JP5086620B2

JP5086620B2 - 遺伝子導入装置及び方法

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Publication number: JP5086620B2
Application number: JP2006324933A
Authority: JP
Inventors: 清彦館山
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2012-11-28
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Also published as: JP2008136401A; EP2116592A1; WO2008065811A1; US8343765B2; US20090291502A1

Description

本発明は、細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置及び方法に関する。

特許文献１には、微細針先端に遺伝子等の導入物質を電気的に吸着させ、この微細針を細胞内に侵入させて、この微細針にパルス電圧を印加することにより、細胞内に導入物質を導入するマイクロインジェクション方法及び装置が開示されている。ここで、微細針の侵入は、微細針と同軸に伸縮する圧電素子を用いて微動することにより行うようになっている。
ＷＯ０４／０９２３６９号公報

上記特許文献１は、微細針先端部に遺伝子を保持する方式であり、細胞に対して低侵襲で遺伝子を導入することが可能で、高い生存率を得ることができる。

しかしながら、カンチレバー先端の微細針の細胞内への侵入容積は微小であり、また、細胞膜が流動性を有しているために、微細針の先端が細胞内に侵入したと思われる位置までカンチレバーを移動させても、細胞膜が流動的に針部の表面を覆ってしまい、細胞膜を貫通させることができない場合がある。このため、遺伝子導入が安定せず、良好な導入率を得ることができないという不都合がある。

本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、低侵襲で生存率を高く維持したまま、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することを目的とする。

本発明の遺伝子導入装置の一態様は、基板上に有る細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で前記細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が前記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備える針部と、
前記微細針の先端が前記基板に接触する位置よりも前記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げることにより、前記微細針の先端を前記基板に対して摺動させる駆動手段と、
を具備し、
前記摺動させられた前記微細針の先端により、前記細胞の細胞膜に孔が形成され、前記孔に前記培養液が流通することにより、前記培養液中に分散された遺伝子が前記細胞内に流入する
ことを特徴とする。

また、本発明の遺伝子導入方法の一態様は、基板上に有る細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が前記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備えた針部を用いて、当該細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
導入される遺伝子が分散された培養液中で、前記微細針を細胞に挿入する工程と、
前記微細針の先端が前記基板に接触する位置よりも前記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げることにより、前記微細針の先端を前記基板に対して摺動させる工程と、
前記摺動させられた前記微細針の先端によって、前記細胞の細胞膜に孔が形成される工程と、
前記孔に前記培養液が流通することにより、前記培養液中に分散された遺伝子が前記細胞内に流入する工程と、
を有することを特徴とする。

本発明によれば、細胞外の溶液中に遺伝子を分散させ、微細針を基板まで降下して細胞を貫通した状態で、微細針と基板とを摺動させることで細胞膜を破断し穿孔することにより、細胞内に溶液を流通させ遺伝子を導入することができるので、低侵襲で、生存率が高く、導入効率も高い遺伝子導入装置及び方法を提供することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。

［第１実施形態］
まず、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図１乃至図６を参照して説明する。

本実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、図１に示すように、細胞を観察するための倒立型顕微鏡１２に備えられる。

倒立型顕微鏡１２は、細胞を収容したワーク１４を載置するワークホルダ１６と、該ワークホルダ１６上の細胞を照明する照明装置１８と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置２０と、上記ワークホルダ１６をＸ方向及びＹ方向に移動する顕微鏡ＸＹステージ２２と、該顕微鏡ＸＹステージ２２を駆動制御する顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４と、上記照明装置１８及び観察装置２０を制御する顕微鏡コントローラ２６と、上記観察装置２０により得られた画像を処理する画像処理装置２８と、該画像処理装置２８により処理された画像を表示するモニタ３０を有し、上記遺伝子導入装置１０及び該倒立型顕微鏡１２の全体を制御する制御コンピュータ３２と、を備えている。なお、ワーク１４は、細胞の観察を行えるよう、少なくともその基板は透明な材料、例えばガラスで形成されている。

また、上記照明装置１８には、細胞に対して、上記観察装置２０とは反対側から照明光を照射する透過照明光源３４と、該透過照明光源３４から発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ３６と、細胞に対して上記観察装置２０と同一方向から照明光を照射する落射照明光源３８とが備えられている。

一方、上記観察装置２０には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤカメラ４０と、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ４２とが備えられている。

そして、本実施形態に係る遺伝子導入装置１０は、上記倒立型顕微鏡１２のワークホルダ１６近傍に配置され、細胞に対して挿入される微細針である導入針４４と、該導入針４４を保持する導入針保持具４６と、該導入針保持具４６を移動させることで上記導入針４４を移動させる駆動ユニット４８と、該遺伝子導入装置１０を制御するコントロールボックス５０と、を備えている。ここで、駆動ユニット４８は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に導入針４４を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。

上記導入針４４は、図２（Ａ）に示すように、カンチレバー５２の自由端側に、該カンチレバー５２の長手方向に対して交差する方向に延びるように設けられている。カンチレバー５２は取付部材５４に固定され、該取付部材５４は、Ｚ軸アクチュエータ５６を介して導入針保持具４６のアーム４６Ａに固定されている。これにより、カンチレバー５２は斜め下向きに保持され、導入針４４はカンチレバー５２の自由端において、先端を鉛直下方に向けて保持されている。

カンチレバー５２は、図２（Ｂ）に示すように、可撓性を持つシリコンベース部５８と、先端に微細な導入針４４が形成されたレバー部６０とから構成されており、上記取付部材５４に対して交換可能に固定される。従って、このカンチレバー５２を交換することで、コンタミネーションのおそれなく、該遺伝子導入装置１０を繰り返し使用することができる。

上記取付部材５４と導入針保持具４６との間に配置されたＺ軸アクチュエータ５６は、例えば、積層された圧電素子により構成され、その印加電圧に応じて伸縮する。図２（Ａ）に示すようにＺ軸アクチュエータ５６は取付部材５４と導入針保持具４６との間に垂直方向に配置されているので、印加電圧を調整することにより導入針保持具４６に対して取付部材５４を垂直方向に微小変位させ、該取付部材５４に鉛直下向きに取り付けられている導入針４４の先端を垂直方向に微小距離、移動させることができるようになっている。

上記コントロールボックス５０は、駆動ユニット４８を制御する駆動ユニット制御回路６２と、Ｚ軸アクチュエータ５６を制御するアクチュエータ制御回路６４と、上記導入針４４の先端が上記ワーク１４の基板面に接触したかどうかを検出する針・基板面検出部６６と、を備えている。

このように構成された本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いた遺伝子導入方法について以下に説明する。

本実施形態に係る遺伝子導入装置１０を用いて、ワーク１４内の培養液中で培養される細胞に遺伝子を導入するには、まず、細胞培養液中に、遺伝子導入物質を分散させる。そして、顕微鏡ＸＹステージコントローラ２４及び顕微鏡コントローラ２６を作動させ、顕微鏡ＸＹステージ２２の作動により観察したい細胞を顕微鏡観察下に配置する。その後、駆動ユニット制御回路６２の作動により駆動ユニット４８を作動させ、カンチレバー５２の導入針４４を細胞の上方から細胞に近接させる。ワーク１４の基板上に播種された細胞は、２μｍ〜１０μｍ程度の厚みしかないため、この近接した位置からの微細な下降は、アクチュエータ制御回路６４の作動によりＺ軸アクチュエータ５６を作動させることにより行う。

Ｚ軸アクチュエータ５６を作動させることにより、図３（Ａ）に示すように、導入針４４を下降させワーク１４の基板７０へ近づけていく。これにより、導入針４４の先端が下降していく途中において、ワーク１４内の遺伝子が分散された培養液（以下、ＤＮＡ分散溶液６８）内に進入し、基板７０上に播種された細胞７２に接触する。ここで、更に導入針４４を下降させていき、細胞内、すなわち、細胞膜７４及び核７６に進入する。

そして、針・基板面検出部６６により、図３（Ｂ）に示すように、導入針４４の先端が基板７０面と接触する位置まで導入針４４を下降させたことを検出したならば、基板７０面との接触位置よりも更に導入針４４を降下させる駆動を行う。これにより、図３（Ｃ）に示すように、導入針４４の先端は基板７０面に対して摺動し、この摺動により破断箇所７８にて、細胞膜７４が破断し孔が空けられる。底面側も破断し、細胞膜７４の上面側及び底面側の２箇所の破断箇所７８間を貫通する孔が空けられる。

こうして形成された孔にＤＮＡ分散溶液６８が流通することにより、ＤＮＡ分散溶液６８中に分散した遺伝子が細胞７２内に流入する。

なお、導入針４４を上昇させて導入針４４を細胞７２から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜７４は自己修復により回復し、細胞７２内に遺伝子が取り込まれた状態となる。

このようにして、従来と同様に低侵襲で生存率は高いまま、本実施形態では、更に、遺伝子を細胞７２内に確実且つ高い導入効率で導入することができる。

なお、導入針４４の摺動方法は、上記のように基板７０面との接触位置よりも更に導入針４４を降下させることにより行う手法に限定されるものではなく、例えば、導入針保持具４６のアーム４６Ａも上記Ｚ軸アクチュエータ５６と同様に積層された圧電素子により構成し、該アーム４６Ａを伸縮させることで、導入針４４の先端が基板７０と接触した状態で導入針４４を水平移動させることにより行うこともできる。

勿論、駆動ユニット４８で微細なＸＹＺ方向の調整が可能な場合には、そのようなＺ軸アクチュエータ５６やアーム４６Ａを圧電素子で構成することは不要となる。

なお、上記針・基板面検出部６６による導入針４４と基板７０面との接触の検知方法としては、基板７０面及び導入針４４先端部の焦点位置を測定し、その測定値から相対的距離を算出する。これは、図４（Ａ）に示すように、コンフォーカル顕微鏡観察下もしくは暗視野照明観察下で、基板７０面及び導入針４４先端部に焦点位置を合わせることによりそれぞれの焦点位置Ｐ１，Ｐ２を測定し、
（Ｐ２−Ｐ１）×ＤＮＡ分散溶液６８の屈折率
の演算を行うことで、相対距離が求められる。そして、その求められた相対距離がゼロとなったときが、導入針４４先端が基板７０面に接触したときである。従って、常に測定しながら導入針４４を下降させていけばよい。しかしながら、一回検出を行えば、相対距離が求められるので、後どれだけ下降させればよいか判別でき、それに基づいて検出を行うことなく下降をさせていくようにしても構わない。

なお、図４（Ｂ）はコンフォーカル顕微鏡により、ガラス面に焦点を合わせたときの観察写真であり、このときの対物レンズの位置が焦点位置Ｐ１となる。図４（Ｃ）は同様にコンフォーカル顕微鏡により、導入針４４の先端に焦点を合わせたときの観察写真であり、このときの対物レンズの位置が焦点位置Ｐ２となる。

また、測定は、導入針４４の先端以外の特徴箇所に焦点を合わせて代用しても良い。例えば、導入針４４及びレバー部６０の寸法は既知であるので、図５に示すように、シリコンベース部５８とレバー部６０の境界８０に焦点を合わせて測定しても構わない。

あるいは、上記針・基板面検出部６６による導入針４４の基板７０面との接触の検知は、図６に示すように、顕微鏡画像下で、シリコンベース部５８の撓みによる導入針４４先端の基板７０面内での位置変化を検出することで行うこともできる。この場合、導入針４４先端部の基板７０面での位置変化から、所定の摺動量で引き上げを行う。

なお、測定は個別細胞毎に行っても良いし、観察エリアの１箇所で行い、その測定結果を当該観察エリア内の全ての細胞に対して適用するようにしても良い。

［実施例１］
図７（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した例であり、細胞が接着している基板面より、２〜３μｍ上方の細胞の水平断面像となる。蛍光色素はスルホローダミンを用いている。レーザ走査型顕微鏡では、この蛍光像を観察するため、細胞周辺の溶液部が観察されている。

本実施例１では、この細胞に対して、導入針４４を下降させ細胞内に進入した後、導入針４４先端部が基板７０面と接触した位置から、さらに下降させた。これにより導入針４４先端部を基板７０面上で３μｍほど摺動させ穿孔し、色素溶液を細胞内に導入することを試みている。図７（Ｂ）は、この結果を示す図である。孔を空けた細胞には、細胞周辺の色素溶液が流入するため、細胞内の蛍光強度が大きくなり、細胞内に取り込まれたことが確認できる。

［実施例２］
実施例１と同様に、ＨｅｌａＳ３細胞を遺伝子溶液中に浸漬し、導入を試みた例を示す、導入した遺伝子は、ＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子であり、導入の正否は蛍光観察により確認することができる。

図８（Ａ）は、遺伝子導入直後の導入を試みた細胞の顕微鏡観察像を示す。観察画像中の複数の細胞を選定し導入を試みている。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、導入２４時間経過後に導入の成否を確認した顕微鏡観察像である。図８（Ｂ）は、位相差観察像であり、２４時間経過後の細胞の状態を示している。図８（Ｃ）は、この細胞を蛍光観察により観察したものであり、導入が成功した細胞では、遺伝子が発現し強い蛍光強度が得られている。この結果より、非常に効率良く、細胞に遺伝子が導入されていることが確認できる。

［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法について、図９（Ａ）及び（Ｂ）を参照して説明する。

本第２実施形態では、図９（Ａ）に示すように、カンチレバー５２のレバー部６０に、該レバー部６０の撓み量を検出するセンサ８２が取り付けられ、針・基板面検出部６６は、このセンサ８２を用いて導入針４４先端の基板７０面への接触状態を検出する。センサ８２としては、例えば撓み量によって抵抗値が変化するＰＺＴ等を用いることができる。

なお、レバー部６０の硬さは、細胞膜７４表面では撓まない硬さであり、且つ、高さ１０μｍ程度の撓みで先端が折損しない硬さとなっている。

Ｚ軸アクチュエータ５６を作動させることにより、導入針４４を下降させていく。これにより、導入針４４の先端が下降していく途中において、ワーク１４内のＤＮＡ分散溶液６８内に進入し、ワーク１４の基板７０上に播種された細胞７２に接触する。ここで、更に導入針４４を下降させていき、細胞内、すなわち、細胞膜７４及び核７６に侵入する。このとき、レバー部６０の硬さから、細胞７２と接触しても撓むことなく基板７０面まで降下する。

そして、導入針４４が基板７０面と接触すると、図９（Ｂ）に示すように、レバー部６０が撓み、センサ８２の抵抗が変化する。針・基板面検出部６６は、このセンサ８２の抵抗値の変化として現れる撓み量を検出することにより、導入針４４を基板７０面と接触する位置まで下降させたことを検出できる。そして、基板７０面との接触位置よりも更にレバー部６０が予め決められた所定量、例えば数μｍ撓む位置まで導入針４４を降下させる駆動を行う。即ち、センサ８２により検出される撓み量が所定の撓み量となるまで、駆動を続ける。そして、所定の撓み量となったならば、Ｚ軸アクチュエータ５６を収縮方向に駆動することで、導入針４４を引き上げる。これにより、導入針４４は基板７０面に対して摺動し、この摺動により、破断箇所７８にて細胞膜７４が破断し孔が空けられる。

以上のように、本第２実施形態によれば、導入針４４の基板７０面との接触が、基板７０の傾きや位置変化に左右されることなく、迅速に精度良く検出でき、細胞７２への侵襲を極力抑えて細胞膜７４を確実に破断することができる。

以上実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。

例えば、細胞内に導入する物質は、遺伝子に限らず、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できるものであれば良い。

（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。

（１）基板上に有る細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で上記細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が上記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備える針部と、
上記微細針の先端が上記基板に接触する位置よりも上記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げる駆動手段と、
を具備することを特徴とする遺伝子導入装置。

（対応する実施形態）
この（１）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、基板７０が上記基板に、細胞７２が上記細胞に、遺伝子導入装置１０が上記遺伝子導入装置に、ＤＮＡ分散溶液６８が上記導入される遺伝子が分散された培養液に、導入針４４が上記微細針に、シリコンベース部５８が上記可撓性支持部に、カンチレバー５２が上記針部に、駆動ユニット４８及びＺ軸アクチュエータ５６が上記駆動手段に、それぞれ対応する。

（作用効果）
この（１）に記載の遺伝子導入装置によれば、微細針と基板との間に細胞膜を挟みこんだ状態で摺動させるため、確実に細胞膜が破断し穿孔できる。また、孔が核内を貫通して形成されているため、遺伝子が核内を流通し効率良く核内に取り込まれる。遺伝子は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され高い導入効率が得られる。

また、微細針を用いるため、細胞に対するダメージを抑え、狙いとする細胞に対して遺伝子が導入できる。

（２）上記可撓性支持部は、上記微細針が上記細胞に押し当てられたときはその状態を維持し、上記微細針が上記基板に押し当てられたときには撓みを生じる硬さを有することを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。

（対応する実施形態）
この（２）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。

（作用効果）
この（２）に記載の遺伝子導入装置によれば、可撓性支持部は、微細針が細胞に押し当てられたときはその状態を維持するので細胞を穿孔でき、微細針が基板に押し当てられたときには撓みを生じることで破損することなく、微細針を摺動させることができる。

（３）上記可撓性支持部の撓み量を検出する検出部をさらに具備し、
上記駆動手段は、上記検出部の検出結果に基づいて所定の上記撓み量を生じる位置まで上記可撓性支持部を押し下げることを特徴とする（１）に記載の遺伝子導入装置。

（対応する実施形態）
この（３）に記載の遺伝子導入装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。その実施形態において、センサ８２が上記検出部に対応する。

（作用効果）
この（３）に記載の遺伝子導入装置によれば、検出部で可撓性支持部の撓み量を検出しながら上記可撓性支持部を押し下げるので、上記可撓性支持部の破損を防止できる。

（４）基板上に有る細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が上記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備えた針部を用いて、当該細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
導入される遺伝子が分散された培養液中で、上記微細針を細胞に挿入する工程と、
上記微細針の先端が上記基板に接触する位置よりも上記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げる工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。

（対応する実施形態）
この（４）に記載の遺伝子導入方法に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。

（作用効果）
この（４）に記載の遺伝子導入方法によれば、微細針と基板との間に細胞膜を挟みこんだ状態で摺動させるため、確実に細胞膜が破断し穿孔でき、遺伝子が効率良く細胞内に取り込まれる。遺伝子は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され高い導入効率が得られる。

（５）基板上に有る細胞へ導入物質を導入する導入装置において、
導入物質が分散された培養液中で上記細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が上記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備える針部と、
上記微細針の先端が上記基板に接触する位置よりも上記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げる駆動手段と、
を具備することを特徴とする導入装置。

（対応する実施形態）
この（５）に記載の導入装置に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。それらの実施形態において、基板７０が上記基板に、細胞７２が上記細胞に、遺伝子導入装置１０が上記導入装置に、ＤＮＡ分散溶液６８が上記導入物質が分散された培養液に、導入針４４が上記微細針に、シリコンベース部５８が上記可撓性支持部に、カンチレバー５２が上記針部に、駆動ユニット４８及びＺ軸アクチュエータ５６が上記駆動手段に、それぞれ対応する。

（作用効果）
この（５）に記載の導入装置によれば、微細針と基板との間に細胞膜を挟みこんだ状態で摺動させるため、確実に細胞膜が破断し穿孔でき遺伝子が効率よく細胞内に取り込まれえる。導入物質は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され高い導入効率が得られる。

また、微細針を用いるため、細胞に対するダメージを抑え、狙いとする細胞に対して物質が導入できる。

（６）上記導入物質は、遺伝子、色素、蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類の何れかであることを特徴とする（５）に記載の導入装置。

（対応する実施形態）
この（６）に記載の導入装置に関する実施形態は、第１及び第２実施形態が対応する。

（作用効果）
この（６）に記載の導入装置によれば、遺伝子を始め、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、溶液中に混濁できる物質を導入できる。

図１は、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入装置を示す全体構成図である。図２（Ａ）は、カンチレバー近傍の構造を示す拡大図であり、図２（Ｂ）は、カンチレバーの構造を示す拡大図である。図３（Ａ）乃至（Ｃ）はそれぞれ、本発明の第１実施形態に係る遺伝子導入方法を説明するための、カンチレバーに設けた導入針の一連の状態を示す図である。図４（Ａ）は、導入針と基板面との接触の検知方法を説明するための図であり、図４（Ｂ）は、基板のガラス面に焦点を合わせた場合の顕微鏡写真を示す図であり、図４（Ｃ）は、導入針の先端に焦点を合わせた場合の顕微鏡写真を示す図である。図５は、導入針と基板面との接触の検知方法の別の手法を説明するための図である。図６は、導入針と基板面との接触の検知方法の更に別の手法を説明するための図である。図７（Ａ）は、ＨｅｌａＳ３細胞を蛍光色素溶液中に浸漬し、レーザ走査型顕微鏡で観察した顕微鏡画像を示す図であり、図７（Ｂ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によって色素溶液を細胞内に導入した結果の顕微鏡画像を示す図である。図８（Ａ）は、第１実施形態に係る遺伝子導入装置及び方法によってＨｅｌａＳ３細胞にＧＦＰ蛍光タンパク質を発現する遺伝子を導入した直後の顕微鏡画像を示す図であり、図８（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ２４時間経過後の位相差観察顕微鏡画像及び蛍光観察による顕微鏡画像を示す図である。図９（Ａ）は、本発明の第２実施形態に係る遺伝子導入装置におけるカンチレバーの構造を示す拡大図であり、図９（Ｂ）は、導入針が基板面と接触してアーム部が撓んだ状態を示す図である。

符号の説明

１０…遺伝子導入装置、１２…倒立型顕微鏡、１４…ワーク、１６…ワークホルダ、１８…照明装置、２０…観察装置、２２…顕微鏡ＸＹステージ、２４…顕微鏡ＸＹステージコントローラ、２６…顕微鏡コントローラ、２８…画像処理装置、３０…モニタ、３２…制御コンピュータ、３４…透過照明光源、３６…コンデンサレンズ、３８…落射照明光源、４０…ＣＣＤカメラ、４２…接眼レンズ、４４…導入針、４６…導入針保持具、４６Ａ…アーム、４８…駆動ユニット、５０…コントロールボックス、５２…カンチレバー、５４…取付部材、５６…Ｚ軸アクチュエータ、５８…シリコンベース部、６０…レバー部、６２…駆動ユニット制御回路、６４…アクチュエータ制御回路、６６…針・基板面検出部、６８…ＤＮＡ分散溶液、７０…基板、７２…細胞、７４…細胞膜、７６…核、７８…破断箇所、８０…境界、８２…センサ。

Claims

基板上に有る細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入装置において、
導入される遺伝子が分散された培養液中で前記細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が前記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備える針部と、
前記微細針の先端が前記基板に接触する位置よりも前記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げることにより、前記微細針の先端を前記基板に対して摺動させる駆動手段と、
を具備し、
前記摺動させられた前記微細針の先端により、前記細胞の細胞膜に孔が形成され、前記孔に前記培養液が流通することにより、前記培養液中に分散された遺伝子が前記細胞内に流入する
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
前記可撓性支持部の硬さは、
前記微細針が前記細胞に押し当てられたときはその状態を維持する硬さであり、且つ、前記微細針が前記基板に押し当てられたときには撓みを生じる硬さであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
前記可撓性支持部の撓み量を検出する検出部をさらに具備し、
前記駆動手段は、前記検出部の検出結果に基づいて所定の前記撓み量を生じる位置まで前記可撓性支持部を押し下げることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入装置。
基板上に有る細胞へ挿入される微細針と、該微細針を支持し、該微細針が前記基板に押し当てられることによって撓みを生じる可撓性支持部と、を備えた針部を用いて、当該細胞へ遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
導入される遺伝子が分散された培養液中で、前記微細針を細胞に挿入する工程と、
前記微細針の先端が前記基板に接触する位置よりも前記可撓性支持部を当該基板に向かって押し下げることにより、前記微細針の先端を前記基板に対して摺動させる工程と、
前記摺動させられた前記微細針の先端によって、前記細胞の細胞膜に孔が形成される工程と、
前記孔に前記培養液が流通することにより、前記培養液中に分散された遺伝子が前記細胞内に流入する工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入方法。