JP5267923B2 - 細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法 - Google Patents

Description

本発明は、単一の細胞を個別に捕捉、リリースすることが可能な新規な細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法に関する。

再生医療、分子医療、ゲノム創薬を初めとしたライフサイエンス分野や生物学の領域において、細胞集団としてではなく、集団の中から単一の細胞、若しくは数個の細胞をそれぞれ単離し、空間的に分離した状態で観察や分析を行うことは、詳細な分析のために不可欠である。また、単一の細胞の観察や分析は、組織を構成する細胞毎の分化の差異の解明や発現解析を行う上でも重要な技術となる。

このような状況から、組織等から単離された単一の細胞を捕捉するための装置が種々提案されている（例えば、特許文献１〜４等を参照）。

例えば、特許文献１には、層流を生じせしめる程度の微小な並走する主流路を少なくとも２つ配置した細胞捕捉部材、及びこれら主流路の流速を異なる流速とすることで細胞を捕捉する方法が開示されている。すなわち、特許文献１記載の発明では、少なくとも２つの並走する主流路を配置し、また、この主流路間に捕捉する細胞の断面積の最大値より小さい断面積の通過路を設ける。そして、流速の異なる液体を前記２つの主流路に流すことにより、通過路入口部位で負圧若しくは加圧を生じさせ、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉し、あるいは放出するようにしている。

また、特許文献２には、捕捉用プレートが内部に配置された細胞捕捉用容器と、前記捕捉用プレートに形成された複数の捕捉孔から細胞の吸引を行う吸引手段とを備えた細胞捕捉装置が開示されている。特許文献２記載の細胞捕捉装置では、シャーレ底板部２箇所に、一対の貫通孔と、これら貫通孔の下開口部とを連続する吸入流路（溝部）を形成している。そして、溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、一方の貫通孔の上開口部位置には捕捉用プレートを配置し、もう一方の貫通孔の上開口部には吸引ポンプから通じる吸引チューブを接続している。

さらに、特許文献３には、細胞の大きさよりも小さい開口を区画する通路と、通路に接続され、通路内に負圧を発生させる負圧発生手段と、通路に接続され、通路内の負圧を調整する負圧制御手段とを備えた細胞捕捉装置が開示されている。特許文献３記載の細胞捕捉装置では、通路内に負圧が発生すると、負圧に基づき細胞は開口部に捕捉される。また、負圧制御手段により、通路内の負圧を一定に維持することができ、細胞は安定した状態で開口部に捕捉され続ける。特許文献３記載の細胞捕捉装置では、負圧発生のための手段として、真空ポンプが用いられている。

特許文献４に記載される細胞の捕捉機構では、単一の細胞のみを保持する大きさ及び形状のウエルを設けており、細胞は重力によってウエル内部に保持される。また、ウエルに保持された細胞を放出させる手法として、ウエルの下に設置されたチャンバーに泡核生成を引き起こし、チャンバー内側に容積膨張を作り出し、ウエルとチャンバの間のチャネルを通じて、液体の噴出により細胞をウエル外に排出するようにしている。
特開２００８−１３６４７５号公報 特開２００６−２８０２３１号公報 特開２００６−１９７８８０号公報 特開２００３−５１４２３６号公報

前述のように、細胞捕捉装置に関して種々の提案がなされているが、必ずしも十分な性能が得られていないのが実情である。例えば、前述の特許文献３に記載される細胞捕捉装置では、多数の細胞群から単一の細胞をそれぞれ単離することは可能であるが、例えばマイクロインジェクションにより細胞への外的操作を加えることでその効果を調べる手法を採用した場合、外部環境に晒されることによる影響から精密性に欠けるという問題が生ずるおそれがある。また、特許文献２や特許文献３に記載される細胞捕捉装置では、形状や構造として、複数の分析操作を集積化するための機構には適さないという問題もある。さらに、特許文献４に記載される細胞の捕捉機構では、捕捉した細胞を個別に回収することができないという問題がある。

ここで、例えば外部環境の影響を回避するためには、外的な操作を全て流路内部で行い、個々の細胞の操作、分析が可能な構造とする必要がある。このような観点から見た場合、例えば特許文献１には、複数流路の制御により細胞の捕捉を行い、その場に捕捉した状態で培養等を行うこと、圧力を高めて開口部を通過させて破砕、回収する方法が示されており、外部環境の影響を回避することが可能であると考えられる。しかしながら、特許文献１に開示される細胞捕捉装置の流路形状においては、個別に捕捉した細胞をそのまま個別に回収することや、個々の細胞を空間的に分離した状態で分析を行うことが困難であるという問題がある。

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、複数の細胞を個別に捕捉及び回収（リリース）することができ、捕捉した細胞については、外部環境に晒すことなく個々の細胞を空間的に分離した状態で分析等を行うことが可能で、複数の分析操作を集積化することも容易な細胞捕捉装置を提供することを目的とし、さらには細胞捕捉方法を提供することを目的とする。

本発明の細胞捕捉装置は、細胞を含む溶液が導入される主流路と、当該主流路の側壁に複数形成される凹部と、各凹部にそれぞれ対応して形成される回収用流路と、前記凹部と前記回収用流路の間に設置され開閉制御されるマイクロバルブとを備え、前記マイクロバルブ内には前記凹部と前記回収用流路とを接続する微細流路が形成されており、前記微細流路を通して前記溶液が前記回収用流路へと流れ込むことで生じる負圧を利用して前記凹部で前記溶液中の細胞を捕捉することを特徴とする。本発明は、外部空気圧により変形するダイヤフラムが前記マイクロバルブに内蔵されており、前記ダイヤフラムを変形させて前記微細流路を前記ダイヤフラムの変形方向に拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする。

本発明の細胞捕捉方法は、細胞を含む溶液が導入される主流路と、当該主流路の側壁に複数形成される凹部と、各凹部にそれぞれ対応して形成される回収用流路と、前記凹部と前記回収用流路とを接続する微細流路が形成されている細胞捕捉装置を用いて、前記微細流路を通して前記溶液が前記回収用流路へと流れ込むことで生じる負圧を利用して前記凹部で前記溶液中の細胞を捕捉し、前記微細流路を拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする。本発明は、前記細胞捕捉装置に備わっているマイクロバルブ内のダイヤフラムを変形させてその変形方向に前記微細流路を拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする。

本発明の細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法において、個別に分離された細胞を含む溶液を主流路に導入すると、溶液に含まれる細胞は、微細流路の形成によって発生する負圧の作用により凹部に引き寄せられる。各凹部は、例えば細胞１個が納まる大きさに形成されており、１個の細胞が凹部内に捕捉されると、当該細胞が微細流路を塞ぐ形になり、それ以上細胞が捕捉されることはない。このようにして各凹部内に個々の細胞が空間的に分離された状態で捕捉される。また、各凹部に捕捉された細胞は、微細流路を介して回収用流路に流れ込むことはないが、バルブ部を開放することで回収用流路へとリリースされ、個別に回収される。

以上のように、本発明の細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法においては、大量の細胞集団を用いる場合において、個々の細胞を並列的に複数捕捉することができ、バルブ部の開放による一斉同時リリースが可能である。また、回収後の流路（回収用流路）を捕捉された細胞毎に個別に設置しているので、確実に単一の細胞の回収が可能となる。

さらに、リリース以降（回収用流路）に例えば遺伝子の発現解析機構や破砕等の処理機構を接続する等、一連の解析処理を集積化したチップとして作製することで、ハイスループットな分析装置の実現が期待できる。特に、単一細胞レベルの解析を行うことで、発現解析等、初めて得られる物質や知見もあり、本発明は、このような解析を個別の細胞において流路内で並列操作できる技術として有用である。さらにまた、本発明の細胞捕捉装置では、バルブ部（マイクロバルブ）も空圧制御のみの簡易な薄膜構造であり、一連の操作を行うチップを同一材料で実現でき、作製も容易であるという利点も有する。

本発明によれば、複数の細胞を個別に捕捉することができ、また簡単な操作によって捕捉した細胞を回収（リリース）することができる。この時、バルブ部が一斉同時開放可能な構造であるため、大量の細胞を同時に各回収流路内で回収または処理操作を行うことが可能であり、複数の分析操作を集積化することも容易である。また、捕捉あるいは回収された細胞については、外部環境に晒すことなく空間的に分離した状態で分析等を行うことが可能である。

以下、本発明を適用した細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用した細胞捕捉装置の概略構成を示す模式図である。図１に示すように、本実施形態の細胞捕捉装置は、個別に分離された細胞を含む溶液が導入される主流路１、細胞を捕捉する複数の凹部２、回収用流路３、前記凹部２と回収用流路３とを接続する微細流路４、前記微細流路４と並列に設置されるマイクロバルブ（バルブ部）５とから構成されており、前記主流路１、凹部２、回収用流路３、及び微細流路４は、基板表面に平面流路として形成されている。

前記主流路１は、基板上に平面流路として形成されるもので、個々の細胞の大きさに比べて十分幅の広い流路として形成されている。個別に分離された細胞を含む溶液は、例えば図中上方から主流路１に導入され、下方に向かって流される。

前記凹部２は、主流路１の一方の側壁１ａに沿って配列される形で形成されており、本例では３箇所形成されている。凹部２の数は３箇所に限られるものではなく、側壁１ａにより多くの凹部２を形成することも可能である。また、本実施形態の細胞捕捉装置では、凹部２は主流路１の一方の側壁１ａにのみ形成されているが、主流路１の両方の側壁に形成されていてもよい。

前記凹部２の大きさは、概ね単一の細胞１個が納まる大きさとされ、例えば凹部２の深さは単一の細胞１個の大きさとほぼ等しくすることが好ましい。凹部２の大きさが大きすぎたり深さが深すぎると、複数の細胞が凹部２内に滞留するおそれがある。凹部２の深さを単一の細胞１個の大きさとほぼ等しく設定しておけば、仮に同じ凹部２内に２個目の細胞が入り込もうとしても、その大部分が主流路１内の溶液の流れに晒されることになり、この流れにのって凹部２から離脱する。逆に、凹部２の深さが浅すぎると、捕捉するべき細胞も主流路１内の溶液の流れに晒され、捕捉状態が不安定になるおそれがあるので、ある程度の深さが必要である。

前記回収用流路３は、各凹部２に対応して設けられており、本実施形態の場合、３箇所に設けられている。当然のことながら、凹部２の数が増えれば回収用流路３の数も増やす必要があり、各凹部２に捕捉された細胞を個別に回収（リリース）するための流路となる。したがって、この回収用流路３は、個々の細胞が通過し得る流路幅が必要である。

前記微細流路４は、前記凹部２と回収用流路３間の隔壁に凹部２と回収用流路３を接続する形で形成されており、主流路１内の溶液を一部回収用流路３へと流し、回収用流路３側から負圧を発生させる役割を果たす。この微細流路４は常に開放されているため、個々の細胞が通過できない十分に細い流路である必要がある。微細流路４が広すぎると、凹部２内の細胞が微細流路４を通過して回収用流路３へと流れてしまい、凹部２内に捕捉することができなくなる。なお、例えば微細流路４の幅が個々の細胞の寸法よりも若干小さくても、細胞が変形して微細流路４を通過してしまう可能性があるので、このような可能性のない十分に細い流路とする必要がある。

以上のような構成により各凹部２に単一の細胞を捕捉することが可能であるが、本実施形態の細胞捕捉装置では、捕捉した細胞を回収（リリース）するための機構を有している。具体的には、各凹部２に対応して、前記微細流路４と並列にマイクロバルブ５が設けられている。マイクロバルブ５は外部空気圧により開閉が制御され、マイクロバルブ５を開放することで、凹部２に捕捉された細胞がマイクロバルブ５を通過して回収用流路３へとリリースされる。

前記マイクロバルブ５は、例えばダイヤフラム（膜）を外部空気圧により変形させることで開閉操作が行われるダイヤフラム方式のマイクロバルブであり、その構造例を図２に示す。マイクロバルブ５は、図２（ａ）に示すように、第１の基板（前記主流路１等が形成された基板）Ｌ１上に、ダイヤフラム１１と、空間１２を有する第２の基板Ｌ２を重ねて配置することにより構成され、極めて簡易な構成を有する。前記空間１２には、当該空間１２内の圧力（空気圧）を制御するための給排気路１３が接続されている。なお、図２（ａ）においては、前記給排気路１３が第２の基板Ｌ２の厚み方向に示されているが、実際には、図１に示すように基板面に沿って設けられている。

前記マイクロバルブ５においては、空間１２内の空気圧が高い時は、図２（ａ）に示すように、前記ダイヤフラム１１が凹部２と回収用流路３を仕切る隔壁６に密着しており、凹部２と回収用流路３間は遮断された状態となる。この状態では、微細流路４を通じて凹部２と回収用流路３の溶液の流れは繋がっているが、捕捉された細胞は微細流路４を通して回収用流路３に移行することはできず、マクロバルブ５を通して回収用流路３に移行することもできない。

一方、マイクロバルブ５において、給排気路１３を通じて空間１２内の空気圧を減圧すると、図２（ｂ）に示すように、ダイヤフラム１１が空間１２内に引き込まれる形で変形し、隔壁６から離間する。これにより、凹部２と回収用流路３の間にこれらを繋ぐ流路が形成される形になる。この流路の寸法が細胞の寸法に比べて大きければ、凹部２内に捕捉された細胞は、回収用流路３に速やかにリリースされる。

以上が本実施形態の細胞捕捉装置の構成であるが、次に、この細胞捕捉装置を用いた細胞捕捉方法について説明する。

細胞の捕捉に際しては、例えば組織等から採取された細胞塊を単一細胞に分離する処理を施し、当該処理によって分離された細胞（単一の細胞）を含む細胞溶液を用意し、図３（ａ）に示すように、各マイクロバルブ５を閉じた状態（図中、マイクロバルブ５に×印が付与されている場合は、マイクロバルブ５が閉じている状態を示す。）で細胞捕捉装置の主流路１に流し込む。主流路１に流し込まれた細胞溶液には分離された細胞Ｃが含まれており、この細胞Ｃが溶液の流れにのって図中上方から下方へと移動する。

この時、各凹部２には微細流路４が接続されており、この微細流路４を通して溶液が回収用流路３へと流れ込むことから、回収用流路３側から負圧が発生し、溶液中の細胞Ｃを凹部２内へと引き寄せる。例えば、最も上流側の凹部２Ａにおいて細胞Ｃが凹部２Ａ内へと引き寄せられる。引き寄せられた細胞Ｃは、微細流路４を介して加わる負圧によって吸着され、凹部２Ａ内に捕捉された状態となる。捕捉された細胞Ｃは、微細流路４を通して回収用流路３へと移動することはなく、またマイクロバルブ５も閉じられているので、マイクロバルブ５を通して回収用流路３に移動することもない。

上流の凹部２Ａに１つの細胞Ｃが捕捉されると、当該凹部２Ａに接続される微細流路４が細胞Ｃによって塞がれ、それ以上細胞Ｃを引き寄せる力は働かない。また、凹部２Ａの大きさは、細胞１個が納まる大きさとされているので、２つ目の細胞Ｃが凹部２Ａ内に入り込むことはできず、仮に入り込もうとしても、凹部２Ａから突出してその大部分が溶液の流れに晒されることになるので、速やかに下流へと流される。

下流へと流された細胞Ｃは、次の凹部（ここでは上から２番目の凹部２Ｂ）内に引き寄せられ、凹部２Ｂ内に捕捉される。さらに、上から３番目の凹部２Ｃに細胞Ｃが捕捉されるというように、次々に凹部２内に細胞Ｃが捕捉される。図３（ｂ）は各凹部２（ここでは凹部２Ａ〜２Ｃ）への細胞Ｃの捕捉状態を示すものであり、各凹部２にはそれぞれ１個の単一細胞Ｃが捕捉される。

各凹部２Ａ〜２Ｃに捕捉された細胞Ｃは、マイクロバルブ５を開放することで、一斉同時リリースが可能である。すなわち、前述のようにして各凹部２Ａ〜２Ｃ内に細胞Ｃを捕捉した後、給排気路１３を介して各マイクロバルブ５の空間１２内を減圧し、ダイヤフラム１１を変形されて開状態とする。これにより、各凹部２Ａ〜２Ｃ内の細胞Ｃは、図３（ｃ）に示すように、各回収用流路３へとリリースされる。回収用流路３は各細胞毎（凹部２毎）に設置されているので、確実に単一細胞の回収が可能になる。また、前記回収用流路３の下流側に遺伝子発現の解析機構や細胞を破砕する処理機構等を設置しておけば、一連の解析処理を集積化することができ、例えばこれをチップ化することで、ハイスループットな分析装置を実現することが可能である。

以上のように、本発明の細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法によれば、様々なメリットを享受することができる。具体的には、平面流路（主流路１）内に負圧を発生させることによる多量のサンプルからの効率的な捕捉、細胞捕捉部（凹部２）の並列化による同時処理、細胞捕捉部のバルブ化による細胞の捕捉及びリリースの実現、空圧制御のダイヤフラムバルブ（マイクロバルブ５）による操作の簡易化及び迅速化、平面流路構成による細胞観察の容易化、微小流路内で連続的に処理するための他機構との接続性、バルブ化による作製の容易化等である。

特に、本発明の細胞捕捉装置では、微細流路４とマイクロバルブ５の組み合わせにより細胞の捕捉、リリースを行うようにしているので、マイクロバルブ５の構造や操作も極めて簡便なものとすることができる。マイクロバルブ５は開閉のみができれば良いからである。例えばマイクロバルブ５のみで細胞の捕捉、リリースを行うことも可能であるが、この場合には、捕捉のための部分開放と、リリースのためのフル開放とが必要になり、マイクロバルブ５の構造や操作が煩雑なものとなる。また、微細流路４のみでは個々の細胞を個別に回収することはできない。

本発明を適用した細胞捕捉装置の一例を模式的に示す概略平面図である。 マイクロバルブの構成例を示す図であり、（ａ）は閉状態の概略断面図、（ｂ）は開状態の概略断面図である。 本発明の細胞捕捉装置による細胞の捕捉及びリリースの様子を模式的に示す図であり、（ａ）は細胞を捕捉する様子を示す概略平面図、（ｂ）は細胞の捕捉状態を示す概略平面図、（ｃ）は細胞のリリース状態を示す概略平面図である。

符号の説明

１ 主流路、２ 凹部、３ 回収用流路、４ 微細流路、５ マイクロバルブ、６ 隔壁、１１ ダイヤフラム、１２ 空間、１３ 給排気路

Claims (4)

1. 細胞を含む溶液が導入される主流路と、当該主流路の側壁に複数形成される凹部と、各凹部にそれぞれ対応して形成される回収用流路と、前記凹部と前記回収用流路の間に設置され開閉制御されるマイクロバルブとを備え、前記マイクロバルブ内には前記凹部と前記回収用流路とを接続する微細流路が形成されており、前記微細流路を通して前記溶液が前記回収用流路へと流れ込むことで生じる負圧を利用して前記凹部で前記溶液中の細胞を捕捉することを特徴とする細胞捕捉装置。
2. 外部空気圧により変形するダイヤフラムが前記マイクロバルブに内蔵されており、前記ダイヤフラムを変形させて前記微細流路を前記ダイヤフラムの変形方向に拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする請求項１記載の細胞捕捉装置。
3. 細胞を含む溶液が導入される主流路と、当該主流路の側壁に複数形成される凹部と、各凹部にそれぞれ対応して形成される回収用流路と、前記凹部と前記回収用流路とを接続する微細流路が形成されている細胞捕捉装置を用いて、前記微細流路を通して前記溶液が前記回収用流路へと流れ込むことで生じる負圧を利用して前記凹部で前記溶液中の細胞を捕捉し、前記微細流路を拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする細胞捕捉方法。
4. 前記細胞捕捉装置に備わっているマイクロバルブ内のダイヤフラムを変形させてその変形方向に前記微細流路を拡大させることで前記細胞を前記回収用流路へリリースすることを特徴とする請求項３記載の細胞捕捉方法。

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