JP6353239B2 - 非球体細胞の高精度生死活性判定方法及び判定装置 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
前記周波数を印加する工程において、電極間100μmあたり1.0〜4.0Vの電圧を印加することが好ましい。
前記周波数を印加する工程において、電極間10μmあたり、1.0〜4.0Vの電圧を印加することが好ましい。
本発明の第1実施形態による、非球体細胞の生死判定装置を図1に示す。非球体細胞の生死判定装置1は、主として、セル2と、交流発振器3と、光源7と、分光器8と、演算処理装置9とから構成される。
S(%)=(T2−T0)/(T1−T0)×100
このように算出した直立割合を、本発明における生存割合の結果とすることができる。このような算出は、任意選択的に、判定装置の一部を構成してもよい演算処理装置9により実施することができる。
本発明の第2実施形態による、非球体細胞の生死判定装置を図3に示す。非球体細胞の生死判定装置10は、主として、セル2と、交流発振器3と、観察装置4と、画像表示装置5とから構成される。
本発明の第3実施形態による、非球体微小細胞の生死判定装置を図4に示す。非球体微小細胞の生死判定装置11は、主として、セル2と、交流発振器3と、観察装置4と、画像表示装置5とから構成される。ここで、非球体微小細胞とは、細胞の短軸と長軸との比が、概ね、1.5以上であって、短軸の長さが概ね2μmより小さいものをいう。一例としては、大腸菌、乳酸桿菌などの桿菌、並びに上記の大きさの藻類、単細胞生物が挙げられるが、これらには限定されない
1)微生物サンプルの調整
分裂酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)をYE培地(0.5%酵母エキス、3%グルコース)でOD600=0.8まで30℃で培養した後、遠心分離機(KUBOTA1900、久保田製作所)を用いて超純水で洗浄、再懸濁して細胞濃度を2x108cells/mLに調整した。
図1に示す第1実施形態による装置の通りにセルを組み立て、図1に示す装置構成とした。25×20mmのITO(インジウム−酸化スズ)透明電極2枚の間に20μmの絶縁スペーサと調整したサンプル1.5μLを注入し、挟み込んだ。上下の電極は、液体接触面に酸化アルミ薄膜で100nmの絶縁被膜を形成した。絶縁被膜は真空スパッタリングで形成した。これを透過率測定用ステージ上に設置した。
光源としてはLED光源(617nm、Ocean Optics LLS-617)を、検出部には分光器(Ocean Optics USB4000)を用いて透過率を測定した。
まず印加前の全細胞が転倒状態での透過率T0を測定した。次に1MHzを印加して全細胞が直立状態の透過率T1を測定した。この際の電圧は、1.6Vとした。続けて15MHzに切り替えて死細胞を転倒させ生細胞のみ直立状態になった透過率T2を測定した。この際の電圧は、0.9Vとした。これらT0、T1、T2から生細胞の直立割合S(%)を、以下の式に従って算出し、これを生存率とした。
S(%)=(T2−T0)/(T1−T0)×100
1)微生物サンプルの調整
本実験例に用いた微生物は、分裂酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)で、長軸が約10μm、短軸が約4μmの円柱状であった。分裂酵母菌をYE培地(0.5%酵母エキス、3%グルコース)でOD600=0.8まで30℃で培養した後、4000rpm、4℃、5分間の条件で遠心分離機(KUBOTA1900、久保田製作所)を用いて超純水で洗浄、再懸濁して細胞濃度を、1x107cells/mLに調整した。ここでは、調製後の細胞懸濁液を生細胞のサンプルとした。ただし、培養中死滅した死細胞もわずかに含まれている場合があった。死細胞のサンプル調製は、生細胞として調製した細胞懸濁液を、80℃で10分間の熱処理によって全て死滅させることにより行った。生死細胞の混合液は、上述の生細胞のサンプルと死細胞のサンプルとを等量混合して調製した。
図3に示す第2実施形態による装置の通りにセルを組み立て、25×20mmのITO(インジウム−酸化スズ)透明電極2枚の間に100μmの絶縁スペーサと調整したサンプル3μLを注入し挟み込んだ。下部電極は、液体接触面にシリコーン樹脂(信越シリコーン、KR-251)で2.9μmの絶縁被膜を形成した。絶縁被膜はスピンコートにより形成した。これを倒立型顕微鏡上に設置した。
上記のようにしてセルに封入した生細胞サンプルに、100kHz、500kHz、1MHz、5MHz、及び10MHzの周波数を印加し、かつ、電圧を0〜4.0Vで変化させて生細胞の直立割合を測定した。結果を図7(a)に示す。死細胞についても同様にして直立割合を測定した。結果を図7(b)に示す。次いで、生細胞が100%のサンプル、死細胞が100%のサンプル、及び生細胞が50%のサンプルについて、判定周波数の印加開始時点からの経過時間と、細胞の直立割合の関係を測定した。直立割合は観察画面内の全細胞数に対し、直立した細胞数で算出した。結果を図8に示す。これらの結果から、交流発振器で周波数5MHz、電圧2.0V以上を印加すると、生細胞のみ直立するので、顕微鏡下で高精度に個々の細胞を生死判別できることがわかった。直立割合は観察画面内の全細胞数に対し、直立した細胞数で算出した。図9は、5MHz、3Vの単一判定周波数を印加開始10秒後の細胞の顕微鏡写真を示す。写真から、丸い形状の生細胞と、細長い形状の死細胞とが混在していることが確認され、生細胞と死細胞との割合を目視で判定することができる。
1)微生物サンプルの調整
乳酸桿菌(Lactobacillus casei)をMRS培地(BD社製)で、OD600=0.8まで37℃で静置培養した後、5000rpm、4℃、5分間の条件で遠心分離機(KUBOTA1900、久保田製作所)を用いて超純水で洗浄、再懸濁して細胞濃度を、1x108cells/mLに調整した。
図4に示す第3実施形態による装置の通りにセルを組み立て、25×20mmのITO(インジウム−酸化スズ)透明電極2枚の間(電極は表面にシリコーン樹脂で絶縁被膜)に10μmの絶縁スペーサと調整したサンプル0.5μLを注入し挟み込んだ。上下の電極は、液体接触面にシリコーン樹脂で絶縁被膜を形成した。絶縁被膜の厚みは1.7μmで、形成方法は実施例1と同様とした。これを倒立型顕微鏡上に設置した。
交流発振器で周波数10〜20MHz、電圧1.5〜2.0Vを印加すると、生細胞のみが直立するので顕微鏡下で高精度に個々の細胞を生死判別できた。図10(a)によれば、生細胞においては、電圧を1.0V以上とすれば、5〜20MHzのいずれの周波数を印加した場合でも細胞が直立し、本発明の測定条件においてブラウン運動の影響を受けないことがわかった。一方、図10(b)によれば、死細胞は、10〜20MHzで電圧が概ね1.5V未満の場合、ブラウン運動の影響を受け、転倒しているものと直立するものが混在することがわかる。5MHz以下の場合には、電圧が上がるに従って直立割合が上がった.また20MHzでは2.0V以上印加することができなかった.そこで、判定周波数を10〜15MHzとし、1.5V以上とした場合には、当該周波数で概ね100%の死細胞を転倒状態とすることができる。したがって、この条件では、静止画像取得による生死判定が正確に実施可能であること、また、判定周波数の印加開始時点を0としたとき、印加後1秒程度で、静止画像に基づく生死判定が可能であった。
2 セル
20a 透明絶縁性薄膜
20b 透明絶縁性薄膜
21a 上面を構成する透明電極
21b 底面を構成する透明電極
22 細胞懸濁液
23 死細胞
24 生細胞
3 交流発振器
4 観察装置
5 画像表示装置
7 光源
7a 光源接続光ファイバケーブル
7b コリメーティングレンズ
8 分光器
8a 分光器接続光ファイバケーブル
8b コリメーティングレンズ
9 演算処理装置
10 非球体細胞の生死判定装置
11 非球体微小細胞の生死判定装置
Claims (12)
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセルであって、少なくとも底面を構成する透明電極の液体接触面が、透明な絶縁性薄膜で被覆されているセル中に非球体細胞懸濁液を封入する工程と、
周波数を印加しない状態の光透過率T0を測定する工程と、
前記一対の透明電極に、全細胞を直立させる周波数を印加し、光透過率T1を測定する工程と、
前記一対の透明電極に、死細胞を選択的に転倒させる周波数を印加し、光透過率T2を測定する工程と、
前記光透過率の値から、前記非球体細胞懸濁液中の細胞生存割合S(%)を算出する工程であって、
S=(T 2 −T 0 )/(T 1 −T 0 )×100
に基づいて算出する工程と
を順に含む、非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記非球体細胞が、酵母細胞であり、
前記全細胞を直立させる周波数が100kHz〜4MHzであり、
前記死細胞を選択的に転倒させる周波数が5〜20MHzである、請求項1に記載の方法。 - 前記光透過率T1を測定する工程と、前記光透過率T2を測定する工程において、前記周波数印加時の電圧が、いずれも電極間20μmあたり0.5〜2.0Vである、請求項1または2に記載の方法。
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセルであって、少なくとも前記底面を構成する透明電極の液体接触面が、透明な絶縁性薄膜で被覆されているセル中に非球体細胞懸濁液を封入する工程と、
前記透明電極に、生細胞を選択的に直立させる2〜20MHzの周波数を印加する工程と、
印加後に、前記底面若しくは上面から、セル内の非球体細胞の静止画像を取得する工程と
を含む、1段階の交流印加による、静止画像上での非球体細胞の生死活性判定方法。 - 前記周波数を印加する工程において、電極間100μmあたり1.0〜4.0Vの電圧を印加する、請求項4に記載の方法。
- 前記周波数の印加後、静止画像を取得するまでの時間が、20秒以内である、請求項4または5に記載の方法。
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成されたセルであって、前記底面を構成する透明電極及び上面を構成する透明電極の液体接触面が、透明な絶縁性薄膜で被覆されているセル中に非球体微小細胞懸濁液を封入する工程と、
前記透明電極に、生細胞を選択的に直立させる6〜20MHzの周波数を印加する工程と、
印加後に、底面若しくは上面から、セル内の非球体微小細胞の静止画像を取得する工程と
を含む、1段階の交流印加による、静止画像上での非球体微小細胞の生死活性判定方法。 - 前記周波数を印加する工程において、電極間10μmあたり、1.0〜4.0Vの電圧を印加する、請求項7に記載の方法。
- 前記周波数の印加後、静止画像を取得するまでの時間が、5秒以内である、請求項7または8に記載の方法。
- 底面と上面とが対向する透明電極で構成され、少なくとも前記底面を構成する透明電極の液体接触面が、50nm〜10μmの透明な絶縁性薄膜で被覆されている、セルと、
前記透明電極に所定範囲の周波数を印加する交流発振器と、
光源と、分光器とを含む光透過率測定装置であって、前記セル中の非球体細胞懸濁液の光透過率を測定するための光透過率測定装置と
を備える非球体細胞の生死活性判定装置。 - 底面と上面とが対向する透明電極で構成され、前記底面を構成する透明電極の液体接触面が50nm〜10μmの透明な絶縁性薄膜で被覆されているか、あるいは、前記底面を構成する透明電極と上面を構成する透明電極との両方の液体接触面が50nm〜10μmの透明な絶縁性薄膜で被覆されている、セルと、
前記透明電極に所定範囲の周波数を印加する交流発振器と、
前記セル中の非球体細胞の静止画像を取得する観察装置と
を備える非球体細胞の生死活性判定装置。 - 前記透明な絶縁性薄膜が、100nm〜2μmの酸化アルミ薄膜又はシリコーン樹脂被膜である、請求項10または11に記載の装置。
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