KR101713097B1 - 잉크젯 프린팅 공정을 통한 생체분자의 비접촉 고착화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체분자를 포함하는 바이오 잉크를 잉크젯 프린팅하여 어레이 기판의 나노 지지체 구조물에 비접촉적으로 고착하는 방법에 관한 것으로, 이를 이용하여 제조된 기판을 바이오칩에 사용할 수 있다. 특히 기판에 수직 방향으로 존재하는 나노팁에 살아있는 세포를 비접촉적으로 고착화할 수 있어, 세포 주변이 기판과 접촉하지 않으므로 실제 생물체 내에 존재하는 세포를 모방할 수 있으며, 평면 기판에 접촉되어 부착된 세포에 비해 훨씬 더 넓은 표면적으로 다른 물질과 세포가 상호작용을 할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 기판은 항생제 개발을 위한 시약 검색용 바이오칩, 질병 확인을 위한 의료용 바이오칩 또는 조직공학용 제품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

잉크젯 프린팅 공정을 통한 생체분자의 비접촉 고착화{NON-CONTACTING FIXATION OF BIOMOLECULES BY INK-JET PRINTING PROCESS}

본 발명은 생체분자를 포함하는 잉크를 잉크젯 프린팅 공정을 통해 분사하여 생체분자를 직접적인 접촉 없이 나노팁에 고착화하는 기술에 관한 것이다.

바이오 영역에서 나노테크놀로지는 다양한 활용가능성으로 많은 주목을 받고 있다. 특히 세포 개체와 나노 물질과의 접목은 세포 단위의 접근을 통해 생물학적, 의학적으로 개발 가능성이 높은 중요한 기술이다. 살아있는 세포와 나노 물질 간의 연관성은 세포공학 및 조직공학분야에서 활용되고 있으며, 세포 내 생화학 반응 확인, 세포를 이용한 전기적 트랜지스터의 개발, 약물 전달 장치, 에너지 하베스팅 등에서 광범위하게 연구가 진행되고 있다.

현재 살아있는 세포의 나노팁에의 삽입 및 고착화는 직접적인 접촉을 통해 진행하거나 (Nanoprobe arrays for multiple single cell insertion using heterogeneous nanosphere lithography (HNSL) Yoon Ho Seo et al., Nanoscale, 2013,5, 7809-7813) 삽입 후 배양을 통한 방법을 이용한다. 그러나, 수작업을 통한 직접적인 접촉은 정확성 면에서는 우수하지만 일대일 대응을 통한 공정이기 때문에 공정 시간이 오래 걸리고 정밀한 작업 환경이 요구된다는 단점이 있고, 나노팁에서의 배양 방식은 안정적인 고착화가 가능하다는 장점이 있으나 포유류의 줄기세포 및 뉴런 등 크기가 큰 특정 세포에만 적합하다는 단점이 있다. 따라서, 다양한 종류의 세포의 고착화에 있어서 조작이 쉽고 대면적으로 활용할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

잉크젯 프린팅은 노즐을 통해 잉크를 미세 액적 형상으로 분사하는 기술로, 지속적으로 액적을 분사하는 연속젯팅 (continuous jet, CJ)과 인가 조건을 통해서 액적이 토출되는 드랍온디맨드 (drop-on-demand, DOD) 방식이 있다. 드랍온디맨드 방식 중에서는, 열처리에 의한 버블스프레이를 활용한 가열 (thermal) 방식과 압전체에 전기적 신호를 인가하여 압력을 주는 압전 (piezo-electric) 방식이 있다. 잉크젯 프린팅 공정은 조작이 쉽고 속도가 빨라 상용화하기에 적합하고 미세 구조를 구현하기에 편리한 장점이 있어, 이를 이용해 세포 및 바이오 물질을 패터닝하여 세포공학적 장치를 제작하거나 배치를 하는 연구가 진행되어 왔다.

세포를 잉크젯 프린팅을 이용하여 패터닝 하는 것과 관련하여, 대한기계학회논문집 B권, 제34권 제1호, pp. 89~94, 2010에서는 세포 패터닝에 잉크젯 프린팅 방식을 사용한 것을 개시하고 있으며, 미국 특허 US 12/370,921는 잉크젯 프린팅 기기로 살아있는 세포를 스캐폴드에 패터닝하는 것을 개시하고 있으나, 평면의 기판에 세포가 직접적으로 접촉하여 부착 또는 포함되므로, 실제 생물체 내의 세포와 상이하고, 이를 이용한 분석 시 상호작용하는 표면적이 한정되는 단점이 있다.

조작이 쉽고 속도가 빠른 잉크젯 프린팅 방법을 이용하여 생체 물질을 기판 위의 나노 지지체에 비접촉적으로 고착하기 위한 방법 및 이를 위한 최적 조건을 찾는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 잉크젯 프린팅에 의한 나노팁에의 비접촉적인 고착에 유리한 물리적 특성을 가지는 세포 잉크를 개발하고, 압전방식 (piezo-electric) 잉크젯 프린팅에서 안정적인 액적 토출을 위한 적정 조건을 구하여 나노팁에 비접촉적으로 세포를 부착하였다.

본 발명의 방법으로 세포를 잉크젯 프린팅하면, 세포를 살아있는 상태로 손상없이 유지하며, 액적이 안정적으로 젯팅되어 살아있는 세포가 나노팁에 비접촉적으로 고착되게 하므로, 세포공학 및 조직공학분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 압전 프린팅 방식을 통한 세포 잉크의 패터닝 및 생세포의 나노팁으로의 고착화를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 잉크젯 프린팅 시스템을 나타낸 사진 및 모식도이다:
사진의 nozzle & ink 및 모식도의 print head: 젯팅 디바이스;
모식도의 reservoir: 잉크 저장소;
모식도의 Drive Electronics Box, strobe interface Box: 드라이브 장치; 및
사진의 CCD camera, 및 모식도의 Video Camera and lens 및 Video Moniter 디바이스: 관측 디바이스.
도 3은 인가조건에 따라 세팅되는 파형을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 세포 잉크의 표면장력의 변화를 나타낸다.
도 5는 인가전압 및 시간의 변화에 따른 액적의 모양 및 젯팅 속도를 나타낸다.
도 6은 잉크젯 프린팅 후 세포 잉크 액적의 패터닝 결과를 나타낸다.
도 7은 잉크젯 프린팅 후 기판에 패터닝된 액적의 산포 오차 범위를 확인한 도이다.
도 8은 잉크젯 프린팅 후 기판에 패터닝된 액적의 선폭을 확인한 도이다.
도 9는 마이크로피펫을 이용한 세포 조작을 통해 세포 삽입 여부를 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 생체분자를 기판의 나노 지지체 구조물에 비접촉적으로 고착하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 생체분자는 진핵세포, 원핵세포, DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), 단백질, 올리고펩타이드, 당류 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 살아있는 세포를 이용하였다.

일 구현예에서, 상기 나노 지지체는 나노팁, 나노 탐침, 나노 닷, 나노 스피어, 나노 와이어 및 나노 튜브로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 어레이 기판에 수직으로 세워져 있는 나노팁에 살아있는 세포를 비접촉적으로 고착시켰다.

일 구현예에서, 상기 나노 지지체는 실리콘, 실리콘산화물 (SiO₂), 금, 은, 구리, 주석산화물 (SnO₂), 탄소, 텅스텐 또는 폴리머로 이루어질 수 있다.

일 구현예에서, 생체물질을 포함하는 잉크가 기판의 나노 지지체 구조물에 충돌하여 삽입됨으로써 잉크 내부에 분산되어 있는 생체분자가 나노 지지체에 비접촉적으로 고착될 수 있다.

일 구현예에서, 생체분자를 포함하는 잉크를 잉크젯 프린팅하여 나노 지지체 구조물에 고착할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 잉크젯 프린팅의 인가 전압은 -100 V 내지 100V이고, 상기 인가 시간은 1 μs 내지 800 μs이며, 1 Hz 내지 2000 Hz의 진동수 하에서 0% 내지 100%의 메니스커스 레벨을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 잉크젯 프린팅은 연속젯팅(continuous-jet), 드랍온디맨드(drop-on-demand)-가열(thermal) 및 드랍온디맨드-압전(piezo electric) 방식으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 드랍온디맨드 압전 방식으로 잉크젯 프린팅하였다.

일 구현예에서, 상기 잉크젯 프린팅에 의해 젯팅되는 액적은 40 ㎛ 내지 70 ㎛의 직경을 가지고 0.5 m/s 내지 3 m/s의 속도로 토출될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 잉크는 수계 기반 배양액에 생체분자를 포함할 수 있으며, 추가로 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(tris(hydroxymethyl)-aminomethan), TAP(tris-acetate-phosphate) 염, 포스페이트 용액, 아세트산 및 미량 원소 용액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 수계 기반 배양액에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 5 부피% 내지 15 부피%로 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 액적의 표면 장력을 낮추기 위해 DMSO를 첨가하여 잉크를 제조하였다.

일 구현예에서, 상기 잉크의 표면 장력은 70 mN/m 이하이며, 점도는 30 mPa·s 이하일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 프린팅 노즐을 세팅하고, 어레이 패턴을 시스템에 입력한 뒤, 인가 전압 및 인가 시간으로 생체분자를 포함하는 잉크를 어레이 기판에 수직으로 세워져 있는 나노 지지체 구조물에 잉크젯 프린팅하여 생체분자가 기판의 나노 지지체에 비접촉적으로 고착됨을 확인하였다.

상기와 같은 전압범위, 인가 시간, 진동수 범위 및 잉크의 액적 조건을 벗어나면, 생체분자를 포함한 잉크 액적을 어레이 기판의 나노 지지체 구조물에 효율적으로 고착시킬 수 없을 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생체분자를 나노 지지체에 비접촉적으로 고착시킨 기판에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 기판을 포함하는 제품에 관한 것으로, 항생제 개발을 위한 시약 검색용 바이오칩, 질병 확인을 위한 의료용 바이오칩, 조직공학용 제품 등이 이에 포함될 수 있다.

본 발명의 바이오칩은, 바이오칩을 수납하거나 또는 바이오칩과 접속하는 용기를 추가로 구비할 수 있다. 용기의 재질은 특별히 한정되지 않으며, 유기 재료 및 무기 재료 모두를 사용할 수 있다. 유기 재료로는, 구체적으로 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 아세트산비닐 수지, 폴리에틸렌비닐 수지, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리부타디엔, 폴리아크릴로니트릴 수지, 폴리메틸메타크릴레이트 수지, AS 수지(아크릴로니트릴과 스티렌의 공중합체), ABS 수지(아크릴로니트릴, 부타디엔 및 스티렌의 공중합체), AAS 수지(아크릴로니트릴, 아크릴산에스테르 및 스티렌의 공중합체), 폴리카르보네이트, 폴리아미드 수지, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 지방족 폴리에스테르, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 지방족 폴리아미드, 지환식 폴리아미드, 시클로올레핀, 폴리메틸펜텐, 폴리염화비닐, 폴리아세트산비닐, 폴리아릴레이트, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리이미드, 트리아세틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 수지, 질산 셀룰로오스 수지, 에폭시 수지, 폴리테트라플루오로에틸렌, 불화에틸렌폴리프로필렌 공중합체, 테트라플루오로에틸렌 퍼플루오로알콕시비닐에테르 공중합체, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 에틸렌테트라플루오로에틸렌 공중합체, 폴리불화비닐리덴, 폴리불화비닐, 실리콘 수지 등을 들 수 있다. 이들 유기 재료의 성형 방법으로는, 예를 들면 사출 성형, 무압착 성형, 사출 압축 성형, 사출 압착 성형, 압축 성형, 상호전달 성형, 절삭 성형, 광조형 등이 가능하다. 무기 재료로는, 구체적으로 니켈, 구리, 철, 알루미늄, 티탄, 실리콘 등의 금속; 실리카, 알루미나, 티타니아 등의 금속 산화물, 소다 유리, 붕규산 유리, 파이렉스(상표), 석영 유리 등의 유리 등을 들 수 있다. 이들 무기 재료는, 압착 성형, 판 에칭, 레이저 천공, 샌드 블라스트(sandblasting), 수지 또는 금속 용기의 표면 도포 등에 의해 예시되는, 성형 또는 표면 처리 가공 등의 각종 방법에 의해 용기 형상으로 만들 수 있다.

이들 DNA 칩, 프로테인 칩, 당쇄 칩 및 세포 칩은, 담체 상에 고정된 각종 프로브에 의해 유전자 기능 해석; 유전자 발현 해석; 기능 프로테오믹스 또는 구조 프로테오믹스; 질병 해석, 각종 감염증 등의 질병의 나환 상황을 확인하기 위한 임상 검사; 유전자 다형의 검출; 테일러 메이드 용법 또는 화학요법이라고 하는 환자의 유전자 서열에 따른 치료 의약의 선정; 핵산, 단백질, 세포, 또는 당쇄와 화학 물질의 상호 작용 연구, 오펀(orphan) 수용체 리간드 탐색; 톡시코게노믹스(toxicogenomics)라고 하는, 의약품 개발을 위한 약리 스크리닝 또는 화학 물질의 안전성 및 독성의 스크리닝; 그 밖의 각종 스크리닝 등에 응용할 수 있다. 또한, 특정한 피검체와 특정한 프로브의 조합에 의해, 면역 분석, 단백질-DNA, 단백질-단백질 등의 상호 작용 분석, 단백, 당쇄, 세포-리간드 분석, 리셉터 리간드 분석, 키나제 등의 효소 분석 등의 각종 분석계를 조직할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 젯팅 디바이스, 바이오 잉크 저장소(reservoir) 및 드라이브 장치(strobe interface)를 포함하고, 생체분자를 기판의 나노 지지체에 비접촉적으로 고착하기 위한 잉크젯 프린팅 장치에 관한 것이다. 젯팅을 실시간으로 관찰하고 조절하기 위한 모니터링 장치(관측 디바이스)를 추가로 포함할 수 있고, 상기 젯팅 디바이스의 노즐은 분사하는 바이오 잉크에 포함된 생체분자의 크기에 따라 선정될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 모니터링 장치로 ccd 카메라를 사용하였으며, 젯팅 디바이스의 노즐은 젯팅한 조류 세포로 막히지 않을 크기인 50 ㎛ 직경의 노즐을 선정하여 사용하였다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 압전 방식 잉크젯 프린팅 시스템 수립

본 발명에 따른 드랍온디맨드-압전 방식의 잉크젯 프린팅 시스템은 젯팅 디바이스 (도 2의 사진 nozzle & ink, 도 2의 도식 print head 부분)와 잉크 저장소(도 2의 도식 reservoir), 드라이브 장치(도 2의 도식의 Drive Electronics Box, strobe interface Box) 및 관측 디바이스 (도 2의 사진 CCD camera, 도 2의 도식 Video Camera and lens, Camera Power Supply 및 Video Monitor)을 포함하고 있다 (도 2). 구체적으로, 노즐 헤드에 인가되는 전압의 크기는 -100 내지 100 V의 전압 레벨로, 전압을 가하는 시간 (전압 인가 시간)을 0 내지 800 μs로 제어하여 인가한 전기적 신호를 압전체가 압력으로 전환하여 노즐의 크기에 상응하는 액적을 젯팅시켜 액적의 토출을 조절하였으며, 한 주기의 파형(waveform)을 110 VAC 장치를 사용하여 제어하여 동일한 펄스를 반복적으로 줌으로써 동일한 젯팅을 가능하게 하였다. 파형은 양극성(bipolar) 형태를 사용하며, 조절 가능한 변수는 파형의 최고점 및 최저점인 인가 전압 V1 및 V2가 있고, 해당 전압을 올리거나 유지시키는 시간인 t rise, t dwell, t fall, t echo 및 t fries가 있다 (도 3). 프린팅에 사용하는 노즐은 10 내지 60 ㎛의 직경을 가지고 있는데, 본 발명에서는 세포의 크기가 약 5 ㎛ 이상인 점을 감안하여 세포로 인해 막히지 않을 크기인 50 ㎛ 직경의 노즐을 선정해서 사용하였다. 본 발명의 잉크젯 프린팅 시스템은 토출되는 액적을 시스템에 장착된 ccd 카메라 (charge-coupled device camera)를 통해 확인하면서 인가 조건을 조절하여 액적의 크기 및 모양, 속도를 제어할 수 있다.

실시예 2. 살아있는 세포 잉크 제작 및 최적화

본 발명에서는 살아있는 세포로 개체별 생존력이 뛰어나고 광합성에 용이한 녹조류에 속하는 클라미도모나스 레인하르티이(chlamydomonas reinhardtii) 종을 사용하였다. 상기 세포를 원활하게 배양하기 위한 용매로써 수계 기반의 TAP(tris-acetate-phosphate) 배지에 분주한 뒤 세포의 농도를 유지하고 응집체를 최소화하기 위해 3000 rpm에서 5분 정도 원심분리를 수행하여 적절한 농도의 세포를 유지하였다. 상기 용매에는 tris(hydroxymethyl)-aminomethan, TAP 염, 포스페이트 용액, 미량 원소 용액, 아세트산 등이 추가로 포함될 수 있다. 세포 잉크의 액적이 꼬리가 생성되지 않고 안정적으로 토출되기 위해서는 70 mN/m 이하의 표면장력이 필요했으며, 이를 위해, 세포의 냉장보존 시 사용하는 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가제로 추가하고 표면장력 변화에 따른 액적의 형태를 ccd 카메라로 확인하였다. 그 결과, 83 mN/m인 TAP 배양액의 표면장력이 DMSO를 첨가한 부피%에 따라 표면장력 값이 약 63 mN/m까지 표면장력이 줄어들었으며, 액적의 꼬리가 끊어지는 시점을 확인함으로써 낮은 표면장력에서 액적 토출이 안정적임을 알 수 있었다 (도 4).

실시예 3. 잉크젯 프린팅을 이용한 세포 패터닝

프린팅 인가 조건에 따른 액적 젯팅 및 패터닝 확인

상기 실시예 2에서 최적화시킨 세포 잉크를 잉크젯 프린팅을 통해 300 ㎛ 간격 10x10로 평면에 수직으로 나노팁이 세워져 있는 기판에 패터닝하였다. 구체적으로, 프린팅 노즐을 진공 세척 및 소닉케이션을 통해 이물질이 없는 상태로 셋팅을 한 다음, 포토샵 프로그램을 이용하여 300 ㎛ 간격의 10x10 점 어레이 패턴을 제작하여 시스템에 입력하였다. 웨이브폼 에디터 내에서 액적을 fire 상태로 둘 경우 초고속으로 찍은 ccd 카메라 이미지를 모니터링하면서 인가 전압과 시간을 조절하게 되면 액적의 모양과 크기, 초기 젯팅 속도 등을 조절할 수 있었다. 액적의 움직임이 비교적 안정적인 조건을 선정하여 프린팅을 진행하였으며, fire 상태에서 시간을 경과했을 때, 액적 생성 자체는 가능하나 액적이 흔들리면서 유지가 불안정한 조건의 경우 일정한 젯팅이 불가능하기 때문에 사용하지 않았다. 이 때, 메니스커스(meniscus) 레벨과 노즐의 높이 등도 조절이 가능하지만, 주변의 다른 변수에 의한 영향을 최소화시키기 위해 고정시킨 상태(meniscus level 65%, 노즐 높이 2 mm)에서 패터닝한 뒤 인가 조건의 변화에 따른 액적의 변화를 확인하였다. 그 결과, 일반적인 경우에서 인가 시간 t rise 및 t dwell이 커질수록 액적의 직경이 커지고, 인가 전압 V1 및 V2가 커짐에 따라 액적의 속도가 빨라지는 경향성을 확인할 수 있었다. 프린팅하고자 하는 액적의 직경과 속도를 맞추기 위해서 메인 변수로 V1과 t rise 및 t dwell의 범위를 먼저 정하였고, 다른 변수들의 유기적인 조절을 통해서 액적을 구형으로 유지하였다 (도 5 및 표 1). 또한, 기판의 동일 포지션에 각각 100번씩 프린팅을 한 뒤 컨포컬을 통해 확인을 한 결과, 많은 양의 액적이 뭉쳐짐에 따른 융합은 있었으나, 패턴 자체는 정상적으로 젯팅 되었다 (도 6)

변수	①	②	③	④	⑤	⑥	⑦
t rise	14	15	10	10	10	11	12
V1	34	50	38	41	50	55	54
t dwell	19	18	18	20	18	15	18
t fall	27	24	32	25	30	33	34
V2	-28	-40	-30	-35	-40	-40	-48
t echo	10	15	15	15	15	15	15
t frise	10	10	10	10	10	10	15
r	58.392	55.927	53.855	55.657	51.426	47.852	54.664
v0	0.967	1.731	1.025	1.196	1.167	1.667	1.433

패터닝된 액적의 산포 오차 범위 확인

패터닝한 기판에서 각 dot의 x-위치 및 y-위치를 측정하고 (표 2), 기준점을 선정한 뒤 프린팅에 따른 격자 위치를 계산하여 프린팅 격자와 실제 격자 간 편차를 계산하여 젯팅된 액적의 산포 오차 범위가 10.7 ㎛임을 확인함으로써, 액적의 크기 및 나노팁 어레이의 간격에 비교해 안정적인 젯팅이 되어 타겟에 대한 고착화를 가능하게 함을 알 수 있었다 (도 7).

dot	X[um]	Y[um]
1	145	1777.5
2	450	1775
3	760	1785
4	1050	1780
5	1370	1780
6	1660	1782.5
7	1962.5	1785
8	2262.5	1785
9	130	1522.5
10	440	1535
11	747.5	1545
12	1047.5	1545
13	1655	1542.5
14	1960	1540
15	2255	1535
16	135	1280
17	430	1280
18	740	1285
19	1047.5	1287.5
20	1647.5	1280
21	1957.5	1287.5
22	2255	1280
23	130	1027.5
24	1047.5	1040
25	1347.5	1042.5
26	1642.5	1037.5
27	2252.5	1040
28	130	780
29	1042.5	790
30	1642.5	787.5
31	132.5	525
32	1040	540
33	1640	537.5
34	1945	535
35	127.5	267.5
36	1035	287.5
37	1335	292.5
38	1637.5	287.5
39	1942.5	290
40	2240	287.5

패터닝된 액적의 선폭 확인

패터닝 된 액적의 선폭을 확인한 결과, 선폭이 50 내지 100 ㎛ 정도임을 확인할 수 있어, 세포 단위의 패터닝이 가능함을 시사하였다 (도 8).

실시예 4. 세포 삽입 및 고착화 확인

세포를 잉크젯 프린팅한 나노팁이 있는 기판을 광학 이미징을 위하여 플레이트에 옮긴 후 주사와 주사 바늘을 이용하여 TAP 배양액을 투여하였다. 이 때 삽입된 세포가 배양액 투여로 인해 빠지지 않도록 벽면을 따라 배양액을 조금씩 투여하여 기판이 완전히 잠기도록 하였다. 그 후, 정립형 광학 현미경을 통해 상기 기판을 확인하고, 마이크로피펫을 이용하여 삽입 및 고착화에 대한 직접적인 조사하였다. 그 결과, 세포를 포함한 액적에 나노팁이 삽입되지 않은 (나노팁에 세포가 고착되지 않은) 경우에는 마이크로피펫으로 직접 세포를 밀면 나노팁에 연관성이 없이 밀려나는 것을 확인하였으나 (도 9a), 세포를 포함한 액적에 나노팁이 삽입된 (나노팁에 세포가 고착된) 경우에는 세포 부분만 한쪽으로 밀면 액적의 내부에 있던 나노팁이 부러져 밀기 전 수직 상태의 음영이 사라지고 나노팁이 완전히 누워있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9b) (검은 색 어레이는 나노팁을 나타내고, 음영을 가지는 것이 기판에 수직 상태를 유지하고 있는 나노팁을 나타낸다.). 어레이 진행시 프린팅되는 힘에 의해서 나노팁이 부러지지 않음을 확인하였으므로, 도 9b의 경우, 나노팁에 세포가 포함된 액적이 걸려서 고착화 되어있는 모양이었음을 알 수 있었다. 마이크로피펫의 구멍을 통한 유압을 줌으로써 세포의 움직임을 관찰한 결과, 마이크로피펫의 유압의 방향에 따라 고착되지 않은 세포는 움직이지만, 고착된 세포는 완전히 날아가지 않고 나노팁에 걸린 상태를 유지하였고 유압을 제거했을 때 다시 원래 자리로 되돌아 오는 것을 확인하였다 (도 9c). 이를 통해, 잉크젯 프린팅 공정을 통해 나노팁 어레이에 세포를 포함하는 액적이 삽입되어 나노팁에 고착화되었음을 알 수 있었다.

어레이 기판에 수직 방향으로 세워져 있는 나노팁에 살아있는 세포를 잉크젯 프린팅 방법으로 젯팅한 결과, 세포를 내부에 포함하는 액적이 나노팁에 삽입되어 고착된 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 기판에 세포가 비접촉적으로 부착되어 세포 주변이 기판과 접하지 않으므로 실제 생물체 내에 존재하는 세포를 모방할 수 있으며, 평면 기판에 접촉되어 부착된 세포에 비해 훨씬 더 넓은 표면적으로 다른 물질과 세포가 상호작용을 할 수 있어, 이를 이용하여 항생제 개발을 위한 시약 검색용 바이오칩, 질병 확인을 위한 의료용 바이오칩 또는 조직공학용 제품에 이용할 수 있는 효과가 있다.

Claims (16)

1. 생체분자를 기판에 접촉시키지 않고 나노 지지체에 고착하는 방법으로서,
   생체분자를 포함하는 수계 기반 배양액의 잉크를 잉크젯 프린팅하여 나노 지지체 구조물에 고착하고,
   상기 나노 지지체는 실리콘, 실리콘산화물 (SiO2), 금, 은, 구리, 주석산화물 (SnO2), 탄소, 텅스텐 또는 폴리머로 이루어지고, 상기 나노 지지체는 나노팁, 나노 탐침, 나노 닷, 나노 스피어, 나노 와이어 및 나노 튜브로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 형태이고,
   상기 잉크의 표면 장력은 70 mN/m 이하이며, 점도는 30 mPa·s 이하이며,
   상기 잉크젯 프린팅의 인가 전압은 -100 V 내지 100 V이고, 인가 시간은 1 μs 내지 800 μs이며, 1 Hz 내지 2000 Hz의 진동수 하에서 0% 내지 100%의 메니스커스 레벨을 가지며, 상기 잉크젯 프린팅에 의해 젯팅되는 액적은 40 내지 70 ㎛의 직경을 가지고 0.5 내지 3 m/s의 속도로 토출되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 생체분자는 진핵세포, 원핵세포, DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), 단백질, 올리고펩타이드, 당류 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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5. 제 1항에 있어서, 생체분자를 포함하는 잉크가 기판의 나노 지지체에 충돌하여 삽입됨으로써 잉크 내부에 분산되어 있는 생체분자를 기판에 접촉시키지 않고 나노 지지체에 고착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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8. 제 1항에 있어서, 상기 잉크젯 프린팅은 연속젯팅(continuous-jet), 드랍온디맨드(drop-on-demand)-가열(thermal) 및 드랍온디맨드-압전(piezo electric) 방식으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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12. 제 1항에 있어서, 상기 수계 기반 배양액에 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(tris(hydroxymethyl)-aminomethan), TAP(tris-acetate-phosphate) 염, 포스페이트 용액 및 아세트산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 상기 수계 기반 배양액에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 5 내지 15 부피%로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항의 방법으로 생체분자를 기판에 접촉시키지 않고 나노 지지체에 고착시킨 기판.
15. 제 14항의 기판을 포함하는 바이오칩.
16. 삭제

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