CN114316003B - 大豆茸毛稀少相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从大豆中分离的与茸毛稀少性状相关的蛋白及其编码基因和应用，同时本发明还提供包含所述基因的表达盒、重组载体及其重组表达转化体，以及获得相应的转基因大豆的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种大豆茸毛稀少相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
植物表皮毛(Trichome)由表皮细胞发育而来，是存在于绝大多数陆地植物地上部分表皮组织的一种特化结构。根据表皮毛的形态、位置以及自身属性可以分为单细胞或多细胞、有分支或无分支以及有腺体或无腺体。
植物表皮毛为表皮层和环境之间构筑了一道天然的物理屏障，可以增加叶片的反射率、降低植物蒸腾速率、增强植物冷害或紫外辐射的耐受性以及保护植物组织免受昆虫的危害等(Kang et al.，2010；Schilmiller et al.，2009；Tingey，1991；Wagner et al.，2004；Wang et al.，2008；Wester et al.，2009)，在植物的生长和发育过程中发挥着极其重要的生物学功能。植物表皮毛由于结构简单，易于观察等特点被作为研究植物细胞命运决定的一种模式系统(Schellmann and Hulskamp，2005)。
植物在整个生命周期过程中会遭受各种来自生物或者非生物的胁迫，而植物表皮毛作为植物的最外层结构，具有抵御外界环境伤害的作用(Johnson，1975；Loughner etal.，2008；Traw and Bergelson，2003)。植物表皮毛对于生物胁迫的抵御主要是通过物理障碍的方式发挥作用，减少生物对植物体本身的伤害。在拟南芥中研究发现，无表皮毛更容易遭受植食性昆虫损害(Loe et al.，2007)。
此外，植物的腺体毛可以通过分泌大量的次生代谢物(如萜类、酚类、生物碱和甾醇等)来驱赶、诱捕或者化学毒杀昆虫从而保护植物自身不受侵害(Valverde et al.，2001)。在陆地棉中，研究人员发现腺体毛的数量随着植物年龄的增加而增多，分泌的正十三烷-2-酮的量也增多，从而抗虫性增加(Leite et al.，2001)。烟草中的次生代谢产物越多，例如茉莉酸甲酯，抗虫性的效果越好(Laue et al.，2000)。在辣椒中，相较于无茸毛材料，拥有表皮毛的材料对辣椒斑点病具有更好的抗性作用(Kim et al.，2011)。在番茄中，IV型和VI型腺体毛中分泌的次生代谢物质(姜烯和酰基糖)可以对植食性昆虫(如烟粉虱、桃蚜、红蜘蛛、甜菜夜蛾及叶螨等)有很好的抵御作用(Liedl et al.，1995；Maluf et al.，2001)。
此外，番茄突变体中的表皮毛减少和形态改变时会明显导致次生代谢物含量下降，如萜类、黄酮类和多酚等含量显著下降，最终表现为抗虫性下降(Kang et al.，2016；Kang et al.，2010)。植物表皮毛除了具有防御外来生物侵害的作用，在提高植物体应对非生物胁迫中也具有非常重要的作用。例如，稠密表皮毛番茄材料在相同条件下具有更高的抗旱和抗寒的能力(Johnson，1975)，橄榄叶片表皮毛能够保护植物体免受紫外光和低温等逆境的危害(Karabourniotis et al.，1992)。
大豆原产我国，已经有5000年的栽培历史，是重要的经济粮食作物。但由于我国大豆平均产量较低，目前我国大豆生产远远不能满足我国大豆消费需求。
目前对于大豆的抗病、虫性的赋予方法已经进行了各种研究。如在大豆抗蚜虫的转基因研究中，使用了苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白，简称Bt基因；来自植物本身的抗虫基因如蛋白酶抑制剂基因和外源凝集素基因等。同时，也有针对病毒抗性的抗花叶病毒转基因，抗大豆胞囊线虫，以及导入其他外源DNA如鹰嘴豆，皂角等，以及人工合成的杀虫基因表达载体的研究。但目前的转基因技术研究的主要是Bt，几丁质酶，蛋白酶抑制剂，植物凝集素类的基因，可利用的基因数量种类有限，需要进一步筛选鉴定。并且，存在常用的筛选标记，抗生素基因和除草剂抗性基因可能会影响人体健康，破坏生态环境的缺点。
与此相比，利用来自多样性的大豆品种资源的大豆自身基因进行转基因，在获得的植株中不会引入他种外源基因，更容易实现基因的功能，大大提高了安全性。进一步，如果基于易于观察的天然性状如根系密度，表皮毛等作为选择标记，可以避免对人体健康，生态环境的影响，具有无可比拟的优势。
Hill等发现，在大豆中，拥有稠密茸毛密度的近等基因系比无毛的近等基因系有显著较高的蚜虫密度(Hill et al.，2006)。相比水稻玉米等作物，大豆的研究起步较晚，目前仅有个别调控重要农艺性状包括结荚习性，开花时间，裂荚等相关性状的基因被报道出来，而已报道的大豆中与表皮毛相关的基因较少。例如，已有报道茸毛色相关基因大豆类黄酮3’-羟化酶在区分灰色绒毛大豆及棕色绒毛大豆中的应用(2014)，但对于茸毛密度相关的基因尚未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆茸毛稀少相关蛋白及其编码基因和应用。
发明人从测序品种美国大豆种系Williams 82中发现了一种与茸毛性状相关的蛋白，将其命名为GmPs蛋白，其编码基因在Williams 82大豆测序基因组中的位置为Chrl2：34824285..34825948，功能注释未知。
发明人发现，GmPs蛋白在利用植物表达载体如农杆菌进行过表达时，与来源种系相比，获得的植株的茸毛性状出现了茸毛密度更加稀少的显著改变，且抗旱性增加。这样的效果是基于现有的技术预料不到的，由此，发明人发现了一种分离的蛋白质，其为大豆茸毛稀少相关蛋白，以及首次注释其编码序列在大豆基因组中的功能。
为实现上述目的，本发明提供一种分离的蛋白质GmPs，其为控制大豆茸毛数目稀少表型的蛋白，包括：
(a)由SEQ ID NO：1所述氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)将(a)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有(a)蛋白质活性的由(a)蛋白质衍生的蛋白质；或
(c)在(a)蛋白质或(b)蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上表达纯化标签的蛋白质。
其中，所述的表达纯化标签可以是本领域常规所述的各类蛋白表达纯化用标签，其氨基酸序列更优选如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6中的任一种所示，具体请参见表1所示。
表1表达纯化标签的序列
| 标签名称 | 残基数目 | 优选序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | SEQ ID NO：2 |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | SEQ ID NO：3 |
| FLAG | 8 | SEQ ID NO：4 |
| Strep-tag II | 8 | SEQ ID NO：5 |
| c-myc | 10 | SEQ ID NO：6 |
为实现上述目的，本发明还提供一种分离的基因GmPs，其编码如前所述的蛋白质GmPs。
优选地，所述基因包括如下核苷酸序列：
(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；或
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性的核苷酸序列。
上述严格条件的含义如本领域常规所述，可为在6×SSC(柠檬酸钠)，0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
为实现上述目的，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含前述基因。
本发明包含以下内容。
1.蛋白质，其为：
(a)由SEQ ID NO：1所述氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)将(a)蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有(a)蛋白质活性的由(a)蛋白质衍生的蛋白质；或
(c)在(a)蛋白质或(b)蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上表达纯化标签的蛋白质，优选所述表达纯化标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6中的任一种所示。
2.基因，其编码如项1或2所述的蛋白质。
3.根据项2所述的基因，其包括如下核苷酸序列：
(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或
(2)核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；或
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上序列同一性的核苷酸序列。
4.表达盒，所述表达盒包含项2或3所述的基因，优选进一步包含启动子和终止子，其中所述启动子优选为35S启动子，更优选为如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的35S启动子，独立地，所述终止子优选包含如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
5.重组载体，所述重组载体包含项2或3所述的基因或项4所述的表达盒。
6.重组表达转化体，所述重组表达转化体包含项5所述的重组载体，其优选为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
7.一种转基因大豆植物的基因工程方法，包括：
在大豆植物中调节项1所述的蛋白质，或项2或3所述的基因的表达，从而调节大豆茸毛发育过程，例如所述调节可以通过向初始大豆植物转入调节所述蛋白质或基因表达的表达盒或重组载体进行，例如通过转入项4所述的表达盒，或项5所述的重组载体进行；
任选地，所述方法可以包括检测所述蛋白质或所述基因的表达；
任选地，所述方法可以包括确认所述蛋白质或所述基因的表达选择大豆茸毛发育发生调节的大豆植物，
任选地，所述检测使用PCR进行，优选使用的引物对为如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的序列，
任选地，所述转入优选使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导进行。
8.如项1所述的蛋白质或如项2或3所述的基因在在大豆基因工程中的应用。
9.如项2或3所述的基因的分子标记在育种中用于茸毛品种的筛选的应用。
10.如项2或3所述的基因作为基因编辑的靶点，用于改变大豆茸毛密度和/或创制不同茸毛密度的大豆材料的应用。
优选地，所述表达盒还包括有效连接的调控序列，如启动子、终止子等。所述启动子可以优选35S启动子，更优选为如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列的35S启动子，独立地，所述终止子优选包含如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
为实现上述目的，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含前述基因或前述表达盒。
其中所述重组载体可通过本领域的常规方法获得，如：将前述基因或前述表达盒连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规，较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明优选pTF101.1载体。
本发明中，可用现有的植物表达载体构建含有目的基因的所述重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。
所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
为实现上述目的，本发明还提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含前述重组载体。
其中所述重组表达转化体可通过本领域的常规方法获得，如：将前述重组载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组载体稳定地自行复制，并且使得其所携带的前述基因或前述表达盒可被有效表达即可。
为实现上述目的，本发明还提供一种获得转基因大豆植物的方法，其是将前述基因或前述表达盒导入目的大豆中，得到与所述目的大豆相比具有茸毛数目减少表型的转基因大豆植物。
其中，导入目的大豆的方法可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化大豆细胞或组织，并将转化的大豆细胞或组织培育成植株。
为实现上述目的，本发明还提供一种如前所述的蛋白质或如前所述的基因在大豆基因工程中的应用。
其中，所述大豆基因工程优选以调节大豆茸毛发育过程为目的的大豆基因工程。
附图说明
图1显示实施例2中野生型和转基因植株的表达量分析结果，其中，纵坐标显示GmPs基因的表达量，横坐标显示株系编号。
图2显示实施例2中野生型和转基因植株茸毛数目的实验结果，其中，纵坐标显示茸毛数目，横坐标显示株系编号。
图3显示实施例2中野生型和转基因植株茸毛数目的相应照片。
图4显示实施例3中野生型和转基因植株抗旱性的实验结果，其中，纵坐标显示复水成活率，横坐标显示株系编号。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
以下的实施例是为了便于更好地理解本发明，但并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或按照商品说明书选择。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
试剂及材料
大豆植物：
作为野生型大豆使用了DN50，下文中用WT(wild type)表示，该品种为黑龙江省审品种(黑审豆2007022)，可以从市面购买得到。DN50为(春播)大豆品种，植株亚有限结荚习性，地上组织的茎叶荚均为(灰色)茸毛，茸毛密度(正常)。
Williams 82为大豆属大豆(Glycine max L.)，购自美国国家农业部，其网站为http：//www.ars-grin.gov/npgs/acc/acc_queries.html。Williams 82为(春播)大豆品种，植株无限结荚习性，地上组织的茎叶荚均为(灰色)茸毛，茸毛密度(正常)。
基因：
GmPs基因是从Williams 82中克隆得到。
载体：
pTF101.1载体和农杆菌菌株GV3101购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心(Biovector Science Lab，Inc)。
试剂盒：
酶切回收试剂盒等耗材购自New England Biolabs和天根生化科技(北京)有限公司。
PFGC5941载体购自北京华博德亿生物技术有限公司，货号vt-3034，载体详情及使用方法请参考产品说明书，参考文献为：Kerschen A，Napoli C A，Jorgensen R A，etal.Effectiveness of RNA interference in transgenic plants[J].FEBS letters，2004，566(1-3)：223-228.
农杆菌：
农杆菌菌株GV3101购自中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心(BiovectorScience Lab，Inc)。
测序公司：北京六合华大基因科技有限公司。
茸毛数目减少或茸毛稀少的定义：目测茎叶茸毛稀少，大约是正常茸毛植株的1/3-1/4。
实施例1 GmPs过表达转基因植物的建立
在大量序列分析和功能验证的基础上，从大豆品种Williams 82中发现一个蛋白质，将其命名为GmPs蛋白(简称为Ps蛋白)，其氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：1所示，
将编码GmPs蛋白的基因命名为GmPs基因，其基因组序列如序列表的SEQ ID NO：7所示(包括1个外显子)，其cDNA序列如序列表的SEQ ID NO：8所示。
一、重组质粒的构建
1、将大豆品种Williams 82中的顶端分生组织从植株上分离下来，提取RNA后进行反转录，获得大豆品种Williams 82的顶端分生组织cDNA。
2、以步骤1合成的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：(SEQ ID NO：9)；
R1：(SEQ ID NO：10)。
3、用限制性内切酶Asc I和Xma I双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Asc I和Xma I双酶切PFGC5941载体，回收约9992bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒GmPs-PFGC5941。根据测序结果，确认重组质粒GmPs-PFGC5941为在PFGC5941载体的AscI I和Xma I酶切位点之间插入了序列表中如SEQ ID NO：8所示的双链DNA分子。
6、以步骤5中得到的质粒GmPs-PFGC5941为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR，将35s启动子与基因序列一起扩增，得到PCR扩增产物。
F2：(SEQ ID NO：11)；
R2：(SEQ ID NO：12)。
7、用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切PTF101.1载体，回收约9138bp位置的载体骨架。
8、将步骤6的PCR产物和步骤7的载体骨架通过(同源重组酶，货号TRANSGEN，CU101)同源重组连接，得到重组质粒GmPs-PTF101.1。根据测序结果，对重组质粒GmPs-PTF101.1进行结构描述如下：在PTF101.1载体的EcoR I和Hind III酶切位点之间插入了35S启动子(如SEQ ID NO：17所示)、序列表中如SEQ ID NO：8所示的双链DNA分子，和终止子(如SEQ ID NO：18所示)，即验证表达盒构建完成。
二、GmPs过表达转基因植物甲的获得
1、将重组质粒乙导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌，冻存于-80℃，甘油保存。
2、将步骤1得到的重组农杆菌采用子叶节转化方法(Margie M.P.et al 2004Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybeantransformation using the cotyledonary node explant.Euphytica 136：167-179)转化受体植株DN50，收获T1代种子。具体操作步骤如下：
(1)种子灭菌与萌发
挑选圆粒饱满、表面光洁无病斑的DN50大豆种子于120mm的培养皿中。将培养皿放入干燥器，在干燥器中放入250ml烧杯一个加入100ml次氯酸钠溶液，然后沿着烧杯缓缓加入4ml浓盐酸，立即盖好干燥器的盖子，利用氯气对大豆种子灭菌18h，灭菌后在超净台中开盖吹掉残余的氯气。将灭过菌的大豆种子种脐朝下均匀摆放于萌发培养基中，每皿30-35粒种子。然后用保鲜袋包好，剪好透气口，放入暗培养箱中，萌发条件为22℃，萌发16小时以上。
(2)农杆菌的侵染及外植体共培养
取萌发好的种子，先切掉一部分子叶，然后沿着下胚轴将种子纵切为对称的两部分，在显微镜下轻轻刮去子叶节处的一对真叶，最后在子叶节处用手术刀轻轻点刺几下即为用于转化的外植体。取冻存于-80℃的甘油保存的重组农杆菌置于冰上解冻后，在超净台中用灭菌枪头蘸取少量菌液画线培养于含有100ug/ml Kan(卡那霉素)和100ug/ml Gen(庆大霉素)的YEP固体培养基上，28℃活化培养2天，然后再用涂布器涂布于新的含有Kan与Gen的YEP固体培养基上，培养过夜，最后将培养过夜的农杆菌用液体共培养基重悬至OD600值为0.6即可。将制备好的外植体放入重悬好的农杆菌菌液中，置于22℃暗培养箱中侵染过夜，然后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液后，将子叶节平铺于铺有无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗侵染5天。
固体共培养基的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES(2-吗啉乙磺酸)，1.6mg/L 6-BA(苄基腺嘌呤)，100mg/L L-Cys，0.1M DDT(双对氯苯基三氯乙烷)，0.5mg/LGA3(赤霉素)，0.2％(w/v)植物凝胶(Sigma-P8169)，pH 5.4)
(3)转基因苗获得
将共培养5天后的子叶节斜插入芽诱导培养基I(SI-I)中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，恢复培养7天，剪掉过长的下胚轴后转入含8mg/ml的PPT(草铵膦)的芽诱导培养基II(SI-II)中，继续培养14-20天。
将丛生芽从下胚轴切下，移入含4mg/ml PPT的芽伸长培养基(SEM)中，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，每10天继代培养一次，直至芽伸长至5cm左右为止。将伸长至5cm左右的幼芽切下，直插入生根培养基，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，直至根伸长至3-4cm，准备移栽。
该步骤中，芽诱导培养基I的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/L Cef，150mg/L Tim，4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；
芽诱导培养基II的组成为B5盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，1.6mg/L 6-BA，50mg/L Cef(头孢霉素)，150mg/L特美汀(Tim，Phytotech-T869-10g)，8g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.7；
芽伸长培养基的组成为MS盐，B5维生素，30g/L蔗糖，0.6g/L MES，0.5mg/L GA3，1mg/L ZR(玉米素核苷(反式))，50mg/L L-Glu，50mg/L Asp，0.1mg/L IAA(吲哚乙酸)，50mg/L Cef，100mg/L Tim，4g/L草丁膦，0.2％(w/v)植物凝胶，pH 5.8；
生根培养基的组成为MS盐，B5维生素，20g/L蔗糖，0.6g/L MES，50mg/L L-Glu，50mg/L Asp，1.5mg/L IBA(吲哚丁酸)，25mg/L Tim，0.2％(W/v)植物凝胶，pH 5.8。
(4)炼苗移栽及筛选
将准备移栽的组培苗去掉封口膜，加入少量无菌水，25℃，16h光照8h黑暗，光照强度为5000-6000Lux，培养两天后移苗，将蛭石与草炭土等量混合均匀，放入加水的托盘中，然后将组培苗从生根培养基中拔出冲洗掉根部残余的培养基，移入充分吸饱水分的营养土中。用含有0.1％Basta除草剂涂抹大豆叶片，3天后无黄化反应的为转基因阳性植株。随机选取两个转基因株系，编号为OE-1株系和OE-2株系(OE即over expressed，过量表达)，进行后续的鉴定。
实施例2 GmPs过表达转基因植物中茸毛性状的变化
1、基因的表达量鉴定
分别将受体株系DN50、GmPs过表达转基因株系OE-1株系和OE-2株系进行如下鉴定：
(1)取幼苗株系的顶端分生组织，提取总RNA并反转录为cDNA。
(2)以步骤(1)提取的cDNA为模板，用F4和R4组成的引物对鉴定GmPs基因的表达量，用F3和R3鉴定内参基因(Actin基因的表达量)。
F3：(SEQ ID NO：13)；
R3：(SEQ ID NO：14)。
F4：(SEQ ID NO：15)；
R4：(SEQ ID NO：16)。
定量PCR扩增的条件为：预变性95℃5min；扩增(45个循环)95℃10s，59℃15s，72℃20s。在扩增循环结束后开始熔解曲线：95℃5s，65℃1min，65-97℃(温度以0.11℃/s速率递增)。
将以所述cDNA为模板，用各个特异性引物对进行定量PCR扩增得到的不同材料中GmPs基因的表达量量示于图1。从图1中可以看出，两个过表达株系OE-1和OE-2中，GmPs的基因表达量明显高于对照DN500，高约40-50倍。
2、受体株系DN50、GmPs过表达转基因株系茸毛数目比较
肉眼观察三组中大豆植株的整株，可以见到受体株系DN50为正常直立茸毛，数目正常，在OE-1和OE-2组中，叶片表面(茸毛数目减少)，叶柄(茸毛数目减少)，茎秆(茸毛：稀少，长度不变，直立，末端形态(钝端))。
发明人将受体株系DN50、GmPs过表达转基因株系OE-1株系和OE-2株系在大豆R1时期进行茸毛数目统计，使用相机拍照植株的叶柄，统计相同节位的0.5cm长叶柄的茸毛数目，每个株系统计十株，利用镊子一根根取下来统计，结果如图2和图3所示。从图2和图3中可以看出，GmPs过表达转基因株系茸毛数目明显比DN50减少，这表明GmPs基因抑制大豆茸毛的产生。
实施例3、GmPs过表达转基因株系的抗旱性
干旱严重影响植物的生长发育，干旱严重时可造成产量严重损失。因此，提高作物抗旱性对于作物稳产具有重要的作用。我们检测了DN50和GmPs过表达转基因植株对于抗旱性的表现，将同上制备的GmPs过表达转基因株系两周的大豆幼苗和对照组DN50大豆幼苗用于抗旱处理，用于抗旱处理的幼苗统一控水两周后进行复水处理，统计复水后的大豆幼苗成活率。控水期间完全不进行浇水，复水处理为恢复正常浇水量。结果表明，两个过表达株系中的复水成活率均显著高于DN50(图4)。
大豆是重要的粮食作物之一，在大豆的遗传育种中，如何提高抗逆性、增加稳产性一直是困扰大豆生产的一大难题。
上述实施例的结果表明，大豆中的GmPs基因参与调控了大豆茸毛的发育，过表达该基因导致大豆中茸毛数目显著减少，抗旱性显著增加。
工业实用性
本发明提供了茸毛密度相关基因，利用该茸毛密度相关基因，如茸毛稀少相关基因能够研究对改善大豆植株的物理性抗生物胁迫性，通过腺体毛的抗生物胁迫性，及应对非生物胁迫的特性等。期待对表皮毛相关基因，如稀少茸毛密度相关基因的编辑，例如导入或缺失，转化技术等在大豆的品种筛选及利用中的应用。
因此，在生产实践中，一方面可以根据该基因设计分子标记，在育种中用于茸毛品种的筛选，另一方面，可以根据该基因设计基因编辑的靶点，适度改变大豆茸毛密度，从而创制不同抗旱性的材料。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (7)
1.一种转基因大豆植物的基因工程方法，包括：
在大豆植物中过表达如SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或如SEQ ID NO：7或如SEQ ID NO：8所示的基因，得到与初始大豆植物相比具有茸毛数目减少表型的转基因大豆植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达通过向初始大豆植物转入调节所述蛋白质或基因表达的表达盒或重组载体进行，所述表达盒包含如SEQ ID NO：7或如SEQID NO：8所示的基因，所述重组载体包含如SEQ ID NO：7或如SEQ ID NO：8所示的基因或所述表达盒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述蛋白质或所述基因的表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括确认所述蛋白质或所述基因的表达选择具有茸毛数目减少表型的转基因大豆植物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测使用PCR进行，使用的引物对为如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的序列。
6.根据权利要求2所述的方法，所述转入使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导进行。
7.过表达如SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或如SEQ ID NO：7或如SEQ ID NO：8所示的基因在茸毛数目减少和抗旱性增加的大豆基因工程中的应用。
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