JPH10179174A - 植物の形質転換方法および形質転換植物の作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 形質転換率の高い、植物の形質転換方法およ
び形質転換植物の作出方法を提供する。 【解決手段】 次の（ａ）〜（ｄ）の各工程により、形
質転換植物を作出する。 （ａ）植物細胞又は植物細胞を含む組織を外来遺伝子お
よびウイスカとともに液体中に分散させる工程、 （ｂ）工程（ａ）の後に、遠心処理を行い、前記植物細
胞にウイスカを付着させる工程、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、超音波処理を行い、ウイスカ
を振動させて、前記植物細胞を穿孔せしめ、この孔から
細胞中に外来遺伝子を導入する工程。 （ｄ）工程（ｃ）で外来遺伝子が導入された植物細胞又
はこれを含む植物組織から植物体を再生する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、効率のよい植物の
形質転換方法および形質転換植物の作出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞に遺伝子を導入して植物細胞を形質
転換し、形質転換植物を得ようとする試みが、いくつか
知られている。

【０００３】例えば、シリコンカーバイドファイバーな
どのウイスカを用いて、植物細胞を液体混合下で激しく
混合し、その操作によって穿孔して、外来遺伝子を導入
する方法（以下、「ウイスカ法」と略す）（米国特許第
５３０２５２３号明細書、米国特許第７４７２５３８号
明細書、Ｋａｅｐｐｅｒ，Ｈ．Ｆ．ら、１９９２年、
「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第８４巻、５６０〜５６６頁、Ａ
ｓａｎｏ,Ｙ.ら、１９９１年、「Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ」、第７９巻、２４７〜２５２頁）、植物細胞に
超音波を照射して、細胞を部分的に損傷させ、損傷箇所
を通して遺伝子を導入する方法（Ｊｏｅｒｓｂｏ，Ｍ．
ら、１９９０年、「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒ
ｔｓ」、第９巻、２０７〜２１０頁、Ｊｏｅｒｓｂｏ，
Ｍ．ら、１９９２年、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌ
ａｎｔａｒｕｍ」、第８５巻、２３０〜２３４頁）があ
るが、いずれの方法によっても効率よく形質転換植物は
得られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来のウイスカ法や超
音波法による遺伝子導入方法では、形質転換体は得られ
難く、実用的な植物の形質転換方法とは言い難い。

【０００５】従って、双子葉および単子葉植物細胞に効
率的に遺伝子を導入し、形質転換植物を得る方法の開発
が望まれている。

【０００６】本発明は、上記の問題点を解決し、形質転
換率の高い、植物の形質転換方法および形質転換植物の
作出方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
目的を達成するために鋭意研究した。その結果、植物細
胞または植物組織を外来遺伝子およびウイスカとともに
液体中に分散させた状態において、遠心処理ならびに超
音波処理を行うことにより、外来遺伝子を細胞内に導入
して、外来遺伝子が発現する形質転換細胞を効率よく得
て、これを再生することにより、形質転換植物が得られ
ることを見い出した。

【０００８】すなわち、第１の本発明の要旨とするとこ
ろは、次の（ａ）〜（ｃ）の各工程を含む、植物の形質
転換方法にある。 （ａ）植物細胞又は植物細胞を含む組織を外来遺伝子お
よびウイスカとともに液体中に分散させる工程、（ｂ）
工程（ａ）の後に、遠心処理を行い、前記植物細胞にウ
イスカを付着させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の後に、超
音波処理を行い、ウイスカにより、前記植物細胞を穿孔
せしめ、この孔から細胞中に外来遺伝子を導入する工
程。

【０００９】また、第２の本発明の要旨とするところ
は、次の（ａ）〜（ｄ）の各工程を含むことを特徴とす
る形質転換植物の作出方法にある。 （ａ）植物細胞又は植物細胞を含む組織を外来遺伝子お
よびウイスカとともに液体中に分散させる工程、（ｂ）
工程（ａ）の後に、遠心処理を行い、前記植物細胞にウ
イスカを付着させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の後に、超
音波処理を行い、ウイスカにより、前記植物細胞を穿孔
せしめ、この孔から細胞中に外来遺伝子を導入する工
程。（ｄ）工程（ｃ）で外来遺伝子が導入された植物細
胞又はこれを含む組織から植物体を再生する工程。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下に本発明の方法を詳細に説明
する。本発明の植物の形質転換方法は、上記（ａ）〜
（ｃ）の各工程からなり、本発明の形質転換植物の作出
方法は、上記工程にさらに（ｄ）工程を付加したもので
ある。

【００１１】以下に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
の各工程を詳細に説明する。

【００１２】〔１〕工程（ａ） 分散工程 本発明は、植物細胞又は植物組織を、外来の遺伝子とウ
イスカとともに液体中に均ーに分散し、懸濁させた状態
にする工程である。

【００１３】本発明の方法が適用される植物は特に限定
されるものではなく、例えば、イネ、トウモロコシ、コ
ムギ、オオムギ、芝草、その他の単子葉植物、または、
タバコ、ダイズ、ワタ、トマト、ハクサイ、キュウリ、
レタスなどの双子葉植物などが挙げられる。

【００１４】本発明に使用される植物細胞としては、例
えば、カルスや懸濁細胞などの脱分化した培養細胞、不
定胚、苗条原基などが、植物組織としては、葉、根、
茎、胚、生長点などが挙げられるが、好ましくは、カル
スおよび懸濁細胞などの植物細胞である。

【００１５】また、本発明に用いられる培養細胞は、植
物由来のいかなる外殖であってもよく、例えば、胚盤、
生長点、花粉、葯、葉身、茎、葉柄、根由来のものが挙
げられる。

【００１６】また、本発明に用いられる培養細胞は、上
記した外殖片をカルス形成培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅら、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａ
ｎｔａｒｕｍ」、１９６２年、第１５巻、４７３頁〜４
９７頁）または、Ｒ２培地（Ｏｊｉｍａら、「Ｐｌａｎ
ｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」、１９
７３年、第１４巻、１１１３〜１１２１貢）、Ｎ６培地
（Ｃｈｕら、１９７８年、「Ｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ」、４３頁〜５
０頁）など、必須成分として無機塩成分およびピタミン
類を含む培地に、植物ホルモンとして、例えば、２，４
−ＰＡ（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃ
ｅｔｉｃａｃｉｄ）０.１〜５ｍｇ／リットル、ならび
に、炭素源として、例えば、ショ糖１０〜６０ｇ／リッ
トル、ゲルライト１〜５ｇ／リットルを添加した培地に
置床して培養することにより得られる。

【００１７】カルス形成培地に外殖片を置床した後、本
発明に用いられる培養細胞が得られるまでの培養期間は
特に限定されるものではないが、形質転換植物を得よう
とする場合には、当該培養細胞からの植物体再生が可能
であること、つまり、当該植物細胞が植物体再生能力を
保有している期間内であることが重要である。

【００１８】また、本発明に用いる培養細胞は植物体再
生能力を保有している培養細胞であれば、液体培地によ
る懸濁細胞であってよい。

【００１９】本発明に用いるウイスカ（whisker）と
は、微細な針状の構造を持った単結晶をいう。本発明に
用いるウイスカとしては、細胞に刺さり、細胞壁を貫い
て、細胞表面に孔を形成させ、この孔を経て、外来遺伝
子を細胞内に導入することができるものであれば、なん
ら限定されるものではないが、孔の寸法が細胞の大きさ
と比較して、大きすぎるものであってはならない。具体
的には、直径が０．０１〜１０μｍ、好ましくは、０．
５〜１μｍ、長さが、１〜１００μｍ、好ましくは３〜
４０μｍである。ウイスカ材質が、チタン酸カリウム、
炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、窒化ケイ素、酸
化亜鉛、塩基性硫酸マグネシウム、マグネシア、ホウ酸
マグネシウム、二ホウ化チタン、カーボングラファイ
ト、硫酸カルシウム、サファイア、シリコンカーバイド
などが挙げられ、好ましくはチタン酸カリウム、炭酸カ
ルシウム、ホウ酸アルミニウムである。

【００２０】本発明に用いるウイスカは、表面処理を行
わなくとも単独で使用することもできるが、ウイスカ表
面に塩基性官能基を持つウイスカ、好ましくは表面処理
剤により表面処理されているウイスカを使用することに
より形質転換率を高めることができる。その際の塩基性
官能基とは、１〜４級アミン類、２価金属錯体などによ
る塩基性官能基が挙げられるが、好ましくは、アミノ基
が用いられる。

【００２１】ウイスカ表面への塩基性官能基の付与に用
いる化合物は、ウイスカ表面と共有結合できる化合物で
あれば、特に限定されないが、好ましくは、シランカッ
プリング剤、より好ましくは塩基性官能基を有するシラ
ンカップリング剤である。シランカップリング剤として
は、３−（２−アミノエトキシルアミノプロピル）−ト
リメトキシシラン、３−アミノプロピル−トリエトキシ
シランなどの塩基性シランカップリング剤を挙げること
ができるが、塩基性官能基を有するシランカップリング
剤であれば、これらに限定されるものではない。

【００２２】本発明に用いられる外来遺伝子は、植物の
形質転換に用いられる核酸であり、ＤＮＡ、ＲＮＡを問
わないが、通常はＤＮＡが用いられる。ここで形質転換
とは、植物細胞内に遺伝子を導入することをいい、その
遺伝子の発現の有無は問わないが、植物細胞内でその遺
伝子が安定に保持されることが好ましい。また、遺伝子
は、タンパク質もしくはペプチド又はアンチセンスＲＮ
Ａ等をコードし、植物細胞内でこれらを発現するもので
あってもよいし、染色体中の遺伝子内部に挿入され、そ
の遺伝子の正常な発現を阻害するものであってもよい。

【００２３】本発明に用いられるＤＮＡの形態として
は、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ（プラ
スミド）、直鎖状ＤＮＡのいずれであってもよい。本発
明の遺伝子を植物細胞に導入した後に、その遺伝子を発
現させようとする場合には、その遺伝子固有のプロモー
ター又はターミネーターが機能可能な場合にはそのまま
用いてもよいが、植物細胞内で効率よくあるいは特異的
に機能するプロモーター又はターミネーターと入れ替え
てもよい。

【００２４】例えば、植物体内で機能するプロモーター
としてカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３
５５プロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８８年、「Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．」、第１０巻、２６３〜
２７２貢）が挙げられ、ターミネーターとして、カリフ
ラワーモザイクウイルス由来のターミネーターや、アグ
ロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子由来のターミ
ネーターが挙げられる。

【００２５】本発明に用いる外来遺伝子として具体的に
は、例えば除草剤耐性遺伝子、昆虫耐性遺伝子、ウイル
ス抵抗性遺伝子、耐病性遺伝子、貯蔵タンパク遺伝子、
さらに選抜マーカーとしての薬剤耐性遺伝子などが挙げ
られるが、植物体内で機能する外来遺伝子であれば特に
限定されるものではない。

【００２６】本発明に用いられる外来遺伝子はそのまま
使用することもできるが、塩基性物質と静電的にイオン
結合した複合体を形成させることにより、形質転換率を
高めることができる。

【００２７】外来遺伝子と結合し、複合体を形成するこ
とのできる塩基性物質としては、例えば、スペルミン、
スペルミジン、ｄｉ−リジン、ｔｒｉ−リジン、ポリリ
ジン、ｄｉ−アルギニン、ｔｒｉ−アルギニン、ポリア
ルギニン、ｄｉ−オルニチン、ｔｒｉ−オルニチン、ポ
リオルニチン、ヒストンＨ１、ヒストンＨ２、ヒストン
Ｈ３、ヒストンＨ４などが挙げられ、水溶液中で正電荷
を持つ物質であれば特に限定されないが、ポリオルニチ
ン、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、ｄｉ−リジ
ン、ｔｒｉ−リジンが好ましい。またこれらの塩基性物
質は２種以上混合して使用してもよい。

【００２８】これらの塩基性物質は外来遺伝子は、外来
遺伝子を植物細胞内で安定に保つことと、染色体に組み
込みやすくするために使用する。外来遺伝子に対する塩
基性物質の量は、外来遺伝子が１０μｇに対して塩基性
物質が０．１〜３００μｇ、好ましくは１〜８０μｇ使
用される。

【００２９】次に、植物細胞または、植物組織、ウイス
カおよび外来遺伝子を分散させる液体は、植物細胞とウ
イスカとを懸濁させ、外来遺伝子を溶解させる目的で使
用され、蒸留水、等張液、緩衝液、組織培養用培地など
が挙げられる。

【００３０】その際の等張液としては、例えばＫＣｌ、
ＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂などの無機塩を添加し
て０．０１〜７Ｍ、好ましくは、０．５〜２Ｍにした液
体が挙げられる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などが挙げられる。

【００３１】組織培養用培地としては、例えばＭＳ培地
としては、例えばＭＳ培地、ガンボルグのＢ５培地、Ｒ
２培地、ホワイト培地、ニッチ−ニッチ培地、Ｎ６培地
などが挙げられる。

【００３２】等張液または組織培養用培地を用いる場合
は糖類を添加して用いるのがよく、その際の糖類として
は、例えばショ糖、果糖、ブドウ糖、ソルビトール、マ
ンニトールなどが挙げられ、糖類の濃度は０.０１〜７
Ｍ、好ましくは０.５〜２Ｍで使用される。

【００３３】本発明に用いる液体のｐＨは、ｐＨ４〜
８、好ましくはｐＨ５〜７である。本発明に用いる液体
の容量は、特に限定されるものではないが、植物細胞の
容量（圧縮細胞量：Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕ
ｍｅ、以下、「ＰＣＶ」と略す）がＰＣＶ １ｍｌに対
して、１０μｌ〜２ｍｌ、好ましくは、３００〜７００
μｌになるよう調整して用いる。

【００３４】本発明に用いる植物細胞の容量は、特に限
定されるものではないが、植物細胞と共に液体中に混合
されるウイスカの量は植物細胞の容量に伴い調整され、
植物細胞量のＰＣＶ １ｍｌ当たり、ウイスカ１〜１０
０ｍｇ、好ましくは、４〜４０ｍｇになるように添加さ
れる。

【００３５】本発明に用いる外来遺伝子、または外来遺
伝子の塩基性物質との複合体の量は、ＰＣＶ １ｍｌに
対して、０．１〜１０００μｇ、好ましくは、１０〜２
００μｇになるように添加される。

【００３６】このようにして得られた上記植物細胞、ウ
イスカおよび外来遺伝子は液体と一緒に同一容器に加え
て混合する。本発明で使用する容器は、例えば、遠心
管、ガラス試験管、ポリプロピレン製試験管、シャー
レ、フラスコなどが使用できるが、無菌で取り扱える容
器であれば、これらに限定されるものではない。

【００３７】植物細胞、ウイスカおよび外来遺伝子は、
液体中で均一に混合され、分散されるよう容器を振って
撹拌するが、特に激しく撹拌する必要はない。このよう
にして、液体中に分散させた植物細胞、ウイスカおよび
外来遺伝子の混合物（以下、「混合物」と略す）を得る
ことができる。

【００３８】〔２〕エ程（ｂ） 遠心処理 本工程は、混合物を遠心処理することによりウイスカを
植物細胞ヘ付着させる工程である．本発明ににおける遠
心処理は、遠心加速度が３，０００〜５０，０００×
ｇ、好ましくは、１０，０００〜３０，０００×ｇで、
遠心時間が、１０秒〜４０分、好ましくは、５〜１０分
間行う。また、植物細胞へのウイスカの付着量を高める
ために同様の遠心処理を１〜２０回、好ましくは、３回
繰り返して行うのよい。

【００３９】〔３〕工程（ｃ） 超音波処理 本工程は、遠心処理を行った後、混合物を超音波照射す
ることによりウイスカを振動させ、ウイスカにより細胞
を穿孔し、外来遺伝子を孔から細胞内に導入させる工程
である。

【００４０】本発明に用いる超音波処理は、前記した従
来技術よりも穏やかな条件、すなわち、周波数が１ｋ〜
１ＭＨｚ、好ましくは、１０〜６０ｋＨｚで、照射時間
が０．２秒〜２０分間、好ましくは、３０秒〜２分間
で、強度は、０．０１〜１０Ｗ／ｃｍ²、好ましくは、
０．１〜１Ｗ／ｃｍ²で照射を行う。

【００４１】超音波処理を行った後、外来遺伝子を細胞
内に侵入させ拡散させるのに十分な時間、混合物を静置
する。その際の温度は０〜２８℃、好ましくは４℃で、
静置時間は１分〜３時間、好ましくは５〜１０分間静置
するほうがよい。

【００４２】本発明においてば、ウイスカの使用と超音
波処理を組み合わせてウイスカを振動させることによ
り、従来技術よりも穏やかな条件でウイスカを細胞内に
侵入させることができるため、細胞に重大な損傷を与え
ることなく高い形質転換効率が得られると推定される。

【００４３】〔４〕工程（ｄ） 植物体再生工程 本工程は、（ｃ）工程で得られた形質転換細胞から植物
体を再生させて形質転換植物の作出を行う工程である。

【００４４】本工程を行うにあたって、発現可能な外来
遺伝子を植物細胞に導入した場合には、上述の如く、遠
心処理と超音波処理を行った後、予め植物細胞を培養し
て外来遺伝子を発現させる。

【００４５】上記のようにして超音波処理された混合物
は、そのまま培養することもできるが、好ましくは、混
合物からウイスカと外来遺伝子を取り除くため洗浄を行
う。その際に用いる洗浄液は、蒸留水、等張液、緩衝
液、培地などが挙げられるが、好ましくは、前述の等張
液または培地を用いる。

【００４６】洗浄は、滅過等の操作によって、混合物か
ら植物細胞を取り出すことができればよく、特に操作が
限定されることはないが、例えば、４０μｍのナイロン
メッシュ等の節いを用いて混合物を洗浄し、植物細胞を
取り出すことができる。

【００４７】このようにして得られた植物細胞を、植物
組織培養用培地を用いて、培養する。この際用いられる
培地は、前述した植物組織培養用培地に必要に応じて、
植物ホルモンとして、例えば、２，４−ＰＡ、ナフタレ
ン酢酸、インドール酢酸などのオーキシン類、ベンジル
アデニン、カイネチンなどのサイトカイニン類を単独も
しくは混合して用い、炭素源として、例えば、ショ糖、
グルコースなどを添加して用いることができるが、形質
転換の目的とする植物種に応じて培地の選択をすること
ができる。

【００４８】培養は、液体培地もしくは、固体培地で１
５〜３０℃、好ましくは、２０〜２８℃、培養期間は６
時間〜７日間、好ましくは、２〜３日間で行うことによ
って、外来遺伝子を植物細胞内で発現させた分裂細胞を
得ることができる。

【００４９】この際、これらの分裂細胞は、外来遺伝子
が導入され、形質転換された形質転換細胞と非形質転換
細胞とが混在しており、効率的に形質転換植物を得るた
めに、形質転換細胞を分裂細胞の中から選抜し、分離す
ることが望ましい。

【００５０】例えば、導入に用いた外来遺伝子上に選抜
マーカーとなる薬剤耐性遺伝子、例えば、抗生物質ハイ
グロマイシン耐性遺伝子を保有させておくことにより、
薬剤による細胞の代謝阻害効果を利用して、形質転換細
胞を選抜することができる。この選抜を行うためには、
前記に得られた分裂細胞をあらかじめ指標となる薬剤を
添加した植物組織培養用培地から成る固体もしくは液体
の選抜培地に置床、もしくは懸濁し、２０〜６０日間、
好ましくは３０〜４０日間培養する。

【００５１】選抜培地に添加される薬剤は、例えばハイ
グロマイシン、カナマイシンなどを用いることができ、
濃度は１〜３００ｍｇ／リットル、好ましくは２５〜５
０ｍｇ／リットルで用いるが、薬剤の種類、濃度は植物
種に応じて選択することができ、特にこれらに限定され
るものではない。

【００５２】また、外来遺伝子の種類により形質転換細
胞数も変動する。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子
を用いた場合、ＧＵＳ遺伝子よりも形質転換細胞が減少
する傾向にある。

【００５３】本発明における植物体再生方法としては、
上記のようにして得られた形質転換細胞を公知の植物体
再生用培地に置床することにより行うことができる。

【００５４】植物体再生用培地に置床された形質転換細
胞は１５〜３０℃、好ましくは、２０〜２８℃で、光照
射は５００〜２，０００ルクス、好ましくは、８００〜
１，０００ルクスで、培養期間は、２０〜６０日間、好
ましくは３０〜４０日間培養すると、個々の細胞から目
的とする外来遺伝子が導入され、形質転換された植物体
が再生する。

【００５５】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示して具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。

【００５６】

【実施例１】 ＜１＞工程（ａ） （１）供試植物細胞の調製 イネ（品種目本晴）完熟種子の籾を脱穀し、７０％エタ
ノール溶液に１０秒間、次いで有効塩素約１％次亜塩素
酸ナトリウム溶液に６分間浸漬して殺菌処理した後、滅
菌水で洗浄した。

【００５７】ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／
リットル、２，４−ＰＡ ２ｍｇ／リットル、寒天８ｇ
／リットルを添加して得た培地（ｐＨ５．８）を直径９
０ｍｍのシャーレに入れて固化させて固体培地を調製し
た。

【００５８】この固体培地に上記で得た種子を１シャー
レに９個置床し、２８℃で１４日間、明所（２，０００
ルクス、１日当たり１６時間照明）にて培養し、カルス
を得た。Ｒ２培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／リッ
トル、２，４−ＰＡ ２ｍｇ／リットル、カサミノ酸２
ｇ／リットルを添加して得た液体培地（ｐＨ５．８）を
１００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌ入れて、オート
クレーブにより滅菌処理を行い、液体培地を調製した
（以下、この液体培地を「Ｒ２Ｄ２培地」と略す。）

【００５９】このＲ２Ｄ２培地に上記で得たカルスを胚
乳から切りだし、これを１フラスコ当たり１０個移植
し、温度２８℃で、明所（２，０００ルクス、１日当た
り１６時間照明）にて、ロータリーシェーカー（１００
ｒｐｍ／分）を用いて振盪培養することによって懸濁培
養細胞を得た。この懸濁培養細胞は７日ごとに、ＰＣＶ
で３ｍｌを新鮮なＲ２Ｄ２培地に移植し、継代培養し
た。継代培養２８日後のイネカルスを、孔１ｍｍのステ
ンレスメッシュの篩を用いて、１ｍｍ以下のカルスを１
シャーレ当たりＰＣＶで３ｍｌ得た。

【００６０】得られた１ｍｍ以下のイネカルスはＲ２Ｄ
２培地で３回洗浄し、試験に供した。

【００６１】（２）ウイスカの調製 チタン酸カリウム製ウイスカ（チタン工業株式会社の製
品「ＬＳ２０」）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブ（エ
ッペンドルフ社製）に入れ、エタノールを０．５ｍｌ加
えて、一晩放置後、エタノールを完全に蒸発させて、殺
菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチュー
ブに減菌水１ｍｌを入れ、よく撹拌した後、これを３０
００ｒｐｍ／分、５分間遠心分離し、上清の水を捨てウ
イスカを洗浄した。この洗浄操作を３回行った後、同チ
ューブ内にＲ２Ｄ２培地を０．５ｍｌ加えてウイスカ懸
濁液を得た。

【００６２】（３）外来遺伝子の調製 外来遺伝子はβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子保
有のｐＢＩ２２１（クローンテック社製）を用いた。

【００６３】プラスミド（ＰＢＩ２２１）は１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度でＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、
ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解し、使用した。

【００６４】（４）ＧＵＳ遺伝子の導入操作 上記（２）で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブ
に上記（１）で得られた１ｍｍ以下のカルスをＰＣＶで
２５０μｌ入れて、撹拌後、１，０００ｒｐｍ／分で１
０秒間遠心を行い、カルスとウイスカを沈殿させ、上清
を捨てて、カルスとウイスカの混合物を得た。

【００６５】また、上記（３）で得たＧＵＳ遺伝子溶液
２０μｌ（２０μｇ含有）に対してＲ２Ｄ２培地１０μ
ｌを加え、混合した後、上記のカルスとウイスカの混合
物の入ったチューブに加え、カルス、ウイスカおよび外
来遺伝子が添加された混合物を十分振り混ぜて混合物を
得た。

【００６６】＜２＞工程（ｂ） 次に、この混合物の入ったチューブを１８，０００ｘｇ
で５分間遠心分離し、遠心後、再度振り混ぜた。この遠
心分離し、再度振り混ぜる操作を３回行った。

【００６７】＜３＞工程（ｃ） （１）超音波処理 このようにして得た混合物の入ったチューブを超音波発
生機（浴槽型：媒体として水を使用）の浴槽にチューブ
が十分浸かるように設置し、周波数４０ｋＨｚ、強度
０．２５Ｗ／ｃｍ²で１分間超音波を照射し、照射後、
３０分間、４℃で放置した。

【００６８】このように超音波処理し混合物を４０μｍ
孔のナイロンメッシュで濾過し、さらに、Ｒ２Ｄ２培地
５ｍｌを加えて洗浄しこの操作を３回くりかえし、ＧＵ
Ｓ遺伝子を導入したカルスを得た。

【００６９】（２）分裂細胞の培養 ＧＵＳ遺伝子を導入したカルスを３．５ｃｍのシャーレ
に入れ、Ｒ２Ｄ２培地を３ｍｌ加えて、２８℃、明所
（２，０００ルクス、１日当たり１６時間照明）にて、
ロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ／分）を用いて培養
し、分裂細胞を得た。

【００７０】（３）形質転換細胞数の選抜 ＧＵＳ遺伝子が導入された細胞数の測定は、次のように
して行った。すなわち、上記（２）の分裂細胞の培養に
おいて、培養２日目にＲ２Ｄ２液体培地のみを取り除
き、シャーレ中にカルスのみを残し、１ｍＭ Ｘ−Ｇｌ
ｕ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏ
ｌｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ）溶液３００μ
ｌをシャーレ中へ添加し、３６℃、暗所で、２４時間放
置し、酵素反応を行った。このＧＵＳアッセイにより、
カルス中の、ＧＵＳ遺伝子が導入され形質転換された細
胞のみが青く発色されるので、これらの細胞を顕微鏡下
で選抜し、形質転換細胞数を調べた。その結果を表１に
示した。

【００７１】

【実施例２】チタン酸カリウム製ウイスカ（チタン工業
株式会社の製品「ＬＳ２０」）１ｇを５００ｍｌ容ナス
型フラスコに入れ、トルエン１００ｍｌを加え、さらに
３−（２−アミノエトキシルアミノプロピル）−トリメ
トキシシラン（カップリング剤）１ｇを加え溶解した
後、このフラスコ内のトルエンの温度を１２０℃となる
ようにしてシリコンオイルバス中で撹拌し、トルエンを
留去し、スラリーを得た。

【００７２】反応後、スラリーを９０％メタノールで洗
浄し、過剰のカップリング剤を取り除いた。さらに洗浄
に用いたメタノールの残液をロータリーエバポレーター
で完全に留去し、表面塩基性ウイスカを得た。

【００７３】上記で得た表面塩基性ウイスカは実施例１
と同様の方法で殺菌した後、Ｒ２Ｄ２培地を加えて混合
物を得た。

【００７４】ＧＵＳ遺伝子２０μｇを含むＴＥ緩衝液２
０μｌにＲ２Ｄ２培地４０μｌを加え、この溶液にポリ
オルニチン２．５μｇ、スペルミジン５０μｇ、スペル
ミン１８μｇ、ヒストンＨ２ ２０μｇを、それぞれ単
独にＲ２Ｄ２培地６０μｌに溶解して加え、室温で１０
分間静置し、４種類のＧＵＳ遺伝子の塩基性複合体を調
製した。

【００７５】これらのＧＵＳ遺伝子の塩基性複合体と上
記の表面塩基性ウイスカの混合物を用いて実施例１と同
様の方法で形質転換細胞を得て、ＧＵＳアッセイを行い
形質転換細胞数を調べた。その結果を表１に示した。

【００７６】

【比較例１】遺伝子導入時に遠心処理のみを行い、超音
波処理を省いた以外は、実施例１に準じて分裂細胞のＧ
ＵＳアッセイを行い形質転換細胞をえた。その結果を表
１に示した。

【００７７】

【比較例２】遺伝子導入時に遠心処理を省き、超音波処
理のみを行った以外は、実施例１に準じて、分裂細胞の
ＧＵＳアッセイを行い形質転換細胞を得た。その結果を
表１に示した。

【００７８】

【比較例３】遺伝子導入時にウイスカの添加を省き、
１．５ｍｌ容チューブに１ｍｍ以下のカルスＰＣＶ ２
５０μｌと外来遺伝子溶液２０μｌ、Ｒ２Ｄ２培地１０
０μｌを入れて得た混合物を用いた以外は、実施例１と
同様にして分裂細胞のＧＵＳアッセイを行い、形質転換
細胞を得た。その結果を表１に示した。

【００７９】

【表１】

【００８０】

【実施例３】 （１）供試植物細胞の調製」は実施例１に準じて行っ
た。 （２）ウイスカの調製は実施例１に準じて行った。 （３）外来遺伝子の調製 外来遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子保有のプラ
スミドｐＣＨ（東京大学より分譲）を用いた。 （４）ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入操作は、実施
例１に準じて行った。

【００８１】（５）分裂細胞の培養 ハイグロマイシン耐性カルスを３．５ｃｍのシャーレに
入れ、Ｒ２Ｄ２培地を３ｍｌ加えて、２８℃、明所
（２，０００ルクス、１日当たり１６時間照明）にて、
ロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ／分）を用いて培養
し、分裂細胞を得た。

【００８２】（６）形質転換細胞の選抜 上記（５）に準じて培養を行い、培養３日目に、これら
の分裂細胞の懸濁液３ｍｌを２，４−ＰＡ ２ｍｇ／リ
ットル、ショ糖３０ｇ／リットル、ゲルライト３ｇ／リ
ットル、およびハイグロマイシン５０ｍｇ／リットルを
含むＮ６培地（ｐＨ５．８）３０ｍｌを直径９ｃｍの大
きさのシャーレ中で固化させた固体培地上に均一に広げ
た後、ピペットで懸濁液の液体を吸い取った。

【００８３】これを２８℃、明所（２，０００ルクス、
１日当たり１６時間照明）で２０日間培養し、ハイグロ
マイシン耐性の形質転換細胞を得た。

【００８４】（７）形質転換細胞から植物体再生 上記により得た形質転換培養細胞１６９個（直径約５ｍ
ｍに生育）をペンジルアデニン２ｍｇ／リットル、ナフ
タレン酢酸１ｍｇ／リットル、ショ糖３０ｇ／リット
ル、ソルビトール３０ｇ／リットル、ゲルライト３ｇ／
リットルを含むＭＳ培地３０ｍｌを直径９ｃｍの大きさ
のシャーレで固化させた再生用培地上に１シャーレ当た
り１０個置床し、２８℃、明所（２，０００ルクス、１
日当たり１６時間照明）で３０日間培養すると、形質転
換細胞から芽と根が再生した。

【００８５】再生した芽と根を含む幼芽（長さ１０〜３
０ｍｍに生育）をショ糖３％、ゲルライト３ｇ／リット
ルを含むＭＳ培地５０ｍｌをプラントボックス（縦５ｃ
ｍ×横５ｃｍ×高さ１０ｃｍ）中で固化させた固体培地
に各々１本づつ移植し、２０日間培養して形質転換植物
を１３５個体得た。その結果を表２に示す。

【００８６】（８）形質転換植物の遺伝子解析 ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）法によるハイグロマイシン耐性遺伝子を保持
する植物体の解析を行った。

【００８７】上記（７）で得た再生植物体の葉５０ｍｇ
を１.５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）３００μｌを添加し、これを磨砕した後、２
０％ＳＤＳを２０ｍｌ加えて、６５℃で１０分間加温し
た。これに５Ｍ酢酸カリウムを１００μｌ加え、氷中に
２０分間置いた後、１，７０００×ｇの遠心加速度で２
０分間遠心分離を行い、得られた上清にイソプロパノー
ル２００μｌを加え、転倒撹拌し、これを再び１，７０
００×ｇの遠心加速度で２０分間遠心分離し、この沈殿
を減圧下で乾燥させ、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し
ＤＮＡを得た。

【００８８】ＰＣＲ用のプライマーとして、公知のハイ
グロマイシン耐性遺伝子の配列を基に、配列番号１及び
２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し
た。次に、これらのオリゴヌクレオチド各１μＭをプラ
イマーとし、上記植物体由来のＤＮＡ５μｌをテンプレ
イトとして、これらを含む反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５
０ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％ゼラチン，ｐＨ８．３，ｄ
ＮＴＰ 各０．２ｍＭ ｍｉｘｔｕｒｅ，Ｔａｑ ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニット）１００μ
ｌで、増幅反応を行った。反応液は、ＰＣＲキット（Ｐ
ＣＲ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造
（株）社製）を用いて調製した。

【００８９】増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒ
ａｍ Ｔｅｍｐ ＣｏｎｔｒｏｌＳｙｓｔｅｍ ＰＣ−
７００（アズテック社製））を用いて、変性９４℃、１
分、アニーリング６０℃、３０秒、伸張（ｅｘｔｅｎｔ
ｉｏｎ）７２℃、１分の３つの反応条件を３０回繰り返
して行った。

【００９０】ＰＣＲ反応液を常法によりアガロース電気
泳動で分析したところ、再生植物から抽出したＤＮＡか
ら３７５ｂｐの増幅されたＤＮＡバンドが確認された。
このＤＮＡバンドパターンより、イネ再生植物体１３５
個体中の全てにハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込ま
れていることが確認できた。その結果を表２に示す。

【００９１】

【実施例４】 （１）供試植物細胞の調製 トウモロコシ（品種Ａ１８８）の交配１０日日の未熟胚
（１〜１．２ｍｍ長）を無菌状態に取り出し、Ｎ６培地
の無機成分組成にショ糖２０ｇ／リットル、２，４−Ｐ
Ａ ２ｍｇ／リットル、Ｌ−プロリン２．９ｇ／リット
ル、カサミノ酸１００ｍｇ／リットル、寒天９ｇ／リッ
トルを添加して得た培地（ｐＨ５．８）を直径９ｃｍの
大きさのシャーレ中で固化させた固体培地（以下、「Ｎ
６Ｓ２培地」と略す）上に、１シャーレ当たり９個置床
し、２８℃、暗所で、２１日間培養し、カルスを得た。

【００９２】「（２）ウイスカの調製」および「（４）
ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入操作」は実施例１に
準じて、また、「（３）外来遺伝子の調製」は実施例２
に準じて行った。

【００９３】（５）分裂細胞の培養 ハイグロマイシン耐性カルスを個々にピンセットでＮ６
Ｓ２培地上に置床し、２８℃、暗所で７日間培養し分裂
細胞を得た。

【００９４】（６）形質転換細胞の選抜 上記（５）に準じて培養し、培養７日目のカルスを分割
せずにそのままハイグロマイシン５０ｍｇ／リットルを
添加したＮ６Ｓ２培地に移植し、２８℃暗所で３０日間
培養しハイグロマイシン耐性の形質転換細胞を得た。

【００９５】（７）形質転換細胞からの植物体の再生 上記（６）により得た形質転換培養細胞１０１個（直径
約５ｍｍに生育）を、ショ糖１０ｇ／リットル、ゲルラ
イト３ｇ／リットルを含む１／２無機塩濃度のＮ６培地
（ｐＨ５．８）に直径９ｃｍの大きさの１シャーレ当た
り６個のカルスを置床し、２８℃、明所（２，０００ル
クス、１日当たり１６時間照明）で３０日培養すると、
形質転換培養細胞から芽と根が再生した。

【００９６】再生した芽と根を含む幼芽（長さ１０〜３
０ｍｍに生育）をショ糖３０ｇ／リットル、ゲルライト
３ｇ／リットルを含むＭＳ培地５０ｍｌをプラントボッ
クス（縦５ｃｍ×横５ｃｍ×高さ１０ｃｍ）中で固化さ
せた固体培地に各々１本づつ移植し、２０日間培養して
形質転換植物を３０個体得た。その結果を表２に示す。

【００９７】（８）形質転換植物の遺伝子解析 実施例２の方法に準じて解析を行ったところ、トウモロ
コシ再生植物体３０個体中２６個体にハイグロマイシン
耐性遺伝子が組み込まれていることが確認された。その
結果を表２に示す。

【００９８】

【比較例４】遺伝子導入時に遠心処理のみを行い、超音
波処理を省いた以外は、実施例３と同様にして分裂細胞
のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、そ
の結果を表２に示した。

【００９９】

【比較例５】遺伝子導入時に遠心処理を省き、超音波処
理のみを行った以外は、実施例３と同様にして分裂細胞
のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、そ
の結果を表２に示した。

【０１００】

【比較例６】遺伝子導入時にウイスカの添加を省き、
１．５ｍｌ容チューブに１ｍｍ以下のカルスＰＣＶ ２
５０μｌと外来遺伝子溶液２０μｌ、Ｒ２Ｄ２培地１０
０μｌを入れて得た混合物を用いた以外は、実施例３と
同様にして分裂細胞のハイグロマイシン耐性の形質転換
細胞数を調査し、その結果を表２に示した。

【０１０１】

【比較例７】遺伝子導入時に遠心処理のみを行い、超音
波処理を省いた以外は、実施例４と同様にして分裂細胞
のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、そ
の結果を表２に示した。

【０１０２】

【比較例８】遺伝子導入時に遠心処理を省き、超音波処
理のみを行った以外は、実施例４と同様にして分裂細胞
のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、そ
の結果を表２に示した。

【０１０３】

【比較例９】遺伝子導入時にウイスカの添加を省き、
１．５ｍｌ容チューブに１ｍｍ以下のカルスＰＣＶ ２
５０μｌと外来遺伝子溶液２０μｌ、Ｎ６Ｓ２培地１０
０μｌを入れて得た混合物を用いた以外は、実施例４と
同様にして分裂細胞のハイグロマイシン耐性の形質転換
細胞数を調査し、その結果を表２に示した。

【０１０４】

【実施例５】 （１）供試植物細胞の調製 芝草ベントグラス（品種ペンクロス）の完熟種子を７０
％エタノール溶液に１０秒間、次いで有効塩素約１％次
亜塩素酸ナトリウム溶液に２０分間浸漬して殺菌処理を
した後、滅菌水で洗浄し、Ｂ５培地の無機成分組成にシ
ョ糖３０ｇ／リットル、２，４−ＰＡ ３ｍｇ／リット
ル、ゲルライト３ｇ／リットルを添加して得た培地（ｐ
Ｈ５．８）を直径９ｃｍの大きさのシャーレ中で固化さ
せて固体培地（以下、「Ｂ５Ｄ３培地」と略す）上に、
１シャーレ当たり１００個置床し、２８℃、明所（２，
０００ルクス、１日当たり１６時間照明）で、６０日間
培養し、カルスを得た。

【０１０５】「（２）ウイスカの調整」および「（４）
ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入操作」は実施例１に
準じて、また、「（３）外来遺伝子の調製」は実施例２
に準じて行った。

【０１０６】（５）分裂細胞の培養 ハイグロマイシン耐性カルスを個々にピンセットでＢ５
Ｄ３培地上に置床し、２８℃、明所（２，０００ルク
ス、１日当たり１６時間照明）で７日間培養し分裂細胞
を得た。

【０１０７】（６）形質転換細胞の選抜 上記（５）に準じて培養し、培養７日目のカルスを分割
せずにそのままハイグロマイシン５０ｍｇ／リットルを
添加したＢ５Ｄ３培地に移植し、２８℃、明所（２，０
００ルクス、１日当たり１６時間照明）で４０日間培養
しハイグロマイシン耐性の形質転換細胞を得た。

【０１０８】（７）形質転換細胞からの植物体の再生 上記（６）により得た形質転換培養細胞５７個（直径約
１ｃｍに生育）をショ糖３０ｇ／リットル、ソルビトー
ル３０ｇ／リットル、ベンジルアデニン０．３ｍｇ／リ
ットル、ナフタレン酢酸０．３ｍｇ／リットル、ゲルラ
イト３ｇ／リットルを含む１／２無機塩濃度のＭＳ培地
（ｐＨ５．８）に直径９ｃｍの大きさのシャーレ当たり
６個のカルスを置床し、２８℃、明所（２，０００ルク
ス、１日当たり１６時間照明）で５０日間培養すると、
形質転換培養細胞から芽が再生した。

【０１０９】再生した芽（長さ３〜５ｍｍに生育）をシ
ョ糖３０ｇ／リットル、ゲルライト３ｇ／リットルを含
む１／２無機塩濃度のＭＳ培地３０ｍｌを試験管（縦１
５ｃｍ×直径４ｃｍ）中で固化させた固体培地に各々１
本づつ移植し、３０日間培養すると、生育した芽の基部
に根が形成した形質転換植物を４９個体得た。その結果
を表２に示す。

【０１１０】（８）形質転換植物の遺伝子解析 実施例３の方法に準じて解析を行ったところ、芝草の再
生植物体４９個体中４４個体にハイグロマイシン耐性遺
伝子が組み込まれていることが確認された。その結果を
表２に示す。

【０１１１】

【比較例１０】遺伝子導入時に遠心処理のみを行い、超
音波処理を省いた以外は、実施例５と同様にして分裂細
胞のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、
その結果を表２に示した。

【０１１２】

【比較例１１】遺伝子導入時に遠心処理を省き、超音波
処理のみを行った以外は、実施例５と同様にして分裂細
胞のハイグロマイシン耐性の形質転換細胞数を調査し、
その結果を表２に示した。

【０１１３】

【比較例１２】遺伝子導入時にウイスカの添加を省き、
１．５ｍｌ容チューブに１ｍｍ以下のカルスＰＣＶ２５
０μｌと外来遺伝子溶液２０μｌ、Ｂ５Ｄ３溶液１００
μｌを入れて得た混合物を用いた以外は、実施例５と同
様にして分裂細胞のハイグロマイシン耐性の形質転換細
胞数を調査し、その結果を表２に示した。

【０１１４】

【表２】

【０１１５】

【発明の効果】本発明によれば植物の種、品種、系統に
左右されず、容易かつ短時間に植物の形質転換を行うこ
とができ、効率よく形質転換植物を作出することができ
る。

【０１１６】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:NO 配列 GCTGGGGCGT CGGTTTCCAC TATCCG 26

【０１１７】配列番号：２ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス:YES 配列 CGCATAACAG CGGTCATTGA CTGGAGC 27

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の（ａ）〜（ｃ）の各工程を含むこと
   を特徴とする植物の形質転換方法。 （ａ）植物細胞又は植物細胞を含む組織を外来遺伝子お
   よびウイスカとともに液体中に分散させる工程、（ｂ）
   工程（ａ）の後に、遠心処理を行い、前記植物細胞にウ
   イスカを付着させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の後に、超
   音波処理を行い、ウイスカにより、前記植物細胞を穿孔
   せしめ、この孔から細胞中に外来遺伝子を導入する工
   程。
2. 【請求項２】 前記外来遺伝子が、塩基性物質と複合体
   を形成している遺伝子である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 次の（ａ）〜（ｄ）の各工程を含むこと
   を特徴とする形質転換植物の作出方法。 （ａ）植物細胞又は植物細胞を含む組織を外来遺伝子お
   よびウイスカとともに液体中に分散させる工程、（ｂ）
   工程（ａ）の後に、遠心処理を行い、前記植物細胞にウ
   イスカを付着させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の後に、超
   音波処理を行い、ウイスカにより、前記植物細胞を穿孔
   せしめ、この孔から細胞中に外来遺伝子を導入する工
   程。（ｄ）工程（ｃ）で外来遺伝子が導入された植物細
   胞又はこれを含む植物組織から植物体を再生する工程。