JP4370397B2 - 物質細胞挿入の力学解析方法 - Google Patents
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Description
力学測定によって追跡する方法である。
しかしながら、エレクトロポレーション、顕微注入、リン酸カルシウム沈殿法などの慣用方法により細胞にDNAなどの物質を導入する場合、細胞に対する侵襲性が非常に大きい
ため、物質を導入された細胞の機能が低下することがしばしばであった。
(1) 細胞と挿入物の位置関係を検出しながら挿入物を細胞に挿入する方法であって、挿入物の先端形状が円筒形であり、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を測定することにより細胞と挿入物の位置関係を検出することを特徴とする方法。(2) 挿入物は原子間力顕微鏡(AFM)又は分子間力顕微鏡(MFM)のカンチレ
バー先端のプローブ上に固定され、カンチレバーの撓みを検知することで挿入物にかかる力を測定することを特徴とする(1)に記載の方法。
(3) 挿入物にかかる力の測定値をHertzモデルによって解析し、その挿入過程を予測
することを特徴とする(1)又は(2)に記載の方法。
(4)先端形状が円筒形である細胞に挿入される挿入物、挿入物の位置制御手段、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を連続的に測定する手段、挿入物にかかる力を解析して挿入物と細胞の位置関係を予測する手段を備えた、細胞と挿入物の位置関係を確認しながら細胞に挿入物を挿入するための装置。
本発明において、細胞は、酵母、バクテリア、真菌、酵母等の微生物、植物細胞、動物細胞が広く例示され、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどの哺乳動物細胞、特にヒト細胞(肝、腎、肺、心臓、神経、表皮、真皮、血管内皮、癌、悪性腫瘍などの細胞、各種幹細胞、を含む)である。
れる。
本発明においては、この原子間力顕微鏡のプローブ先端に、例えばカーボンナノチューブ、シリコン、シリコン結晶、チタン、ジルコニウム等の金属結晶、ZnO等の金属酸化物
等からなる挿入物を固定するか、あるいは、シリコン、窒化シリコン等からなるプローブ自身を挿入物として使用できる。
保できる。
B)に示す。
より、細胞に対する侵襲性を最小限に抑制しつつ、細胞内に挿入物を挿入することが可能である。
ことができる。
1 細胞に挿入する物質の作製
細胞にダメージを与えずに物質を挿入するために、挿入物質は直径が500 nm以下のものを用いる。ここでは、市販されているAFM用のシリコン製探針を切削したもの(直径100 -200 nm)を挿入物質として用いた(図1)。加工(切削)はFocused ion beam装置を用いたエッチングによって行った。先端の形状は、従来の円錐形のものに加え、円筒形のものを作製した。(図1)
2 力学測定方法
本手法では物質を有するシリコン探針にかかる力を測定することによって、挿入過程を解析する。そのため、測定には力学測定が可能なAFM、あるいは分子間力顕微鏡(MFP)を用いる。シリコン探針をAFM装置によって細胞に挿入するAFM装置の一部を図2に示した。AFM装置において、探針はピエゾ素子に固定されており、このピエゾ素子の延伸・収縮制御
によって上下に移動させることができる。探針はカンチレバーと呼ばれる板バネに取り付けられており、試料との間に力が働くことによって上方あるいは下方に反る。この反りをカンチレバーの背面に照射したレーザーの反射光の変位として力を検出することができる。ここでは、細胞としてメラノサイト細胞を用いた。細胞に挿入物質を下ろしていく際の顕微鏡像を図3に示す。
3 解析方法
先端の形状が円錐形の挿入物質をAFMのピエゾ素子によって細胞に近づけていったとき
に挿入物質にかかる力を測定した結果を図4Aに示す。この力学曲線において、縦軸は挿
入物質にかかっている力、横軸は挿入物質が圧入した深さを表す。図5にHertzモデルの
概要を示すが、圧入する物質の形状が円錐形ならば、物質にかかる力は圧入深さの2乗に比例し、圧入する物質が円筒形ならば、物質にかかる力は圧入深さに正比例することがわかる。すなわち、力が圧入深さに対してどのような変化を示すかによって、物質の挿入過程を予測するのである。先端の形状が円錐形の場合、物質にかかる力は二次曲線として上昇した後、一次直線として上昇する。その後物質が細胞内に挿入されて、かかっていた力が緩和される。一方、先端が円筒形の場合、図4Bに示したような一次直線で力が上昇し
、その後すぐに細胞内に挿入されて力が緩和される。この挿入過程は本発明の解析方法によって予測が可能である。それによれば、これら先端の形状の違う物質を細胞に挿入する過程において、円錐形の場合は2μm以上細胞を圧入した後にはじめて挿入されるが、円筒形の場合は1μm以下で挿入できている。すなわち、先端が円錐形のものに比べ、円筒
形のものは圧入による細胞の変形を最小限に抑えられる。細胞に対する物理的なストレスは種々の反応を惹起するため、円筒形状の物質を用いることによって細胞へのストレスを抑えることができる。
Claims (4)
- 細胞と挿入物の位置関係を検出しながら挿入物を細胞に挿入する方法であって、挿入物の先端形状が円筒形であり、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を測定することにより細胞と挿入物の位置関係を検出することを特徴とする方法。
- 挿入物は原子間力顕微鏡(AFM)又は分子間力顕微鏡(MFM)のカンチレバー先端のプローブ上に固定され、カンチレバーの撓みを検知することで挿入物にかかる力を測定することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 挿入物にかかる力の測定値をHertzモデルによって解析し、その挿入過程を予測すること
を特徴とする請求項1又は2に記載の方法。 - 先端形状が円筒形である細胞に挿入される挿入物、挿入物の位置制御手段、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を連続的に測定する手段、挿入物にかかる力を解析して挿入物と細胞の位置関係を予測する手段を備えた、細胞と挿入物の位置関係を確認しながら細胞に挿入物を挿入するための装置。
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