JP4530991B2 - マイクロインジェクション方法および装置 - Google Patents
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Description
好ましくは、前記針は、前記細胞に挿入される範囲では光学分解能を超える細さの直径を有する。
好ましくは、前記針は、前記細胞に挿入される範囲では50〜100nmの直径を有する。
好ましくは、前記針によって形成される前記細胞の細胞膜の針穴は、前記培養液中に散在する前記生理活性物質を前記細胞に導入する導入経路となる。
好ましくは、前記針は、当該針が前記培養液中にあるときに正の電圧が印加され、前記細胞に挿入されたときに負の電圧が印加される。
本発明の方法においては、500nm以下の直径を有する針の周囲に生理活性物質を付着させ、該針を細胞内に挿入することによって、生理活性物質を細胞内に導入する。
なお、導電性(帯電性)を有する表面の針を用いることだけですみ、特に、生体分子に合わせた修飾を針表面に施すことは必要としない。
従来例に示されているような金属酸化物ウィスカーに金(Au)又は白金(pt)等を蒸着・スパッタなどの装置を用いて表面が導電性を有するようにした針。また、原子間力顕微鏡のカンチレバーとして多用されているシリコン製カンチレバーに金(Au)又は白金(pt)等を蒸着・スパッタなどの装置を用いて表面が導電性を有するようにした針なども使用できる。なお、シリコン製カンチレバーは針先部をIPCやFIBなどの装置を用いてエッチングし、先鋭化した後に、導電膜を形成することにより、生細胞への侵襲度はさらに、低減することができる。また、シリコン製のカンチレバーの場合、エッチングにより針先にテーパー形状を有することにより、針強度を向上することができる。なお、前記の針は、細胞内に挿入される範囲で50〜500nmの直径を有する針であることが、細胞へのダメージを低減する上で必要であり、前述のテーパー形状を有する場合の針の場合も、細胞内に挿入される範囲で50〜500nmの直径を有する形状となっている。
本発明の方法の一例としては、以下の工程を行うことができる。
(1)針を正に帯電させる工程;
(2)負に帯電した生理活性物質を含む溶液中に針を浸し、針の周囲に生理活性物質を付着させる工程;
(3)細胞内の標的部位に針を挿入して細胞内に生理活性物質を導入する工程;
(4)針を細胞から抜き、針を負に帯電させて針の周囲に残存した生理活性物質を除去する工程;および
(5)上記(1)〜(4)を繰り返すことにより、複数の細胞に、細胞毎に所望の同一または異なる少なくとも1種類以上の生理活性物質を導入する工程:
図1に本発明の方法の概要を示す。図1は駆動手段9に接続されたカンチレバー1に装着された針2が、細胞3の真上の位置と、生理活性物質を含む溶液8を含む容器7の真上の位置との間を移動することを両方向の矢印を用いて示す。細胞3はシャーレ5の内部で培養されており、シャーレ5は細胞保持手段6の上に設置されている。
図2に示されるようにマイクロインジェクション装置は倒立型顕微鏡のステージ上に構成されており、遺伝子導入開始からその後の経過を観察・計測できるものである。顕微鏡ステージ上には温度環境を37℃に維持するための保温箱12が構成され、その内部に、マイクロインジェクション装置が設置される。
保温箱の内部に形成された顕微鏡ステージ上には、標本となるシャーレ(ディッシュやマイクロプレート等)や、遺伝子DNAを含む溶液の入ったサンプルカップなどの容器18や、針を洗浄する洗浄槽19などがモータなどで動作するXYステージ20上に構成されている。
よつて、遺伝子導入用の針の下には、標本16、容器18、洗浄槽19が移動してくることができ、同様に、標本内の全エリアを観察することができる。
一方、遺伝子DNA溶液が入った容器18や洗浄槽19に下降する場合は、厳密な高さ制御は不要であるためZ軸ステージ24による粗動作だけでよい。
(1)針の洗浄:遺伝子導入用の針21の下に洗浄槽19が位置し、洗浄槽19内に針21が下降する。洗浄槽19内には、洗浄水(滅菌水)などが貯留されており、針21が確実に浸漬された状態で、針21に交番電圧が印加される。針先に付着したゴミや前回付着させた遺伝子DNAを除去する。例えば、図5のように、印加電圧としては±5Vの100HZの交番電圧を印加する。これにより、針表面の不純物が除去される。好ましくは、洗浄槽19を超音波洗浄化したり、酸又はアルカリなどの薬品洗浄槽と滅菌水洗浄槽を2つ設けてもよい。
(2)その後、洗浄槽19から針21は上昇し、その過程で、針先をエアーブローなどにより、乾燥させてもよい。
(3)次に、針下に遺伝子DNA溶液が入った容器18が移動され、その中に針21が下降する。溶液に浸漬された状態で、針表面に正の電圧を印加する。例えば、印加電圧を1V、印加時間を3秒間以上とする。これにより、遺伝子DNAが負の極性を有しているため、針表面に付着する。その後、針先は上昇し、標本16が針下に位置される。この間、針先に電圧を印加していても、しなくてもよい。
(4)針先が標本16のシャーレ内に下降する際には、針21への印加電圧を停止し、細胞表面付近まで粗動作で下降し、その後、微動作で細胞核27に針21を下降させる。
(5)針21の移動が停止した後、針先へ負の電圧を印加し、針表面の遺伝子DNAを離脱させ、細胞内(細胞核内)に放出する。例えば、印加電圧は−0.5V、印加時間は1秒程度である(針の遺伝子DNAが離脱するために十分な時間の電圧を印加することが望ましい)。遺伝子DNAを保持してから放出するまでの電圧波形を示すと、図6のようになる。
(6)電圧印加終了後、針21を上方に移動させ、洗浄槽19にて針21を洗浄し、異なる遺伝子DNAが入った容器にて別の遺伝子DNAを針表面に保持し、別の細胞に放出する。
なお、針先への印加電圧は上述に限られるものではなく、例えば、図8や図9に示される電圧パターンでもよい。図8においては、遺伝子DNAを保持する時間を短縮し、針先への遺伝子DNAの付着量を少なくすることができる。つまり、導入される遺伝子DNAの量は、このときに付着される量に左右されるため、電圧値を小さく、印加時間を短くすると、付着量は少なくなり、逆を行えば、付着量を多くすることができ、導入量も増加する。細胞への遺伝子導入量に変化(差)を設ける場合の手段として、有効である。また、図9は細胞核内に遺伝子DNAを放出する際に、針先への印加電圧を短い間隔でパルス電圧化(時間的に変化する電圧化)することにより、針先に付着した遺伝子DNAの剥離作用現象を助長し、ぼぼ全量の離脱を行うことができる。細胞内での電圧印加は全く影響がないとは言えず、刺激となりうる。このため、印加時間は少ないほど好ましく、例えば、印加電圧を−1V、10HZにて10パルスの電圧を印加する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
培養シャーレ内で培養している神経細胞に対して、図1に記載の装置を用いてDNAを導入した。
神経細胞としてはPC12細胞(ラット副賢髄質クロム親和性細胞種より単離された神経系クローン細胞)を用いた。培地は、10%胎児ウシ血清(FBS)を含むDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)を用いた。培養は37℃、5%Co2の条件下で行った。DNAとしは、NGF受容体遺伝子を含む組み換え発現ベクターを使用し、1μg/mlのDNA溶液を使用した。
図1に記載の装置で使用した針は、図11に示される直径50nmおよび長さ3μmを有するカーボンナノチューブから成る針である。
なお、図12に示される針はシリコン製のカンチレバーをエッチングにより細径化し、表面に白金層が形成されている。こちらの針を用いて、Hela細胞への導入を実施した結果、同様に、DNAを導入後、3日経過後においてもHela細胞は生存していた。
一方、比較例として、直径50nmおよび長さ3μmを有するカーボンナノチューブから成る針を使用する代わりに、上記と同じDNA溶液を充填したガラスピペット(内径300μm)を用いて、マイクロインジェクションを行った。マイクロインジェクション後、神経細胞を培養したが、3日後までに神経細胞死んでしまい、生存している細胞は皆無であった。
Claims (7)
- 培養液中の細胞に生理活性物質を導入するマイクロインジェクション方法であって、前記培養液中に前記生理活性物質を散在させる工程と、前記生理活性物質が散在された前記培養液中の細胞に対し、光学的分解能を超えるくらいの細さである500nm以下の直径を有する針の移動を制御する工程とを含むことを特徴とする、マイクロインジェクション方法。
- 培養液中の細胞に生理活性物質を導入するマイクロインジェクション装置であって、前記細胞内に挿入される光学的分解能を超えるくらいの細さである500nm以下の直径を有する針と、前記生理活性物質が散在された前記培養液中の細胞に対する前記針の移動を制御する駆動手段とを有することを特徴とするマイクロインジェクション装置。
- 前記生理活性物質が核酸であることを特徴とする請求項2に記載のマイクロインジェクション装置。
- 前記針が、前記細胞に挿入される範囲では50〜100nmの直径を有することを特徴とする、請求項2に記載のマイクロインジェクション装置。
- 前記針が、高速な動作周期で往復運動され、前記細胞の細胞膜に針穴を形成することを特徴とする、請求項2に記載のマイクロインジェクション装置。
- 前記針によって形成される前記細胞の細胞膜の針穴が、前記培養液中に散在する前記生理活性物質を前記細胞に導入する導入経路となることを特徴とする、請求項2に記載のマイクロインジェクション装置。
- 負の電荷を有する生理活性物質が前記培養液中に散在するときに前記針に正の電圧が印加され、前記細胞に挿入されたときに前記針に負の電圧が印加されることを特徴とする、請求項2に記載のマイクロインジェクション装置。
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