JPWO2011027832A1 - 有核赤血球濃縮回収用チップ及び有核赤血球濃縮回収方法 - Google Patents
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Abstract
Description
任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
[2]
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
[3]
前記分離用狭流路の内壁は、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である[2]に記載のマイクロ流路チップ。
[4]
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である
前記マイクロ流路チップ。
[5]
複数の分離用狭流路は、スペーサーで隔てられており、スペーサーの出口側流路に面する面は、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、及び/又はスペーサーの入口側流路に面する面は、入口側流路側に凸型形状の曲面である1〜3のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[6]
分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段が、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた圧力調整可能室から構成される[1]〜[3]、[5]のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[7]
入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、
チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有する[6]に記載のマイクロ流路チップ。
[8]
各流路の内壁は、細胞付着防止コーティングや、非特異的吸着防止コーティングで表面処理されている[1]〜[7]のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[9]
[2]〜[3]、[5]〜[8]のいずれかに記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
[10]
[4]に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
[11]
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、percollを用いた密度勾配遠心分離で1.070g/ml〜1.095g/mlの密度の画分を回収したものである[9]または[10]に記載の方法。
[12]
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものである[11]に記載の方法。
[13]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、圧力調整可能室を分離用狭流路に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形することを防止する[9]、[11]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする、[9]、[11]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて、液の導入時、または洗浄時、気泡の除去時に、液が容易に分離用狭流路を通過できる寸法にする、[9]、[11]〜[14]のいずれかに記載の方法。
本発明は、任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下、粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下、粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップである。このマイクロ流路チップは、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する。
高さh > φA×dfA×k1
高さh < φB×dfB×k1
ここで、k1は、任意の係数であるが、dfAおよびdfBは全く変形しないものである場合を1とすれば、k=1とすることができる。粒子径φAおよびφBは、公知の方法で適宜決定できる。また、dfAおよびdfBは、主にチップにおけるサンプル液の流速や分離用狭流路入口の寸法により決まるものであり、分離用狭流路入口において粒状物にかかる応力を考慮して決定できる。具体的には、実際のサンプルをチップの試作品に適用し、分離用狭流路入口における粒状物の変形の度合いを顕微鏡などで観察することで、dfAおよびdfBを求めることができる。
幅w > φA×(1/dfA)×k2
この式では、k2は最低1であり、好ましくは例えば、2〜30とすることができる。k2は30を超える値であってもよい。
図1に基づいて本発明の有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップ1について説明する。図1の右側には、流路形成層A、中間膜Bおよび空気室形成層Cからなる3層構造を有するチップ1の分解説明図、左上側に流路形成層Aの上下面をひっくり返した図、左下側に流路形成層Aの分離用狭流路30付近の拡大図を示す。
本発明のチップを作製するためには様々な技術を利用することができ、利用される技術は一部には最適な材料に基づいて選択される。本発明のチップを作製するための代表的材料には、ガラス、シリコン、スチール、ニッケル、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、シリコン類(例、ポリジメチルシロキサン)、およびそれらの組み合わせが含まれる。その他の材料は、当技術分野において知られている。これらの材料で流路を作製する方法は当技術分野において知られている。これらの方法には、フォトリソグラフィー(例、立体リソグラフィーまたはX線フォトリソグラフィー)、モールディング法、エンボス加工法、シリコン微細加工法、湿式もしくは乾式化学エッチング法、ミリング法、ダイアモンド切削法、リソグラフィーによる電気めっきおよび成形法(LIGA)および電気めっき法が含まれる。例えば、ガラスについては、後に湿式(KOH)または乾式エッチング(フッ素またはその他の反応ガスを用いた反応性イオンエッチング)を実施する伝統的なフォトリソグラフィーによるシリコン作製法を利用できる。レーザー微細加工法などの技術は、高度の光子吸収効率を備えるプラスチック材料のために採用できる。この技術は、この工程が連続的種類であるため、低スループット作製のために適合する。大量生産されるプラスチック製チップには、熱可塑性射出成形法、および圧縮成形法が適合する。本発明のチップを作製するためには、(サブミクロンで機能の忠実度を保存する)コンパクトディスクの大量生産に使用される従来的な熱可塑性射出成形法もまた利用されてよい。例えば、チップの機能は従来型のフォトリソグラフィーによってガラスマスター上で複製される。ガラスマスターを電気鋳造すると、頑丈で耐熱衝撃性、熱伝導性かつ硬質の型が作り出される。この型は、機能をプラスチック製チップに成形する射出成形法または圧縮成形法のためのマスターテンプレートとして機能する。チップを作製するために使用されるプラスチック材料並びに光学的品質および最終製品のスループットに関する要件に依存して、製造方法として圧縮成形法または射出成形法を選択できる。圧縮成形法(ホットエンボス加工法またはリリーフインプリンティング法とも呼ばれる)には、小型構造にとって卓越しているが高縦横比構造を複製する際に使用するのは困難でサイクル時間が長い高分子量ポリマーと適合する利点がある。射出成形法は、高縦横比構造とも良好に作用するが、低分子量ポリマーにとって最も適合する。
本発明は、有核赤血球濃縮液の調製方法も包含する。この有核赤血球濃縮液の調製方法は、上記本発明のマイクロ流路チップを用いる方法である。具体的には、
(1)チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで
(2)流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収すること
を含む方法である。
実施例1
チップの作製
PDMS (polydimethylsiloxane) 樹脂によるチップを完成させるまでの一連の工程は、流路パターンの設計、光リソグラフィー用のマスクの作製、流路鋳型の作製、鋳型を使ったPDMS流路層の作製、各層の貼り合わせに大別できる。
流路パターンは、PC上でIllustrater (Adobe社) を用いて作図した。
流路パターンを透明なOHPフィルムに印刷する。このフィルムを透明なガラス板に張り付け、光リソグラフィーのためのマスクを完成させた。
流路鋳型の材料には、光硬化性レジストSU-8 (米国 MICRO CHEM社) を用いた。 6インチの片面鏡面研磨シリコンウェハー(CZ-N, 信越化学工業株式会社、厚み625μm 結晶面<100>) を基板として使用した。 基板表面を超純水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、Acetone (EL grade, 関東化学株式会社) で洗浄し、窒素ガスで再び乾燥させた。スピンコーター (1H-DX2、ミカサ株式会社) に、洗浄後の基板を固定し、SU-8を鏡面側に適量を滴下した後、スピンコートした。 次にSU-8を塗布した基板をホットプレート(DATAPLATE, アズワン株式会社)上に置き、65℃で1分間、95℃で1分間加熱した後、ホットプレートの電源を切り、基板温度が室温程度に下がるまで放置した (プリベイク)。 次にコンタクト露光型マスクアライナー (Suss MJB3 UV400、米国 Karl Suss社) に前述した流路パターンを有するガラスマスクをセットし、波長365nm(i線)の紫外線を、基板のSU-8塗布側に照射した。UV露光後の基板をホットプレート上に置き、65℃で1分間、95℃で1分間加熱した後、ホットプレートの電源を切り、基板温度が室温程度に下がるまで放置した (ポストベイク) 。次に基板を、現像液(SU-8 Developer、MICRO CHEM社) に1分30秒浸し、マスクによってUV露光されていないSU-8部位を除去した後、窒素ガスで基板を乾燥させ、SU-8による流路鋳型を完成させた。
シリコーン系樹脂であるPDMS (polydimethylsiloxane) の材料として、SYLGARD 184 silicone elastomer Kit (Dow corning Toray社) を使用した。 PDMS主剤と架橋剤とを重量比10:1の割合で混合し、混合時に取り込まれた空気を除去するためにベルジャー内にPDMSを静置し、完全に脱泡されるまでロータリー真空ポンプで減圧した。周囲にPDMSが流れ出さないようにシリコーンゴムで作製した枠を取り付けたSU-8流路鋳型に、脱泡したPDMSを流し込んだ。 次に、これをオーブン (DKN 301, ヤマト科学株式会社) に入れ、65℃で5時間静置することでPDMSを硬化させた。硬化したPDMS流路を流路鋳型から丁寧に剥がし、アセトンで洗浄したベルト用の穴空けを使ってPDMS流路の必要な部位に穴をあけ、溶液導入用のリザーバーあるいは空圧制御用のチューブを取り付ける穴を作製した。
PDMSに付着した埃等の不純物を取り除くため、超純水で洗浄し窒素ガスで乾燥させた。表面を洗浄したB層とC層を、反応性イオンエッチング装置(Reactive Ion Etching-10NR、サムコ株式会社) により、100sccm、100W、8.8Paで10秒間、酸素プラズマ処理した。 このプラズマ処理によって親水性に改質された表面に触れぬよう注意しながら、B層とC層をピンセットで操作し、これらを貼り合わせ、PDMSチップを完成させた。
実施例1で作製したチップを用いて、以下の方法により母体血から有核赤血球の濃縮および回収を行った。
<血液導入方法>
採血した時の血液量では、チップで有核赤血球を濃縮するまでに時間を要する。このため、血液量を減らす工程が必要となる。そこで、密度勾配遠心分離を行い有核赤血球を濃縮し、血液量を少なくした。
母体血(6.0mL〜7.0mL)は、ピペットを用いて分取し、半分づつ遠沈管へ移す。 母体血の採血量は、個人差のある血液の粘性などに影響され若干変化するが6.0mL以上は、確実に採取されている。半分に分けた母体血は、0.9%(g/mL)NaCl水溶液を用いて2倍希釈する。別の遠沈管に、密度の異なるPercoll(1.075 g/mL、1.085 g/mL)を用いて密度勾配を作製する。この結果を図5の、母体血を入れた試験管の写真(左図)、母体血を生理食塩水で二倍希釈した際の写真(中図)、および1.075 g/mLと1.085 g/mLのPercoll溶液を重層した際の写真(右図)として示す。
2.1 チップの原理
実施例1で作製したチップを用いての有核赤血球の回収は、分離用狭流路である流路の間隙部に有核赤血球を留めかつ無核赤血球等は通過させ(図9左図)、その後、中間膜を動作させる(図9右図)ことで行う。間隙部の高さは、微小間隙部の最適化で行い1.0μmにした。血液が流路通過時に淀みを生じることがあり、これに対する解消案は、微小間隙部の最適化で述べた。
2.1で血液量を少なくした母体血(30μL〜60μL)を4倍希釈しチップへ導入する。導入する速度は、10μL/minで行う。中間膜動作前にリザーバー部まで通過した血液は、マイクロピペッターを用いて逐次回収した。図10(左図)に用いたPDMSチップの外観を示す。右図は、血球試料溶液を送液し、間隙部に留まる血球を顕微鏡で観察した際の画像である。
間隙部入口に留まった血球をリリースし、リザーバー部から回収した。回収した溶液をギムザ染色して標本を作製し、顕微鏡で有核赤血球を確認した写真を図12に示す。矢印は、有核赤血球を示す。
次に実施例2のチップを用いて、白血球と赤血球の除去率を求めた。まず、母体血1mL中のもとの白血球数と赤血球数をFACSで計測する。また同じ母体血1mLを微小間隙1.0 μmのチップに通し、回収した通過液中の 白血球数と赤血球数をFACSで計測する。 間隙通過後の液中の血球数を、もとの母体血中の血球数で割って100を掛けたものを通過率(%)とし、100−通過率を捕捉率とし、これを赤血球と白血球についてもとめる。そのほかの条件は実施例2と同じである。
10 入口側流路
11 入口側流路に連絡する入口
20 出口側流路
21 出口側流路に連絡する出口
30 分離用狭流路
31 スペーサー
40 可撓性膜(中間膜B)
50 空気室
51 空気室に連絡する口
Claims (15)
- 任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。 - 有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。 - 前記分離用狭流路の内壁は、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である請求項2に記載のマイクロ流路チップ。
- 有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である
前記マイクロ流路チップ。 - 複数の分離用狭流路は、スペーサーで隔てられており、スペーサーの出口側流路に面する面は、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、及び/又はスペーサーの入口側流路に面する面は、入口側流路側に凸型形状の曲面である請求項1〜3のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
- 分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段が、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた圧力調整可能室から構成される請求項1〜3、5のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
- 入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、
チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有する請求項6に記載のマイクロ流路チップ。 - 各流路の内壁は、細胞付着防止コーティングや、非特異的吸着防止コーティングで表面処理されている請求項1〜7のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
- 請求項2〜3、5〜8のいずれか1項に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
- 請求項4に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
- 無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、percollを用いた密度勾配遠心分離で1.070g/ml〜1.095g/mlの密度の画分を回収したものである請求項9または10に記載の方法。
- 無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものである請求項11に記載の方法。
- 請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、圧力調整可能室を分離用狭流路に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形することを防止する請求項9、11〜12のいずれかに記載の方法。 - 請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする、請求項9、11〜13のいずれかに記載の方法。 - 請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて、液の導入時、または洗浄時、気泡の除去時に、液が容易に分離用狭流路を通過できる寸法にする、請求項9、11〜14のいずれかに記載の方法。
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