JP2021506263A - 慣性的細胞集束及び選別 - Google Patents
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Abstract
本発明は、粒子、好ましくは循環腫瘍細胞(CTC)のマイクロ流体選別、分離及び/又は操作に関する。本発明の一側面が提供する流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置は、(a)前記流体懸濁液を導入するための少なくとも1つの入口;(b)所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも1つの出口;並びに(c)前記少なくとも1つの入口及び前記少なくとも1つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも1つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネルを含み、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する。
Description
本発明は、マイクロ流体工学の分野に関する。特に、本発明は、粒子のマイクロ流体選別、分離及び/又は操作に関する。より詳細には、本発明は、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための、受動流体力を利用する慣性マイクロ流体工学に関する。
微細な生物粒子(細胞や病原菌など)の選別は、生物学的分析や医療診断で重要な役割を果たす。例えば、ヒト血球から循環腫瘍細胞(circulating tumor cell、CTC)を分離し、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell、MSC)や造血幹細胞(hemopoietic stem cell、HSC)などのさまざまな幹細胞の種類を選別することは、臨床分析や生物学的研究において重要視されている。高いスループットは、現在の細胞選別技術を実用的な生物医学用途に実行可能にするための主要な制約の1つである。
実用的な生物医学分析では、通常、患者の生の生体サンプル1〜10mLを処理する必要がある。感度と選択性を向上させるために、実際の生物医学分析の前にサンプルの精製が一般的に必要である。したがって、全体のターンアラウンドタイムを最小限に抑えるために、サンプルを非常に高いスループットで(〜mL/min)で精製することが強く望まれている。現在の細胞選別技術は、多大な労力(遠心分離)又は高価な機器(蛍光活性化細胞選別)を必要としている。
マイクロスケールでの細胞の正確な操作と分離は、生物学的研究に不可欠な有効化技術であり、生物工学及び製薬産業においても非常に商業的な可能性を秘めている。過去20年間で、さまざまなマイクロ流体細胞選別技術が開発され、能動的方法と受動的方法に分類できる。従来の能動的方法は、一般に外部音響1、2、3、4、5、電気6、7、8、9、10及び磁場11、12、13を適用し、非常に正確な細胞分離の卓越した能力を備えている。しかし、実際の用途での能動的細胞分離法の広範な利用は、複雑な装置の製造と組立て、比較的低いスループット(特に非常に少量の生体粒子を分離するために、数mL程度の大量のサンプルを処理する必要がある場合)によって妨げられる。受動的細胞分離法には、主にサイズベースの精密ろ過14、15、決定論的横置換法(deterministic lateral−displacement、DLD)16、17、18、及び慣性集束が含まれる。1961年までさかのぼると、SegreとSilberberg19は、2つの対向する慣性揚力のバランスから生じる、層流領域における、円筒状パイプに沿って粒子が自発的に環状パターンを形成すること(チューブラピンチ効果)を最初に観察した。決定論的平衡位置へのこの横方向の移行は、慣性集束現象として知られている。この受動的な粒子集束現象は、流体の流れが中間レイノルズ数領域(〜1<Re<〜100)にあるときの慣性揚力の結果である。近年、ミクロンサイズの粒子(通常は1ミクロンを超える)の慣性集束は、非常に高い流速(〜mL/min)で動作しているマイクロ流体装置でも達成できることがわかった。効果的な慣性集束のための高流速の要件は、実際の生物医学用途で必要とされる高スループットのサンプル処理も可能にする。慣性集束は、2007以来、マイクロ流体工学における強力な正確な細胞操作技術の1つとして登場し20、その後、その高スループット、低エネルギー消費、シンプルな装置構造、及び易しい製造手順、並びに既存のマイクロ流体チップと組み合わせて機能コンポーネントとして機能することの容易さのおかげで、マイクロ流体工学研究分野で徐々に大きな注目を集めている21、22、23。
慣性集束は、サイズ選択的な操作がチャネルジオメトリーに大きく依存する、受動的マイクロ流体操作技術である。慣性集束を実証するために、ストレート24、25、26、27、湾曲/蛇行28、29、30、31、非対称湾曲32、29、33、スパイラル34、35、27、36、及び収縮/拡張37、38、39、40を含むさまざまなチャネルジオメトリー設計が採用されており、その中で各チャネル設計は異なる慣性集束挙動を示す21。曲線又は膨張収縮機能を備えたマイクロ流体チャネルは、メイン流れ方向に垂直なディーン二次流れを生成できる。ディーン流れの生成は、中央領域と壁付近の領域での連続フローの慣性の不一致(通常はチャネルの断面に沿うディーン渦の逆回転)に起因する。したがって、ディーンの二次流れは、ディーン抗力(Dean drag force)を生み出し、ディーン抗力は、慣性揚力のバランスをとるために使用できるため、粒子の平衡位置を制御する融通性を提供する41。特に、ディーン抗力と慣性揚力は粒子サイズに応じて非常に際立って変化し、これにより、連続流で粒子を選別するために、異なるサイズの粒子の微分平衡位置を区別できる42。ディーン二次流れは、サンプル収集の便宜のために必要な平衡位置の数を減らすためにも役立つ。
多能性のマイクロ流体操作法として、慣性集束は、複数の用途(例えば、ほんの数例を挙げると、フローサイトメトリーにおけるシースレス配列43、30、サイズ依存性細胞分離36、44、45、変形能依存性細胞分離46、希少細胞分離34、32、40、47、細菌分離26、血小板分離29、血漿抽出48及び溶液交換40、49)に適用されている。とりわけ、循環腫瘍細胞(CTC)は、上皮間葉転換(EMT)を受けて循環系に侵入する、原発腫瘍(又は転移後の腫瘍)から脱落した悪性がん細胞である。CTCは腫瘍転移の前提条件と見なされており、CTCを捕捉して分析する能力が、がんの早期診断とがん転移の体系的な研究が可能になる。ただし、CTCは血流では非常に希少であり(つまり、1mLの全血サンプルに数十のCTCが含まれる50)、そのため、CTC選別技術は、実用的な研究及び臨床的要求のための高スループット、純度、及び捕捉率の要件を満たす必要がある。慣性集束にはサンプルを高スループットで処理する能力があるため、高スループットの慣性選別又は濃縮技術の開発への関心が高まっている。例えば、スパイラルチャネルは、希少細胞の単離51、52、35(CTCなど)、特定の細胞型の分離36、44、27、単一細胞のカプセル化53など、慣性細胞の集束と選別に広く研究及び適用されている設計である。Majid Ebrahimi Warkianiらは、シースフローと組み合わせたスパイラル慣性装置を使用して、リゾ化血液サンプルにスパイクされたがん細胞の少なくとも85%の回復率を達成し54、シースフローを有する傾斜スパイラルチャネルにより、全血にスパイクされたがん細胞の80%以上の回復率を達成した51。Jiashu Sunらはダブルスパイラルマイクロチャネルにより、全血にスパイクされたがん細胞の88.5%の回復率を得た35。
このようならせん慣性装置は、ディーン二次流れが弱いため、小さな細菌を効果的に集束させることができない。そのため、それらは血球濃縮に使用できるが、血液サンプルから細菌を分離して除去するために使用することはできない。生体適合性ポリマーを添加した粘弾性流体を使用する我々の設計では、臨床サンプルからサブミクロン粒子の弾性慣性集束と選別を実現できる。
本発明では、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための一連の逆波状チャネル構造を有する新規のチャネル設計が考案された。「逆」とは、本発明の実施形態による湾曲ユニットにおけるディーン二次流れの逆転を意味する。様々な実施形態では、単一の波状チャネルユニットは、チャネルの断面に沿って周期的に逆転ディーン二次流れを生成する4つの半円形セグメントからなる。慣性揚力とディーン抗力とのバランスにより、フロースルー粒子と細胞のサイズにもよるが、決定論的な平衡集束位置が得られる。6種の蛍光ミクロ粒子(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm、1μm)を使用して、サイズ依存性慣性集束挙動を研究した。急回転サブユニットを備えた我々の斬新な設計は、血小板の平均サイズである3μmという小さな粒子を効果的に集束させることができ、シースフローを使用せずに全血からがん細胞を選別することを可能にした。最適化されたチャネル設計により、シースフローを使用せずに、希釈された全血サンプルにスパイクされたMCF−7乳がん細胞のサイズベースの選別が実証された。単一の選別プロセスにより、元の混合物から89.72%のMCF−7細胞を回収し、優れた細胞生存力でMCF−7細胞を元の純度の5.3%から68.9%に濃縮することができた。
さらに、4種の異なるサイズの蛍光サブミクロンスフェア(1μm、500nm、300nm、100nm)を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。純度が88%を超え、回収率が76%を超える、サブミクロンのエキソソームのシンプルで高いスループット、かつラベルフリーの選別が実現できた。
本明細書における、明確に先に公開された文献の提示及び検討は、必ずしも、その文献が最新技術の一部であるか、又は一般的な一般知識であることを承認するものとは限らない。
本明細書で言及される文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、〜mL/分の程度の流速での高いスループットの細胞選別のための一連の新しい慣性マイクロ流体装置を提供する。特に、本発明は、慣性揚力と二次ディーン流れからの抗力との間のバランスを利用する。サイズに大きく依存するフロースルー細胞の微分平衡位置により、高いスループットのサイズベースの細胞選別が可能になる。二次ディーン流れは、周期的な回転チャネル構造によって生成される。サブミクロンの粒子集束では、生体適合性ポリマーを添加して粘弾性流体を導入することにより、波状チャネルは、従来の直線チャネルと比較して、垂直方向と水平方向の両方でチャネル中心線領域に向けて粒子の集束を促進するより大きな弾性力を生成できる。これらの回転構造の異なるジオメトリー設計により、平衡位置が変化する。これは、特定の細胞選別用途がこれらの周期的な回転チャネル構造の独自の設計を必要とすることを意味する。この一連の新しい慣性マイクロ流体装置は、1〜10mLの容量の複雑な生体サンプル、例えば全血サンプル中の循環腫瘍細胞、エキソソーム及び病原体のような希少細胞集団の高いスループット及び高忠実度の選別に適用できる大きな可能性がある。
本発明の一側面は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置を提供し、この装置は、(a)前記流体懸濁液を導入するための少なくとも1つの入口;(b)所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも1つの出口;並びに(c)前記少なくとも1つの入口及び前記少なくとも1つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも1つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネルを含み、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する。
有利には、本発明の装置は、3μmという小さな粒子を効果的に集束させることができ、かつ半径パラメータを変更することで調整可能な粒子分離を容易に達成することができる、少なくとも1つの急回転サブユニットを有する。また、粘弾性力を導入することにより、サブミクロンの粒子集束を実現できる。「湾曲」とは、メインチャネルのあらゆる曲がりを含むことを意味する。例えば、チャネルは、ジグザグ構成、半円構成、O形状構成、スプリング/スパイラル形状構成などを形成するように曲げられてもよい。
様々な実施形態において、本発明の湾曲ユニットは連続波に似ており、湾曲ユニットの曲率は、既存の技術のスパイラルチャネルと比較してはるかに小さな曲率半径を有するように設計できる。このようなスパイラルチャネルは、徐々に増加する曲率半径を持っている。したがって、湾曲ユニットによって形成されるこれらの周期的な回転チャネル構造は、スパイラルチャネルよりもはるかに強力な二次ディーン流れを生成でき、1μm以下の粒子の集束を可能にする(スパイラルチャネルでは1μmの粒子の集束は困難である)。粒子の大部分は4μm未満であるため、1μm以下の粒子を効果的に操作する能力は、細菌の選別にとって非常に重要である。直線チャネルは、そのような小さな粒子サイズでは純粋な慣性力で(すなわち、ディーン抗力を導入せずに)細菌の集束を達成することはできない。湾曲ユニットは、本発明の教示に従って半径パラメータを変更することにより、3μm程度の小さな粒子を効果的に集束させ、調整可能な粒子分離を容易に達成することができる。
様々な実施形態では、前記谷の半円弧セグメントの直径が、前記山の半円弧セグメントの直径以上である。
様々な実施形態では、前記メインチャネルが複数の湾曲ユニットを含む。
様々な実施形態では、前記複数の湾曲ユニットは直線方向に配置される。1つのチャネルでサンプルを0.1〜1mL/minの速度で処理できるが、実用的な用途での高いスループットの細胞選別には、チャネルの並列化がなお必要である。チャネルの並列化、すなわち、複数のチャネルを並行して運転することは、スパイラルマイクロ流体装置では実現が困難である。本発明では、そのような複数の湾曲ユニットを直線方向に配列又は配置することができ、スパイラルチャネルと比較してチャネルの並行化の実施がより簡単である。
様々な実施形態では、前記複数の湾曲ユニットが10〜40個の湾曲ユニットを含む。
様々な実施形態では、装置が複数の出口を含む。例えば、装置は3つの出口、すなわち第1、第2及び第3の出口を含むことができ、各出口は、流体懸濁液サンプル内の異なるサイズ又はタイプの粒子を排出する。
様々な実施形態では、前記第1、第2及び第3の出口の幅が異なる。第1、第2及び第3の出口の幅は、それぞれ30〜80μm、40〜55μm及び30〜80μmであり得る。幅は、操作されている標的/粒子に応じて調整できる。
様々な実施形態では、メインチャネルは長方形の断面輪郭を有する。一例では、メインチャネルの幅は20〜125μm、高さは5〜40μmである。
様々な実施形態では、前記入口及び前記少なくとも1つの出口のそれぞれが、前記流体懸濁液及び懸濁液中の選別された粒子のためのリザーバをさらに含む。一例では、前記リザーバの直径が1.5mmである。
様々な実施形態では、前記山の半円弧セグメントの直径が600〜800μmであり、前記面の半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が600μm〜1200μmである。
慣性による選別は受動的な技術であり、集束、選別、又は操作の効率は、チャネルのジオメトリー、特定の寸法、及び操作のフロー条件に大きく依存することに注意すべきである。さまざまな細胞選別用途の場合、チャネルのジオメトリーと寸法は、非常に慎重な設計が必要であり、それは確実に特許性を有する。したがって、以下で詳細に説明するように、本発明の湾曲ユニットのジオメトリー及び設計構成の選択は、任意のものではない。
本発明の別の側面は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作する方法を提供し、この方法は、(a)前記流体懸濁液を導入するための少なくとも1つの入口を提供すること;(b)所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも1つの出口を提供すること;(c)前記少なくとも1つの入口及び前記少なくとも1つの出口と流体連通し、それらの中間にあるメインチャネルであって、前記メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも1つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されており、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷がそれぞれ半円弧セグメントを形成する、メインチャネル;並びに(d)前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと、前記湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることを含む。
様々な実施形態では、前記方法は、前記谷の半円弧セグメントの直径が前記山の半円弧セグメントの直径以上である前記湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含む。
様々な実施形態では、前記方法は、直線方向に配置される複数の湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含み、前記複数の湾曲ユニットが、10〜40個の湾曲ユニットを含む。
様々な実施形態では、前記方法は、前記流体懸濁液を40μL/分〜200μL/分の流速でポンプで送ることをさらに含む。
様々な実施形態では、前記方法は、前記山の半円弧セグメントの直径が600〜800μmであり、前記面の半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が600μm〜1200μmである波状湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることを含む。
様々な実施形態では、前記方法は、第1、第2及び第3の出口である3つの出口で前記流体懸濁液を排出することをさらに含む。
様々な実施形態では、前記方法は、前記第1の出口で約3μm〜10μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第2の出口で約15μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第3の出口で約3μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出することをさらに含む。
様々な実施形態では、前記流体懸濁液が全血サンプルであり、前記方法は前記サンプルから、がん細胞を分離し、又は前記流体懸濁液サンプルから異なるタイプの血球を分離し、又はサブマイクロン小胞とエキソソームを分離する。
様々な実施形態では、前記方法は約300nm(以上)のサイズを有する粒子を、約100nmのサイズを有する粒子から分離する。
有利に、本発明は、生物学的研究及び臨床診断における、希少細胞集団の高いスループット及び高忠実度の選別に適用できる大きな可能性がある。
本発明が完全に理解され、容易に実施できるように、非限定的な例として、本発明の好ましい実施形態のみを説明し、説明は添付の例示の図を参照して行う。
本発明では、シースレス慣性粒子集束及び細胞選別のための、新規の幾何学的チャネル設計、非対称逆波状マイクロチャネルが考案されている。台形44、円、半円、三角55などの複数の断面形状が研究されてきたが、単純な製造プロセスであることから、典型的な長方形断面設計が選択された。3つのチャネルパターン設計における6種の蛍光ミクロンサイズの粒子(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)の慣性集束挙動が実験的に調べられた。効果的な慣性集束のための最小粒子サイズは、1〜3μmであることがわかった。これらの実験的研究に基づいて、全血サンプルのがん細胞の分離の要件を満たすために最適化されたチャネル設計が特定された。この新しい装置設計の応用の可能性を実証するために、乳がん細胞でスパイクした希釈全血サンプルを使用して、臨床CTCサンプルを擬態し、慣性マイクロ流体装置の選別性能をテストした。1つの単一の選別プロセスで、89%以上のがん細胞を回収し、がん細胞の純度を13倍に高めることができた。以前の慣性選別装置と比較して、極急回転サブユニットを備えた現在の新規設計は、3μmもの小さな細胞に効果的に集束でき、したがってシースフローを使用せず、がん細胞から3種の主要な血球タイプ(すなわち、赤血球、白血球、及び血小板)を効果的に分離することができる。さらに、反復波状のユニットが直線方向に配列されているため、大量のサンプルを処理するためのマルチチャネルの水平(2D)及び垂直(3D)の並列化が容易になる。さらに、4種の異なるサイズの蛍光サブミクロンスフェア(1μm、500nm、300nm、100nm)を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。純度が88%を超え、回収率が76%を超える、エキソソームのシンプルで高いスループット、かつラベルフリーの選別が実現できた。この開発された弾性慣性エキソソーム選別技術は、さまざまなエキソソーム関連の生物学的研究、臨床及び製薬用途で有望なプラットフォームを提供する可能性がある。
図1は、流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための慣性装置5の実施形態を示す。図1を参照すると、装置5は、流体懸濁液を受け入れ又は導入するための入口10と、チャネル15と、出口20を含む。これにより、流体懸濁液は、入口10からチャネル15を通って移動し、出口20を介して装置5から出る。
「流体懸濁液」とは、選別、分離又は操作されることが望まれる粒子の懸濁液を含むあらゆる流体を含むことを意味する。粒子は生物学的物質又はその他のものであり得る。様々な実施形態では、以下で詳細に説明するように、流体懸濁液は、血液成分を含む血液サンプルであってよい。
この図は、両端に配置された入口10及び出口20、並びに入口10及び出口20と流体連通し、それらの中間にあるチャネル15を示す。出口20は、選別/分離/操作された粒子を排出するように適合されている。様々な実施形態では、出口20は、1つより多く含むことができる。例えば、図5bは、3つの出口20a、20b及び20cを示す。各出口は、特定のサイズの粒子を選別するように適合される。装置5が選別を達成する手段は、チャネル15の一部を湾曲させて、少なくとも1つの湾曲ユニット25を形成することである。図1bは、本発明の実施形態による湾曲ユニット25の分解図を示す。
湾曲ユニット25は、山30、谷40上で湾曲するリップ35、及び面45を有する波の輪郭を形成するように成形されており、湾曲ユニット25の山30、リップ35、面45及び谷40はそれぞれ半円弧セグメントを形成する。図1b及び2aに示される矢印は、湾曲ユニット25を通る、すなわち、山30の半円弧セグメントから谷40の半円弧セグメントへの流体懸濁液の移動方向を示す。
「半円弧セグメント」とは、あらゆる曲線を含むことを意味する。様々な実施形態では、円の一部を形成できる任意の曲線を含むことも意味する。そのようなセグメントには、割線又は弦によって円の残りの部分から「カットオフ」される円の領域が含まれる。本発明の文脈では、あらゆる曲線は、入口10と出口20との間に配置される湾曲チャネル15にあたり得る。本発明の非限定的な特定の実施形態では、半円弧セグメントは、直径線に沿って円全体を切断することによって形成される半円であり得る。
湾曲ユニット25は、より詳細に説明され得る。図に見られるように、湾曲ユニット25の波輪郭は、波輪郭の山30(上部外側半円)及び面45(上部内側半円)によってそれぞれ表される上部半円、並びに波輪郭のリップ35(下部内側半円)及び谷40(下部外側半円)によってそれぞれ表される下部半円を有することができる。上部と下部の半円は、架空の水平軸を中心に互いに向かい合っている。
コンセプトと動作原理
固体粒子が中間レイノルズ数領域(〜100>Re>〜1)で境界付き直線チャネルに沿って流れている場合、メイン流れ方向に沿って粒子に作用する粘性抗力に加えて、メイン流れに対して垂直に、粒子に作用する4つのタイプの慣性揚力がある22:i)粒子のすべり回転によるマグヌス力(Magnus force);ii)粒子の滑り剪断によるサフマン力(Saffman force);iii)流体速度プロファイルの曲率に起因する、剪断勾配によって引き起こされる揚力(粒子から壁に指向する)、及びiv)粒子と壁の間の相互作用に起因する、壁によって引き起こされる揚力(壁から粒子を押し離す)。これらの力の中で、マグヌス力とサフマン力は通常、他の2つの揚力と比較してはるかに小さく、通常、マイクロ流体選別用途では無視できる。後者の2つの慣性揚力のバランスにより、SegreとSilberberg19によって観察された円筒状パイプに沿ったチューブラピンチ効果が生じる。Asmolov氏のモデル56、42によると、2つの主要な揚力からなる正味慣性揚力は、次のように表すことができる。
中心付近:
壁付近:
式中、fLは揚力係数を指し、レイノルズ数Re<100の場合は通常0.520となり、ρf、U及びaはそれぞれ流体密度、流体速度及び粒子径を指す。ここでのHは水力直径として定義され、長方形のチャネルでは2wh/(w+h)として計算され、ここで、wはチャネル幅を指し、hは断面のチャネル高さを指す。
固体粒子が中間レイノルズ数領域(〜100>Re>〜1)で境界付き直線チャネルに沿って流れている場合、メイン流れ方向に沿って粒子に作用する粘性抗力に加えて、メイン流れに対して垂直に、粒子に作用する4つのタイプの慣性揚力がある22:i)粒子のすべり回転によるマグヌス力(Magnus force);ii)粒子の滑り剪断によるサフマン力(Saffman force);iii)流体速度プロファイルの曲率に起因する、剪断勾配によって引き起こされる揚力(粒子から壁に指向する)、及びiv)粒子と壁の間の相互作用に起因する、壁によって引き起こされる揚力(壁から粒子を押し離す)。これらの力の中で、マグヌス力とサフマン力は通常、他の2つの揚力と比較してはるかに小さく、通常、マイクロ流体選別用途では無視できる。後者の2つの慣性揚力のバランスにより、SegreとSilberberg19によって観察された円筒状パイプに沿ったチューブラピンチ効果が生じる。Asmolov氏のモデル56、42によると、2つの主要な揚力からなる正味慣性揚力は、次のように表すことができる。
中心付近:
定常状態の非圧縮性ナビエストークス方程式(Navier−Stokes equations)(式3)及び連続方程式(式4)を使用して、マイクロチャネル内の流体の流れを表す。式3の左側の項は、急回転でディーン二次流れを生成する流体の慣性である。
流体に作用する慣性力と粘性力の関係を定量化するために、チャネルレイノルズ数Recは次のように定義される。
式中、Umは最大流速、μは流動粘度である。「u→」(uの上に右矢印)は流体速度ベクトル、ρは流体圧力である。
中間レイノルズ数領域での曲率誘起ディーン流れなどの二次側方流動の導入により、粒子の平衡位置の制御性が向上する21。中央と壁付近の領域での連続流に対する側方遠心力の不一致と質量の保存により、湾曲チャネルの断面に沿って2つの逆回転ディーン渦が生成されることが可能である。無次元ディーン数Deは、ディーン流動強度を描くために使用される41、57。
式中、Rは曲率半径を表す。ディーン流れの大きさは、U2 mに比例し、すなわち、
ディーン流れは、メイン流れ方向に対して垂直な粒子を引き寄せる。ディーン抗力は、次のように定義できる。
ディーン抗力には線形サイズスケーリングがあり、これは正味慣性揚力のサイズスケーリングとは異なる。したがって、ディーン抗力と正味慣性揚力の同時効果により、サイズの異なる粒子の平衡位置が微分され、連続フローでサイズベースの慣性選別が可能になる。
慣性選別装置の設計を導くために、特定のチャネルジオメトリーの以前の研究で2つの経験的パラメータが見つかった。まず、慣性集束を成功させるために、a/H>0.07が一般的に推奨される20。別の経験的パラメータRfは、慣性揚力とディーン抗力の比であり、以下のように定義される23:
Rf>〜0.08の場合、慣性揚力がディーン抗力よりも支配的であることを意味する。逆に、Rf<〜0.08の場合、粒子の動きは慣性揚力ではなくディーン流れによって支配される。また、Rfの値が小さすぎると、決定論的な粒子集束ではなく、カオス的な粒子の動きが生成される。
非ニュートン粘弾性流体の場合、粒子に生成される追加の弾性力は、粒子の平衡集束位置にも影響を与える。ワイセンベルク数(Weissenberg number)Wiは、流体の粘弾性効果を測定するために使用される58、59、60。
ここで、λは流体の緩和時間を表し、「Υ・」(Υの上に点)はチャネル断面全体の流体せん断速度を表す。粘弾性流体を流れる粒子は、第1及び第2の垂直応力の影響を受ける61、62。N1=τ11−τ22はメイン流れ方向に沿った張力を示し63、N2=τ22−τ33はチャネルの断面に沿って二次流れを及ぼし64、ここで、τ11、τ22、τ33は、それぞれ流れ、速度勾配、回転方向を表す。ほとんどの粘弾性解では、N1の大きさがN2よりはるかに大きいため、N2は無視できる65,66。そのため、より小さいせん断速度領域を指向する粒子に加えられる弾性力は、以下のように表すことができる67、68、69。
ここで、CEは無次元の弾性揚力係数を指す。
図1は、下部の外側の半円形の半径が、これらのチャネルジオメトリーにおいて集束する慣性粒子にどのように影響するかを理解するための3つの異なるチャネルパターンを示す。パターン1〜3は、同じ上部半円形設計と異なる下部外側半円形設定を持ち、ここで、パターン1はユニットパターンの中心に対して幾何学的に対称であり、パターン2と3はある程度の幾何学的非対称性を示す。3つのチャネル設計はすべて1つの入口設計を使用しており、メインチャネルの幅は125μm、高さは40μmであり、アスペクト比の低い設計(AR=h/w=0.32)である。3つの出口分岐の幅は、それぞれ80μm、45μm、80μmである。入口及び出口リザーバの直径は1.5mmである。図1aは、連続逆波状チャネル構造を持つ代表的なマイクロ流体チャネルを示す。ここで、入口でランダムに分布した粒子は、チャネルを出るときに、粒子サイズに基づいて決定論的に、微分の細いストリークに集束されることができる(図1b)。これらのパターン設計の詳細な幾何学的パラメータを図1cに示す。
材料及び方法
[装置の製作]
3つの異なるマイクロチャネルを、標準のポリジメチルシロキサン(polydimethylsiloxane、PDMS)ソフトリソグラフィープロセスを使用して製造した。PDMSキャスティングのマスターモールドは、シリコンウェーハ上にSU−8(SU−8 2025、MicroChem、ニュートン、マサチューセッツ州、米国)で製造した。PDMSマイクロチャネル層と超音波洗浄ガラススライドを空気プラズマ(HarrickプラズマPDC−32G、イサカ、ニューヨーク、米国)で処理して、表面にヒドロキシル官能基を生成した。次に、処理された表面を接触させて、閉じたマイクロチャネルを形成した。
[装置の製作]
3つの異なるマイクロチャネルを、標準のポリジメチルシロキサン(polydimethylsiloxane、PDMS)ソフトリソグラフィープロセスを使用して製造した。PDMSキャスティングのマスターモールドは、シリコンウェーハ上にSU−8(SU−8 2025、MicroChem、ニュートン、マサチューセッツ州、米国)で製造した。PDMSマイクロチャネル層と超音波洗浄ガラススライドを空気プラズマ(HarrickプラズマPDC−32G、イサカ、ニューヨーク、米国)で処理して、表面にヒドロキシル官能基を生成した。次に、処理された表面を接触させて、閉じたマイクロチャネルを形成した。
[数値モデリング]
有限要素法(finite element method、FEM)ベースの数値シミュレーションを、COMSOL Multiphysics 5.0層流モジュールを使用して定常状態試験(steady state study)で行った(www.comsol.com)。このモデルは、実験と同じジオメトリー寸法と入口流速を持つ3つの逆波状チャネルユニットで構成されている。非圧縮性ナビエストークス方程式(式3)と連続方程式(式4)は、マイクロチャネル内の流体運動をシミュレーションする支配方程式であり、ディーン二次流れが慣性粒子の集束にどのように影響するかを理解するのに役立つ。入口と出口以外の境界は非スリップ状態とした。流速197.60μL/min(チャネルレイノルズ数Rec=40に相当)での入口速度が計算され、最大ディーン流速も得られた。
有限要素法(finite element method、FEM)ベースの数値シミュレーションを、COMSOL Multiphysics 5.0層流モジュールを使用して定常状態試験(steady state study)で行った(www.comsol.com)。このモデルは、実験と同じジオメトリー寸法と入口流速を持つ3つの逆波状チャネルユニットで構成されている。非圧縮性ナビエストークス方程式(式3)と連続方程式(式4)は、マイクロチャネル内の流体運動をシミュレーションする支配方程式であり、ディーン二次流れが慣性粒子の集束にどのように影響するかを理解するのに役立つ。入口と出口以外の境界は非スリップ状態とした。流速197.60μL/min(チャネルレイノルズ数Rec=40に相当)での入口速度が計算され、最大ディーン流速も得られた。
[細胞培養]
MCF−7乳がん細胞株を、American Type Culture Collection(ATCCカタログ番号HB−72)から購入し、10%のウシ胎児血清(fetal bovine serum、FBS、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国)を補充した(成長因子と抗生物質を提供するため)ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium、DMEM)(Thermo Fisher Scientific、米国)で培養した。この培地は、細菌の成長を防ぐため、ペニシリンとストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific、米国)を含む。加湿インキュベーター内において、単層が80〜90%のコンフルエントに達したときに細胞を2〜3日ごとに継代培養し、37℃、5%(v/v)CO2に維持した。次に、細胞を0.25%トリプシン−EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific、米国)でトリプシン処理した。
MCF−7乳がん細胞株を、American Type Culture Collection(ATCCカタログ番号HB−72)から購入し、10%のウシ胎児血清(fetal bovine serum、FBS、サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国)を補充した(成長因子と抗生物質を提供するため)ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium、DMEM)(Thermo Fisher Scientific、米国)で培養した。この培地は、細菌の成長を防ぐため、ペニシリンとストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific、米国)を含む。加湿インキュベーター内において、単層が80〜90%のコンフルエントに達したときに細胞を2〜3日ごとに継代培養し、37℃、5%(v/v)CO2に維持した。次に、細胞を0.25%トリプシン−EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific、米国)でトリプシン処理した。
[サンプル前処理]
蛍光ポリスチレンミクロスフェア(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)を、追加の変更なく購入した(Magsphere、米国)。これらの蛍光ポリスチレン粒子はすべて、0.6%Pluronic F127(Sigma−Aldrich、米国)を含む脱イオン(deionized、DI)水で希釈して、粒子の凝集とチャネル壁への付着を回避した。以下の実験で使用される典型的な粒子濃度は約6×106粒子/mLであった。15μm、10μm、3μmの粒子をDI水に懸濁した混合物(0.6%F127を含む)を使用して、連続フローでのサイズベースの粒子選別を実証した。がん細胞(MCF−7)をSYTO 9蛍光色素(Thermo Fisher Scientific、米国)で染色し、希釈された全血(最終濃度は約5×107細胞/mL)と混合した。この細胞混合物は、上記波状慣性集束装置を使用して、血球からのMCF−7がん細胞のサイズベースの選別を実証するために使用された。
蛍光ポリスチレンミクロスフェア(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)を、追加の変更なく購入した(Magsphere、米国)。これらの蛍光ポリスチレン粒子はすべて、0.6%Pluronic F127(Sigma−Aldrich、米国)を含む脱イオン(deionized、DI)水で希釈して、粒子の凝集とチャネル壁への付着を回避した。以下の実験で使用される典型的な粒子濃度は約6×106粒子/mLであった。15μm、10μm、3μmの粒子をDI水に懸濁した混合物(0.6%F127を含む)を使用して、連続フローでのサイズベースの粒子選別を実証した。がん細胞(MCF−7)をSYTO 9蛍光色素(Thermo Fisher Scientific、米国)で染色し、希釈された全血(最終濃度は約5×107細胞/mL)と混合した。この細胞混合物は、上記波状慣性集束装置を使用して、血球からのMCF−7がん細胞のサイズベースの選別を実証するために使用された。
蛍光ポリスチレンミクロスフェア(1μm、500nm、300nm、100nm)を、追加の変更なく購入した(Magsphere、米国)。これらの蛍光ポリスチレン粒子はすべて、0.6%Pluronic F127(Sigma−Aldrich、米国)を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco’s phosphate−buffered saline、DPBS、Thermo Fisher Scientific、米国)で希釈して、粒子の凝集とチャネル壁への付着を回避した。この実験で使用される典型的な粒子濃度は約6×107粒子/mLであった。PEO(ポリエチレンオキシド)溶液は、PEO(Mw=600KDa、Sigma−Aldrich、米国)の粉末をDPBS(Thermo Fisher Scientific、米国)に0.08wt%、0.10wt%、0.12wt%、0.14wt%及び0.16wt%の濃度で溶解することで作成した。PEO粉末をDPBSに加えた後、均一な溶液特性を維持するために、溶液は一晩の穏やかな拡販を要した。PEOを水溶液に添加すると、流体は非ニュートン流体になる。これを行うことにより、追加の力を使用して、流体内のサブミクロン粒子を操作できる。
細胞外小胞は、約48時間〜72時間(細胞コンフルエントは約85%に達する)の細胞増殖後にMCF−7細胞培養培地から収集した。次に、細胞外小胞を含む細胞培養上清を、示差遠心分離手順にかけた。最初に、500×gの速度で5分間の遠心分離を使用して、かさばるアポトーシス及び死細胞の破片を除去した。続いて、残りの無傷の細胞、及びより大きなEVの一部を、2000×g及び12000×gで10分間遠心分離することにより除去した。なお、タンパク質含有物の変性を防ぐために、すべての遠心分離ステップは4℃で行われた。培地を最後に膜濾過(ポアサイズ:0.8μm、Millipore、USA)で処理して、不要な破片を取り除いた。実験で使用される典型的な小胞濃度は約5×108粒子/mLであった。
[実験セットアップ]
使用済み装置内の残留粒子や気泡による相互コンタミネーションや考えられる詰まりを回避するために、個々の実験は新しいマイクロチャネル装置を使用して行われた。各実験について、シリンジポンプを使用して、49.41μL/minから197.60μL/min(10〜40のRecに相当)の流速で、調製した水性サンプルをマイクロチャネルに連続的に注入した。これらの蛍光マイクロ粒子の軌跡は、CCDカメラを使用して倒立顕微鏡(オリンパス、CKX53、日本)で記録し、慣性集束挙動をキャプチャした。三叉出口での単一細胞の動きは、細胞分離プロセスを視覚化するために高速カメラ(FASTCAM Mini UX100、PHOTRON、日本)を使用してキャプチャした。慣性選別の前後のサンプルの細胞含有量を、市販のフローサイトメーター(Accuri C6、Becton Dickinson、カリフォルニア州、米国)で分析して、選別性能を評価した。エキソソーム単離実験では、選別の前後のサンプルの媒体内容物を、市販のNTA、ナノ粒子追跡分析システム(ZetaView、Particle Metrix、ドイツ)で分析してサイズ分布を取得し、選別性能を評価した。すべてのサンプルは、正確な結果を得るためにNTA測定用にDPBSで約5×106の濃度に希釈され、すべての測定は22℃で行われた。すべてのデータはZetaView(www.particle−metrix.de)を通じて収集し、ZetaView Analyzeで分析した。
使用済み装置内の残留粒子や気泡による相互コンタミネーションや考えられる詰まりを回避するために、個々の実験は新しいマイクロチャネル装置を使用して行われた。各実験について、シリンジポンプを使用して、49.41μL/minから197.60μL/min(10〜40のRecに相当)の流速で、調製した水性サンプルをマイクロチャネルに連続的に注入した。これらの蛍光マイクロ粒子の軌跡は、CCDカメラを使用して倒立顕微鏡(オリンパス、CKX53、日本)で記録し、慣性集束挙動をキャプチャした。三叉出口での単一細胞の動きは、細胞分離プロセスを視覚化するために高速カメラ(FASTCAM Mini UX100、PHOTRON、日本)を使用してキャプチャした。慣性選別の前後のサンプルの細胞含有量を、市販のフローサイトメーター(Accuri C6、Becton Dickinson、カリフォルニア州、米国)で分析して、選別性能を評価した。エキソソーム単離実験では、選別の前後のサンプルの媒体内容物を、市販のNTA、ナノ粒子追跡分析システム(ZetaView、Particle Metrix、ドイツ)で分析してサイズ分布を取得し、選別性能を評価した。すべてのサンプルは、正確な結果を得るためにNTA測定用にDPBSで約5×106の濃度に希釈され、すべての測定は22℃で行われた。すべてのデータはZetaView(www.particle−metrix.de)を通じて収集し、ZetaView Analyzeで分析した。
結果と考察
[3つのチャネル設計での流体の流れのシミュレーション]
図2aで定義されている4つの断面A〜Dに沿った速度プロファイルを調査することが特に興味深いため、3つの異なるチャネル設計での流体の流れが最初にシミュレーションした。すべてのシミュレーションは、197.60μL/min(Rec=40)の流速で行われた。図2bは、チャネル断面の1つに沿った代表的なフロープロファイルを示す。左側と右側は、それぞれチャネルの外壁(曲率半径が大きい)と内壁(曲率半径が小さい)である。流体が回転チャネルを流れるとき、流体の慣性は中間チャネルレイノルズ数領域(〜100>Rec>〜1)で重要になる。チャネルの中央領域では、メイン流れ方向に沿って速く移動する流体は、断面方向に沿って外壁に向かって移動する傾向がある。閉じたチャネル内の流体質量を保存するために、上壁と下壁の近くでゆっくり動く流体は、内壁に向かって移動する傾向があり、ディーン二次流れと呼ばれるメイン流れ方向に垂直な2つの対称的な逆回転渦を生成する。
[3つのチャネル設計での流体の流れのシミュレーション]
図2aで定義されている4つの断面A〜Dに沿った速度プロファイルを調査することが特に興味深いため、3つの異なるチャネル設計での流体の流れが最初にシミュレーションした。すべてのシミュレーションは、197.60μL/min(Rec=40)の流速で行われた。図2bは、チャネル断面の1つに沿った代表的なフロープロファイルを示す。左側と右側は、それぞれチャネルの外壁(曲率半径が大きい)と内壁(曲率半径が小さい)である。流体が回転チャネルを流れるとき、流体の慣性は中間チャネルレイノルズ数領域(〜100>Rec>〜1)で重要になる。チャネルの中央領域では、メイン流れ方向に沿って速く移動する流体は、断面方向に沿って外壁に向かって移動する傾向がある。閉じたチャネル内の流体質量を保存するために、上壁と下壁の近くでゆっくり動く流体は、内壁に向かって移動する傾向があり、ディーン二次流れと呼ばれるメイン流れ方向に垂直な2つの対称的な逆回転渦を生成する。
図2cの最初の欄は、単一の波状チャネルユニットの中心に対して幾何学的に対称になるように設計されたチャネルパターン1の4つの断面に沿ったディーン二次流れを示している。流体が断面Aを流れると、断面に沿って比較的弱いディーン二次流れが発生し始める。図2cにおける外壁は常にチャネル断面の左側にある。断面AからBに向かって、流体は上部外側の半円から下部内側の半円に流れ、その間、曲率半径は徐々に減少する。ディーン流れの大きさがRに反比例するので、ディーン二次流れは、断面Aと比較して、断面Bではるかに顕著になる。AからBまで、外壁は同じチャネル側に沿っていることに留意すべきである。断面BからCに向かって、流体は下部内側半円から上部内側半円に流れ、最も急な流れの回転を受ける。2つの断面の曲率半径は同じであるものの、ディーン二次流れは、断面Bと比較して、断面Cでさらに強くなる。これは、AからBへの曲率半径の変化とBからCへの曲率半径の変化が異なるため、BとCでの流れの発達にかなりの違いが生じることを考慮すると、直感的に理解できる。4つの断面における最大ディーン流れ速度を表1に列挙し、定量的に比較すると、BとCの間でディーン流れ強度に〜27%の相対差があることがわかる。特に、この逆波状チャネル設計により、AからBへの外壁は、同じチャネル側に沿ってBからCへの内壁に反転する。これは、断面に沿ったディーン二次流れの方向が、断面BからCに反転することを意味する。断面CからDにかけて、曲率半径は徐々に増加し、内壁は同じチャネル側に沿ったままである。その結果、ディーン二次流れは、上部内側の半円から下部外側の半円に流れるときに弱くなる。要約すると、一つの波状チャネルユニットに沿って、ディーン二次流れの強度は弱かったり強かったりし、内側の半円に最も強いディーン渦があり、当該一つの波状チャネルユニットを離れると再び弱くなる。さらに、ディーン二次流れの方向は、一つの波状チャネルユニットを通じて1回反転する。チャネルパターン1はユニットの中心に対して幾何学的に対称であるが、周期的に反転するディーン二次流れの強度は、特に2つの内側の半円に沿って、ある程度の非対称を示す。
チャネルパターン1とは異なり、パターン2と3は、下部の外側の半円の曲率半径をそれぞれ100μmと200μm増加させることにより、ある程度の幾何学的非対称性を導入している。全体的に、4つの断面A、B、C、Dでのディーン流れは、同様の速度プロファイルを示す。表1は、3つのチャネルパターン設計における異なる断面での最大ディーン流速を定量的に比較している。断面A、B、Cにおける3つの設計の最大速度の相対差は、約5%未満である。前述のように、断面BとCの間の最大ディーン流速の相対差は、パターン1で約27%である。この相対差は、パターン2と3の両方で〜27%のままであることがわかっており、BからCへの一貫した流れの非対称性を示す。導入された幾何学的非対称性は主に下部外側半円の曲率半径を変化させるため、パターン1と2の間、及びパターン1と3の間における、断面Dでの最大速度の相対差はそれぞれ〜23%と〜38%であることがわかった。断面Dでのディーン流れの違いを明確に視覚化するために、図2dの黒い破線枠内に示すように、流速のスケールを拡大した。明らかに、断面Dでのディーン渦の強度は、パターン1からパターン3へと減少する。断面Dのディーン渦は断面Cのディーン渦に比べて約7〜10倍弱いことから、下部外側半円の曲率半径の変化は、一つの波状チャネルユニット内における、ディーン二次流れの微調整と考えることができる。
[3つのチャネル設計におけるサイズに依存する慣性集束]
3つの異なるチャネル設計における異なるサイズのミクロスフェア(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)の慣性集束挙動を調査した。これらのミクロスフェアは蛍光性であるため、非常に高い流速でも粒子の軌跡を明確に視覚化できる。図3a〜3cは、3つのチャネル設計における、さまざまな流速での異なるサイズの粒子の蛍光ストリーク画像を示している。4つの異なる流速49.41μL/min、98.83μL/min、148.25μL/min、及び197.60μL/min(それぞれチャネルレイノルズ数Rec=10、20、30及び40に相当)を選択して、慣性集束挙動を研究した。
3つの異なるチャネル設計における異なるサイズのミクロスフェア(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)の慣性集束挙動を調査した。これらのミクロスフェアは蛍光性であるため、非常に高い流速でも粒子の軌跡を明確に視覚化できる。図3a〜3cは、3つのチャネル設計における、さまざまな流速での異なるサイズの粒子の蛍光ストリーク画像を示している。4つの異なる流速49.41μL/min、98.83μL/min、148.25μL/min、及び197.60μL/min(それぞれチャネルレイノルズ数Rec=10、20、30及び40に相当)を選択して、慣性集束挙動を研究した。
チャネルの上流でのチャネルパターン1(図3a)の慣性集束挙動を詳しく見ると(図3aのI欄に示す最初の波状チャネルユニット)、6種の異なるサイズの蛍光粒子は非常によく似た挙動を示し、明らかな慣性集束効果なしにチャネル断面全体を完全に占有した。慣性集束が定常状態(Rec=40)に達していない中流(図3aのII欄)では、15μmと10μmの粒子がチャネルの中心線に沿って集束する傾向を示した。7μm、5μm、及び3μmの粒子は、チャネルの2つの側壁の近くに2つのストリークを形成する傾向があった。最小の1μmは、慣性集束の傾向を示さなかった。下流(図3aのIII欄からVI欄に示す最後の波状チャネルユニット)でも、異なるサイズの粒子を収集するための三叉出口もあり、これらの粒子は異なるRecで定常状態の慣性集束に達している。15μmのミクロスフェアは、Rec=10でも、チャネルの中心線領域に沿って1つの単一ストリークを形成するように集束された。中央領域付近の慣性揚力はU2とa4に比例するため、15μmのミクロスフェアは他の粒子サイズよりも慣性集束を達成するのが簡単であった(a/H=0.354>0.07)。慣性揚力とディーン抗力の役割を評価するためのもう1つの重要なパラメータは、Rf=0.354である。以下では、さまざまな粒子のすべてのRf値は、内側の半円の外壁に沿った曲率半径を使用して計算した(R=175μm)。Rf=0.354>0.08は、慣性揚力がディーン抗力よりも支配的であることを意味し、その結果、15μm粒子の平衡集束位置は、直線チャネルに沿った慣性集束と同様に、ほぼ中心線に沿ったままで、AR=h/w=0.32であった。Rec=10及び20では、15μmのミクロスフェアは最終的に予想どおり中央の出口に流れ込んだ。一方、Rec=30及び40では、集束された15μmのミクロスフェアが上部出口に流れ込み、その平衡集束位置が上部出口に向かってわずかにシフトしたことを示している。流速が増加するにつれて、ディーン抗力は15μmミクロスフェアの慣性揚力よりも速く増加したと推測される。ディーン抗力は慣性揚力に比べて弱いものの、平衡集束位置が中心線から少し離すようにシフトされる。
10μmのミクロスフェア(a/H=0.165>0.07、Rf=0.157>0.08)も、慣性揚力が集束挙動を支配する単一ストリークに集束した。さらに、比較的弱いディーン抗力でも、その平衡集束位置を上にシフトさせ、10μmのミクロスフェアが上部出口に流れ込んだ。一方、7μmのミクロスフェアの慣性集束挙動は、流速によって変化した。a/H=0.115>0.07は、効果的に集束されることを意味する。Rf=0.077は経験値0.08に非常に近く、7μmのミクロスフェアにおいて慣性揚力がディーン抗力に匹敵するようになったことを示す。Rec=10及び20では、7μmのミクロスフェアが側壁の近くの2つのストリークに集束され、ディーン抗力が慣性揚力よりもわずかに優勢であった。ディーン二次流れは周期的な波状チャネルユニットに沿って周期的に逆転するため、ディーン抗力は粒子を2つの側壁に向かって引き寄せる傾向があった。ディーン抗力と慣性揚力、特に壁誘導揚力のバランスにより、側壁近くに平衡位置が生じた。ただし、Rec=30及び40では、7μmのミクロスフェアが中心線からシフトされた1つのストリークに集中し、慣性揚力がディーン抗力よりもわずかに支配的であることを明らかにしている。7μmは、慣性揚力とディーン抗力が等しく重要になるしきい値サイズであるか、又はそれに非常に近いと推測される。2つの力は、流速がわずかに異なっても変化するため、7μmのミクロスフェアの集束挙動は、単一ストリーク集束(中心線からシフト)と2つのストリーク集束(側壁近く)の間で簡単に切り替えることができる。5μmのミクロスフェアの2つの重要なパラメータは、a/H=0.083>0.07とRf=0.039<0.08である。したがって、5μmのミクロスフェアはディーン抗力に支配され、2つの側壁の近くに2つのストリークが形成された。3μmのミクロスフェアの場合、a/H=0.049<0.07(Rf=0.014<0.08)であるが、側壁近くの2つのストリークに効果的に集束していた。なお、この効果的な慣性集束のための経験的パラメータa/H=0.07は、別チャネル設計から得られたものであり、このしきい値は、異なるチャネル設計の場合、0.07からわずかに逸脱することがある。1μmのミクロスフェアの場合、2つの重要なパラメータはa/H=0.016<0.07及びRf=0.002<0.08であるため、明確な慣性集束を達成できなかった。
図3bと3cは、チャネルパターン2と3での6種の異なるサイズの粒子の慣性集束挙動をそれぞれ示す。全体的に、3つのチャネル設計における慣性粒子集束は非常に似た傾向に従うが、下部外側の半円に導入された幾何学的非対称性により、3つの設計間にわずかな違いが生じた。図3dは、3つのチャネル内の異なる粒子の集束位置と集束ストリークの幅のより明確な比較を示す。15μmのミクロスフェアの場合、Recが10から40に増加すると、パターン1では集束ストリークが64〜80.5μmから73.37〜89.87μmにシフトし;パターン2では63〜79.5μmから69.25〜85.75μmにシフトし、パターン3では63〜78μmから64.5〜79.5μmにシフトした。パターン3は下部外側半円の曲率半径が最大であるため、生成されたディーン二次流れはわずかに弱くなり、これも表1に示されている。したがって、15μmのミクロスフェアは、他の2つのパターンと比較して、パターン3の中心線の近くに好適に集束される。10μmの粒子の場合、Rec=10に完全には集束されなかった。Recが10から40に増加すると、パターン1では集束ストリーク73.3〜99.5μmから83.5〜96.8μmにシフトし;パターン2では63.5〜86.5μmから83.2〜96.5μmにシフトし、パターン3では81.5〜97.8μmから87.5〜97.5μmにシフトした。したがって、パターン3は、10μmの粒子と15μmの粒子の集束ストリークの間の端から端までの距離が最も大きかった(少なくとも8μm)ため、10μmの粒子から15μmの粒子を分離するのに最適な設計であった。図3cは、パターン3が、4つのRec値すべてにおいて、15μmと10μmの粒子がそれぞれ中央の出口と上部の出口に流れ込んだ唯一の設計であることも示している。7μmの粒子の場合、前述のように、パターン1で2つのストリーク集束(Rec=10及び20)から単一のストリーク集束(Rec=30及び40)にシフトした。パターン2及び3ではディーン二次流れが弱まったため、7μm粒子はRec=10及び20ではあまり効果的に集束されなかった。しかし、パターン2と3においてはRec=30及び40では単一ストリーク集束を形成した。3つのパターンにおいて、Rec=30及び40では7μmの粒子の集束ストリークはほぼ同じで、断面に沿って99.8〜107.8μmを占めていた。残りの3種の粒子(5μm、3μm、及び1μm)は、3つのチャネルパターンで非常によく似た挙動をした。Rec>=20の場合、5μmの粒子は2つのストリーク集束を形成し、断面の101.8〜108.8μm(上部ストリーク)と21.2〜29.3μm(下部ストリーク)を占めていた。同様に、Rec>=20の場合、3μmの粒子は2つのストリーク集束を形成し、94.8〜108.8μm(上のストリーク)と22〜30.8μm(下のストリーク)を占めていた。1μmの粒子は、3つのチャネルパターンすべてにおいて効果的に集束できなかった。
[サイズベースの慣性粒子選別]
3つの異なるパターンでサイズが異なる個々の粒子の慣性集束挙動がわかったため、チャネルパターン3は、複数の粒子サイズの粒子混合物の選別を実証するために選択された。高いスループットを達成するために、以下のすべての選別実験で、197.60μL/min(Rec=40)の流速を選択した。図4aは、15μm(緑)、10μm(赤)、及び3μm(青)の蛍光マイクロ粒子を含む粒子混合物の選別の概略実験セットアップを示す。インプット粒子混合物は、アウトプット1、2、及び3によって収集された3つの亜集団に選別された。図4bは、一連の波状チャネルユニットを流れた後の、三叉出口での3種の粒子の差動集束を示す。これらの蛍光ストリークは、15μm(緑)の粒子が主にメインチャネルの中心線に沿って集束し、アウトプット2に収集されることを明確に示している。10μm(赤)の粒子は、メインチャネルの上端近くの狭いストリークに集束され、アウトプット1に収集された。個々の粒子の慣性集束に関する以前の研究では、15μmと10μmの粒子の集束ストリークの間の端から端までの距離は約8〜10μmであった。この粒子分離実験では、15μmと10μmの粒子の集束ストリーク間の距離が約30μmに拡大され、粒子の選別が大幅に促進された。15μmと10μmの粒子間の分離距離の拡大は、比較的高濃度での粒子間相互作用力に起因する可能性がある。大きい15μmの粒子がチャネルの中央領域をすぐに占めると、これらの大きい粒子は小さい粒子をはじく傾向があった。最小の3μm(青)の粒子は、メインチャネルの上端と下端に近い2つの細い縞に集束され、それに応じてアウトプット1と3の両方に収集された。
3つの異なるパターンでサイズが異なる個々の粒子の慣性集束挙動がわかったため、チャネルパターン3は、複数の粒子サイズの粒子混合物の選別を実証するために選択された。高いスループットを達成するために、以下のすべての選別実験で、197.60μL/min(Rec=40)の流速を選択した。図4aは、15μm(緑)、10μm(赤)、及び3μm(青)の蛍光マイクロ粒子を含む粒子混合物の選別の概略実験セットアップを示す。インプット粒子混合物は、アウトプット1、2、及び3によって収集された3つの亜集団に選別された。図4bは、一連の波状チャネルユニットを流れた後の、三叉出口での3種の粒子の差動集束を示す。これらの蛍光ストリークは、15μm(緑)の粒子が主にメインチャネルの中心線に沿って集束し、アウトプット2に収集されることを明確に示している。10μm(赤)の粒子は、メインチャネルの上端近くの狭いストリークに集束され、アウトプット1に収集された。個々の粒子の慣性集束に関する以前の研究では、15μmと10μmの粒子の集束ストリークの間の端から端までの距離は約8〜10μmであった。この粒子分離実験では、15μmと10μmの粒子の集束ストリーク間の距離が約30μmに拡大され、粒子の選別が大幅に促進された。15μmと10μmの粒子間の分離距離の拡大は、比較的高濃度での粒子間相互作用力に起因する可能性がある。大きい15μmの粒子がチャネルの中央領域をすぐに占めると、これらの大きい粒子は小さい粒子をはじく傾向があった。最小の3μm(青)の粒子は、メインチャネルの上端と下端に近い2つの細い縞に集束され、それに応じてアウトプット1と3の両方に収集された。
[サイズベースの慣性細胞選別]
希少細胞選別における潜在的な臨床適応性を証明するため、パターン3の慣性選別装置を使用して、乳がん細胞でスパイクされた希釈全血サンプルの分離をした。全血サンプルを、無細胞PBSバッファーを使用して100倍に希釈し、最終濃度は5000万細胞/mLであった。混合細胞サンプルには、フローサイトメトリー分析の蛍光シグナルによる評価では、〜5%の蛍光染色された乳がん細胞(MCF−7、直径約19〜24μm)が含まれていた。細胞混合物の残りの細胞集団は、主に赤血球(RBC、直径約6〜8μm)、血小板(直径約3μm)及び白血球(WBC、直径約10〜15μm)であった。図5aは、混合細胞サンプルの顕微鏡画像を示す。この図では、個々のMCF−7細胞が他の血液細胞と比較してはるかに大きくなっている。高いスループットを達成するために、197.60μL/min(Rec=40)の流速が実行された。図3の個々の粒子の慣性集束の研究によると、MCF−7細胞はアウトプット2に収集され、大部分のWBC及びRBCはアウトプット1に収集され、血小板はアウトプット1と3の両方に収集されることが予想された(図5bに示すように)。
希少細胞選別における潜在的な臨床適応性を証明するため、パターン3の慣性選別装置を使用して、乳がん細胞でスパイクされた希釈全血サンプルの分離をした。全血サンプルを、無細胞PBSバッファーを使用して100倍に希釈し、最終濃度は5000万細胞/mLであった。混合細胞サンプルには、フローサイトメトリー分析の蛍光シグナルによる評価では、〜5%の蛍光染色された乳がん細胞(MCF−7、直径約19〜24μm)が含まれていた。細胞混合物の残りの細胞集団は、主に赤血球(RBC、直径約6〜8μm)、血小板(直径約3μm)及び白血球(WBC、直径約10〜15μm)であった。図5aは、混合細胞サンプルの顕微鏡画像を示す。この図では、個々のMCF−7細胞が他の血液細胞と比較してはるかに大きくなっている。高いスループットを達成するために、197.60μL/min(Rec=40)の流速が実行された。図3の個々の粒子の慣性集束の研究によると、MCF−7細胞はアウトプット2に収集され、大部分のWBC及びRBCはアウトプット1に収集され、血小板はアウトプット1と3の両方に収集されることが予想された(図5bに示すように)。
三叉出口での異なる細胞集団の予想される収集は、図5cと5dに示す選別実験を通じて確認された。図5cは、三叉出口での2つの主要な集束ストリークを示す。高速の流速での生きているがん細胞の比較的弱い蛍光のために、その集束位置を表すために薄緑色のストリークのみが視覚化できた。高密度の赤血球(比較的少量の白血球と血小板も含む)でも、蛍光標識なしでも薄い赤い線を形成した(サイズが小さく密度が低いため、チャネルの下端近くの血小板の集束ストリークは観察できなかった)。明らかに、一連の波状チャネルユニットを流れた後の完全な慣性集束では、乳がん細胞はメインチャネルの中心線に沿って集中し、RBC、WBC、血小板から大きな分離距離を示した。図5dは、高速カメラでキャプチャされた他の血球からの個々のMCF−7細胞の分離プロセスも示している。この場合、血球の大部分はアウトプット1に流れ込み、より大きなMCF−7細胞(白い矢印で示される)がアウトプット2に流れ込んだ。
元の細胞混合物と3つのアウトプットから収集された選別されたサンプルは、フローサイトメーターを使用して、少なくとも10,000細胞をカウントすることで分析した。図6a〜6dは、元の細胞混合物とアウトプットから収集された3つのサンプルの顕微鏡画像を示す。インプットサンプルは、全血球に対して5.3%のプリセット比率で蛍光染色されたMCF−7細胞を含んでいた。慣性選別の後、図6cの濃い緑色の蛍光スポットで示されるように、ほぼすべてのMCF−7細胞がアウトプット2に収集された。アウトプット1は、ラベル付けされていない血球の大部分を収集し(図6b)、アウトプット3には血球のごく一部のみが収集された(図6d)。選別性能を定量的に評価するために、各アウトプットにおけるMCF−7細胞の回収率(式12)とMCF−7細胞の純度(式13)を定義する。
回収率=各アウトプットにおけるがん細胞数/インプットにおけるがん細胞数 (12)
純度=各アウトプット又はインプットにおけるがん細胞数/各アウトプット又はインプットにおける総細胞数 (13)
回収率=各アウトプットにおけるがん細胞数/インプットにおけるがん細胞数 (12)
純度=各アウトプット又はインプットにおけるがん細胞数/各アウトプット又はインプットにおける総細胞数 (13)
単一の選別プロセスの後、図6fに示すように、元のインプットサンプルから89.72%のMCF−7細胞を回収できた。高細胞濃度での不可避な細胞間相互作用により、アウトプット1と3でそれぞれ3.56%と2.18%の回復率で示されるように、MCF−7細胞のごく一部もアウトプット1と3から収集された。図6gは、単一の選別プロセス後の3つの収集されたアウトプットサンプルのMCF−7細胞の純度を示す。アウトプット2(分離されたMCF−7細胞)の平均純度は68.9%で、元の純度の5.3%から13倍に濃縮された。アウトプット2から収集されたMCF−7細胞の生存力が調査された。図6eは、選別されたMCF−7細胞が増殖できたことを示しており、慣性選別プロセス後の優れた細胞生存力を示している。
上記に加えて液体生検は、外科的生検に代わるその単純で非侵襲的な特性により、臨床診断及び予後検査(この中で循環腫瘍細胞(CTC)とエキソソームは研究者にとって非常に魅力的である)において有望なルーチン試験として浮上していることにも注意すべきである。エキソソームが期待の星になる理由:(I)転移性がんからの包括的な情報:エキソソーム(ほとんどすべての細胞から分泌される小さな膜小胞(30〜200nm)は、タンパク質、マイクロRNA及びDNAとしての重要な情報を含み、実際の液体生検における疾患の診断及び予後検査と密接に関連している。(II)豊富な量:患者の末梢血に存在するまれな量のCTC(1mLあたり10〜100CTC)と比較して、エキソソームは、末梢血だけでなく唾液、尿、滑液などにも現れる高濃度の優位性を持っており、臨床サンプル取得のためのより便利な基盤がある。ただし、従来のエキソソーム単離方法は、通常、超小サイズのエキソソームのため、高純度、高いスループット、低コスト、省力、時間節約のプロセスで結果を達成するのは困難であった。
本発明は、本発明の慣性装置を利用して、ミクロンレベルの粒子径(粒子>2μm)の不均一な細胞サンプルから希少CTCコレクションの選別/分離/操作を達成することを示した(図7(I)に示される)。
さらに、本発明は、大きな小胞からの、サブミクロンの直径(あるいは<2μmの粒子)を有するエキソソーム収集を実現した(図7(II)に示される)。エキソソームを得るために、粘弾性流体を組み合わせた一連の逆波状チャネル構造が、慣性サブミクロン/ナノスケール粒子の集束及び選別について提示された。波状チャネルによって生成された、マイクロ流体の定期的に逆転されるディーン二次流れは、直線チャネルと比較して粒子の集束を促進できる。より大きな細胞外小胞は、弾性揚力によって支配され、チャネルの中心線領域に沿って集束される。より小さなエキソソームが2つのチャネル側壁近くの領域に残るため、エキソソームの分離は成功した。
[さまざまなサブミクロン粒子に対するPEO濃度の影響]
単一の入口を持つ波状チャネル内のさまざまなPEO濃度下での4つのサブミクロン粒子(1μm、500nm、300nm、100nm)の弾性慣性集束挙動を調査した。図8は、PEO濃度が0.08wt%から0.16wt%に増加したとき、三叉出口での粒子集束挙動を示す。1μm粒子は、PEO濃度が0.08wt%と低くても効果的な集束を実現でき、PEO濃度が0.16wt%に増加しても同様の集束挙動を維持できる。500nmの粒子は、PEO濃度が0.08wt%になると集束傾向を示し始め、PEO濃度が増加するにつれてより良好な集束を示す。式11に示されているように、弾性揚力はd3に比例し、これは、1μm粒子に作用する弾性揚力が、同じPEO濃度下で500nm粒子に作用する力の約8倍であることを意味する。前述のように、N1=2ηpλΥ・2のOldroyd−Bモデルでは、PEO溶液の緩和時間λはc0.65とともに増加し(cはPEO濃度を表す)、ηpはcとともに増加し、Υ・は低濃度のPEO溶液で定数とみなすことができ70、つまりcを増加させると、弾性揚力が向上し、中心線領域に向かってさらに粒子が移動することになる71。300nmの粒子は、0.08wt%と0.10wt%のPEO濃度では明確な集束挙動を示さず、PEO濃度が0.14wt%より高くなると徐々に効果的な集束を達成する。100nmの粒子は、PEO濃度が0.08wt%から0.16wt%に増加した場合でも、明確な集束を示さなかった。
単一の入口を持つ波状チャネル内のさまざまなPEO濃度下での4つのサブミクロン粒子(1μm、500nm、300nm、100nm)の弾性慣性集束挙動を調査した。図8は、PEO濃度が0.08wt%から0.16wt%に増加したとき、三叉出口での粒子集束挙動を示す。1μm粒子は、PEO濃度が0.08wt%と低くても効果的な集束を実現でき、PEO濃度が0.16wt%に増加しても同様の集束挙動を維持できる。500nmの粒子は、PEO濃度が0.08wt%になると集束傾向を示し始め、PEO濃度が増加するにつれてより良好な集束を示す。式11に示されているように、弾性揚力はd3に比例し、これは、1μm粒子に作用する弾性揚力が、同じPEO濃度下で500nm粒子に作用する力の約8倍であることを意味する。前述のように、N1=2ηpλΥ・2のOldroyd−Bモデルでは、PEO溶液の緩和時間λはc0.65とともに増加し(cはPEO濃度を表す)、ηpはcとともに増加し、Υ・は低濃度のPEO溶液で定数とみなすことができ70、つまりcを増加させると、弾性揚力が向上し、中心線領域に向かってさらに粒子が移動することになる71。300nmの粒子は、0.08wt%と0.10wt%のPEO濃度では明確な集束挙動を示さず、PEO濃度が0.14wt%より高くなると徐々に効果的な集束を達成する。100nmの粒子は、PEO濃度が0.08wt%から0.16wt%に増加した場合でも、明確な集束を示さなかった。
[サブミクロン粒子のサイズベースの慣性選別]
さまざまな条件下での粘弾性流体内の波状チャネル内のサブミクロン粒子の弾性慣性集束挙動がわかったため、0.16wt%のPEO濃度は、300nmと100nmの粒子混合物のサイズベースの選別を実証するために選択された。基本的に、100nmと300nmの粒子は、それぞれエキソソームとより大きなEVを擬態するために使用された。粒子混合物のサイズベースの選別の概略的な実験セットアップを図7(II)に示す。ここで、粒子サンプルとシースフローの流速はそれぞれ25μL/min(1500μL/hに相当)及び150μL/min(9000μL/hに相当)であった。シースフローの助けにより、粒子の混合物はメインチャネルに入るときに側壁の近くに制限され、300nmの粒子は徐々に中央領域に移動し、一連の逆波状チャネルユニットを通過した後、チャネルの中心線に沿って狭いストリークを形成した。前述のように、横方向の移動、すなわち弾性慣性集束は、弾性揚力によって支配され、ディーン流れによって促進される。図8から観察されるように、100nmの粒子は集束挙動を示さず、これらは主な流体の流れに従うだけであり、シースフローによってチャネル壁の近くに限定されることを意味する。その結果、100nmの粒子が側面の出口から収集され、300nmの粒子が中央の出口から収集されて、300nmの粒子から100nmの分離が達成された。収集された2つのサンプルはNTA測定によって分析された。これに基づいて、図9に示すように、1回の選別プロセスの後、100nmの粒子の収集は、95%を超える純度と87.9%を超える回収率を達成できる。選別実験は、同じ条件で3回個別に繰り返された。
さまざまな条件下での粘弾性流体内の波状チャネル内のサブミクロン粒子の弾性慣性集束挙動がわかったため、0.16wt%のPEO濃度は、300nmと100nmの粒子混合物のサイズベースの選別を実証するために選択された。基本的に、100nmと300nmの粒子は、それぞれエキソソームとより大きなEVを擬態するために使用された。粒子混合物のサイズベースの選別の概略的な実験セットアップを図7(II)に示す。ここで、粒子サンプルとシースフローの流速はそれぞれ25μL/min(1500μL/hに相当)及び150μL/min(9000μL/hに相当)であった。シースフローの助けにより、粒子の混合物はメインチャネルに入るときに側壁の近くに制限され、300nmの粒子は徐々に中央領域に移動し、一連の逆波状チャネルユニットを通過した後、チャネルの中心線に沿って狭いストリークを形成した。前述のように、横方向の移動、すなわち弾性慣性集束は、弾性揚力によって支配され、ディーン流れによって促進される。図8から観察されるように、100nmの粒子は集束挙動を示さず、これらは主な流体の流れに従うだけであり、シースフローによってチャネル壁の近くに限定されることを意味する。その結果、100nmの粒子が側面の出口から収集され、300nmの粒子が中央の出口から収集されて、300nmの粒子から100nmの分離が達成された。収集された2つのサンプルはNTA測定によって分析された。これに基づいて、図9に示すように、1回の選別プロセスの後、100nmの粒子の収集は、95%を超える純度と87.9%を超える回収率を達成できる。選別実験は、同じ条件で3回個別に繰り返された。
[エキソソームのサイズベースの慣性選別]
エキソソーム関連の生物学的研究及び臨床応用のためのこの新しい弾性慣性選別技術の可能性を実証するため、MCF−7培養液中のエキソソームとより大きなEVを分離するためのこの技術の使用が検討された。選別条件は、前節での100nm及び300nm粒子の選別とまったく同じである。300nm粒子の挙動と同様に、より大きなEVは徐々に中央領域に移動し、これらの繰り返し逆波状チャネルユニットを流れた後、チャネルの中心線に沿って集束したままで、最終的に中央の出口から収集された。30〜200nmのサイズの小さいエキソソームは、側壁の近くに残り、2つの側面の出口から収集された。収集された2つのサンプルは、NTA分析によって評価された。図10aは、正規化後のMCF−7培地からのエキソソーム(30〜200nm)とより大きなEV(300〜800nm)の混合分布を示す。エキソソーム濃度は、より大きなEVのほぼ3.5倍であった。図10bと10cは、それぞれ選別手順後のエキソソームとより大きなEVの分布を表しており、前の粒子分離の結果と非常によく一致している。図10dに示すように、最初のエキソソーム濃度が5×108粒子/mLであるところ、1つの単一の選別プロセスで、88%を超える純度と76%を超える回収率を示すエキソソームの高いスループットのサイズベースの選別が成功に実証された。選別実験は、同じ条件で3回個別に繰り返された。
エキソソーム関連の生物学的研究及び臨床応用のためのこの新しい弾性慣性選別技術の可能性を実証するため、MCF−7培養液中のエキソソームとより大きなEVを分離するためのこの技術の使用が検討された。選別条件は、前節での100nm及び300nm粒子の選別とまったく同じである。300nm粒子の挙動と同様に、より大きなEVは徐々に中央領域に移動し、これらの繰り返し逆波状チャネルユニットを流れた後、チャネルの中心線に沿って集束したままで、最終的に中央の出口から収集された。30〜200nmのサイズの小さいエキソソームは、側壁の近くに残り、2つの側面の出口から収集された。収集された2つのサンプルは、NTA分析によって評価された。図10aは、正規化後のMCF−7培地からのエキソソーム(30〜200nm)とより大きなEV(300〜800nm)の混合分布を示す。エキソソーム濃度は、より大きなEVのほぼ3.5倍であった。図10bと10cは、それぞれ選別手順後のエキソソームとより大きなEVの分布を表しており、前の粒子分離の結果と非常によく一致している。図10dに示すように、最初のエキソソーム濃度が5×108粒子/mLであるところ、1つの単一の選別プロセスで、88%を超える純度と76%を超える回収率を示すエキソソームの高いスループットのサイズベースの選別が成功に実証された。選別実験は、同じ条件で3回個別に繰り返された。
結論
以上より、主な流れの方向に垂直に周期的に反転するディーン二次流れを生成する一連の逆波状チャネル構造を備えた新しい慣性集束及び選別装置が提示される。2つの慣性効果、すなわち慣性揚力とディーン二次流れのバランスにより、チャネルをわたるサイズに依存した粒子の集束が生成される。幾何学的非対称度の異なる3つのチャネル設計における6種の粒子サイズ(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)の慣性集束挙動が研究された。15μmと10μmの粒子について、慣性揚力がディーン抗力よりも優勢である場合、それらは単一ストリーク集束を形成することがわかった。ただし、15μmと10μmの粒子では力の支配の程度が異なるため、依然として粒子の集束位置が異なる。粒子サイズが小さくなるにつれて、2つの力は7μmの粒子につき同等になり、異なる流速で単一ストリーク集束から2つのストリーク集束への切り替わりが可能である。5μmと3μmの粒子について、ディーン抗力が慣性揚力よりも支配的になる場合、それらは2つの側壁近くの2つの細いストリークに集束された。チャネルパターン3の装置を使用して、10μm及び3μmの粒子からの15μmの粒子の分離を実証した。効果的な慣性集束の最小粒子サイズは、チャネルパターン3で1μm〜3μmであるため、シースフローを使用しない、希釈全血サンプルからのMCF−7がん細胞の分離も実証された。単一の選別プロセスで、元の混合物からMCF−7細胞の89.72%の回収率を達成でき、MCF−7細胞の純度が5.3%から68.9%に大幅に増加したことがわかった。選別されたMCF−7細胞は優れた生存力を示し、増殖することができた。4種の異なるサイズの蛍光サブミクロン粒子(1μm、500nm、300nm、及び100nm)を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。最適化されたパラメータの組み合わせにより、本発明は、純度が88%を超え、回収率が76%を超える、エキソソームの高いスループット(1分あたり数十マイクロリットル、1時間あたり数千マイクロリットル)、かつラベルフリーのサイズ依存性選別を実証した。これらの繰り返し波状チャネルユニットの線形配列により、マルチチャネルの水平(2D)及び垂直(3D)並列化が容易になり、実用的な生物医学用途での高いスループットでの細胞選別の大きな可能性を提供する。
以上より、主な流れの方向に垂直に周期的に反転するディーン二次流れを生成する一連の逆波状チャネル構造を備えた新しい慣性集束及び選別装置が提示される。2つの慣性効果、すなわち慣性揚力とディーン二次流れのバランスにより、チャネルをわたるサイズに依存した粒子の集束が生成される。幾何学的非対称度の異なる3つのチャネル設計における6種の粒子サイズ(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm及び1μm)の慣性集束挙動が研究された。15μmと10μmの粒子について、慣性揚力がディーン抗力よりも優勢である場合、それらは単一ストリーク集束を形成することがわかった。ただし、15μmと10μmの粒子では力の支配の程度が異なるため、依然として粒子の集束位置が異なる。粒子サイズが小さくなるにつれて、2つの力は7μmの粒子につき同等になり、異なる流速で単一ストリーク集束から2つのストリーク集束への切り替わりが可能である。5μmと3μmの粒子について、ディーン抗力が慣性揚力よりも支配的になる場合、それらは2つの側壁近くの2つの細いストリークに集束された。チャネルパターン3の装置を使用して、10μm及び3μmの粒子からの15μmの粒子の分離を実証した。効果的な慣性集束の最小粒子サイズは、チャネルパターン3で1μm〜3μmであるため、シースフローを使用しない、希釈全血サンプルからのMCF−7がん細胞の分離も実証された。単一の選別プロセスで、元の混合物からMCF−7細胞の89.72%の回収率を達成でき、MCF−7細胞の純度が5.3%から68.9%に大幅に増加したことがわかった。選別されたMCF−7細胞は優れた生存力を示し、増殖することができた。4種の異なるサイズの蛍光サブミクロン粒子(1μm、500nm、300nm、及び100nm)を使用して、さまざまな条件下での粘弾性流体内の集束挙動を研究した。最適化されたパラメータの組み合わせにより、本発明は、純度が88%を超え、回収率が76%を超える、エキソソームの高いスループット(1分あたり数十マイクロリットル、1時間あたり数千マイクロリットル)、かつラベルフリーのサイズ依存性選別を実証した。これらの繰り返し波状チャネルユニットの線形配列により、マルチチャネルの水平(2D)及び垂直(3D)並列化が容易になり、実用的な生物医学用途での高いスループットでの細胞選別の大きな可能性を提供する。
既存の方法に対する主な利点/改良点は、本発明の慣性マイクロ流体装置が、そのサイズに基づいて高いスループット及び高忠実度の細胞選別のための非常に低コストの基盤を提供することである。このシステムでパワー作動を必要とする唯一の要素は、高流速でのサンプル導入用のポンプである。慣性マイクロ流体装置のコストは、複雑なアクチュエータを備えた従来のマイクロ流体装置よりはるかに低いため、これらの慣性装置は、相互コンタミネーションを回避するために、1回限りの使用に提供できる。
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、設計又は構造の詳細に多くの変更又は修正を加えることができることが理解される。
参考文献
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Claims (23)
- 流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置であって、
(a)前記流体懸濁液を導入するための少なくとも1つの入口;
(b)所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも1つの出口;並びに
(c)前記少なくとも1つの入口及び前記少なくとも1つの出口と流体連通し、それらの中間にあるチャネルであって、前記チャネルの一部が湾曲して少なくとも1つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されている、チャネル
を含み、
前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷はそれぞれ半円弧セグメントを形成し、前記流体懸濁液は、前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと前記湾曲ユニットを通って移動する
装置。 - 前記谷の半円弧セグメントの直径が、前記山の半円弧セグメントの直径以上である、請求項1に記載の装置。
- 前記谷の半円弧部分の直径が200μm〜1200μmである、請求項2に記載の装置。
- 前記チャネルが複数の湾曲ユニットを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の装置。
- 前記複数の湾曲ユニットが直線方向に配置される、請求項4に記載の装置。
- 前記複数の湾曲ユニットが10〜40個の湾曲ユニットを含む、請求項4又は5に記載の装置。
- 前記少なくとも1つの出口が、第1、第2及び第3の出口である3つの出口をさらに含む、請求項1〜6のいずれかに記載の装置。
- 前記第1、第2及び第3の出口の幅が異なる、請求項1〜7のいずれかに記載の装置。
- 前記第1、第2及び第3の出口の幅が、それぞれ30〜80μm、40〜55μm及び30〜80μmである、請求項8に記載の装置。
- 前記メインチャネルが長方形の断面輪郭を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の装置。
- 前記メインチャネルが20〜125μmの幅及び5〜40μmの高さを有する、請求項10に記載の装置。
- 前記入口及び前記少なくとも1つの出口のそれぞれがリザーバをさらに含み、前記リザーバの直径が1.5mmである、請求項1〜10のいずれかに記載の装置。
- 前記山の半円弧セグメントの直径が600〜800μmであり、前記面の半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が600μm〜1200μmである、請求項1〜11のいずれかに記載の装置。
- 流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作する方法であって、
(a)前記流体懸濁液を導入するための少なくとも1つの入口を提供すること;
(b)所望のサイズの粒子を含む前記流体懸濁液を排出するための少なくとも1つの出口を提供すること;
(c)前記少なくとも1つの入口及び前記少なくとも1つの出口と流体連通し、それらの中間にあるメインチャネルであって、前記メインチャネルの一部が湾曲して少なくとも1つの湾曲ユニットを形成し、前記湾曲ユニットが、山、谷の上で湾曲するリップ、及び面を有する波の輪郭を形成するように成形されており、前記湾曲ユニットの山、リップ、面及び谷がそれぞれ半円弧セグメントを形成する、メインチャネル;並びに
(d)前記山の半円弧セグメントから前記谷の半円弧セグメントへと、前記湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ること
を含む方法。 - 前記谷の半円弧セグメントの直径が前記山の半円弧セグメントの直径以上である前記湾曲ユニットを通って、前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 直線方向に配置される複数の湾曲ユニットを通って前記流体懸濁液をポンプで送ることをさらに含み、前記複数の湾曲ユニットが、10〜40個の湾曲ユニットを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記流体懸濁液を40μL/分〜200μL/分の流速でポンプで送ることをさらに含む、請求項14〜16のいずれか記載の方法。
- 前記山の半円弧セグメントの直径が600〜800μmであり、前記面の半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記リップの半円弧セグメントの直径が200〜350μmであり、前記谷の半円弧セグメントの直径が600μm〜1200μmである、請求項14〜17のいずれかに記載の方法。
- 第1、第2及び第3の出口である3つの出口で前記流体懸濁液を排出することをさらに含む、請求項14〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の出口で約3μm〜10μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第2の出口で約15μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出し、前記第3の出口で約3μmのサイズを有する粒子を含む前記流体懸濁液を排出することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記流体懸濁液が全血サンプルであり、前記方法は前記サンプルから、がん細胞を分離し、又は前記流体懸濁液サンプルから異なるタイプの血球を分離し、又はサブマイクロン小胞とエキソソームを分離する、請求項14〜20のいずれかに記載の方法。
- 約300nmのサイズを有する粒子を、約100nmのサイズを有する粒子から分離する、請求項14〜21のいずれかに記載の方法。
- 流体懸濁液中の粒子を選別、分離又は操作するための装置又は方法であって、実施例のいずれか又は添付図面のいずれかを参照して本明細書に実質的に記載されている装置又は方法。
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