JP4504501B2 - 粒子移動／固定装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞等のような粒子を媒質中にて移動または固定させるための細胞移動／固定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、粒子状の微小な対象物を操作するマイクロマニピュレーション技術の一種として、マイクロインジェクションという技術が知られている。
【０００３】
マイクロインジェクションとは、例えばガラス管を加工してなるマイクロピペットと呼ばれる注射針を用い、細胞内にＤＮＡ、ＲＮＡ、オルガネラ、各種蛋白質、各種薬液等を注入する手法のことを指す。このような技術は、特定遺伝子などを細胞内に選択的に導入しうる有効な手法として近年特に注目を浴びている。かかる手法は、類似の手法であるレーザーインジェクション等に比べて導入効率が高くてしかも安価といった利点を有している。
【０００４】
上記技術においては、媒質中に浮遊している細胞に対してマイクロピペットを突き刺した状態で細胞内に液体を注入するため、突き刺し時には細胞を何らかの手段により固定しておく必要がある。また、細胞における特定の部位に遺伝子等を導入したい場合には、ピペットを突き刺しやすい所定の方向に当該部位を向けた状態で細胞を固定する必要がある。そして、従来では突き刺し用のマイクロピペットとは別の固定用ピペットを用い、その先端に細胞を吸い付けることにより、細胞の固定を図っていた。
【０００５】
しかし、細胞を吸い付けて固定するという従来方法は、面倒で時間がかかるため、生産性の向上を期待することが難しかった。そこで、これに代わるものとして、本発明者らは図６に示すような細胞移動／固定装置６１を備えるユニットを想到した。同図において細胞移動／固定装置６１は、媒質６２を満たすための容器を兼ねる取り付け用ホルダ６３内にて支持されている。装置６１を構成する基材であるガラス板６４の中央部には、細胞６５を１つ１つ収容するための細胞チャンバ６６が設けられている。この図において、粒子収容部である細胞チャンバ６６は、ガラス板６４の表面側に形成された略椀状の凹部になっている。ガラス板６４の表面側かつ細胞チャンバ６６の近傍には、スパッタリング等によって複数の表面電極６７ａが設けられている。ガラス板６４の裏面側かつ細胞チャンバ６６の近傍には、同じくスパッタリング等によって複数の裏面電極６７ｂが設けられている。これらの電極６７ａ，６７ｂは配線パターン６８を介してパッド６９に接続され、さらに各パッド６９には図示しない給電用のリード線が接続されている。また、同装置６１はホルダ６３とともに顕微鏡のステージ７１上に固定される。ステージ７１の下方には対物レンズ７２が配置されていて、ステージ７１の上方にはマイクロピペット７３が配置されている。
【０００６】
従って、各リード線を介して各電極６７ａ，６７ｂへ高周波電圧を印加すると、細胞チャンバ６６内に電界が発生し、その電界が細胞６５に対して好適な誘電泳動力をもたらす。よって、細胞６５を細胞チャンバ６６内にて移動させて位置修正した後、その細胞６５を固定させることが可能である。ゆえに、オペレータは装置６１の下方側から細胞６５の観察を行いながら、マイクロピペット７３を操作してその先端を細胞６５に突き刺すことができるようになっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、図６の装置６１の構成では、表面電極６７ａ−細胞６５間の距離や、裏面電極６７ｂ−細胞６５間の距離が長くなってしまうため、細胞６５を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができない。また、表面電極６７ａ−裏面電極６７ｂ間には、媒質６２である水に比べて比誘電率の小さなガラス板６４が介在している。このことも、十分な誘電泳動力を得ることができない原因の１つとなっている。
【０００８】
さらに、前記装置６１は細胞チャンバ６６への細胞６５の搬入・搬出を行うための構造を何ら備えていないため、オペレータはそのような作業をマイクロピペット７３を用いて慎重に行う必要があり、極めて面倒である。
【０００９】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、粒子を移動・固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる粒子移動／固定装置を提供することにある。
【００１０】
本発明の第２の目的は、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、請求項１に記載の発明では、媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記基材の表面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた表面電極と、前記基材の裏面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた裏面電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記電極の先端が、前記粒子収容部の中央部方向に張り出した状態で配置されていることを特徴とする粒子移動／固定装置をその要旨とする。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、請求項１において、前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記表面電極は前記ガラス板の表面側かつ前記貫通部の近傍に接合された導電性金属板であるとした。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２において、前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記裏面電極は電極形成用の補助ガラス板の表面側に形成されたものであり、前記補助ガラス板は前記ガラス板の裏面側に貼り付けられているとした。
【００１４】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか１項において、前記基材に搬送路を設けかつその搬送路の経路上に前記粒子収容部を配置するとともに、前記搬送路内に電界を発生させる搬送用電極を設けた。
【００１５】
以下、本発明の「作用」について説明する。
請求項１に記載の発明によると、粒子収容部の中央部方向に張り出している電極の先端と、粒子収容部内の媒質中にて浮遊する粒子との距離が短くなる。これに加えて、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に介在している基材の厚さも確実に小さくなる。従って、電極への通電によって媒質中に電界を発生させた場合、粒子を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる。
【００１６】
請求項２に記載の発明によると、ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部を粒子収容部とした結果、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に基材が介在しなくなる。よって、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、導電性金属板からなる表面電極は、ある程度の強度を備えているため、その先端を粒子収容部の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、比較的簡単に製造可能な装置とすることができる。
【００１７】
請求項３に記載の発明によると、ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部を粒子収容部とした結果、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に基材が介在しなくなる。よって、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、裏面電極が形成された補助ガラス板を貼り付ける構造にしたことにより、裏面電極の先端を粒子収容部の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、比較的簡単に製造可能な装置とすることができる。
【００１８】
請求項４に記載の発明によると、搬送用電極への通電によって搬送路内に電界を発生させることにより、その搬送路に沿って粒子を移動させることができる。従って、粒子収容部への粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の粒子移動／固定装置を具体化した一実施形態のセルマニピュレーションシステム１を図１〜図５に基づき詳細に説明する。
【００２０】
このセルマニピュレーションシステム１は、細胞移動／固定装置２、取り付け用ホルダ３、下部観察手段としての対物レンズ４、顕微鏡のステージ５、マイクロピペット６、マニピュレータ(図示略)、光源(図示略)等を含んで構成されている。また、細胞移動／固定装置２及び取り付け用ホルダ３によって、１つの細胞移動／固定ユニットＵＮ１が構成されている。
【００２１】
図１に示されるように、ステージ５の中央部には透孔１１が設けられている。この透孔１１の下方には対物レンズ４が上向き状態で配設されている。対物レンズ４は、図示しない操作手段を操作することにより垂直方向に移動することができる。光源は透孔１１の上方に離間して配置されている。マイクロピペット６は、ステージ５の上側に配置されている。マイクロピペット６は、加熱溶融したガラス管を細く引き延ばすことによって製造される。マイクロピペット６の先端部は、直径数十μｍ〜数百μｍ程度の植物細胞１２を突き刺すことができるように尖った形状に形成されている。なお、マイクロピペット６はマニピュレータを操作することにより三次元的に駆動される。マニピュレータの駆動方式としては、例えば油圧式、エア式、機械式などがある。マイクロピペット６の基端部は、図示しないシリンジ等の加圧器に接続されている。加圧器からは例えばＤＮＡを含む溶液等が圧送されてくる。
【００２２】
図１に示されるように、取り付け用ホルダ３は、透孔１１のある顕微鏡ステージ５の上面中央部に対し、図示しないボルト等の締結により取り付けられている。ホルダ３は円形状をした有底状の部材であって、その底部中央には透孔が形成されている。ホルダ３の底部上面は、細胞移動／固定装置２の外周部下面側を支持している。その結果、ホルダ３内において装置２が水平に挟持された状態で載置されるようになっている。
【００２３】
本実施形態の細胞移動／固定装置２は、２枚の基材を貼り合わせることによって構成された、いわゆる多層構造になっている。顕微鏡観察の都合上、透光性を有する基材が選択されることがよく、それを考慮してここではガラス製の基材が選択されている。なお、各種ガラスのなかでも、透明度の高いほう珪酸ガラスを選択することが特に好ましい。上側基材であるガラス板２１の裏面側には、下側基材である補助ガラス板２２が図示しない接着剤を介して貼り付けられている。前記接着剤としては、例えばＵＶ硬化型の接着剤などが使用される。
【００２４】
図１〜図３に示されるように、ガラス板２１の厚さは１００μm〜２００μm程度であって、その平面形状は正方形になっている。正方形の一辺の大きさは２０mm〜３０mm程度に設定されている。ガラス板２１は、培養液にて浮遊する植物細胞１２を収容する粒子収容部としての細胞チャンバ１６を備えている。本実施形態の細胞チャンバ１６は、具体的にはガラス板２１を厚さ方向に貫通する貫通孔である。図２に示す細胞チャンバ１６は非円形状かつ等断面積であって、ガラス板２１の中心部に位置している。かかる細胞チャンバ１６には、粒子である植物細胞１２が１つ１つ収容される。細胞チャンバ１６は、１つのガラス板２１について複数個設けられていてもよい。
【００２５】
図２に示されるように、ガラス板２１は搬送路としての搬送溝２３を備えている。本実施形態の搬送溝２３は、具体的にはガラス板２１を厚さ方向に貫通する貫通溝である。図２の搬送溝２３はガラス板２１の中心部を通過しつつ一直線状に延びており、その途上には細胞チャンバ１６が配置されている。図２における搬送溝２３の右端部は、搬送溝２３内に培養液１３を供給するための入口部２４になっている。同じくその左端部は、搬送溝２３から培養液１３を排出するための出口部２５になっている。本実施形態の場合、細胞チャンバ１６は入口部２４及び出口部２５のちょうど中間点に位置している。搬送溝２３の幅は、細胞チャンバ１６から入口部２４または出口部２５に向かうほど広くなっていることが好ましい。その理由は、入口部２４または出口部２５が広くなる結果、搬送溝２３へ植物細胞１２を供給等する作業が容易になるからである。
【００２６】
細胞チャンバ１６及び搬送溝２３は、レーザー加工により形成されることが望ましい。その理由は、レーザー加工であれば、例えばエッチング加工等に比べて、簡単にかつ正確に微細な孔・溝を形成することができるからである。勿論、レーザー加工に代えて、例えばざぐり加工、ドリル加工、研削加工、エッチング加工等を行ってもよい。
【００２７】
ガラス板２１の表面側かつ細胞チャンバ１６の近傍には、粒子駆動用の表面電極３１が複数（ここでは４つ）接合されている。本実施形態では、銅、アルミニウム等のような導電性の金属からなる板材が、前記表面電極３１として用いられている。これらの導電性金属板は、少なくとも１つの角部がある形状、例えば多角形状であることがよい。本実施形態では、正方形状の導電性金属板（５mm角）を用いている。
【００２８】
図２に示されるように、各表面電極３１の先端（即ち１つの表面電極３１につき４つある角部のうちの１つ）は、細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している表面電極３１の先端の下方領域には、厚いガラス板２１が存在しておらず、比較的大きな空間ができている（図１参照）。なお、先端の張り出し量は、０．１mm〜１mm程度に設定されている。
【００２９】
各々の表面電極３１は、水との接触による電気分解を防止するために、絶縁層（例えば透明な絶縁樹脂材料からなる層）Ｒによって全体的に被覆されている。ただし、表面電極３１においてガラス板２１の外周部に位置する角部の表面については、前記絶縁層Ｒから外部に露出されている。そして、これらのリード取り出し部分に対しては、導電性接着剤３２を用いてリード線３３がそれぞれ接合されている。絶縁性の向上のため、前記導電性接着剤３２はさらに樹脂層３４によって全体的に被覆されている。本実施形態の場合、ガラス板２１の上面側に接合された４本のリード線３３は、上部開口を介してホルダ３の外部に引き出される。引き出されたリード線３３は、数１０ｋＨｚ〜数ＭＨｚの高周波交流電圧を発生する装置（図示略）に対して電気的に接続される。
【００３０】
図２に示されるように、ガラス板２１の裏面側に貼り付けられている補助ガラス板２２の表面中央部には、粒子駆動用の裏面電極４１が複数（ここでは４つ）形成されている。本実施形態における各裏面電極４１は、いずれも細長い長方形状になっている。各裏面電極４１の先端（内側端）は、細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している裏面電極４１の先端の上方領域には、厚いガラス板２１が存在しておらず、比較的大きな空間ができている。なお、先端の張り出し量は、表面電極３１のそれと同じく０．１mm〜１mm程度に設定されている。
【００３１】
補助ガラス板２２の外周部における４箇所には、矩形状の接続用パッド４２が形成されている。これらの接続用パッド４２は、いずれもガラス板２１よりも外側に配置されている。各々の接続用パッド４２と、それに対応する裏面電極４１とは、線状パターン４３を介して電気的に接続されている。これらの線状パターン４３は、長さの異なる４つの直線部分４３ａからなり、各直線部分４３ａは互いに９０°の角度をもってつながっている。前記線状パターン４３は、裏面電極４１の基端（外側端）を始点として図２の反時計回りに進みながら３回直角に屈曲した後、終点である接続用パッド４２に接続している、と把握することもできる。 ４本ある線状パターン４３のそれぞれの直線部分４３ａは、等間隔を隔てながら互いに平行な位置関係を保つように配置されている。それぞれの線状パターン４３は、搬送溝２３を２箇所横切るように配設されている。より具体的には、各線状パターン４３は、入口部２４−細胞チャンバ１６間で１回搬送溝２３を横切り、細胞チャンバ１６−出口部２５間でもう１回搬送溝２３を横切っている。
【００３２】
また、この細胞移動／固定装置２は、植物細胞１２のような粒子を誘電泳動力によって搬送するための搬送システムを備えている。即ち、本実施形態の装置２では前記搬送溝２３に加えて、その搬送溝２３内に電界を発生させるための搬送用電極Ｅ１が設けられている。この装置２では、上述した線状パターン４３が、実質的には搬送用電極Ｅ１の役割を果たしている。別の言い方をすると、裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ導電領域が、搬送用電極Ｅ１として機能するようになっている。
【００３３】
搬送用電極Ｅ１は複数（ここでは裏面電極４１と同数の４つ）であって、それらは搬送溝２３の延びる方向に対して所定の角度を持った状態（望ましくは図２，図３のように前記方向に対して直交する状態）で配設されることがよい。
【００３４】
ここで、裏面電極４１、接続用パッド４２及び搬送用電極Ｅ１（線状パターン４３）の形成手順を簡単に述べる。
まず、電極形成用の補助ガラス板２２を用意する。本実施形態では、直径４０mmかつ厚さ１００μm〜２００μm程度の円形状補助ガラス板２２が用いられている。この補助ガラス板２２の面積は前記ガラス板２１のそれよりも大きい。このような補助ガラス板２２の表面側に、従来公知の真空蒸着法によって、クロム層及び金層をその順で形成する。その結果、厚さ数μm程度であって２層構造の裏面電極４１、接続用パッド４２及び搬送用電極Ｅ１が得られる。
【００３５】
次いで、補助ガラス板２２の表面側の全体に透明な絶縁膜４４を形成する。このような絶縁膜４４を形成する理由は、裏面電極４１を培養液１３から隔てておくことにより、電圧印加時における水の電気分解を未然に防ぐためである。なお、絶縁膜４４の厚さは数μm程度に設定されることがよい。このような薄い絶縁膜４４は、例えばＳＯＧをスピンコートすること等により形成可能である。なお、絶縁膜４４が厚くなりすぎると、電極３１，４１間の距離の短縮にとってマイナスになるおそれがある。絶縁膜４４において各接続用パッド４２に対応する箇所には、リード引き出し用の開口部４５が設けられる。後工程において、開口部４５から露出する接続用パッド４２には、上述した導電性接着剤３２を用いてリード線３３がそれぞれ接合される。絶縁性の向上のため、前記導電性接着剤３２はさらに樹脂層３４によって全体的に被覆される。
【００３６】
次に、裏面電極４１を覆う絶縁膜４４が形成された補助ガラス板２２を、上記接着剤を用いてガラス板２１の裏面側に貼り付ける。以上の結果、実質上、ガラス板２１の裏面側かつ細胞チャンバ１６の近傍に裏面電極４１が設けられた状態となる。
【００３７】
接続用パッド４２に接合された４本のリード線３３は、上部開口を介してホルダ３の外部に引き出される。引き出されたリード線３３は、数１０ｋＨｚ〜数ＭＨｚの高周波交流電圧を発生する装置に対して電気的に接続される。
【００３８】
ここで、電極の位置関係を説明する便宜上、表面電極３１にU１，Ｕ２，Ｕ３，Ｕ４を付し、裏面電極４１にＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４を付す（図２，図３参照）。これによると、電極U１−Ｄ１、Ｕ２−Ｄ２、Ｕ３−Ｄ３、Ｕ４−Ｄ４がそれぞれ対応する上下位置関係にあることがわかる。
【００３９】
図４（ａ）〜（ｃ）には、これら８つの電極３１，４１（Ｕ１〜Ｕ４，Ｄ１〜Ｄ４）に対する通電の仕方を説明するための表が示されている。
搬送溝２３の長手方向に延びる軸線を中心として、図２の矢印Ａ１の方向に植物細胞１２を回転させたい場合には、Ｕ１＋Ｕ２→Ｕ３＋Ｕ４→Ｄ３＋Ｄ４→Ｄ１＋Ｄ２というように、特定の２つの電極３１（４１）に対してプラス電圧を印加することを行えばよい。このとき、前記特定の２つの電極３１（４１）以外の電極についてはＧＮＤ（グランド）に接続しておく。通電をＤ１＋Ｄ２→ Ｄ３＋Ｄ４→ Ｕ３＋Ｕ４→ Ｕ１＋Ｕ２という順序で行えば、植物細胞１２を前記軸線を中心として逆方向に回転させることができる。
【００４０】
装置２の厚さ方向に平行な直線を中心として植物細胞１２を右回転させたい場合には、Ｕ１→Ｕ２→Ｕ３→Ｕ４というように、特定の１つの電極３１のみに対してプラス電圧を印加することを、右回りで順に行なえばよい。このとき、前記特定の１つの電極３１以外の電極についてはＧＮＤに接続しておく。これをＵ４→Ｕ３→Ｕ２→Ｕ１というように反対回りで順に行なえば、植物細胞１２を前記直線を中心として左回転させることができる。
【００４１】
植物細胞１２を上昇させたい場合には、Ｕ１及びＵ２にプラスの電圧を印加し、かつＵ３及びＵ４にマイナスの電圧を印加し、それ以外のものについてはＧＮＤに接続しておけばよい。植物細胞１２を下降させたい場合には、Ｕ１〜Ｕ４にプラスの電圧を印加し、Ｄ１〜Ｄ４ついてはＧＮＤに接続しておけばよい。また、植物細胞１２を動かさずに固定したい場合には、 Ｕ１〜Ｕ４，Ｄ１〜Ｄ４に対して印加する電圧値を固定すればよい。即ち、各電極３１，４１に対して同じ電圧を印加すればよい。
【００４２】
以上のような動作制御が可能なのは、リード線３３を介して電極３１，４１へ高周波電圧を印加すると、細胞チャンバ１６内に電界が発生し、その電界が植物細胞１２に対して好適な誘電泳動力をもたらすからである。この場合、粒子状対象物である植物細胞１２の誘電率は、一般的に媒質である培養液１３の誘電率と異なるため、電界が働くことで植物細胞１２が静電分極を起こす。その結果、細胞チャンバ１６内にて好適な誘電泳動力が発生し、静電分極した植物細胞１２が電界の強いほうへと引き寄せられるからである。
【００４３】
次に、図５に基づいて本実施形態における搬送システムについて説明する。
説明の便宜上、装置２において最も外周側に位置する搬送用電極を「Ｅ１１」、Ｅ１１のすぐ内側に位置するものを「Ｅ１２」、さらにＥ１２のすぐ内側に位置するものを「Ｅ１３」、最も内側に位置するものを「Ｅ１４」とする。
【００４４】
図５（ａ）では、植物細胞１２が搬送用電極Ｅ１１上に位置しており、このときまだ各電極Ｅ１１〜Ｅ１４には電圧は印加されていない。従って、搬送溝２３内には何ら電界が発生していない。
【００４５】
この状態で電極Ｅ１２にプラス電圧を印加するとともに、電極Ｅ１１をＧＮＤに接続する。すると、発生する電界のもたらす誘電泳動力の作用によって、植物細胞１２が電極Ｅ１２上へと移動する（図５(b)参照）。次いで、電極Ｅ１３にプラス電圧を印加するとともに、電極Ｅ１２をＧＮＤに接続する。すると、同じく誘電泳動力の作用によって、植物細胞１２が電極Ｅ１３上へと移動する（図５（c）参照）。そして、以上のような電圧印加を順次行えば、植物細胞１２を搬送溝２３に沿って移動させ、最終的に植物細胞１２を細胞チャンバ１６内に到らせることができる。
【００４６】
次に、このように構成されたシステム１の具体的な使用方法の一例を述べておく。
顕微鏡ステージ５上にホルダ３をセットし、かつそのホルダ３の底部上面に細胞移動／固定装置２を固定しておく。この状態で搬送溝２３及び細胞チャンバ１６内を滅菌した培養液１３で満たしておく。その結果、搬送溝２３及び細胞チャンバ１６内がともに培養液１３のある環境となり、乾燥に弱い植物細胞１２の死滅が未然に回避される。なお、植物細胞１２は、プロトプラストや花粉等のような単細胞であってもよいほか、胚珠などの特定器官やカルス等のような細胞群（即ち多細胞）であってもよい。
【００４７】
オペレータは図示しない培養液供給装置を駆動して、培養液１３に流れを生じさせ、搬入溝２３の入口部２４に植物細胞１２を導入する。そして、搬送用電極Ｅ１に上記のごとく電圧を印加することにより、搬送システムを駆動する。その結果、植物細胞１２を搬送溝２３に沿って動かし、細胞チャンバ１６内に移送させる。次いで、オペレータは顕微鏡観察を行いながら電極３１，４１に高周波電圧を印加し、植物細胞１２の位置修正を行なう。この場合、特定遺伝子を導入したい部位が例えば胚であれば、胚の部分をマイクロピペット６の先端部に向けるように調整する。
【００４８】
次いでオペレータは、顕微鏡を観察しながらマイクロピペット６を駆動操作して、その先端部をターゲットである植物細胞１２に向けてゆっくりと前進させる。マイクロピペット６の先端部が植物細胞１２の胚に突き刺さったことを顕微鏡により確認した後、オペレータはシリンジの頭部を静かに押圧し、外部にＤＮＡの入った液体を押し出すようにする。すると、マイクロピペット６を経由してその先端部から当該液体が吐出される。従って、植物細胞１２の胚にＤＮＡを注入することができる。上記のような導入処理が終了した後、オペレータはマイクロピペット６を後退させて、その先端部を植物細胞１２から抜き去る必要がある。以上の結果、特定遺伝子を植物細胞１２内に選択的にかつ効率よく導入することができる。この後、遺伝子導入がなされた植物細胞１２は、搬送システムの駆動によって再び搬送溝２３を移動し、出口部２５に移送される。そして、前記培養液供給装置を駆動させ、植物細胞１２を装置２の外部に排出する。
【００４９】
従って、本実施形態によれば以下のような効果を得ることができる。
（１）この装置２では、各々の表面電極３１の角部の先端が細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。また、各々の裏面電極４１の角部の先端も、同様に細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している電極３１，４１の先端と、細胞チャンバ１６内の培養液１３中にて浮遊する植物細胞１２との距離が、従来構造に比較して確実に短くなる。これに加えて、表面電極３１の先端と裏面電極４１の先端との間に介在しているガラスの厚さも確実に小さくなる。従って、電極３１，４１への通電によって培養液１３中に電界を発生させた場合、植物細胞１２を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる。
【００５０】
（２）この装置２では、ガラス板２１を厚さ方向に貫通する細胞チャンバ１６を、粒子収容部としてガラス板２１に設けている。その結果、表面電極３１の先端と裏面電極４１の先端との間に、水に比べて比誘電率の小さなガラスが殆ど介在しない状態となる。なお、表面電極３１−裏面電極４１間には絶縁膜４４が一応存在しているものの、ガラス板２１に比べて極めて薄く、無視してよい程度のものである。よって、実施形態の構成によれば、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、導電性金属板からなる表面電極３１は、少なくとも自重に耐えうる程度の強度を備えている。このため、その先端を細胞チャンバ１６の中央部方向に容易に張り出させることができ、その際においても変形して垂れ下がるようなことは起こりにくい。即ち、本実施形態の装置２は、比較的簡単に製造することが可能な構造となっている。
【００５１】
（３）この装置２では、裏面電極４１、接続用パッド４２、搬送用電極Ｅ１が形成された補助ガラス板２２をガラス板２１に貼り付けた構造になっている。裏面電極４１の先端を細胞チャンバ１６の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、本実施形態の装置２は、比較的簡単に製造することが可能な構造となっている。
【００５２】
また、補助ガラス板２２に裏面電極４１等をあらかじめ形成しておくことができるので、あえて導電性金属板等の材料を用いなくてもよく、通常の薄膜形成法にて薄い裏面電極４１等を簡単に形成することができる。
【００５３】
（４）この装置２では、経路上に細胞チャンバ１６を有する搬送溝２３が設けられるとともに、搬送溝２３内に電界を発生させる搬送用電極Ｅ１が設けられている。従って、搬送用電極Ｅ１への通電によって好適な誘電泳動力が発生し、その力により搬送溝２３に沿って植物細胞１２を移動させることができる。従って、細胞チャンバ１６への植物細胞１２の搬入作業や、細胞チャンバ１６からの植物細胞１２の搬出作業を容易に行うことができる。
【００５４】
（５）本実施形態の搬送溝２３は一方向に延びており、全体的にみて屈曲していない。これに加え、各搬送用電極Ｅ１は搬送溝２３の延びる方向に対して直交している。従って、植物細胞１２の移動時に、植物細胞１２が搬送溝２３の側壁に衝突したり摺接したりする可能性が小さい。ゆえに、植物細胞１２の損傷が最小限に押えられ、収率も確実に向上するという利点がある。
【００５５】
さらに、本装置２では、裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ線状パターン４３が搬送用電極Ｅ１として機能するようになっている。このため、裏面電極４１へ通電を行うための接続用パッド４２やリード線３３を、搬送用電極Ｅ１へ通電を行うためのものとして兼用することができる。従って、省スペース化及び構造の簡素化が達成される。
【００５６】
なお、本発明の実施形態は以下のように変更してもよい。
・ 裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ線状パターン４３を搬送用電極Ｅ１として兼用するのではなく、それとは別個に搬送用電極Ｅ１を設ける構成にしてもよい。
【００５７】
・ 粒子収容部１６や搬送路２３は、必ずしもガラス板２１の表裏を貫通していなくてもよい。ただし、実施形態のような貫通構造のほうが、レーザーによる加工形成が簡単であるほか、誘電率の観点からみても好適なものとなる。
【００５８】
・ 補助ガラス板２２の表面側に対して裏面電極４１等を形成する方法として、実施形態にて例示した真空蒸着のみならず、例えばスパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、めっき、印刷等を採用してもよい。
・ ガラス板２１及び補助ガラス板２２の形成材料として、ほう珪酸ガラス以外のもの、例えばシリカガラス等を用いてもよい。なお、ガラスに限定されることはなく、ジルコニア等に代表されるような透明のセラミック材料を基材の形成材料として選択してもよい。
【００５９】
・ 電極３１，４１の数、形状、レイアウト等は、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて任意に変更可能である。
・ 搬送用電極Ｅ１や搬送溝２３は特に必要がなければ省略されてもよい。
【００６０】
・ 実施形態にて示した植物用の培養液１３を媒質として用いるのみならず、養分を殆ど含まない単なる蒸留水等を媒質として用いても構わない。勿論、媒質は粒子の種類に応じて適宜変更することが可能である。
【００６１】
・ 本発明のシステム１は、実施形態において述べたような植物細胞１２へのＤＮＡそのものの導入のみに使用されるに止まらず、様々な用途に用いられることができる。例えば、粒子状対象物を動物の卵細胞とした場合には、顕微受精技術の１つである卵子細胞質への精子のインジェクション（卵細胞質精子注入法）等に利用することができる。勿論、本発明のシステム１は、細胞１２等のような生物を対象物とした操作のみならず、非生物を対象物とした操作にも利用されることができる。
【００６２】
次に、特許請求の範囲に記載された技術的思想のほかに、前述した実施形態によって把握される技術的思想をその効果とともに以下に列挙する。
（１）媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記粒子収容部の近傍に設けられた電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記基材は、前記粒子を誘電泳動力によって搬送する搬送システムを備えていることを特徴とする粒子移動／固定装置。従って、この技術的思想１に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６３】
（２）媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記粒子収容部の近傍に設けられた電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記基材には、前記粒子収容部に連通する搬送路と、その搬送路内に電界を発生させる搬送用電極とが設けられていることを特徴とする粒子移動／固定装置。従って、この技術的思想２に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６４】
（３）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路の延びる方向に対して角度を持った状態で配設されていること。
【００６５】
（４）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路を横切るように配設されていること。
（５）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路の延びる方向に対して直交していること。従って、この技術的思想５に記載の発明によれば、粒子が搬送路の側壁に衝突・摺接しにくくなるため、粒子の損傷が最小限に押えられ、収率も向上する。
【００６６】
【発明の効果】
以上詳述したように、請求項１に記載の発明によれば、粒子を移動・固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６７】
請求項２，３に記載の発明によれば、十分な誘電泳動力を確実に得ることができるにもかかわらず、比較的簡単に製造することができる。
請求項４に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を具体化した実施形態の細胞移動／固定装置を備えるユニットを利用したセルマニピュレーションシステムを示す概略断面図。
【図２】実施形態の細胞移動／固定装置の平面図。
【図３】細胞移動／固定装置を構成する補助ガラス板上に形成された電極のパターン形状を説明するための平面図。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、細胞移動／固定装置の各電極に対する電圧印加パターンを説明するための表。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、細胞移動／固定装置の備える搬送システムを説明するための要部拡大平面図。
【図６】従来の細胞移動／固定装置を利用したセルマニピュレーションシステムを示す概略断面図。
【符号の説明】
２…粒子移動／固定装置、１２…粒子としての植物細胞、１３…媒質としての培養液、１６…粒子収容部としての貫通部（細胞チャンバ）、２１…基材としてのガラス板、２２…電極形成用の補助ガラス板、２３…搬送路としての搬送溝、３１（Ｕ１〜Ｕ４）…表面電極としての導電性金属板、４１（Ｄ１〜Ｄ４）…裏面電極、Ｅ１…搬送用電極。
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞等のような粒子を媒質中にて移動または固定させるための細胞移動／固定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、粒子状の微小な対象物を操作するマイクロマニピュレーション技術の一種として、マイクロインジェクションという技術が知られている。
【０００３】
マイクロインジェクションとは、例えばガラス管を加工してなるマイクロピペットと呼ばれる注射針を用い、細胞内にＤＮＡ、ＲＮＡ、オルガネラ、各種蛋白質、各種薬液等を注入する手法のことを指す。このような技術は、特定遺伝子などを細胞内に選択的に導入しうる有効な手法として近年特に注目を浴びている。かかる手法は、類似の手法であるレーザーインジェクション等に比べて導入効率が高くてしかも安価といった利点を有している。
【０００４】
上記技術においては、媒質中に浮遊している細胞に対してマイクロピペットを突き刺した状態で細胞内に液体を注入するため、突き刺し時には細胞を何らかの手段により固定しておく必要がある。また、細胞における特定の部位に遺伝子等を導入したい場合には、ピペットを突き刺しやすい所定の方向に当該部位を向けた状態で細胞を固定する必要がある。そして、従来では突き刺し用のマイクロピペットとは別の固定用ピペットを用い、その先端に細胞を吸い付けることにより、細胞の固定を図っていた。
【０００５】
しかし、細胞を吸い付けて固定するという従来方法は、面倒で時間がかかるため、生産性の向上を期待することが難しかった。そこで、これに代わるものとして、本発明者らは図６に示すような細胞移動／固定装置６１を備えるユニットを想到した。同図において細胞移動／固定装置６１は、媒質６２を満たすための容器を兼ねる取り付け用ホルダ６３内にて支持されている。装置６１を構成する基材であるガラス板６４の中央部には、細胞６５を１つ１つ収容するための細胞チャンバ６６が設けられている。この図において、粒子収容部である細胞チャンバ６６は、ガラス板６４の表面側に形成された略椀状の凹部になっている。ガラス板６４の表面側かつ細胞チャンバ６６の近傍には、スパッタリング等によって複数の表面電極６７ａが設けられている。ガラス板６４の裏面側かつ細胞チャンバ６６の近傍には、同じくスパッタリング等によって複数の裏面電極６７ｂが設けられている。これらの電極６７ａ，６７ｂは配線パターン６８を介してパッド６９に接続され、さらに各パッド６９には図示しない給電用のリード線が接続されている。また、同装置６１はホルダ６３とともに顕微鏡のステージ７１上に固定される。ステージ７１の下方には対物レンズ７２が配置されていて、ステージ７１の上方にはマイクロピペット７３が配置されている。
【０００６】
従って、各リード線を介して各電極６７ａ，６７ｂへ高周波電圧を印加すると、細胞チャンバ６６内に電界が発生し、その電界が細胞６５に対して好適な誘電泳動力をもたらす。よって、細胞６５を細胞チャンバ６６内にて移動させて位置修正した後、その細胞６５を固定させることが可能である。ゆえに、オペレータは装置６１の下方側から細胞６５の観察を行いながら、マイクロピペット７３を操作してその先端を細胞６５に突き刺すことができるようになっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、図６の装置６１の構成では、表面電極６７ａ−細胞６５間の距離や、裏面電極６７ｂ−細胞６５間の距離が長くなってしまうため、細胞６５を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができない。また、表面電極６７ａ−裏面電極６７ｂ間には、媒質６２である水に比べて比誘電率の小さなガラス板６４が介在している。このことも、十分な誘電泳動力を得ることができない原因の１つとなっている。
【０００８】
さらに、前記装置６１は細胞チャンバ６６への細胞６５の搬入・搬出を行うための構造を何ら備えていないため、オペレータはそのような作業をマイクロピペット７３を用いて慎重に行う必要があり、極めて面倒である。
【０００９】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その第１の目的は、粒子を移動・固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる粒子移動／固定装置を提供することにある。
【００１０】
本発明の第２の目的は、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、請求項１に記載の発明では、媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記基材の表面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた表面電極と、前記基材の裏面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた裏面電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記電極の先端が、前記粒子収容部の中央部方向に張り出した状態で配置されていることを特徴とする粒子移動／固定装置をその要旨とする。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、請求項１において、前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記表面電極は前記ガラス板の表面側かつ前記貫通部の近傍に接合された導電性金属板であるとした。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２において、前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記裏面電極は電極形成用の補助ガラス板の表面側に形成されたものであり、前記補助ガラス板は前記ガラス板の裏面側に貼り付けられているとした。
【００１４】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか１項において、前記基材に搬送路を設けかつその搬送路の経路上に前記粒子収容部を配置するとともに、前記搬送路内に電界を発生させる搬送用電極を設けた。
【００１５】
以下、本発明の「作用」について説明する。
請求項１に記載の発明によると、粒子収容部の中央部方向に張り出している電極の先端と、粒子収容部内の媒質中にて浮遊する粒子との距離が短くなる。これに加えて、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に介在している基材の厚さも確実に小さくなる。従って、電極への通電によって媒質中に電界を発生させた場合、粒子を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる。
【００１６】
請求項２に記載の発明によると、ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部を粒子収容部とした結果、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に基材が介在しなくなる。よって、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、導電性金属板からなる表面電極は、ある程度の強度を備えているため、その先端を粒子収容部の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、比較的簡単に製造可能な装置とすることができる。
【００１７】
請求項３に記載の発明によると、ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部を粒子収容部とした結果、表面電極の先端と裏面電極の先端との間に基材が介在しなくなる。よって、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、裏面電極が形成された補助ガラス板を貼り付ける構造にしたことにより、裏面電極の先端を粒子収容部の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、比較的簡単に製造可能な装置とすることができる。
【００１８】
請求項４に記載の発明によると、搬送用電極への通電によって搬送路内に電界を発生させることにより、その搬送路に沿って粒子を移動させることができる。従って、粒子収容部への粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の粒子移動／固定装置を具体化した一実施形態のセルマニピュレーションシステム１を図１〜図５に基づき詳細に説明する。
【００２０】
このセルマニピュレーションシステム１は、細胞移動／固定装置２、取り付け用ホルダ３、下部観察手段としての対物レンズ４、顕微鏡のステージ５、マイクロピペット６、マニピュレータ(図示略)、光源(図示略)等を含んで構成されている。また、細胞移動／固定装置２及び取り付け用ホルダ３によって、１つの細胞移動／固定ユニットＵＮ１が構成されている。
【００２１】
図１に示されるように、ステージ５の中央部には透孔１１が設けられている。この透孔１１の下方には対物レンズ４が上向き状態で配設されている。対物レンズ４は、図示しない操作手段を操作することにより垂直方向に移動することができる。光源は透孔１１の上方に離間して配置されている。マイクロピペット６は、ステージ５の上側に配置されている。マイクロピペット６は、加熱溶融したガラス管を細く引き延ばすことによって製造される。マイクロピペット６の先端部は、直径数十μｍ〜数百μｍ程度の植物細胞１２を突き刺すことができるように尖った形状に形成されている。なお、マイクロピペット６はマニピュレータを操作することにより三次元的に駆動される。マニピュレータの駆動方式としては、例えば油圧式、エア式、機械式などがある。マイクロピペット６の基端部は、図示しないシリンジ等の加圧器に接続されている。加圧器からは例えばＤＮＡを含む溶液等が圧送されてくる。
【００２２】
図１に示されるように、取り付け用ホルダ３は、透孔１１のある顕微鏡ステージ５の上面中央部に対し、図示しないボルト等の締結により取り付けられている。ホルダ３は円形状をした有底状の部材であって、その底部中央には透孔が形成されている。ホルダ３の底部上面は、細胞移動／固定装置２の外周部下面側を支持している。その結果、ホルダ３内において装置２が水平に挟持された状態で載置されるようになっている。
【００２３】
本実施形態の細胞移動／固定装置２は、２枚の基材を貼り合わせることによって構成された、いわゆる多層構造になっている。顕微鏡観察の都合上、透光性を有する基材が選択されることがよく、それを考慮してここではガラス製の基材が選択されている。なお、各種ガラスのなかでも、透明度の高いほう珪酸ガラスを選択することが特に好ましい。上側基材であるガラス板２１の裏面側には、下側基材である補助ガラス板２２が図示しない接着剤を介して貼り付けられている。前記接着剤としては、例えばＵＶ硬化型の接着剤などが使用される。
【００２４】
図１〜図３に示されるように、ガラス板２１の厚さは１００μm〜２００μm程度であって、その平面形状は正方形になっている。正方形の一辺の大きさは２０mm〜３０mm程度に設定されている。ガラス板２１は、培養液にて浮遊する植物細胞１２を収容する粒子収容部としての細胞チャンバ１６を備えている。本実施形態の細胞チャンバ１６は、具体的にはガラス板２１を厚さ方向に貫通する貫通孔である。図２に示す細胞チャンバ１６は非円形状かつ等断面積であって、ガラス板２１の中心部に位置している。かかる細胞チャンバ１６には、粒子である植物細胞１２が１つ１つ収容される。細胞チャンバ１６は、１つのガラス板２１について複数個設けられていてもよい。
【００２５】
図２に示されるように、ガラス板２１は搬送路としての搬送溝２３を備えている。本実施形態の搬送溝２３は、具体的にはガラス板２１を厚さ方向に貫通する貫通溝である。図２の搬送溝２３はガラス板２１の中心部を通過しつつ一直線状に延びており、その途上には細胞チャンバ１６が配置されている。図２における搬送溝２３の右端部は、搬送溝２３内に培養液１３を供給するための入口部２４になっている。同じくその左端部は、搬送溝２３から培養液１３を排出するための出口部２５になっている。本実施形態の場合、細胞チャンバ１６は入口部２４及び出口部２５のちょうど中間点に位置している。搬送溝２３の幅は、細胞チャンバ１６から入口部２４または出口部２５に向かうほど広くなっていることが好ましい。その理由は、入口部２４または出口部２５が広くなる結果、搬送溝２３へ植物細胞１２を供給等する作業が容易になるからである。
【００２６】
細胞チャンバ１６及び搬送溝２３は、レーザー加工により形成されることが望ましい。その理由は、レーザー加工であれば、例えばエッチング加工等に比べて、簡単にかつ正確に微細な孔・溝を形成することができるからである。勿論、レーザー加工に代えて、例えばざぐり加工、ドリル加工、研削加工、エッチング加工等を行ってもよい。
【００２７】
ガラス板２１の表面側かつ細胞チャンバ１６の近傍には、粒子駆動用の表面電極３１が複数（ここでは４つ）接合されている。本実施形態では、銅、アルミニウム等のような導電性の金属からなる板材が、前記表面電極３１として用いられている。これらの導電性金属板は、少なくとも１つの角部がある形状、例えば多角形状であることがよい。本実施形態では、正方形状の導電性金属板（５mm角）を用いている。
【００２８】
図２に示されるように、各表面電極３１の先端（即ち１つの表面電極３１につき４つある角部のうちの１つ）は、細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している表面電極３１の先端の下方領域には、厚いガラス板２１が存在しておらず、比較的大きな空間ができている（図１参照）。なお、先端の張り出し量は、０．１mm〜１mm程度に設定されている。
【００２９】
各々の表面電極３１は、水との接触による電気分解を防止するために、絶縁層（例えば透明な絶縁樹脂材料からなる層）Ｒによって全体的に被覆されている。ただし、表面電極３１においてガラス板２１の外周部に位置する角部の表面については、前記絶縁層Ｒから外部に露出されている。そして、これらのリード取り出し部分に対しては、導電性接着剤３２を用いてリード線３３がそれぞれ接合されている。絶縁性の向上のため、前記導電性接着剤３２はさらに樹脂層３４によって全体的に被覆されている。本実施形態の場合、ガラス板２１の上面側に接合された４本のリード線３３は、上部開口を介してホルダ３の外部に引き出される。引き出されたリード線３３は、数１０ｋＨｚ〜数ＭＨｚの高周波交流電圧を発生する装置（図示略）に対して電気的に接続される。
【００３０】
図２に示されるように、ガラス板２１の裏面側に貼り付けられている補助ガラス板２２の表面中央部には、粒子駆動用の裏面電極４１が複数（ここでは４つ）形成されている。本実施形態における各裏面電極４１は、いずれも細長い長方形状になっている。各裏面電極４１の先端（内側端）は、細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している裏面電極４１の先端の上方領域には、厚いガラス板２１が存在しておらず、比較的大きな空間ができている。なお、先端の張り出し量は、表面電極３１のそれと同じく０．１mm〜１mm程度に設定されている。
【００３１】
補助ガラス板２２の外周部における４箇所には、矩形状の接続用パッド４２が形成されている。これらの接続用パッド４２は、いずれもガラス板２１よりも外側に配置されている。各々の接続用パッド４２と、それに対応する裏面電極４１とは、線状パターン４３を介して電気的に接続されている。これらの線状パターン４３は、長さの異なる４つの直線部分４３ａからなり、各直線部分４３ａは互いに９０°の角度をもってつながっている。前記線状パターン４３は、裏面電極４１の基端（外側端）を始点として図２の反時計回りに進みながら３回直角に屈曲した後、終点である接続用パッド４２に接続している、と把握することもできる。 ４本ある線状パターン４３のそれぞれの直線部分４３ａは、等間隔を隔てながら互いに平行な位置関係を保つように配置されている。それぞれの線状パターン４３は、搬送溝２３を２箇所横切るように配設されている。より具体的には、各線状パターン４３は、入口部２４−細胞チャンバ１６間で１回搬送溝２３を横切り、細胞チャンバ１６−出口部２５間でもう１回搬送溝２３を横切っている。
【００３２】
また、この細胞移動／固定装置２は、植物細胞１２のような粒子を誘電泳動力によって搬送するための搬送システムを備えている。即ち、本実施形態の装置２では前記搬送溝２３に加えて、その搬送溝２３内に電界を発生させるための搬送用電極Ｅ１が設けられている。この装置２では、上述した線状パターン４３が、実質的には搬送用電極Ｅ１の役割を果たしている。別の言い方をすると、裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ導電領域が、搬送用電極Ｅ１として機能するようになっている。
【００３３】
搬送用電極Ｅ１は複数（ここでは裏面電極４１と同数の４つ）であって、それらは搬送溝２３の延びる方向に対して所定の角度を持った状態（望ましくは図２，図３のように前記方向に対して直交する状態）で配設されることがよい。
【００３４】
ここで、裏面電極４１、接続用パッド４２及び搬送用電極Ｅ１（線状パターン４３）の形成手順を簡単に述べる。
まず、電極形成用の補助ガラス板２２を用意する。本実施形態では、直径４０mmかつ厚さ１００μm〜２００μm程度の円形状補助ガラス板２２が用いられている。この補助ガラス板２２の面積は前記ガラス板２１のそれよりも大きい。このような補助ガラス板２２の表面側に、従来公知の真空蒸着法によって、クロム層及び金層をその順で形成する。その結果、厚さ数μm程度であって２層構造の裏面電極４１、接続用パッド４２及び搬送用電極Ｅ１が得られる。
【００３５】
次いで、補助ガラス板２２の表面側の全体に透明な絶縁膜４４を形成する。このような絶縁膜４４を形成する理由は、裏面電極４１を培養液１３から隔てておくことにより、電圧印加時における水の電気分解を未然に防ぐためである。なお、絶縁膜４４の厚さは数μm程度に設定されることがよい。このような薄い絶縁膜４４は、例えばＳＯＧをスピンコートすること等により形成可能である。なお、絶縁膜４４が厚くなりすぎると、電極３１，４１間の距離の短縮にとってマイナスになるおそれがある。絶縁膜４４において各接続用パッド４２に対応する箇所には、リード引き出し用の開口部４５が設けられる。後工程において、開口部４５から露出する接続用パッド４２には、上述した導電性接着剤３２を用いてリード線３３がそれぞれ接合される。絶縁性の向上のため、前記導電性接着剤３２はさらに樹脂層３４によって全体的に被覆される。
【００３６】
次に、裏面電極４１を覆う絶縁膜４４が形成された補助ガラス板２２を、上記接着剤を用いてガラス板２１の裏面側に貼り付ける。以上の結果、実質上、ガラス板２１の裏面側かつ細胞チャンバ１６の近傍に裏面電極４１が設けられた状態となる。
【００３７】
接続用パッド４２に接合された４本のリード線３３は、上部開口を介してホルダ３の外部に引き出される。引き出されたリード線３３は、数１０ｋＨｚ〜数ＭＨｚの高周波交流電圧を発生する装置に対して電気的に接続される。
【００３８】
ここで、電極の位置関係を説明する便宜上、表面電極３１にU１，Ｕ２，Ｕ３，Ｕ４を付し、裏面電極４１にＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４を付す（図２，図３参照）。これによると、電極U１−Ｄ１、Ｕ２−Ｄ２、Ｕ３−Ｄ３、Ｕ４−Ｄ４がそれぞれ対応する上下位置関係にあることがわかる。
【００３９】
図４（ａ）〜（ｃ）には、これら８つの電極３１，４１（Ｕ１〜Ｕ４，Ｄ１〜Ｄ４）に対する通電の仕方を説明するための表が示されている。
搬送溝２３の長手方向に延びる軸線を中心として、図２の矢印Ａ１の方向に植物細胞１２を回転させたい場合には、Ｕ１＋Ｕ２→Ｕ３＋Ｕ４→Ｄ３＋Ｄ４→Ｄ１＋Ｄ２というように、特定の２つの電極３１（４１）に対してプラス電圧を印加することを行えばよい。このとき、前記特定の２つの電極３１（４１）以外の電極についてはＧＮＤ（グランド）に接続しておく。通電をＤ１＋Ｄ２→ Ｄ３＋Ｄ４→ Ｕ３＋Ｕ４→ Ｕ１＋Ｕ２という順序で行えば、植物細胞１２を前記軸線を中心として逆方向に回転させることができる。
【００４０】
装置２の厚さ方向に平行な直線を中心として植物細胞１２を右回転させたい場合には、Ｕ１→Ｕ２→Ｕ３→Ｕ４というように、特定の１つの電極３１のみに対してプラス電圧を印加することを、右回りで順に行なえばよい。このとき、前記特定の１つの電極３１以外の電極についてはＧＮＤに接続しておく。これをＵ４→Ｕ３→Ｕ２→Ｕ１というように反対回りで順に行なえば、植物細胞１２を前記直線を中心として左回転させることができる。
【００４１】
植物細胞１２を上昇させたい場合には、Ｕ１及びＵ２にプラスの電圧を印加し、かつＵ３及びＵ４にマイナスの電圧を印加し、それ以外のものについてはＧＮＤに接続しておけばよい。植物細胞１２を下降させたい場合には、Ｕ１〜Ｕ４にプラスの電圧を印加し、Ｄ１〜Ｄ４ついてはＧＮＤに接続しておけばよい。また、植物細胞１２を動かさずに固定したい場合には、 Ｕ１〜Ｕ４，Ｄ１〜Ｄ４に対して印加する電圧値を固定すればよい。即ち、各電極３１，４１に対して同じ電圧を印加すればよい。
【００４２】
以上のような動作制御が可能なのは、リード線３３を介して電極３１，４１へ高周波電圧を印加すると、細胞チャンバ１６内に電界が発生し、その電界が植物細胞１２に対して好適な誘電泳動力をもたらすからである。この場合、粒子状対象物である植物細胞１２の誘電率は、一般的に媒質である培養液１３の誘電率と異なるため、電界が働くことで植物細胞１２が静電分極を起こす。その結果、細胞チャンバ１６内にて好適な誘電泳動力が発生し、静電分極した植物細胞１２が電界の強いほうへと引き寄せられるからである。
【００４３】
次に、図５に基づいて本実施形態における搬送システムについて説明する。
説明の便宜上、装置２において最も外周側に位置する搬送用電極を「Ｅ１１」、Ｅ１１のすぐ内側に位置するものを「Ｅ１２」、さらにＥ１２のすぐ内側に位置するものを「Ｅ１３」、最も内側に位置するものを「Ｅ１４」とする。
【００４４】
図５（ａ）では、植物細胞１２が搬送用電極Ｅ１１上に位置しており、このときまだ各電極Ｅ１１〜Ｅ１４には電圧は印加されていない。従って、搬送溝２３内には何ら電界が発生していない。
【００４５】
この状態で電極Ｅ１２にプラス電圧を印加するとともに、電極Ｅ１１をＧＮＤに接続する。すると、発生する電界のもたらす誘電泳動力の作用によって、植物細胞１２が電極Ｅ１２上へと移動する（図５(b)参照）。次いで、電極Ｅ１３にプラス電圧を印加するとともに、電極Ｅ１２をＧＮＤに接続する。すると、同じく誘電泳動力の作用によって、植物細胞１２が電極Ｅ１３上へと移動する（図５（c）参照）。そして、以上のような電圧印加を順次行えば、植物細胞１２を搬送溝２３に沿って移動させ、最終的に植物細胞１２を細胞チャンバ１６内に到らせることができる。
【００４６】
次に、このように構成されたシステム１の具体的な使用方法の一例を述べておく。
顕微鏡ステージ５上にホルダ３をセットし、かつそのホルダ３の底部上面に細胞移動／固定装置２を固定しておく。この状態で搬送溝２３及び細胞チャンバ１６内を滅菌した培養液１３で満たしておく。その結果、搬送溝２３及び細胞チャンバ１６内がともに培養液１３のある環境となり、乾燥に弱い植物細胞１２の死滅が未然に回避される。なお、植物細胞１２は、プロトプラストや花粉等のような単細胞であってもよいほか、胚珠などの特定器官やカルス等のような細胞群（即ち多細胞）であってもよい。
【００４７】
オペレータは図示しない培養液供給装置を駆動して、培養液１３に流れを生じさせ、搬入溝２３の入口部２４に植物細胞１２を導入する。そして、搬送用電極Ｅ１に上記のごとく電圧を印加することにより、搬送システムを駆動する。その結果、植物細胞１２を搬送溝２３に沿って動かし、細胞チャンバ１６内に移送させる。次いで、オペレータは顕微鏡観察を行いながら電極３１，４１に高周波電圧を印加し、植物細胞１２の位置修正を行なう。この場合、特定遺伝子を導入したい部位が例えば胚であれば、胚の部分をマイクロピペット６の先端部に向けるように調整する。
【００４８】
次いでオペレータは、顕微鏡を観察しながらマイクロピペット６を駆動操作して、その先端部をターゲットである植物細胞１２に向けてゆっくりと前進させる。マイクロピペット６の先端部が植物細胞１２の胚に突き刺さったことを顕微鏡により確認した後、オペレータはシリンジの頭部を静かに押圧し、外部にＤＮＡの入った液体を押し出すようにする。すると、マイクロピペット６を経由してその先端部から当該液体が吐出される。従って、植物細胞１２の胚にＤＮＡを注入することができる。上記のような導入処理が終了した後、オペレータはマイクロピペット６を後退させて、その先端部を植物細胞１２から抜き去る必要がある。以上の結果、特定遺伝子を植物細胞１２内に選択的にかつ効率よく導入することができる。この後、遺伝子導入がなされた植物細胞１２は、搬送システムの駆動によって再び搬送溝２３を移動し、出口部２５に移送される。そして、前記培養液供給装置を駆動させ、植物細胞１２を装置２の外部に排出する。
【００４９】
従って、本実施形態によれば以下のような効果を得ることができる。
（１）この装置２では、各々の表面電極３１の角部の先端が細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。また、各々の裏面電極４１の角部の先端も、同様に細胞チャンバ１６の中央部方向に張り出した状態で配置されている。従って、張り出している電極３１，４１の先端と、細胞チャンバ１６内の培養液１３中にて浮遊する植物細胞１２との距離が、従来構造に比較して確実に短くなる。これに加えて、表面電極３１の先端と裏面電極４１の先端との間に介在しているガラスの厚さも確実に小さくなる。従って、電極３１，４１への通電によって培養液１３中に電界を発生させた場合、植物細胞１２を移動または固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる。
【００５０】
（２）この装置２では、ガラス板２１を厚さ方向に貫通する細胞チャンバ１６を、粒子収容部としてガラス板２１に設けている。その結果、表面電極３１の先端と裏面電極４１の先端との間に、水に比べて比誘電率の小さなガラスが殆ど介在しない状態となる。なお、表面電極３１−裏面電極４１間には絶縁膜４４が一応存在しているものの、ガラス板２１に比べて極めて薄く、無視してよい程度のものである。よって、実施形態の構成によれば、十分な誘電泳動力を確実に得ることができる。また、導電性金属板からなる表面電極３１は、少なくとも自重に耐えうる程度の強度を備えている。このため、その先端を細胞チャンバ１６の中央部方向に容易に張り出させることができ、その際においても変形して垂れ下がるようなことは起こりにくい。即ち、本実施形態の装置２は、比較的簡単に製造することが可能な構造となっている。
【００５１】
（３）この装置２では、裏面電極４１、接続用パッド４２、搬送用電極Ｅ１が形成された補助ガラス板２２をガラス板２１に貼り付けた構造になっている。裏面電極４１の先端を細胞チャンバ１６の中央部方向に容易に張り出させることができる。即ち、本実施形態の装置２は、比較的簡単に製造することが可能な構造となっている。
【００５２】
また、補助ガラス板２２に裏面電極４１等をあらかじめ形成しておくことができるので、あえて導電性金属板等の材料を用いなくてもよく、通常の薄膜形成法にて薄い裏面電極４１等を簡単に形成することができる。
【００５３】
（４）この装置２では、経路上に細胞チャンバ１６を有する搬送溝２３が設けられるとともに、搬送溝２３内に電界を発生させる搬送用電極Ｅ１が設けられている。従って、搬送用電極Ｅ１への通電によって好適な誘電泳動力が発生し、その力により搬送溝２３に沿って植物細胞１２を移動させることができる。従って、細胞チャンバ１６への植物細胞１２の搬入作業や、細胞チャンバ１６からの植物細胞１２の搬出作業を容易に行うことができる。
【００５４】
（５）本実施形態の搬送溝２３は一方向に延びており、全体的にみて屈曲していない。これに加え、各搬送用電極Ｅ１は搬送溝２３の延びる方向に対して直交している。従って、植物細胞１２の移動時に、植物細胞１２が搬送溝２３の側壁に衝突したり摺接したりする可能性が小さい。ゆえに、植物細胞１２の損傷が最小限に押えられ、収率も確実に向上するという利点がある。
【００５５】
さらに、本装置２では、裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ線状パターン４３が搬送用電極Ｅ１として機能するようになっている。このため、裏面電極４１へ通電を行うための接続用パッド４２やリード線３３を、搬送用電極Ｅ１へ通電を行うためのものとして兼用することができる。従って、省スペース化及び構造の簡素化が達成される。
【００５６】
なお、本発明の実施形態は以下のように変更してもよい。
・ 裏面電極４１と接続用パッド４２とをつなぐ線状パターン４３を搬送用電極Ｅ１として兼用するのではなく、それとは別個に搬送用電極Ｅ１を設ける構成にしてもよい。
【００５７】
・ 粒子収容部１６や搬送路２３は、必ずしもガラス板２１の表裏を貫通していなくてもよい。ただし、実施形態のような貫通構造のほうが、レーザーによる加工形成が簡単であるほか、誘電率の観点からみても好適なものとなる。
【００５８】
・ 補助ガラス板２２の表面側に対して裏面電極４１等を形成する方法として、実施形態にて例示した真空蒸着のみならず、例えばスパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、めっき、印刷等を採用してもよい。
・ ガラス板２１及び補助ガラス板２２の形成材料として、ほう珪酸ガラス以外のもの、例えばシリカガラス等を用いてもよい。なお、ガラスに限定されることはなく、ジルコニア等に代表されるような透明のセラミック材料を基材の形成材料として選択してもよい。
【００５９】
・ 電極３１，４１の数、形状、レイアウト等は、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて任意に変更可能である。
・ 搬送用電極Ｅ１や搬送溝２３は特に必要がなければ省略されてもよい。
【００６０】
・ 実施形態にて示した植物用の培養液１３を媒質として用いるのみならず、養分を殆ど含まない単なる蒸留水等を媒質として用いても構わない。勿論、媒質は粒子の種類に応じて適宜変更することが可能である。
【００６１】
・ 本発明のシステム１は、実施形態において述べたような植物細胞１２へのＤＮＡそのものの導入のみに使用されるに止まらず、様々な用途に用いられることができる。例えば、粒子状対象物を動物の卵細胞とした場合には、顕微受精技術の１つである卵子細胞質への精子のインジェクション（卵細胞質精子注入法）等に利用することができる。勿論、本発明のシステム１は、細胞１２等のような生物を対象物とした操作のみならず、非生物を対象物とした操作にも利用されることができる。
【００６２】
次に、特許請求の範囲に記載された技術的思想のほかに、前述した実施形態によって把握される技術的思想をその効果とともに以下に列挙する。
（１）媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記粒子収容部の近傍に設けられた電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記基材は、前記粒子を誘電泳動力によって搬送する搬送システムを備えていることを特徴とする粒子移動／固定装置。従って、この技術的思想１に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６３】
（２）媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記粒子収容部の近傍に設けられた電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、前記基材には、前記粒子収容部に連通する搬送路と、その搬送路内に電界を発生させる搬送用電極とが設けられていることを特徴とする粒子移動／固定装置。従って、この技術的思想２に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６４】
（３）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路の延びる方向に対して角度を持った状態で配設されていること。
【００６５】
（４）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路を横切るように配設されていること。
（５）請求項４、技術的思想１，２において、前記搬送用電極は複数であって、それらは前記搬送路の延びる方向に対して直交していること。従って、この技術的思想５に記載の発明によれば、粒子が搬送路の側壁に衝突・摺接しにくくなるため、粒子の損傷が最小限に押えられ、収率も向上する。
【００６６】
【発明の効果】
以上詳述したように、請求項１に記載の発明によれば、粒子を移動・固定させるのに十分な誘電泳動力を得ることができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【００６７】
請求項２，３に記載の発明によれば、十分な誘電泳動力を確実に得ることができるにもかかわらず、比較的簡単に製造することができる。
請求項４に記載の発明によれば、粒子の搬入・搬出作業を容易に行うことができる粒子移動／固定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を具体化した実施形態の細胞移動／固定装置を備えるユニットを利用したセルマニピュレーションシステムを示す概略断面図。
【図２】実施形態の細胞移動／固定装置の平面図。
【図３】細胞移動／固定装置を構成する補助ガラス板上に形成された電極のパターン形状を説明するための平面図。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、細胞移動／固定装置の各電極に対する電圧印加パターンを説明するための表。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、細胞移動／固定装置の備える搬送システムを説明するための要部拡大平面図。
【図６】従来の細胞移動／固定装置を利用したセルマニピュレーションシステムを示す概略断面図。
【符号の説明】
２…粒子移動／固定装置、１２…粒子としての植物細胞、１３…媒質としての培養液、１６…粒子収容部としての貫通部（細胞チャンバ）、２１…基材としてのガラス板、２２…電極形成用の補助ガラス板、２３…搬送路としての搬送溝、３１（Ｕ１〜Ｕ４）…表面電極としての導電性金属板、４１（Ｄ１〜Ｄ４）…裏面電極、Ｅ１…搬送用電極。
Claims (4)
- 媒質中にて浮遊する粒子を収容するための粒子収容部が形成された基材と、前記基材の表面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた表面電極と、前記基材の裏面側かつ前記粒子収容部の近傍に設けられた裏面電極とを備え、前記電極への通電によって前記媒質中に電界を発生させ、その電界のもたらす誘電泳動力により前記粒子を移動または固定させるようにした粒子移動／固定装置において、
前記電極の先端が、前記粒子収容部の中央部方向に張り出した状態で配置されていることを特徴とする粒子移動／固定装置。 - 前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記表面電極は前記ガラス板の表面側かつ前記貫通部の近傍に接合された導電性金属板であることを特徴とする請求項１に記載の粒子移動／固定装置。
- 前記基材はガラス板であり、前記粒子収容部は前記ガラス板を厚さ方向に貫通する貫通部であり、前記裏面電極は電極形成用の補助ガラス板の表面側に形成されたものであり、前記補助ガラス板は前記ガラス板の裏面側に貼り付けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の粒子移動／固定装置。
- 前記基材に搬送路を設けかつその搬送路の経路上に前記粒子収容部を配置するとともに、前記搬送路内に電界を発生させる搬送用電極を設けたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の粒子移動／固定装置。
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