CN109422802B - 植物种子休眠相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种植物种子休眠相关蛋白及其编码基因和应用，同时本发明还提供包含所述基因的表达盒、重组载体及其重组表达转化体，以及获得相应的转基因植物的方法。本发明对于植物育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种植物种子休眠相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
种子休眠是指种子由于内在的一些原因不能在一定的环境下萌发的现象。种子休眠普遍存在于野生植物中，这能保证物种能够逃避自然灾害，防止种子在不合适的季节萌发（Teresa and Günter, 2013; Rachel and Michael, 2013）。而驯化后的物种的种子一般有比较快速、整齐的萌发率，以便于收获高产量以及高质量的作物。然而，缺少休眠的种子也存在穗发芽等一系列问题，而且低休眠性的种子一般种子的寿命也会缩短（Clerkx,et al., 2003）。因此，研究作物的种子休眠有利于我们更好的掌握不同物种的生长习性，对于提高作物产量，改善作物品质都具有非常重要的意义。
初生种子萌发主要受种皮结构、种子激素水平和一些蛋白的调节。严格意义上的种子萌发是指幼根突破种皮。种皮的硬度影响种皮的吸水性，从而影响种子的快速萌发。野生物种一般具有高硬度的种皮，以维持种子休眠（Fuller and Allaby, 2009）。ABA和GA是调控种子休眠主要的激素。ABA促进种子休眠，而GA促进萌发，打破休眠。在模式植物拟南芥中的研究表明，很多参与ABA、GA代谢及信号通路中的重要组分在调控种子休眠过程中都起了非常关键的作用。ABA合成相关突变体表现为休眠减弱的表型，而过表达ABA 合成相关的酶会造成休眠性提高（Nambara and Marion, 2003）。种子进入后熟阶段时，种子内的ABA在ABA 8’-hydroxylases的作用下降解，使ABA降低到相对较低的水平，从而部分解除了ABA对种子萌发的抑制作用（Okamoto, et al., 2006）。GA可以促进水解酶弱化种皮和胚乳，促进胚的伸长，进而促进种子萌发（Holdsworth, et al., 2008; Resentini, et al., 2015）。研究发现，ABA/GA的平衡是决定种子萌发的关键：高ABA和低GA水平促进种子休眠，而低浓度ABA水平和高GA水平可能导致种子穗发芽。另外，ABA和GA合成会互相调控（Seo, et al.,2006; Shu, et al., 2013）。除ABA和GA外，BRs、乙烯等激素也参与种子休眠的调控。BRs可以通过调控ABA途径从而促进种子的萌发。乙烯受体突变体etr1-2突变体种子休眠增强，研究表明该蛋白通过下调ABA的含量促进种子的萌发（Chiwocha, et al., 2005）。一些小分子复合物也会影响种子休眠，包括光敏色素、NO、ROS、硝酸盐、活性氧。这些物质以ABA/GA平衡为重要节点共同调控种子休眠这一复杂性状（Ruth, et al., 2008）。
大豆原产我国，已经有5000年的栽培历史，是重要的经济粮食作物。但由于我国大豆平均产量较低，目前我国大豆生产远远不能满足我国大豆消费需求。相比水稻玉米等作物，大豆的研究起步较晚，目前仅有个别调控重要农艺性状的基因被报道出来，包括结荚习性，种子大小，裂荚等相关性状，而与大豆休眠相关的基因尚未见报道。大豆中休眠调控基因的研究可在一定程度上为大豆高产育种奠定理论基础，对于提高我国大豆的产量，促进形成具有国际竞争能力的转基因高产大豆产业，进而确保国家粮食安全具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物种子休眠相关蛋白及其编码基因和应用。
为实现上述目的，本发明提供一种分离的蛋白质，其为植物种子休眠相关蛋白，包括：
(a)由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)将(a)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有(a)蛋白质活性的由(a)蛋白质衍生的蛋白质；或
(c)在(a)蛋白质或(b)蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上表达纯化标签的蛋白质。
其中，所述的表达纯化标签可以是本领域常规所述的各类蛋白表达纯化用标签，其氨基酸序列更优选如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.6中的任一种所示，具体请参见表1所示。
表1表达纯化标签的序列
| 标签名称 | 残基数目 | 优选序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | SEQ ID NO.2 |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | SEQ ID NO.3 |
| FLAG | 8 | SEQ ID NO.4 |
| Strep-tag II | 8 | SEQ ID NO.5 |
| c-myc | 10 | SEQ ID NO.6 |
为实现上述目的，本发明还提供一种分离的核酸，其编码如前所述的蛋白质。
优选地，所述核酸包括如下DNA分子：
(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的DNA分子；或
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的DNA分子；或
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交的DNA分子；或
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA分子。
上述严格条件的含义如本领域常规所述，可为在6×SSC(柠檬酸钠)，0.5％ SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS 和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
为实现上述目的，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含前述核酸。
优选地，所述表达盒还包括有效连接的调控序列，如启动子、终止子等。
为实现上述目的，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含前述核酸或前述表达盒。
其中所述重组载体可通过本领域的常规方法获得，如：将前述核酸或前述表达盒连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规，较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明优选 pTF101.1载体。
本发明中，可用现有的植物表达载体构建含有目的基因的所述重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
为实现上述目的，本发明还提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含前述重组载体。
其中所述重组表达转化体可通过本领域的常规方法获得，如：将前述重组载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组载体稳定地自行复制，并且使得其所携带的前述核酸或前述表达盒可被有效表达即可。
为实现上述目的，本发明还提供一种获得转基因植物的方法，其是将前述核酸或前述表达盒导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有萌发受到抑制表型的转基因植物。
其中，导入目的植物的方法可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。所述目的植物包括单子叶植物或双子叶植物，本发明优选大豆(Glycine max L.)。
为实现上述目的，本发明还提供一种如前所述的蛋白质或如前所述的核酸在植物基因工程中的应用。
其中，所述植物基因工程优选以调节植物种子休眠过程为目的的植物基因工程。
本发明提供的植物种子休眠相关蛋白及其编码核酸均为申请人的首次发现，且经过转基因植株和野生型植株的表型分析验证说明过表达本发明的植物种子休眠相关蛋白能够抑制种子萌发，促进种子休眠。本发明对于植物育种及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。
附图说明
图1显示实施例2中野生型和转基因植株的表型分析结果，其中，纵坐标显示GmG基因的表达量，横坐标显示株系编号。
图2显示实施例2中野生型和转基因植株种子的萌发率实验结果，其中，纵坐标显示萌发率(％)，横坐标显示实验时间(天)。
图3显示实施例2中野生型和转基因植株体内ABA含量的比较实验结果，其中，纵坐标显示ABA积累量，横坐标显示株系编号。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
以下的实施例是为了便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或按照商品说明书选择。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
在下述实施例中，所称DN50为野生型大豆，用WT(wild type)表示，该品种为黑龙江省审品种(黑审豆2007022)，可以从市面购买得到。 GmG基因是从PI 603336中克隆得到，PI 603336为大豆属大豆(Glycine max L.)，购自美国国家农业部，其网站为 http://www.ars-grin.gov/npgs/acc/acc_queries.html。
pTF101.1载体和农杆菌菌株GV3101购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心(Biovector Science Lab,Inc)。
酶切回收试剂盒等耗材购自New England Biolabs和天根生化科技(北京)有限公司。
PFGC5941载体购自北京华博德亿生物技术有限公司，货号vt-3034，载体详情及使用方法请参考产品说明书，参考文献为：Kerschen A,Napoli C A,Jorgensen R A,etal.Effectiveness of RNA interference in transgenic plants[J].FEBS letters,2004,566(1-3):223-228.
实施例1 GmG蛋白及其编码基因的发现
在大量序列分析和功能验证的基础上，从大豆品种PI 603336中发现一个蛋白质，将其命名为GmG蛋白(简称为G蛋白)，其氨基酸如序列表中的SEQ ID NO.1所示，将编码G蛋白的基因命名为GmG基因，其基因组序列如序列表的SEQ ID NO.7所示(包括4个外显子)，其cDNA序列如序列表的SEQ ID NO.8所示。
实施例2 GmG蛋白的功能验证
一、重组质粒的构建
1、将大豆品种PI 603336中的种皮从种子上分离下来，提取RNA后进行反转录，获得大豆品种PI 603336的种皮cDNA。
2、以步骤1合成的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-GGCGCGCC ATGGAACTGTTGTCTCTGAGACTC-3’(SEQ ID NO.9)；
R1：5’-CCCGGG TCAGTCTGTCACGTAACCATTTT-3’(SEQ ID NO.10)。
3、用限制性内切酶Asc I和Xma I双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Asc I和Xma I双酶切PFGC5941载体，回收约 9992bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在PFGC5941载体的AscI I和Xma I酶切位点之间插入了序列表中如SEQ ID NO.8所示的双链 DNA分子。
6、以步骤5中得到的质粒甲为模板，用F2和R2组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-TGAGACTTTTCAACAAAGGATAATT-3’(SEQ ID NO.11)；
R2：5’-CTAGTTGGAGTTTTTTTCTTCTGAC-3’(SEQ ID NO.12)。
7、用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切PTF101.1载体，回收约 9138bp的载体骨架。
8、将步骤6的PCR产物和步骤7的载体骨架通过同源重组连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在 PTF101.1载体的EcoR I和Hind III酶切位点之间插入了35S启动子、序列表中如SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子和终止子，即表达盒构建完成。
二、GmG过表达转基因植物甲的获得
1、将重组质粒乙导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌采用子叶节转化方法(Margie M.P.et al 2004Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybeantransformation using the cotyledonary node explant.Euphytica 136:167–179) 转化受体植株DN50，收获T1代种子。具体操作步骤如下：
(1)种子灭菌与萌发
挑选圆粒饱满、表面光洁无病斑的DN50大豆种子于120mm的培养皿中。将培养皿放入干燥器，在干燥器中放入250ml烧杯一个加入100ml 次氯酸钠溶液，然后沿着烧杯缓缓加入4ml浓盐酸，立即盖好干燥器的盖子，利用氯气对大豆种子灭菌18h，灭菌后在超净台中开盖吹掉残余的氯气。将灭过菌的大豆种子种脐朝下均匀摆放于萌发培养基中，每皿30-35粒种子。然后用保鲜袋包好，剪好透气口，放入暗培养箱中，萌发条件为 22℃，萌发16小时以上。
(2)农杆菌的侵染及外植体共培养
取萌发好的种子，先切掉一部分子叶，然后沿着下胚轴将种子纵切为对称的两部分，在显微镜下轻轻刮去子叶节处的一对真叶，最后在子叶节处用手术刀轻轻点刺几下即为用于转化的外植体。取冻存于-80℃的甘油保存的重组农杆菌置于冰上解冻后，在超净台中用灭菌枪头蘸取少量菌液画线培养于含有Kan(卡那霉素)和Gen(庆大霉素)的YEP固体培养基上， 28℃活化培养2天，然后再用涂布器涂布于新的含有Kan与Gen的YEP 固体培养基上，培养过夜，最后将培养过夜的农杆菌用液体共培养基重悬至OD600值为0.6即可。将制备好的外植体放入重悬好的农杆菌菌液中，置于22℃暗培养箱中侵染过夜，然后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液后，将子叶节平铺于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗侵染5天。
(3)转基因苗获得
将共培养5天后的子叶节斜插入芽诱导培养基I(SI-I)中，25℃，16h 光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，恢复培养7天，剪掉过长的下胚轴后转入含8mg/ml的PPT(草铵膦)的芽诱导培养基II(SI-II)中，继续培养14-20天。将丛生芽从下胚轴切下移入含4mg/mlPPT的芽伸长培养基(SEM)中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，每10天继代培养一次，直至芽伸长至5cm左右为止。将伸长至5cm左右的幼芽切下，直插入生根培养基，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为 5000-6000Lux，直至根伸长至3-4cm，准备移栽。
该步骤中，芽诱导培养基I的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖， 0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/L Cef，150mg/L Tim，4g/L草丁膦， 0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；芽诱导培养基II的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/LCef，150mg/L Tim， 8g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；芽伸长培养基的组成为MS盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，0.5mg/L GA3，1mg/L ZR， 50mg/L L-Glu，50mg/LAsp，0.1mg/L IAA，50mg/L Cef，100mg/L Tim， 4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8；生根培养基的组成为MS盐， B5维生素，20g/L蔗糖，0.6g/L MES，50mg/L L-Glu，50mg/LAsp，1.5 mg/L IBA，25mg/L Tim，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8。
(4)炼苗移栽及筛选
将准备移栽的组培苗去掉封口膜，加入少量无菌水，25℃，16h光照 8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，培养两天后移苗，将蛭石与草炭土等量混合均匀，放入加水的托盘中，然后将组培苗从生根培养基中拔出冲洗掉根部残余的培养基，移入充分吸饱水分的营养土中。用含有0.1％Basta 除草剂涂抹大豆叶片，3天后无黄化反应的为转基因阳性植株。随机选取两个转基因株系，编号为OE-1株系和OE-2株系(OE即over expressed，过量表达)，进行后续的鉴定。
三、转基因植物的鉴定
1、基因的表达量鉴定
分别将受体株系DN50、GmG过表达转基因株系进行如下鉴定：
(1)取新收获的DN50以及GmG过表达转基因株系的种子，分离种皮以后提取总RNA并反转录为cDNA。
(2)以步骤(1)提取的cDNA为模板，用F4和R4组成的引物对鉴定GmG基因的表达量，用F3和R3鉴定内参基因(Actin基因的表达量)。 F3：5’-AAGCTATTTGAAGCCTGGTATGAA-3’(SEQ ID NO.13)；
R3：5’-ATATTATCAGTTTGGATCCACTCGA-3’(SEQ ID NO.14)。
F4：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’(SEQ ID NO.15)；
R4：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’(SEQ ID NO.16)。
以所述cDNA为模板，用各个特异性引物对进行定量PCR扩增得到的不同材料中GmG基因的表达量，结果如图1所示。从图1中可以看出，两个过表达株系OE-1和OE-2中，GmG的基因表达量明显高于对照DN50。
2、受体株系DN50、GmG过表达转基因株系成熟种子的萌发率比较
我们将受体株系DN50、GmG过表达转基因株系新收获的种子进行萌发实验的比较，结果如图2所示。从图2中可以看出，GmG过表达转基因株系成熟种子的萌发明显比DN50慢。萌发24h时，DN50萌发率为36％， GmG过表达转基因株系仅为6％。这表明GmG基因促进种子休眠。
3、受体株系DN50、GmG过表达转基因株系体内ABA含量的比较
ABA作为影响种子萌发的激素之一，其积累量和信号传导都有可能影响种子休眠。我们检测了DN50和GmG过表达转基因新鲜种子中的ABA含量，两个过表达株系中的ABA含量均显著高于DN50，如图3所示。
大豆是重要的粮食作物之一，为人类和动物提供油料和蛋白质来源。目前，我国大豆产量供不应求，主要依靠进口大豆填补空缺。在大豆的遗传育种中，如何打破休眠，保证种子的发芽率整齐一致一直是困扰大豆生产的一大难题。上述实施例的结果表明，大豆中的GmG基因参与调控了大豆种子的休眠作用，过表达该基因导致大豆中ABA含量积累，可以显著促进种子的休眠，因此，在生产实践中，一方面可以根据该基因设计分子标记，在育种中用于休眠品种的筛选，另一方面，可以根据该基因设计基因编辑的靶点，打破种子的休眠，提高种子的萌发率，培育并创制新的高产优异品系。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种获得具有萌发受到抑制表型的转基因大豆的方法，其是将编码植物种子休眠相关蛋白的核酸或包含所述核酸的表达盒导入目的大豆植物中，得到与所述目的大豆植物相比具有萌发受到抑制表型的转基因大豆；
其中所述植物种子休眠相关蛋白是由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物种子休眠相关蛋白还包括在其氨基末端或羧基末端上连接表达纯化标签的蛋白质，所述表达纯化标签的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2~ SEQ ID NO.6中的任一种所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20201027 Termination date: 20210829 |