JP6500119B2 - 細胞解析装置およびそれを用いた細胞解析方法 - Google Patents
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Description
前記二次元アレイチップの核酸捕捉部に隣接して設けられた溶液保持部をさらに備え、前記溶液保持部は、毛細管現象により核酸捕捉部に滞留した溶液を吸収し、かつ負圧を印加することにより吸収した溶液を外部に排出可能な三次元多孔質体を有し、
前記溶液保持部は流路と隣接し、流路の一端に負圧を印加することにより、前記溶液保持部、核酸捕捉部および細胞捕捉部に負圧を印加可能に構成されている、前記デバイス。
(2)前記流路がデバイス外部に開放された吸気ポートと連通しており、流路の一端に負圧を印加することにより吸気ポートから外気が取り込まれ、その気流が前記溶液保持部を通過することにより溶液保持部から溶液が排出される、(1)に記載のデバイス。
(3)複数の二次元アレイチップおよび個々の二次元アレイチップに対応する溶液保持部を備え、前記流路が複数の溶液保持部を直列的に接続している、(2)に記載のデバイス。
(4)複数の二次元アレイチップおよび個々の二次元アレイチップに対応する溶液保持部を備え、前記流路が複数の溶液保持部を並列的に接続しており、前記吸気ポートが個々の溶液保持部ごとに複数設けられている、(2)に記載のデバイス。
(5)前記三次元多孔質体の表面に1μLの純水を滴下した際の液滴の吸収時間が10秒以内である、(1)〜(4)のいずれかに記載のデバイス。
(6)前記三次元多孔質体が、多孔質ガラス材、ガラス繊維集合体、またはガラスビーズ集合体である、(1)〜(4)のいずれかに記載のデバイス。
(7)前記核酸捕捉部が核酸を捕捉するための核酸プローブを有し、核酸プローブは細胞から抽出された核酸とハイブリダイズする核酸捕捉配列と、各細胞捕捉部に対応して異なる細胞認識配列とを有する、(1)〜(4)のいずれかに記載のデバイス。
(8)前記核酸捕捉部が、核酸プローブが固定されたビーズが充填された構造を有する、(7)に記載のデバイス。
(9)(1)または(2)に記載のデバイスを用いた単一細胞解析方法であって、前記二次元アレイチップの上を細胞溶液で満たす工程、および前記溶液保持部が隣接する流路の一端に負圧を印加することにより前記細胞捕捉部に負圧を印加し、前記細胞溶液を溶液保持部に吸収させるとともに、前記細胞捕捉部に単一の細胞を吸着させる工程を含む、前記方法。
(10)前記細胞捕捉部に吸着させた単一の細胞を、細胞捕捉部に負圧を印加した状態で破砕し、前記細胞から抽出された核酸を前記核酸捕捉部に捕捉させる工程をさらに含む、(9)に記載の解析方法。
(11)前記核酸捕捉部に捕捉された核酸とハイブリダイズする配列を有する第二の核酸プローブ、ならびに捕捉された核酸を鋳型とする相補鎖合成のための酵素および基質を核酸捕捉部に供給して相補鎖合成を行う工程をさらに含む、(10)に記載の解析方法。
図3は、本実施例で製造したデバイスの構成の概要を示す図であり、(a)は上面図、(b)は3A-3A'断面における断面図を示す。デバイス301は複数の反応室302を備えており、その反応室302のそれぞれには、複数の細胞捕捉部203と、その個々の細胞捕捉部203に対応する核酸捕捉部202を備えた二次元アレイチップ315が配置されている。細胞溶液は、上部インレット307から上部アウトレット308に向かって共通流路305の中を流すことにより二次元アレイチップ315上に供給し、チップ上を細胞溶液で満たす。個別インレット311は、チップことに個別に試薬を導入する場合、具体的にはチップを識別するためのタグ配列を有するプライマーを含む試薬を導入する際に用いる。
図5〜7は、図3に示される実施例1-1で製造した本発明のデバイスを用いた単一細胞解析法の詳細を示すフロー図である。本実施例では、(1)細胞捕捉、(2)細胞リシス(破砕)、(3)逆転写(cDNA合成)、(4)RNA分解、(5)2nd strand合成、(6)PCR増幅をデバイス中で実行する。(4)までをデバイス中で実行して、その後二次元アレイチップを個別の反応チューブに入れて、(5)および(6)の反応を行ってもよい。ここでは、(1)〜(6)までの反応をデバイス中で行う場合を説明する。
図2に示した本発明によるデバイスと、図1に示したような三次元多孔質体による毛細管現象を利用しない従来技術によるデバイスにおける溶液の吸引速度を比較した。いずれも、下部アウトレットにはシリンジポンプを接続し、同じ圧力で初期の負圧を印加した。本発明によるデバイスでは、三次元多孔質体として1.3×1.3×0.7mmの大きさの3μmポアのSPG膜を二次元アレイチップごとに一枚用いた。吸引速度の比較結果を図4に示す。両者には、約一桁オーダーの吸引力の差が生じることがわかった。
図9は、本発明の別態様に係るデバイスの構成の概要を示す図であり、(a)は上面図、(b)は9A-9A'断面における断面図を、(c)は(b)に対して垂直方向の断面図を示す。本実施例のデバイスでは、液体保持部211が吸収した水溶液を排出させる方法が実施例1とは異なる。以下、実施例1のデバイスとの相違点について説明する。
図11は、本発明の別態様に係るデバイスの構成の概要を示す図であり、(a)は上面図、(b)は11A-11A'断面における断面図を、(c)は(b)に対して垂直方向の断面図を示す。本実施例のデバイスでは、下部流路1109の構成が異なる。すなわち、溶液保持部211が吸収した水溶液を排出させるための負圧の印加を、図9のように二次元アレイチップ315に対して平行方向に行うのではなく、二次元アレイチップ315に対して垂直方向に行えるよう下部流路1109を構成している。このような流路構成をとることによって、空気の流れが溶液保持部211を迂回することがなく、より効率的に溶液保持部211に吸収された溶液を排出させることができる。なお、この構成において、溶液保持部211と下部流路1109の隣接部分に、さらに親水性多孔質膜を配置してもよい。そのようにすることで、溶液保持部211から下部流路1109への溶液の排出がよりスムーズに進むようになる。
実施例1〜3では、細胞溶液や反応試薬を上部インレット307から導入し、上部アウトレット308から吸引することによって、溶液を二次元アレイチップ上に溶液を満たし、次いで下部アウトレット310に負圧を印加することによって、細胞の捕捉や、核酸捕捉部への試薬の導入および排出を行う構成としたが、本実施例では細胞溶液や試薬を個別に導入ウェル1330に分注することによって導入する構成とした。デバイスの構造を図13に示す。このような流路構成にすることによって、上部インレットから二次元アレイチップまでの途中で細胞が吸着するなどの問題が発生する可能性が排除できる。
Claims (11)
- 細胞を1個ずつ捕捉可能な複数の細胞捕捉部と、各細胞捕捉部に対応して存在し、細胞捕捉部に捕捉された細胞から抽出された核酸を捕捉する核酸捕捉部を有する二次元アレイチップを備えた単一細胞解析用デバイスであって、
前記二次元アレイチップの核酸捕捉部に隣接して設けられた溶液保持部をさらに備え、前記溶液保持部は、毛細管現象により核酸捕捉部に滞留した溶液を吸収し、かつ負圧を印加することにより吸収した溶液を外部に排出可能な三次元多孔質体を有し、
前記三次元多孔質体の細孔の孔径は、前記核酸捕捉部が有する細孔の孔径よりも大きく、
前記溶液保持部は流路と隣接し、流路の一端に負圧を印加することにより、前記溶液保持部、核酸捕捉部および細胞捕捉部に負圧を印加可能に構成されている、前記デバイス。 - 前記流路がデバイス外部に開放された吸気ポートと連通しており、流路の一端に負圧を印加することにより吸気ポートから外気が取り込まれ、その気流が前記溶液保持部を通過することにより溶液保持部から溶液が排出される、請求項1に記載のデバイス。
- 複数の二次元アレイチップおよび個々の二次元アレイチップに対応する溶液保持部を備え、前記流路が複数の溶液保持部を直列的に接続している、請求項2に記載のデバイス。
- 複数の二次元アレイチップおよび個々の二次元アレイチップに対応する溶液保持部を備え、前記流路が複数の溶液保持部を並列的に接続しており、前記吸気ポートが個々の溶液保持部ごとに複数設けられている、請求項2に記載のデバイス。
- 前記三次元多孔質体の表面に1μLの純水を滴下した際の液滴の吸収時間が10秒以内である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記三次元多孔質体が、多孔質ガラス材、ガラス繊維集合体、またはガラスビーズ集合体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記核酸捕捉部が核酸を捕捉するための核酸プローブを有し、核酸プローブは細胞から抽出された核酸とハイブリダイズする核酸捕捉配列と、各細胞捕捉部に対応して異なる細胞認識配列とを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記核酸捕捉部が、核酸プローブが固定されたビーズが充填された構造を有する、請求項7に記載のデバイス。
- 請求項1または2に記載のデバイスを用いた単一細胞解析方法であって、前記二次元アレイチップの上を細胞溶液で満たす工程、および前記溶液保持部が隣接する流路の一端に負圧を印加することにより前記細胞捕捉部に負圧を印加し、前記細胞溶液を溶液保持部に吸収させるとともに、前記細胞捕捉部に単一の細胞を吸着させる工程を含む、前記方法。
- 前記細胞捕捉部に吸着させた単一の細胞を、細胞捕捉部に負圧を印加した状態で破砕し、前記細胞から抽出された核酸を前記核酸捕捉部に捕捉させる工程をさらに含む、請求項9に記載の解析方法。
- 前記核酸捕捉部に捕捉された核酸とハイブリダイズする配列を有する第二の核酸プローブ、ならびに捕捉された核酸を鋳型とする相補鎖合成のための酵素および基質を核酸捕捉部に供給して相補鎖合成を行う工程をさらに含む、請求項10に記載の解析方法。
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