CN114990120A

CN114990120A - 一种油菜长链非编码rna基因及其在提高油菜含油量及种子粒重中的应用

Info

Publication number: CN114990120A
Application number: CN202210737424.0A
Authority: CN
Inventors: 鲁少平; 郭亮; 李雨晴
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN114990120B

Abstract

本发明公开了一种油菜长链非编码RNA基因MSTRG.86004，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过获得过表达材料，分析转基因材料的含油量，发现MSTRG.86004基因调控含油量的积累及脂肪酸组成，同时还调控种子粒重。本发明进一步提供了一种提高油菜含油量及种子粒重的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有MSTRG.86004基因的过表达载体转化到作物的基因组中，获得MSTRG.86004基因过表达的油菜品种。本发明在油菜高油、高产育种中具有潜在的应用价值。

Description

一种油菜长链非编码RNA基因及其在提高油菜含油量及种子粒重中的应用

技术领域

本发明属于分子育种领域，具体涉及一种油菜长链非编码RNA基因(MSTRG.86004基因)及其在提高油菜含油量及种子粒重中的应用。

背景技术

非编码RNA已被证明在调控细胞生长和发育中起着关键作用。全基因组转录组测序研究表明，超过90％的真核生物基因组可以转录，但只有1％-2％的基因可以编码蛋白质，基因组中很大一部分基因是非编码的。根据转录本的长度，非编码RNA可以分为短链非编码RNA(<200nt)和长链非编码RNA(lncRNA，>200nt)。根据lncRNAs在基因组上的位置，它们可以被分为内含子lncRNA、基因间lncRNA(lincRNA)、正义lncRNA和反义lncRNA。此前的研究表明，许多lncRNA可以通过顺式或反式作用影响其目标mRNA的表达，然后调节细胞中的基因功能。在大量的实验中已经验证了lncRNAs具有调控转录、翻译和转录后的功能。

油菜籽是世界上第三大油料作物，约占全球油料产量的13％，仅次于油棕榈和大豆(USDA)。种子油的生物合成是一个复杂的生物过程，主要包含质体中的脂肪酸合成和内质网(ER)中的TAG组装。以前的研究已经很好地阐明了许多转录因子和基因的作用机制参与了这些过程。此外，研究发现，一些基因参与了油料积累的调节过程。最近，lncRNAs也被预测参与调控种子油的生物合成。例如，牡丹种子中的39个lncRNAs被预测为脂质代谢过程相关基因。在B.napus的发育中的种子中，13个lncRNAs的表达模式与8个脂质相关基因的表达模式明显相关，推测这些lncRNAs可能在油的合成中发挥作用。然而，目前还没有直接证据表明lncRNA参与了种子油的合成调控，lncRNA如何影响种子油的积累还不清楚。

本发明从油菜中克隆了长链非编码RNA基因MSTRG.86004。研究表明，将MSTRG.86004在油菜中过表达可以显著提高种子的含油量及粒重。本申请人的结果表明MSTRG.86004基因在调控油菜种子含油量中起到重要作用，因此可以为油菜高油育种提供理论参考依据，同时为油脂合成这一研究提供新的思路。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一个油菜长链非编码RNA基因，申请人将其命名为MSTRG.86004基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为576bp。申请人通过对油菜lncRNAs进行大量筛选和鉴定最终得到该基因，可以采用PCR技术从植物基因组、mRNA和cDNA中扩增得到。

为了获得该基因，申请人从油菜种子中提取总RNA并反转录成cDNA，然后设计正、反向引物，从cDNA中扩增目的基因。其中，

正向引物：5’-GCGACTAGT GCCTGTGTTTAAAATGGC-3’(SEQ ID NO:2)

反向引物：5’-GCGTTCGAA TATCTGTGTTTTAAATGG-3’(SEQ ID NO:3)

本发明还提供了含有所述油菜长链非编码RNA基因的重组质粒和重组菌。

利用本发明提供的油菜长链非编码RNA基因、重组质粒或重组菌，可以对油菜进行分子育种并提高油菜含油量及种子粒重。

本发明进一步提供一种提高油菜含油量及种子粒重的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜长链非编码RNA基因的过表达重组质粒转化到油菜的基因组中，获得油菜长链非编码RNA基因超表达的油菜品种，其中，所述油菜长链非编码RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所使用的载体质粒是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明过表达重组质粒的载体包括但不限于PMDC83等。

本发明的一个特点在于通过获得过表达材料，分析了转化材料的含油量，发现MSTRG.86004正调控含油量的积累，同时还调控脂肪酸组成及种子粒重。

本发明获得的过表达油菜植株在油菜高油育种中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：MSTRG.86004基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2：构建的植物表达载体PMDC83-MSTRG.86004的质粒图谱。

图3：油菜转化单株的qRT-PCR检测。OE1、OE2和OE3是基因MSTRG.86004的超表达株系。每个株系有3个不同单株，**表示在Student’s t test中P<0.01。

图4：MSTRG.86004在油菜的表型鉴定。利用近红外分析油菜种子的含油量，OE1、OE2和OE3是基因MSTRG.86004的超表达株系，每个株系有8-12个不同单株，**表示在Student’s t test中P<0.01。

图5：MSTRG.86004在油菜的表型鉴定。利用GC-MS分析油菜种子的脂肪酸组成，OE1、OE2和OE3是基因MSTRG.86004的超表达株系，每个株系有8-12个不同单株，*表示在Student’s t test中P<0.05，**表示在Student’s t test中P<0.01。

图6：MSTRG.86004在油菜的表型鉴定。利用千粒重仪分析油菜千粒重组成，OE1、OE2和OE3是基因MSTRG.86004的超表达株系，每个株系有8-12个不同单株，*表示在Student’s t test中P<0.05，**表示在Student’s t test中P<0.01。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明而不是用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold SpringHarbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法予以实施。

实施例1MSTRG.86004基因的克隆

(1)RNA的提取

总RNA的提取采用全式金公司的TransZol(目录号ET101)，提取方案遵从试剂盒使用说明书。需要提前准备的试剂有RNase-free水、氯仿、异丙醇和75％乙醇(由DEPC处理的水配制)。所用试剂和实验用品均经过DEPC灭活RNA酶处理。具体步骤如下：

a.取甘蓝型油菜的发育中种子于液氮中充分研磨直至粉末状，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml TransZol，之后上下剧烈震荡使之充分混匀，进行匀浆处理，之后室温静置5分钟；

b.向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；

c.10，000×g 4℃离心15分钟；

d.将上层无色的水相转移至新的离心管中(体积大约为0.6ml)，加入0.5ml经过预冷的异丙醇并颠倒混匀，室温孵育10分钟；

e.10，000×g 4℃离心10分钟，倒去上清，离心管侧壁和底部形成沉淀；向离心管中加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，剧烈涡旋；

f.7，500×g 4℃离心5分钟，去上清，室温晾干沉淀15分钟左右；

g.将沉淀溶于50-100μl RNA溶解液中，55-60℃孵育10分钟，保存于-80℃冰箱中备用。

h.取1μl抽提的总RNA在Nanodrop下测定RNA浓度和质量，依据1.8<OD260/OD280<2.0鉴定RNA纯度。同时取1μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测完整性和质量。

(2)RNA反转录

本实验所用的反转录试剂盒是全式金

One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix(目录号AE311-03)。具体实验操作遵从使用说明书：

以5μg总RNA为模板，依次加入1μl的Anchored Oligo(dT)18Primer，10μl的2×ESReaction Mix，1μl的

RT/RI Enzyme Mix，1μl的gDNARemover，最后用RNase-free Water补充至20μl。将以上反应体系轻轻混匀后置于42℃孵育30min，进行合成第一链cDNA和去除gDNA；之后，85℃加热5秒钟失活

RT/RI和gDNA Remover。最后，加入180μl RNase-free Water溶解合成的cDNA。

(3)MSTRG.86004基因的扩增

以上述cDNA为模板，用正向引物5’-GCGACTAGT GCCTGTGTTTAAAATGGC-3’和反向引物5’-GCGTTCGAA TATCTGTGTTTTAAATGG-3’扩增得到含有MSTRG.86004全长片段。采用I-5^TM2×High-Fidelity Master Mix(TSINGKE Biologica technology)进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为:

按照上述反应体系配置好反应液于PCR管中，在Bio-Rad PCR仪上进行扩增，PCR扩增程序为：

扩增后产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，扩增获得576bp的MSTRG.86004全长，PCR扩增产物的挖胶回收使用天根琼脂凝胶DNA回收试剂盒。

实施例2MSTRG.86004基因过表达转化载体的构建

(1)对上述获得的MSTRG.86004片段用快速限制性内切酶SpeI和BstbI进行双酶切，本实验所用的限制性内切酶为上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。双酶切体系如下:

酶切反应在37℃水浴1.5小时。酶切产物利用北京天根生物工程有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(DP130227)进行回收。

(2)酶切产物连接到载体PMDC83，连接反应体系如下：

连接反应条件：22℃3小时。

(3)转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取3个阳性克隆送样测序，分析结果显示，MSTRG.86004基因的序列成功连接上载体，即成功构建并转化植株的植物表达载体pMDC83-MSTRG.86004，质粒信息如图2所示。

(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株GV3101，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。使用电击法转化农杆菌GV3101感受态，具体实验步骤如下：

a.用纯水、超纯水、无水乙醇分别清洗电转杯，置于超净台晾干；

b.将重组质粒和农杆菌GV3101感受态置于冰上解冻；

c.取构建正确的重组质粒1μl，加入到25μl农杆菌GV3101感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；

d.将上述混合液沿着杯壁迅速转入已经预冷的电转杯中；

e.将电转仪调至1800V，之后用吸水纸擦干电转杯外壁，在1800V电压条件下电击；

f.电击成功后，向电转杯中加入200μl无抗LB液体培养基，轻轻吸打几下，之后将溶液转移至1.5ml无菌离心管中，28℃150r/min活化2小时左右；

g.将复苏的菌株涂到含有抗生素的LB固体培养基上，于28℃培养箱中倒置培养48小时；

h.在平板上挑取单菌落，用载体前引物和目的基因后引物对其进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。

i.取阳性菌液加入抗性的LB液体培养基，于28℃，150r/min摇床中扩大培养至OD值达到0.8，加入等体积的50％(v/v)的甘油混匀，将其保存于-80℃冰箱。

实施例3遗传转化实验

(1)油菜的遗传转化

对构建好的过表达载体采用下胚轴暗光培养进行油菜的遗传转化，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜Westar，具体方法如下：

a.种子的灭菌：

将经过挑选的成熟饱满的甘蓝型油菜‘Westar’种子倒入培养盒中，用75％的酒精浸泡种子1min左右，时间不能超过5分钟；使用无菌水清洗浸泡后的种子1-2次；加入能够淹没种子的0.15％-0.2％升汞溶液(保存于实验室的棕色瓶中，可用实验室5％的母液稀释)，消毒15min；用无菌水清洗种子5-6次。

b.播种：

用灭过菌的镊子将种子播种于M0培养基，每个培养皿均匀播种36-40粒种子；播完种后将培养皿放在暗光条件下培养7天左右，温度25℃。

c.农杆菌的培养：

播种五天后，在抗性平板上接种细菌，用经过消毒的接种环蘸取含有目的基因的农杆菌菌液在抗性LB平板上划线；2天后在抗性平板上用牙签或枪头吸取阳性单菌落，置于抗性LB液体培养基中吹打，于28℃，150r/min摇菌。

d.外植体的制备和侵染：

检测菌液在600nm吸收光条件下的浓度(分光光度计)，测出菌液的OD值，OD值在0.6-0.8之间为最佳，此时将菌液6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液等体积的DM(Dilution Medium)液体重悬，6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液相同体积的DM溶液悬浮。之后取2ml菌液于灭菌的培养皿中，20ml DM溶液对其进行稀释(1：10)；用无菌解剖刀和镊子将暗光培养7天后的幼苗下胚轴切下，切取长度为0.8-1.0cm，切取外植体时尽量一刀切下，保持其切口整齐；将切取下来的外植体放到已配好浓度的菌液中，侵染30min(时间不能过长)，用移液器隔段时间吸打一次，使得切口充分接触菌液。

e.愈伤组织的培养：

用已灭菌的吸水纸吸干外植体上的菌液，再将外植体转移到M1培养基中，每皿50-60个外植体，暗光条件下培养2天左右，温度25℃；两天后，将外植体转移到诱导愈伤的M2培养基中，光照条件下进行培养(白天16h/夜晚8h)，温度22℃，之后都在光照条件下进行培养；三周后，将生长正常，两端膨大的外植体转到分化培养基M3中，每2-3周继代一次，长出绿芽为止；切下已经有明显基节的绿芽并将其转入培养基M4中进行生根，需要2-4周，待生根后将其移栽至室外大田里，观察植株田间生长表型(本发明中培养基配方见表1)。

表1下胚轴暗光培养的培养基配方

(2)过表达转化单株的鉴定

提取获得的油菜过表达转化单株的基因组DNA，通过PCR检测外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为pMDC83，在骨架载体上设计引物PMDC83-R(5’-CCAGCAGCTGTTACAAACTCAAG-3’)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行PCR反应(MSTRG.86004-F和PMDC83-R)，外源片段引物MSTRG.86004-F(5’-GCGACTAGTGCCTGTGTTTAAAATGGC-3’)和MSTRG.86004-R(5’-GCGTTCGAATATCTGTGTTTTAAATGG-3’)，在PCR水平检测转基因苗。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

对PCR获得的油菜转基因阳性苗进行qRT-PCR，以检测基因表达量。利用TransZol试剂盒提取转化单株种子的RNA并进行反转录合成cDNA(方法同实施例1)，最后用全氏金的PerfectStart^TM Green qPCR SuperMix试剂对样品进行荧光定量PCR分析。

定量引物利用Primer 5软件设计得到，产物大小在100bp-200bp之间，设计好后用参考序列进行BLAST比对，确保引物MSTRG.86004qPCR-F(5’-CGTAGTCTTCAAGTGGGTCTTC-3’)、MSTRG.86004qPCR-R(5’-GGCGATCCAAGGCGATAAT-3’)的特异性。BnaACTIN-F(5’-TGTTCCCTGGAATTGCTGACCGTA-3’)和BnaACTIN-R(5’-TGCGACCACCTTGATCTTCATGCT-3’)作为油菜qRT-PCR的内参引物。qRT-PCR反应体系为:

qRT-PCR反应程序为：

qRT-PCR反应在Bio-Rad CFX96 Real-Time System中进行。

根据内参引物进行标准化，不同重复间定量变异用delta-deltathresholdcyclerelative quantification(2-ΔΔCT)的方法计算。转化植株的表达量分析见图3。

(3)遗传转化所得转基因植株的含油量分析

采用气相色谱-火焰离子化检测器法测定油菜种子含油量：

a.称取4粒形状大小一致的油菜成熟种子，保证总质量在15mg-18mg范围内，记录下称取的质量，每株材料进行8-12个重复。

b.将称取好对油菜种子放入干净的提脂管中，加入4ml甲醇提取液(95％甲醇，5％浓硫酸，0.01％BHT)。

c.利用玻璃棒研破提脂管中种子的种皮并使种子露出胚。

d.用玻璃针(100μl)量取配好的十七烷酸100μl(C17：0，16.2μmol/ml，分子量270.45)于提脂管中，用力旋紧管盖，上下颠倒混匀。

e.将提脂管置于85℃水浴锅中，水浴2h，让其充分反应。

f.2h后，将提脂管拿出并冷却至室温，之后加入3ml的ddH2O和3ml的正己烷，注意要缓慢加液防止液体溅出，涡旋混匀。

g.1000r/min 25℃离心10min，用胶头滴管吸取1ml左右的上清液于进样瓶中，用于之后的GC-MS分析，暂时不用可放置-20℃冰箱储存。

(以上提取脂肪酸过程用的有机试剂均是色谱纯级别。)

h.设置高效气相色谱气质联用分析仪(GC-MS)参数：将分流比设成10：1，选择Rtx-Wax(0.25mm×30m)色谱柱，设置GC进样口温度为230℃，柱箱初始温度为170℃并保持2min，之后温度以5℃/min的速率上升至230℃保持5min。MS进样口温度设置为230℃，调谐电压为0.2kV。之后GC-MS自动进样进行分析。

i.利用GC-MS的峰图结果对物质进行定性分析。利用GC-MS的峰图结果对物质进行定量分析：结合物质的分子量和质量，根据内标计算脂肪酸组成和含油率。

含油量结果显示，与WT(43.29±1.12)相比，MSTRG.86004基因的过表达材料含油量分别为OE1(45.44±0.93)、OE2(45.24±0.83)和OE3(45.36±1.06，显著上升1.94-2.13个百分点(图4)。另外，脂肪酸组成结果显示，与WT相比，过表达材料的C16:0和C18:1显著增加，C18:0和C18:3含量均显著减少(图5)。另外，过表达材料的千粒重也有所增加(图6)。

这些结果表明，MSTRG.86004在调控甘蓝型油菜种子含油量和脂肪酸组成中确实发挥着重要作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种油菜长链非编码RNA基因及其在提高油菜含油量及种子粒重中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜 (Brassica napus L.)

<400> 1

gcctgtgttt aaaatggcgc tcgccttttg cgccatggcg cgaggcgcac tcaggcgacg 60

gctccatcgc catgtacctc ctaggcgagg gtgggttccg taaggcgctc gccaagtgcg 120

cattggtcat aaggcggtgc cttaaaaggc aacgcaaagg cgagccatgg agacgatgac 180

gttaaccgat actaaaccac gtagaaaccc taacttaata aatggaccaa ccttaaacca 240

aacttaaaac caaacgtcta aaaacttatc aaaaccctag cttgctcttg tagaaaagca 300

aagttaaaaa cttaacaaaa catggatctc acggactgtg ttttgcataa ggttagtacg 360

tactctcttc tctaatctca tggggctttc ttctgataaa aactatttaa taaaggcaaa 420

atcacgtgaa tgaaatttgt atattacgca cggatacata actaacgtag tcttcaagtg 480

ggtcttcaag gcgagcgctt tcttgcgcca tggcgcaagg cgcaaggcac acacattatc 540

gccttggatc gccatgcgcc atttaaaaca cagata 576

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

gcgactagtg cctgtgttta aaatggc 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

gcgttcgaat atctgtgttt taaatgg 27

Claims

1.一种油菜长链非编码RNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

2.用于扩增权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示。

3.含有权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的重组质粒。

4.含有权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的重组菌。

5.权利要求1所述的油菜长链非编码RNA基因、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的重组菌在提高油菜含油量和调控脂肪酸组成中的应用。

6.权利要求1所述的油菜长链非编码RNA基因、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的重组菌在提高油菜种子粒重中的应用。

7.一种提高油菜含油量及种子粒重的方法，其特征在于：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜长链非编码RNA基因的过表达重组质粒转化到油菜的基因组中，获得油菜长链非编码RNA基因超表达的油菜品种，其中，所述油菜长链非编码RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.如权利要求7所述的提高油菜含油量及种子粒重的方法，其特征在于：所述过表达重组质粒的载体质粒是PMDC83质粒。