場合には、粒子の全数測定によって粒子検出感度を向上させつつ、試料液体中の対象粒子の数密度を測定する効果が得られる。一方、図１４に示した実施形態に適用した場合には（斜視図１７）、上記の効果に加えて、移動相液体中の粒子が空間的に分離された状態のまま測定用流路に導入されるため、粒子の分離チャネル内での空間分布を正確に測定する効果が得られる。
　図１８～図２１は、分割流路の形態の他の実施例を示す断面模式図である。これらの実施例では、分割流路１０７が少なくとも１つの測定用流路２１と補助流路２２から成る形態をとる。図１８は、流路断面が円形で、軸の中心部分を測定用流路２１、外周部分を補助流路２２とした実施例を示している。図１９は、流路断面が円形で、円形断面を同軸状の２つの領域に分け、外周部分を測定用流路２１、中心部分を補助流路２２とした実施例を示している。図２０は、図１９に示した実施例において外周部分の測定用流路２１を円周方向にさらに分割した実施例を示している。図２１は、流路断面が四角形で、底面部分を測定用流路２１、その上部を補助流路２２とした実施例を示している。これらの実施例は、図３、図６及び図１４に示したいずれの実施形態に対しても適用可能である。
　図１８～図２１に示した実施例を図３及び図６に示した実施形態に適用した場合には、分離部１０３を出た粒子は再び接続配管１０４内で均一に拡散するため、粒子検出器に導入される粒子の割合は粒径に依存しない。したがって、粒子検出器の総数を減らして測定を簡便化しつつ、試料液体中の対象粒子の粒径ごとの個数比を測定する効果が得られる。一方、図２２は、図１８～図２１に示した実施例を図１４に示した実施形態に適用した場合の一例を示す斜視模式図である。図２２は分離チャネルが平板型である場合の実施例である。分離チャネル内で粒子に作用する力Ｅ１が向く方向の内壁近傍に粒子の空間分布が集中することから、その壁面に沿って測定用流路２１を配置することで、対象粒子のうち、特に大粒径粒子を選択的に粒子検出器に導入することができる。したがって、検出器の総数を減らして測定を簡便化しつつ、大粒径粒子の検出感度を向上させる効果が得られる。このような測定は、粒子の凝集体を選択的に測定する場合に特に有効である。
　図２３及び図２４は、分割流路１０７の形態の他の実施例を示す断面模式図である。これらの実施例では、分割流路１０７が測定用流路２１と補助流路２２から成り、なおかつ補助流路２２が入口にフィルタ２３を備える形態となっている。このフィルタは、移動相液体及びカットオフ径より小さな粒子を透過するが、カットオフ径より大粒径の対象粒子は通過できないような微細孔を有するフィルタであり、好ましくは、フィルタ２３を通過しなかった粒子が速やかに測定用流路２１に導入されるように、流れ方向に対して傾斜を持つように設置される。
　図２３は図１９に示した実施例にフィルタ２３を追加した一実施例であり、図２４は図２１で示した実施例にフィルタ２３を追加した一実施例である。図１８や図２０を含む、補助流路を備えるあらゆる実施例に対して、フィルタを備える実施例は適用可能である。また、これらの実施例は、図３、図６及び図１４に示したいずれの実施形態に対しても適用可能である。これらの実施形態に適用した場合には、カットオフ径より大粒径の対象粒子は全て粒子検出器に導入されるため、検出器の総数を減らして測定を簡便化しつつ、対象粒子の検出感度を向上する効果が得られる。
　図２５は、図１４及び図２４で示された実施形態にフィルタを適用した場合の斜視模式図である。フィルタ２３は補助流路２２の入口を覆うようにして設置される。また、フィルタ２３は、フィルタ２３を通過できないカットオフ径より大きな粒径の粒子を表面に沿って測定用流路２１に誘導できるように流れ方向に対して傾けて配置されている。この実施例によると、測定用流路１つ当たりの流量を低減させつつ、検出対象粒子を濃縮しながら測定用流路に導入することができる。
　本発明の粒子分析装置及び粒子分析方法によって得られる測定結果について以下に説明する。
　図２６は、検出部において、ある１つの粒子検出器で測定されたイオン電流の時間変化を示す図である。第１の球状粒子と、第１の粒子より粒径の大きな第２の球状粒子と、第２の粒子と同体積で形状の異なる第３の粒子を混合した粒子試料を分析すると、粒子は大きさと形状によって分離され、それぞれ異なる保持時間ｔ1，ｔ2，ｔ3の後に順次検出器に到達し、体積に比例した大きさΔＩ1，ΔＩ2，ΔＩ3のイオン電流のパルス的な変化（以下、電流ピークとする）として検出される。なお、イオン電流以外の他の電気信号、すなわち、電気抵抗、電位、又は交流インピーダンスを測定した場合にも、パルス的な信号の減少又は増大が観測され、イオン電流と同様の解析が可能である。
　図２７は、図２６に示した測定結果を、横軸を粒子のチャネル内での保持時間、縦軸を電流ピーク値としてプロットしたグラフである。粒子の大きさと形状の差異を反映して、第一の粒子、第二の粒子、第三の粒子は異なる分布を示し、球状の粒子と非球状の粒子は、グラフ上で異なる曲線上に分布することとなる。そのため、抵抗パルス測定のみでは得られない粒子の形状に関する情報を、容易に視認することができる。また、事前に様々な大きさや形状の標準粒子を測定しておくことで、対象粒子の測定結果と、標準粒子から得られた測定値とを比較し、対象粒子の大きさや形状を推定することができる。
　図２８は、本発明による粒子測定の結果と従来法による測定結果を比較して示した図である。図２８（ａ）は、従来法において、分離チャネルの後段に取り付けた光学測定器で得られる測定信号の時間変化を示したものである。図２８（ｂ）は、図２７に示したものと同様のプロットを時間的に分画し、各分画に含まれる電流ピークの個数を計数し、横軸を保持時間として得られるヒストグラムの一例である。図２８（ａ）に示される従来法で得られる測定結果は対象粒子の密度を表し、図２８（ｂ）に示される本発明で得られる測定結果は対象粒子の個数を表している。
　従来法においては、試料中の粒子に対する検出感度は光学測定器のバックグラウンドノイズで決定される。測定信号は粒子の単位体積中に含まれる粒子の個数、すなわち粒子の数密度に比例するため、粒子の数密度が非常に低い試料に対しては、粒子による測定信号はバックグラウンドノイズに埋もれてしまい、粒子検出が困難となる。一方で、本発明においては、試料中の粒子に対する検出感度は、粒子検出器の電気ノイズで決定され、ノイズレベルよりも大きな電気信号を発する粒子、すなわち検出限界粒径よりも大きな粒子は必ず検出することができる。したがって、本発明の測定方法は、検出限界粒径より大きな粒子に対して、検出感度において従来法よりも優れていることは明らかである。
　図２９は、複数の粒子検出器で得られたイオン電流の時間変化を示す図である。各々の粒子検出器で、図２７及び図２８（ｂ）で示した分析を行い、複数の粒子検出器で得られた分析結果を積算することで、分析対象粒子数を増大させることができる。これによって、対象粒子の大きさや形状の測定結果の信頼性を向上させ、粒子検出の感度を向上させることができる。また、図１６に示したような試料の全量測定を行う実施例においては、試料中に含まれる対象粒子の絶対数や濃度を求めるために、全ての粒子検出器で得られた分析結果を積算することが必須である。
　図３０は、分離部と検出部が一体化している構成において、複数の粒子検出器で得られたイオン電流の時間変化を示す図である。各々の粒子検出器で得られた、イオン電流の時間変化に対して、図２８（ｂ）で示したように時間分画ごとの電流ピークの個数を計数することで、ある時間分画において各々の測定用流路の入口近傍に存在する対象粒子の個数を求めることができる。したがって、分離チャネルの出口における対象粒子の空間的・時間的な分布を得ることができる。得られた結果から、対象粒子の拡散係数、対象粒子に作用する力の大きさ、流れ場の形状を求めることで、それらの情報をもとに分離チャネルの動作条件、すなわち作用力及び流量を最適化し、より分離能を向上させることが可能である。図３１は、以上述べた複数の粒子検出器で得られた対象粒子の空間分布に基づく分離パラメータ最適化のプロセスを示すフローチャートである。図３２は、分離パラメータの最適化によって分離チャネルの分解能が向上する様子を示した模式図であり、最適化された分離ピークを示している。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１　　 ポア
２　　 導線
３　　 電圧源
４　　 電流計
５　　 第１電極
６　　 第２電極
７　　 電気化学測定部
８　　 共通電極
１１　 平板型分離チャネル上面壁
１２　 平板型分離チャネル底面壁
１３　 円筒型分離チャネル円筒壁
２１　 測定用流路
２２　 補助流路
２３　 フィルタ
１０１ 送液部
１０２ 試料導入部
１０３ 分離部
１０４ 接続配管
１０５ 検出部
１０６ 出口ポート
１０７ 分割流路
１０８ 分離検出部
Ｓ１　 接続配管断面積
Ｓ２　 分割流路総断面積
Ｆ１　平板型分離チャネルにおけるハーゲン・ポアズイユ流れ
Ｆ２　円筒型分離チャネルにおけるハーゲン・ポアズイユ流れ
Ｅ１　平板型分離チャネルにおいて粒子に作用する力
Ｅ２　円筒型分離チャネルにおいて粒子に作用する力

Claims (15)

  1. 　移動相液体を送り出す送液部と、
    　前記移動相液体に粒子を含む試料を導入する試料導入部と、
    　フィールドフローフラクショネーション法に基づく分離チャネルを備え粒子を大きさ又は形状によって分離する分離部と、
    　前記分離部で分離された粒子を検出する検出部とを有し、
    　前記検出部は、複数の分割流路を備え、少なくとも１つの分割流路が測定用流路であり、前記測定用流路は第１電極を備え、前記第１電極の対向電極としての第２電極が前記測定用流路の内部又は外部に配置され、
    　前記第１電極及び第２電極は電気化学測定部に接続され、
    　前記電気化学測定部は前記第１電極と前記第２電極間の電気化学的特性を測定する
    ことを特徴とする粒子分析装置。
  2. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記分離部が単一の出口ポートを備え、前記出口ポートと前記検出部が接続配管を介して接続されており、前記分割流路の総断面積が前記接続配管の断面積以上であることを特徴とする粒子分析装置。
  3. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記分離部が前記分割流路と同数の出口ポートを備え、前記分割流路と前記出口ポートが一対一で接続されていることを特徴とする粒子分析装置。
  4. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記検出部が、前記分割流路のうち前記測定用流路ではない補助流路の入口にフィルタを備え、前記フィルタのカットオフ径が検出対象粒子の粒径以下であることを特徴とする粒子分析装置。
  5. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記分割流路が、流れ方向を軸とする断面内で同軸状に配置されていることを特徴とする粒子分析装置。
  6. 　請求項３に記載の粒子分析装置において、
    　前記測定用流路に接続されている前記出口ポートが、前記分離部において粒子の空間分布が集中する壁面に沿って設けられていることを特徴とする粒子分析装置。
  7. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記第２電極が、前記測定用流路を流れる前記移動相液体の流れを挟むように前記第１電極と対向していることを特徴とする粒子分析装置。
  8. 　請求項１に記載の粒子分析装置において、
    　前記第２電極が、前記測定用流路の外部に設けられ、複数の第１電極に対して共有されていることを特徴とする粒子分析装置。
  9. 　移動相液体に対象粒子を含む試料を導入する工程と、
    　前記移動相液体中の粒子をフィールドフローフラクショネーション法に基づいて大きさ又は形状によって時間的又は空間的に分離する工程と、
    　前記分離された粒子を含む前記移動相液体を並列に配置された複数の流路に分割して流す工程と、
    　前記複数の流路のうち少なくとも１つの測定用流路を通過する粒子を抵抗パルス法に基づいて測定する工程と、
    を有することを特徴とする粒子分析方法。
  10. 　請求項９に記載の粒子分析方法において、
    　前記移動相液体中の粒子を空間的に分離された状態のまま前記測定用流路に導入することにより前記粒子の空間分布を反映した測定を行うことを特徴とする粒子分析方法。
  11. 　請求項９に記載の粒子分析方法において、
    　前記測定用流路ではない流路の入口に検出対象粒子を透過させないフィルタを備えることで、前記測定用流路１つ当たりの流量を低減させつつ、前記検出対象粒子を濃縮しながら前記測定用流路に導入することを特徴とする粒子分析方法。
  12. 　請求項９に記載の粒子分析方法において、
    　前記抵抗パルス法によって測定された電気信号の時間変化から粒子の通過に伴う信号ピーク位置と信号ピーク高さを抽出し、前記信号ピーク位置と前記信号ピーク高さを組み合わせて検出された粒子の大きさ又は形状を測定することを特徴とする粒子分析方法。
  13. 　請求項１２に記載の粒子分析方法において、
    　各々の測定用の流路で得られた分析結果を、複数の測定用流路にわたって積算することを特徴とする粒子分析方法。
  14. 　請求項９に記載の粒子分析方法において、
    　前記抵抗パルス法によって測定された電気信号の時間変化を時間的に分画し、各時間分画に含まれる対象粒子の通過に伴う信号ピークの個数を計数することを特徴とする粒子分析方法。
  15. 　請求項１４に記載の粒子分析方法において、
    　各々の測定流路で得られた分析結果を、複数の測定用流路にわたって積算することを特徴とする粒子分析方法。
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