JP7162291B2 - 粒子分離装置及び粒子分離方法 - Google Patents
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Description
一方の末端に流体導入口を備え、もう一方の末端において他の分岐流路と合流する2以上の分岐流路、当該2以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び狭窄流路のもう一方の末端に接続され、流路幅が拡大され、少なくとも1の回収口が備えられた拡大流路を含む、粒子分離装置であって、1の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入した場合に、狭窄流路の壁面に沿って粒子が滑流し、前記拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大することを特徴とする、前記粒子分離装置。
少なくとも1の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、その他の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有しない流体を導入し、それにより合流して形成される流路の壁面に沿って、粒子を滑流させる工程を含む、粒子分離方法にも関する。粒子分離方法は、さらに拡大流路の回収口から、粒子を回収する工程を含んでもよい。
本発明による連続分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ10は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
4インチベアシリコンウェハ(株式会社フィルテック)上へ、フォトレジストSU-8 3005(Microchem社)を滴下後、スピンコーター(MIKASA社)を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。マスクアライナー(ウシオ電機社)と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、SU-8Developer(Microchem社)を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、SYLGARD SILICONE ELASTOMER KIT(東レ・ダウコーニング社)を用いて調整した未硬化のシロキサンモノマーと重合開始剤の混合物(重量比10:1)を流し込み、80℃で2時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン(PDMS)を作製した。硬化したPDMSを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路の入り口側ポート、アウトレットを形成した。剥離したPDMSとスライドガラス(松浪ガラス社)を酸素プラズマ発生装置(メイワフォーシス社)で表面処理後、PDMSとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップを作製した。
製造実施例に記載の手順で作製したマイクロチップを用いて、直径0.2μm及び直径0.5μmの粒子を用いて分離を検証した。0.2μm粒子として、蛍光ポリスチレンビーズFluoresbriteDG(Polyscience社製;吸収極大波長480nm、蛍光極大波長;520nm)、0.5μm粒子として蛍光ポリスチレンビーズFluoresbriteBB(Polyscience社製;吸収極大波長360nm、蛍光極大波長;407nm)を用いた。分離対象の粒子を含有する流体100Pとしては、0.05%(v/v)ツイーン20水溶液を用い、直径0.2μmの蛍光ポリスチレン粒子を3.3ng/mL、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子を7.5ng/mLになるように調製した。分離対象の粒子を含有しない流体100Nとしては0.05%(v/v)ツイーン20水溶液を用いた。ここで、用いた0.05%(v/v)ツイーン20水溶液は実験前にポアサイズ0.45μmのシリンジフィルター(メルクミリポア社製)を用いて異物除去を行ってから用いた。シリンジポンプ(KDScientific社)により流量を調節し、流体100Pをインレット14aから、流体100Nをインレット14bから、それぞれ5、90μL/hの流量で送液した。なお、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用した。各流体をマイクロチップ10に導入し、導入しながら、それぞれ対応する波長の光で別々に蛍光画像を取得した。蛍光画像は、倒立型顕微鏡IX71(オリンパス社)を用いて水銀ランプで所定の励起光を観察領域へ照射し、デジタルCMOSカメラORCA-FLASH(浜松ホトニクス社)で画像取得エリア30を2秒間にわたり撮影することで取得した。0.2μmの粒子及び0.5μmの粒子でそれぞれ蛍光画像を作成後、検出ライン20の蛍光プロファイルを解析した。蛍光プロファイルの横軸は検出ライン20上の座標であり、縦軸は座標ごとの相対蛍光輝度を示している。なお、検出ライン20は分岐点31からアウトレット15の方向へ200μm下流地点に設定し、座標0を拡大領域壁面17a側とした。また画像取得エリア30は検出ライン20が取得画像内に収まるよう設定した。
図3(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作成した。図3(a)はマイクロチップ10の上面図であり、図3(b)におけるA矢視図である。図3(b)は図3(a)におけるB-B線による断面図であり、図3(c)は図3(a)における領域21の拡大図である。
基板11の下面11aには、基板12を重ね合わせた際に流路13を形成するように、加工を行った。流路13の深さはすべて3.5μmとした。流路13の端部に、基板11の上面に貫通するインレット14a、14b、アウトレット15、23(それぞれ穴の径1.5mm)を設けた。また流路13は、分岐流路18a(幅20μm、長さ1.5mm)、分岐流路18b(幅40μm、長さ500μm)、狭窄流路16(幅3.3μm、長さ20μm)、拡大流路17(幅215μm、長さ6.15mm)、ドレイン流路22(幅300μm、長さ1.3mm)の流路からなった。
図4(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24a、24bが90°で、狭窄流路壁面16aから拡大流路壁面17aまでの幅が50μmとなる点のみが実施例2と異なるよう設計したものを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ5、80μL/hとなるよう設定した点以外は実施例1と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例1と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
図5(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24aが90°、24bが180°となるよう設計した点以外は実施例1と同様のマイクロチップ10を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ5、80μL/hとなるよう設定した点以外は実施例1と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例1と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度24aを90°、24bを180°としたため、拡大流路17が狭窄流路に対して垂直方向に、ドレイン流路22が狭窄流路に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ10を用いた。つまり、本比較例は実施例1の狭窄流路16と拡大流路17の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路17を狭窄流路16に対して平行方向に、つまり実施例1と同じ方向に配置し、ドレイン流路22が垂直方向で、実施例1とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路22へ粒子が流れた。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路22による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例1と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図5(a)~(c)に示す流路構造とした。
図6(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24aが180°、24bが135°で、拡大領域のスロープ部分40の長さが1/√2mmで、アウトレット15と23へ流れる流体の比が実施例1と同等になるよう、ドレイン流路の長さを500μmとした点以外は実施例2と同じ構造をもつマイクロチップ10を用い、また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ3、90μL/hとなるよう設定した点以外は実施例1と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例1と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
図7(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例2のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24aが135°、24bが180°となるよう設計した点以外は実施例2と同様のマイクロチップ10を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ3、95μL/hとなるよう設定した点以外は実施例3と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例2と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。また、角度24aを135°、24bを180°としたため、拡大流路17が狭窄流路16に対して垂直方向に、ドレイン流路22が狭窄流路16に対して平行方向に位置する流路構造をもつマイクロチップ10を用いた。つまり、本比較例は実施例2の狭窄流路16と拡大流路17の接続部分の構造を、上下反転したもので比較を行っているものである。ここで、拡大流路17を狭窄流路16に対して平行方向に、つまり実施例2と同じ方向に配置し、ドレイン流路22が垂直方向で、実施例1とは上下反転した位置に配置した流路構造とした場合、大半の流体が流れるドレイン流路22へ粒子が流れることになった。すなわち、この配置の場合、ドレイン流路22による分離能向上の効果を得ることが出来なかった。そこで、実施例2と同じ粒子分離能をもつ流路構造とするため、図7(a)~(c)に示す流路構造とした。
図8(a)~(d)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ10は、実施例2とほぼ同じ構造であるが、拡大領域のスロープ部分40の一部には、狭窄流路16と拡大流路17の接続部分の拡大図を示す図8(d)に示すように、シース液側狭窄流路壁面16bとスロープ部分40との間に、流路壁面41a、41b(共に長さ50μm)により構成される部分的な凹部をもつマイクロチップ10を用い、その他の実験条件は実施例3と同じになるよう設定し、直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例2と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
狭窄流路16の幅を2μm、流路13の深さを2μmへ変更した点以外は同じ構造をもつマイクロチップ10を粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。このマイクロチップ10を用いて、0.1と0.2μm粒子の分離を検証した。分離する粒子としては、直径0.2μmの蛍光ポリスチレンビーズFluoresbriteDG(Polyscience社製;吸収極大波長480nm、蛍光極大波長;520nm)と、直径0.1μmの蛍光ポリスチレンビーズFluoresbriteBB(Polyscience社製;吸収極大波長360nm、蛍光極大波長;407nm)を用い、直径0.2μmの蛍光ポリスチレン粒子は3.3ng/mLに希釈し、直径0.1μmの蛍光ポリスチレン粒子は67ng/mLに希釈し実験に用いた。また、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ0.5、75μL/hとなるよう設定した。なお、実施例2と同様に各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
図12(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24aが210°、24bが90°となるよう設計した点以外は実施例2と同様のマイクロチップ10を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプP-PumpBasic(Dolomite社)を用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ1090、1200mbarとなるよう設定した点以外は実施例2と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例2と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
図13(a)~(c)で示されるマイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、狭窄流路16と拡大流路17との角度24a、24bが165°となるよう設計した点以外は実施例2と同様のマイクロチップ10を用い、送液ポンプとしてプレッシャーポンプを用い、サンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ1070、1200mbarとなるよう設定した点以外は実施例2と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。なお、実施例2と同様に、各流量は最も2つの粒子の分離が良好な条件を採用し、分離の評価に用いた。
マイクロチップ10を、粒子分離装置として上述の製造実施例に基づき作製した。実施例1のマイクロチップ10と比較して、流路13の深さをすべて3.2μm、狭窄流路16の幅を3.0μmとし、狭窄流路16と拡大流路17との角度24aを180°、角度24bをθとした場合に、拡大領域のスロープ部分40の長さを212/tanθμmとなるよう設計し、アウトレット15と23へ流れる流体の比が実施例1と同等になるよう設計した。また、送液ポンプとしてプレッシャーポンプP-PumpBasic(Dolomite社)を用いてサンプル液とシース液の流量条件がそれぞれ5、90μL/hとなるよう設定した点以外は実施例1と同じ実験条件で、同様に直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離の検証を行った。本実施例では、角度24bを65°、90°、112°、124°、135°へと変更した場合の直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の分離性能評価をRs値により行った。
Rs値は、直径0.2μm、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子の検出ライン20の蛍光プロファイルを示したグラフにおいて、直径0.2μm蛍光ポリスチレン粒子のピーク位置をP(0.2)、ピーク幅の半値をw(0.2)、直径0.5μmの蛍光ポリスチレン粒子ピーク位置をP(0.5)、ピーク幅の半値をw(0.5)、ピーク幅とした場合にRs=(P(0.5)―P(0.2))/(w(0.2)+w(0.5))で表されるものとし、値が大きいほど分離性能が高いことを示すこととする。
11 基板
11a 基板下面
12 基板
13 流路
14a、14b インレット
15 アウトレット
15a、15b、15c アウトレット
16 狭窄流路
16a サンプル液側狭窄流路壁面
16b シース液側狭窄流路壁面
17 拡大流路
17a サンプル液側拡大流路壁面
17b シース液側狭拡大路壁面
18a、18b 分岐流路
19 拡大開始点
20 検出ライン
21 領域
22 ドレイン流路
23 アウトレット
24a、24b 角度
30 画像取得エリア
31 分岐点
40 スロープ部分
41a、41b 流路壁面
100P 流体
100N 流体
Claims (8)
- 一方の末端側に流体導入口を備え、もう一方の末端側において他の分岐流路と合流する2以上の分岐流路、
当該2以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び
狭窄流路のもう一方の末端に接続し、流路幅が拡大され、少なくとも1の回収口が備えられた拡大流路
を含む、粒子分離装置であって、
1の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入した場合に、狭窄流路の壁面に沿って粒子が滑流し、前記拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大することを特徴とする、
前記粒子分離装置。 - 粒子が滑流しない壁面側に向けて、拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度24bが65°以上であるすることを特徴とする、請求項1に記載の粒子分離装置。
- 粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度24bが90°以上であることを特徴とする、請求項1に記載の粒子分離装置。
- 粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の拡大する角度24bが135°以上であることを特徴とする、請求項1に記載の粒子分離装置。
- 一方の末端に流体導入口を備え、もう一方の末端において他の分岐流路と合流する2以上の分岐流路、
当該2以上の分岐流路が合流して形成される狭窄流路、及び
狭窄流路のもう一方の末端に接続され、流路幅が拡大され、少なくとも1の回収口が備えられた拡大流路
を含み、拡大流路の壁面のうち、粒子が滑流する壁面側に向けて流路幅は拡大せず、粒子が滑流しない壁面側に向けて流路幅が拡大する粒子分離装置を用いた粒子分離方法であって、
1の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入し、もう一方の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含まない流体を導入して、それにより合流して形成される流路の壁面に沿って粒子を滑流させる工程を含む、前記方法。 - 粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度24bが65°以上であることを特徴とする、請求項5に記載の粒子分離方法。
- 粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度24bが90°以上であることを特徴とする、請求項5に記載の粒子分離方法。
- 粒子が滑流しない壁面側に向けて拡大流路の流路幅が拡大し、狭窄流路壁面と拡大流路壁面との間の角度24bが135°以上であることを特徴とする、請求項5に記載の粒子分離方法。
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