WO2017171493A1 - 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 제조 방법 및 장치 - Google Patents

단면 패턴을 갖는 인쇄물의 제조 방법 및 장치 Download PDF

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WO2017171493A1
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WO
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ink
printing
cross
printing apparatus
partitioned
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PCT/KR2017/003579
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English (en)
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안근선
진송완
심진형
윤원수
강동구
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주식회사 티앤알바이오팹
한국산업기술대학교산학협력단
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C67/00—Shaping techniques not covered by groups B29C39/00 - B29C65/00, B29C70/00 or B29C73/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for producing a printed matter having a single-sided pattern and a manufacturing method using the same.
  • a printing apparatus capable of manufacturing a printed matter having a single-sided pattern using a single ejection body obtained from at least two different inks. It relates to the printing method used.
  • Organs or tissues that make up the human body can be composed of biomaterials that make up a variety of cells and extracellular matrix. Researches are being actively conducted to regenerate the functional tissues required through the fabrication of cell structures similar to those of the human body using 3D bioprinting technology.
  • Head models applied to bioprinting technology are largely divided into inkj et-based printing and extrusion-based printing models.
  • various methods using lasers and ultrasonics have been proposed, but the first two gamma hairs are the most widely used.
  • the physical properties of the bio inks required by such bio printing techniques vary greatly depending on the printing head models used. Discharge-based printing systems using fine nozzles and syringes are not limited to the viscosity of the material compared to jetting-based technologies. Therefore, the range of applicable biomaterials becomes much wider than inkjet-based printing technology. In addition, it is easy to process a thick layer, it is easy to manufacture a cell structure of the size required by the clinical.
  • the resolution of bioprinting techniques based on extrusion laminated molding developed to date is several hundred micrometers, but the basic structure of tissues and organs in the human body has a big difference of several tens of micrometers or less.
  • the diameter of the capillaries that supply nutrients to cells constituting organs or tissues is 3 to 4 micrometers, so it is difficult to implement the current bioprinting technique.
  • bioprinting may use multiple ink.
  • hydrogel ingots When the curing agent is cured together, or when co-culture of several kinds of cells, the function of the cells is improved when the division between heterogeneous cells is used rather than simply mixing and spraying the cells.
  • bioprinting should be performed by spraying multiple inks. According to this conventional method, to solve this problem using a multiheaded head containing heterogeneous materials, there are disadvantages in that the printing process time increases, which adversely affects cell viability and complicates the system.
  • a nozzle with a small diameter should be used.
  • a shear stress is generated between the material and the wall discharged from the inside of the nozzle during the discharging. .
  • the problem of cell death frequently occurs due to shear force, it is also difficult to miniaturize the diameter of the nozzle.
  • the present invention relates to an ink ejecting member for producing a printed matter having a cross-sectional pattern using one ejection containing two or more different inks and a printing method using the same.
  • the present invention relates to a printing apparatus for producing a printed matter having a cross-sectional pattern using one ejection containing two or more different inks and a printing method using the same.
  • An object of the present invention is to provide an apparatus for printing a biological tissue shape having a complex cross-sectional structure with high precision and resolution, and a printing method using the same.
  • the present invention provides a printing apparatus and printing method that can heterogeneously print a desired shape and at the same time greatly reduce the shear stress of the cells.
  • the present invention provides an ink ejecting member for producing a printed matter having a cross-sectional pattern by using one ejection containing two or more different ' inks, and a printing apparatus including the same. And it relates to a printing method using the same.
  • the printing device may be a bioprinting device and method used for manufacturing artificial tissues, organs, and the like.
  • Another example of the present invention is to provide a different ink in each partitioned space of the ink ejection member, which includes a compartment provided in the three-dimensional printing apparatus, a compartment for accommodating ink, a ejection portion and a partition member for providing two or more partitioned spaces.
  • the ink discharge member is partitioned so as to have a cross-sectional pattern having the same shape as a three-dimensional printed material by the partition member. It may be to provide more than one space.
  • the method for producing a printed matter having a cross-sectional pattern includes a partition member for providing two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter, in the space partitioned by the partition member A different ink in each partitioned space of the ink ejecting member, each including a receiving portion accommodating different printing inks and a discharging portion disposed below the accommodating portion and having a single passage through which the ink passes and discharging the ink contained in the accommodating portion; Providing a partition member for providing two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter, in the space partitioned by the partition member A different ink in each partitioned space of the ink ejecting member, each including a receiving portion accommodating different printing inks and a discharging portion disposed below the accommodating portion and having a single passage through which the ink passes and discharging the ink contained in the accommodating portion; Providing a partition member for providing two or more spaces partition
  • It relates to a three-dimensional printing method of a printed matter having a cross-sectional pattern comprising the step of printing the ink discharge on a substrate.
  • the discharge or printed matter has a cross-sectional pattern having the same shape as the printed matter, and preferably, the cross-sectional pattern of the receiving portion is a ratio of the cross-sectional pattern of the discharge or printed matter, for example, the diameter of the cross-section is 100: 99 to 1.00: 0.1, or 100: 50 to 100: 1, 100: 18 to 100: 1 ratio.
  • Another example of the present invention is a three-dimensional printing apparatus of a printed matter having a cross-sectional pattern,
  • a partition member for providing two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter, and a receiving portion for receiving different printing ink in the space partitioned by the partition member, and located below the receiving portion
  • An ink discharge member having a single passage through which ink passes and including a discharge portion for discharging ink contained in the accommodation portion
  • a nozzle connected to the discharging end
  • It relates to a three-dimensional printing apparatus including a pressing member for applying pressure to the ink contained in each partitioned space, each different ink is printed to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter through the discharge portion having a single passage.
  • the printing apparatus performs pressure using a single pressurizing member or applies two or more pressurizing members to apply the same pressure to the ink contained in each partitioned space. Pressurized to the same pressure can be carried out. Pressing by the pressing member can be printed so that different inks each have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter through the discharge portion having a single passage.
  • the printing apparatus when using the printing apparatus according to the present invention, it is possible to produce a printed matter having a variety of cross-sectional patterns, in particular can be produced by a three-dimensional printing method by printing a biological tissue shape having a complex cross-sectional structure with high precision and resolution, In the case of including the cells in the biological tissue, there is an advantage that can significantly reduce the shear force of the cell at the same time heterogeneous printing the desired shape.
  • the three-dimensional printing method of a printed matter having a cross-sectional pattern comprises an ink ejection member, each of which includes an accommodating portion, an ejecting portion, and a partition member for providing two or more partitioned spaces, which are provided in the three-dimensional printing apparatus.
  • an ink ejection member each of which includes an accommodating portion, an ejecting portion, and a partition member for providing two or more partitioned spaces, which are provided in the three-dimensional printing apparatus.
  • compartment Providing different inks; applying pressure of the same condition to the ink contained in each of the divided spaces, and discharging the ink contained in the two or more divided spaces to a single discharge port to produce ink discharges; And printing the ink discharge on a substrate—, and a three-dimensional printing method of a printed matter having a single-sided pattern.
  • the application of the pressure under the same condition may be performed by using a single pressing member or by pressing the same pressure using two or more pressing members.
  • the pressure under the same condition is a pressure condition under which ink contained in two or more divided spaces can be discharged to a single discharge port to form a single ink discharge.
  • ink contained in two or more divided spaces is a single discharge port.
  • a single ink discharge is formed by discharging, and means a pressure condition such that the ink discharge and the printed matter produced therefrom have the same shape as the cross-sectional pattern of the target printed object.
  • the three-dimensional printing method of a printed matter having a cross-sectional pattern according to the present invention can be performed by using the ink ejecting member or the three-dimensional printing apparatus including the ink ejecting member according to the present invention.
  • the three-dimensional printing apparatus of a printed matter having a cross-sectional pattern includes a partition member for providing two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed material, the space partitioned by the partition member And an ink ejecting member including a receiving portion for receiving different printing inks, each having a single passage located below the receiving portion, and having a single passage through which the ink passes, and an ejecting portion for ejecting the ink contained in the receiving portion. And a pressurizing member for applying pressure to the ink contained in each of the divided spaces, and a nozzle connected to the discharge unit.
  • the three-dimensional printing apparatus may include a substrate for printing the discharge and an additional device for printing may include components included in a conventional three-dimensional printing apparatus.
  • a three-dimensional printing method of a printed matter having a cross-sectional pattern providing different ink to each partitioned space of the receiving portion of the ink ejecting member, by applying pressure to the ink contained in each partitioned space, By discharging ink through the discharge unit, an ink discharge product having a cross-sectional pattern having the same shape as the print Manufacturing, and printing the ink discharge on a substrate.
  • a method of manufacturing a printed article having a cross-sectional pattern using an ink ejecting member or a three-dimensional printing apparatus including the ink ejecting member, and a three-dimensional printing apparatus including the ink ejecting member or a thin ink ejecting member is provided.
  • Each component and method step by step will be described in detail below.
  • the ink ejecting member includes a partition member for providing two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern of the same shape as the printed matter, and a receiving portion for receiving different printing inks into the space partitioned by the partition member; And a discharge part disposed below the container and having a single passage through which the ink passes, and discharging the ink contained in the container.
  • the present invention uses two ink to eject two or more different inks together. Since printing is possible, a single printing head can be used, which reduces the printing process time and hardly exerts shear stress on the ink or the cells contained therein. Therefore, when using the ink containing the cells using the printing method or apparatus according to the present invention, there is an advantage that the cell viability is high and the system is simple.
  • the ejecting member is a component for supplying ink by pushing the ink under pressure from the denture, and may be a cartridge or a syringe (syr inge) that is generally used in a three-dimensional printing apparatus.
  • the receiving portion may include a partition member that provides two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern, the same shape as the discharged material, and the space partitioned by the partition member may accommodate different ink.
  • a partition member that provides two or more spaces partitioned to have a cross-sectional pattern, the same shape as the discharged material, and the space partitioned by the partition member may accommodate different ink.
  • the partition member included in the ink ejecting member is formed integrally with the receiving portion or is detachable from the ink ejecting member.
  • the partition member In order to provide two or more spaces in the accommodating part, it may be mounted on the inner part of the accommodating part or may further include a hollow part mountable in the accommodating part. In the case of including the hollow part, the partition member may be provided in an integral form or detachable form with the hollow part.
  • the partition member may be manufactured by various methods such as injection, extrusion, or three-dimensional printing, but preferably may be manufactured by three-dimensional printing.
  • the size of the partition member is to be allowed to enter inside the receiving portion, any size and shape, such as cylindrical, square, triangular pyramid is possible.
  • the cross-sectional pattern of the compartment may be manufactured in various shapes, for example, may have the same pattern as the cross-sectional area of the artificial tissue to be manufactured. Examples of various cross-sectional shapes of partition members are shown in FIG. 5, and may include shapes similar to urethral shapes, shapes including a plurality of concentric circles, and the like. 5 is a photograph showing a partition member used in the ink ejecting member according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 3 and 4 An example of the hollow part according to the present invention is shown in FIGS. 3 and 4, wherein the hollow part 70 is combined with a partition member 30 that is made in an integral or detachable form, into the interior of the ink ejecting member 10. Can be mounted.
  • the material of the singer-based compartment is ABS (Acrylonitrile lebutadiene styrene), PCL (polycaprolactone), ASA (Acrylonitrile-Stryrene-Acrylate), SAN (St. ryrene ⁇ Acryloni trylene copolymer), PS (Polystyrene)
  • Thermoplastic resins and photocurable resins such as PPSF / PPSU (Pol y heny 1 s u.1 f one), Polyether imide, PLA (Polylactic acid), PDL (Poly—d—lysine) Solid materials such as nonferrous and nonferrous alloy materials that can be processed are suitable.
  • the ink ejecting member has a single passage located below the accommodating portion and has a single passage through which the multiple inks pass, and includes an ejecting portion for ejecting the ink contained in the accommodating portion.
  • the discharge part may have a single passage, so that the ink contained in the accommodation part partitioned into a plurality of spaces may be discharged in a single channel thin method rather than multi-channel control.
  • the inner diameter of the discharge port is formed very small.
  • the ink contained in the accommodation portion through the discharge port can be discharged to the outside of the accommodation portion. remind The ink discharge discharged from the discharge portion has the same cross-sectional pattern as that of the accommodating portion, but may be reduced in size.
  • the three-dimensional printing apparatus may further include a nozzle connected to the discharging end of the discharge member, the ink is discharged through the exposure, and the printing is discharged from the nozzle by placing a plate under the nozzle. The ink is deposited on the plate to produce a print.
  • the printed matter which has a cross-sectional pattern which concerns on this invention is a human-like tissue.
  • Yrol there are muscle tissue (b ⁇ die structure), bone tissue (l amel lae & canal structure), nerve tissue (per ineurium structure), vascular tissue (mul ti-layer structure), spinal cord tissue, etc. .
  • the accommodation unit having the same cross-sectional pattern and the discharge unit discharging the same in a single passage can be provided, thereby achieving high resolution.
  • a method for printing a living tissue provides a printing ink having an enlarged cross-sectional shape having the same shape and proportion as a printed matter in a receptacle, while maintaining a cross-sectional pattern of the receptacle in the same shape,
  • the pressure can be controlled to pass through the discharge section having a smaller cross section. It is preferable that the cross-sectional pattern of the discharged ejection is at a level capable of maintaining the same shape as the cross-sectional pattern of the accommodation portion.
  • the present invention it is possible to easily print a microstructure having a very small and complicated size by using a printing ink of a large size that can be produced relatively easily.
  • the meaning of “same” is defined to mean not only the same, but also the same to the extent that it can perform substantially the same function. Only the size of the cross section It means that the shape of the original cross section is kept small as it is small. By doing so, a printing material having a large cross section, which is easier to mold, is first made, and then printing of tissue cells corresponding to a desired size, i.
  • the viscosity of the printing ink is preferably such that the cross section of the discharged discharged through the nozzle can maintain the same shape as the cross section of the printing material.
  • the cross-section of the printed result is a small size that cannot be achieved with current bioprinting techniques or a microstructure that can significantly reduce survival when printed.
  • muscle tissue (bundle structure), bone tissue (l alam lae & canal structure), nerve 2: ⁇ (per ineurium structure), vascular tissue (mul ti layer structure), spinal cord tissue.
  • the cross section of the printing device accommodating portion according to the present invention has a cross-sectional pattern having the same shape as the printed matter, and the cross-sectional pattern of the accommodating portion is represented by various methods such as the area ratio, diameter ratio, etc. Can be.
  • the cross-sectional pattern of the accommodating portion is a ratio of the cross-sectional pattern of the sing-up discharge or the printed matter, for example, the diameter of the cross-sectional pattern is 100: 99 to 100: 0.1, or 100: 50 to 100: 1, 100: 18 to 1.00: 1 ratio can be reduced.
  • the reduction ratio is directly affected by the cross-sectional diameter of the receiving portion, the fragment diameter of the discharge portion, or the diameter of the nozzle, and can be variously designed by appropriately adjusting the cross-sectional pattern size of the desired printed matter.
  • the cross-sectional diameter of the printout varies depending on the size of the nozzle. The range is 0.1 ram to lmm, and the characteristics of the material, the pressure, the speed of the printing head, the position of the printing result (printing bed), etc. It may change depending on the printing process.
  • the ratio can be downsized to 98.7% (200 ⁇ ) from the total diameter (15 mm 3) of the specific shape (eg Lobule).
  • the reduction ratio may be calculated according to Equation 1 below.
  • the ink provided to the ink ejecting member according to the present invention can be used to manufacture artificial organs and the like. It is preferred that it is a bioink which can be used. Specifically, printing may be performed by supplying different ink to each partitioned space in an ink container including a partition that provides two or more partitioned spaces so as to have a cross-sectional pattern having the same shape as a printed matter.
  • the different inks mean that the inks are different from one or more selected from the group consisting of constituents, constituent contents and physical properties.
  • the term 'bio ink' includes living cells or biomolecules, and is a term used to collectively refer to a material capable of manufacturing a structure that is required for the Bao printing technology.
  • the bio ink of the present invention comprises a liquid, semisolid, or solid composition comprising a plurality of cells.
  • the bio ink should provide a physical environment for three-dimensional processing and a biological environment for the cells to perform the intended function.
  • the supply of nutrients and oxygen necessary for the survival of cells in the ink ejecting member is appropriately performed. It must also be able to protect the cells from the physical stresses that occur during the printing process.
  • the bio ink should have the physical properties required in the printing process such as repeatability of 3D patterning, productivity, and no clogging of the nozzle.
  • the ink according to the present invention is a hydrogel
  • the ink may include a gelling polymer, for example, one or more selected from the group consisting of a gelling polymer, a cell, a growth factor, and an extracellular matrix. can do.
  • the bioink used in the present invention may be, for example, a hydrogel containing / mixing a desired cell with a specific growth factor.
  • Hydrogels include collagen, matrigel, alginate, gelatin and agarose. Decellularized tissue-derived cell ink, hyaluronic acid, fibrin gel, or the like or a compatible hydrogel is suitable.
  • bio-inks diffuse faster at lower viscosities, they are thicker than water (1 cp) and have a viscosity measured at 25 ° C, ranging from 2 cp to 1, 000, 000 Cp, for example, 2 cp to 10,000 cp, or Material grades on gels having a viscosity of 5 cP to 1,000, 000 cP are suitable.
  • the viscosity of the substance in gel form used in the process according to the invention It is preferable to have a suitable viscosity so that the printing material can be discharged in the discharge process described later.
  • the inks applicable to the present invention may use various viscosity enhancers to provide a viscosity suitable for ejection. Viscosity of the printing material is such that the cross section of the discharged discharged through the nozzle can maintain the same shape as the cross section of the printing material.
  • hydrogel-based bio inks Although natural-derived or synthetic hydrogel bio inks have been developed and used in the three-dimensional bio printing field, hydrogel-based bio inks have excellent physical and biological aspects such as biocompatibility, printing suitability, geometric precision and precision. have.
  • extrudeable is meant that can be shaped by passing (eg under pressure) an ejection, nozzle or orifice (eg one or more holes or tubes). Derived from growing cells at an appropriate density The cell density required for the biomink depends on the cell to be used and the tissue or organ to be prepared.
  • the present invention also provides a bio-ink composition which taps that the bio-ink composition further contains tissue-derived components.
  • tissue-derived components mean that specific tissues of animals such as cartilage, kidneys, heart, liver, muscles, etc. are decellularized and gelated of a substance mainly composed of extracellular matrix. Can be included to enhance.
  • the bio ink composition may further include a cell culture medium.
  • the cell culture medium is a concept including any medium suitable for the cells of interest.
  • the ink according to the present invention may include a gelling polymer, and the gelling polymer solution used for such printing may be used in various kinds.
  • the conditions that the polymer solution should have are as follows. In order to ensure that it has a suitable viscosity, it must be easy to eject to the nozzle, and the problem of crushing the shape of the object made by rapid curing after discharge Should not occur. In addition, for manufacturing purposes, it should be possible to create a cell culture environment similar to the tissue in the human body.
  • gelling polymer examples include fucoidan, collagen, alginate, chitosan, hyaluronic acid, silk, polyimides, polyamix acid, polycarprolactone, polyetheriniide, nylon (nylon) ), Polyaramid, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone (o 1 yi ny I yr rol i done),
  • Polyaniline polyacrylonitrile, polyethylene oxide, polystyrene, cellulose,.
  • Polyacrylate polyacrylate
  • polymethyl methacrylate polymethylmethacrylate
  • poly Leshan polylact ic acid
  • ⁇ PLA polylact ic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • copolymers PLGA of the lock acid and polyglycolic acid
  • PPE polyphosphazene
  • PA polyanhydride
  • P0E ⁇ poly (propylene fumarate) —diacrylate ⁇ po 1 y (pr opy 1 ene fumarate) — diacrylate
  • PPF-DA ⁇ polyethylene glycol diacrylate ⁇ polyethylene glycol) diacrylate
  • the material is not limited to this embodiment.
  • the gelling polymer may be a chemical modification of the natural polymer, for example pentapept to add a binding site of GelMA, Alginate / Gelat in, Alginate that combines gelatin and methacrylate (MA) chemically and combines photohiitiator Ide sequencing Tyr—Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) and alginate combined with EDC / NHS.
  • the hydrogel including the polyethylene glycol, alginate, collagen and gelatin has a high moisture content, excellent biocompatibility and control the mechanical properties It has been widely used in the manufacture of a carrier in which cells can be embedded and have excellent biodegradability. For this reason, hydrogels are well suited for the manufacture of cell-loaded structures and can be printed directly to obtain various types of tissue regeneration backbones.
  • the gelatin is particularly suitable as the cell carrier material because it exhibits temperature-sensitive properties, ie, 3 ⁇ 4 Latin has the property of liquefying at 37 0 C and solidifying below room temperature.
  • the gelling polymer may form a crosslink by using a physical treatment or a chemical treatment, a crosslinking solution may be used for the chemical treatment, and a crosslinking solution may be appropriately selected according to the selected gelling polymer.
  • the crosslinking solution may be gypsum; Or hydroxyapatite, apatite carbonate, apatite fluoride, apatite chloride, o TCP, ⁇ -TCP, calcium metaphosphate, tetracalcium phosphate, calcium hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, calcium pyrophosphate, calcium carbonate, calcium sulfate, EDC ⁇ 1-et hy 1-(3-3-di me t hy 1 am i nopr opy 1) carbodi imide hydrochloride ⁇ or salts thereof.
  • the ratio of collagen concentration in the collagen solution of the liquid form is usually in the range of 0.1 ⁇ 30 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the manufacturing method of the hydrogel may be carried out by applying a manufacturing method used when preparing an ink for a conventional three-dimensional printing, but is not particularly limited.
  • the bioink according to the present invention may include cells, and applicable cells or tissues are not particularly limited, and may be animal cells or plant cells, or tissues of animals or plants.
  • the cells may be stem cells. ), Osteoblasts, myoblasts, tenocytes, neuroblasts, fibroblasts (fi br ob 1 as t), glial cells (g ⁇ ob 1 as t) (germce 11), hepatocyte, renal cell, sertoli cell, chondrocyte, epithelial cell, cardiovascular cell, keratinocyte, smooth muscle cell ( In the group consisting of smooth muscle cells, cardiomyocytes, nerve cells, endothelial cells, hormone secreting cells, immune cells, pancreatic islet cells, and neurons It may be any one or more selected.
  • the cell type used in the prepared artificial tissue of the present invention may be cultured in any manner known in the art. Cell and tissue culture methods are known in the art.
  • the cells may also be incubated with cell differentiation materials that induce differentiation of the cells along the desired cell line.
  • stem cells are incubated in contact with differentiation medium to produce a range of cell types.
  • differentiation media include, but are not limited to, osteogenic differentiation medium, chondrogeni c differentiation medium, adipogenic differentiation medium, neuronal differentiation medium, cardiomyocyte differentiation medium, and enterocyte differentiation medium (eg, Incubated with contact with differentiation medium).
  • cells may be cultured with growth factors, cytokines, and the like.
  • Growth factor refers to a protein, polypeptide, or polypeptide complex comprising a cytokine that is produced by a cell and can affect itself and / or various other adjacent or isolated cells. Factors affect growth and / or differentiation of certain types of cells, either developmentally or in response to a number of biochemical or environmental stimuli Some, but not all, growth factors are hormones.
  • Fibroblast growth factor FGF
  • PDGFM vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • KGF keratinocyte growth factor
  • bFGF basic FGF
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • Bone-forming proteins BMP
  • HGF hepatocyte growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor Transforming growth factor beta
  • EGF epidermal growth factor
  • GM—CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • TGF—a TGF i and TGF 3 Stimulating factors
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-8 interleukin-8
  • bioprinting means three-dimensional accurate cell deposition (eg, cell solutions, cell-containing gels, cell suspensions) through a methodology compatible with automated, computer-assisted, three-dimensional prototype assemblies (eg bioprinters). , Cell concentrates, multicellular aggregates, multicellular bodies, etc.). 3D printing uses a bio-plotter to extrude the biodegradable polymer from the nozzle It is characterized by being carried out by laminating on the stage.
  • tissue analogues can be generated by the methods described above.
  • the pattern or stacking arrangement for laminating the bio ink composition may be determined by the size and diameter of the tissue-like organ to be manufactured.
  • the number of cells included in the bio-ink used to prepare the tissue-like organ may be the type of cell. , It may be adjusted according to the content of the cell nutrients contained in the bio ink composition.
  • the type of cells included in the bio ink composition may be variously changed depending on the type of tissue-like organ to be prepared according to the above method. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can select and apply appropriate cells according to the type of tissue-like organ to be prepared by three-dimensional bio-printing.
  • the bio ink composition After the bio ink composition is sprayed and loaded by the three-dimensional bio printer, it may be heated, exposed to ultraviolet rays, or added to the crosslinking solution to promote crosslinking of the bioink composition. This crosslinking allows the laminated bio ink composition to be completed into a tighter structure.
  • An optical initiator may be used to promote the crosslinking.
  • an ink ejecting member having the same cross-sectional pattern as the printed matter, but having the same or different cross-sectional pattern
  • a single ink containing different ink in each of the partitioned spaces of the ink ejecting member accommodating portion and placed under the accommodating portion is passed through the ink. It is provided with a passage and controls the pressure, for example a piston, to pass through the discharge part which discharges ink.
  • a small amount of hydrogel as a supporting material in the amount of 0.01 mL to 2 raL before the bio ink is poured into the receiving portion, and then put it in the receiving portion. Thereafter, no hydrogel or black is added to the barrel.
  • FIG. 1 is a view schematically showing an ink ejecting member of a bioprinting apparatus having a receiving portion partitioned into four spaces according to an embodiment of the present invention.
  • the interior of the ink ejecting member 10 is divided into a plurality of spaces containing respective inks 11, 12, .1.3, 14.
  • the accommodating portion of the ink ejecting member may be integrally produced so that a specific number of spaces are formed, or may be partitioned into a plurality of spaces by the partition member 30 detachable from the accommodating portion.
  • the partition member detachable from the ink ejecting member there is an advantage in that it is possible to print in various types of patterns by changing only the partition portion in a single accommodating portion 10.
  • the size of the space partitioned by the partition can be adjusted according to the area ratio of each ink.
  • FIG. 2 can be applied to an example of discharging five inks (1, 2, 3, 4, 5) in accordance with an example of the present invention. Bioprinting gong-chi is shown.
  • the partition member 30 may be inserted into the receiving portion in the example of FIGS. 1 and 2, and in the example of FIG. 3 and 4.
  • the member may be mounted with the hollow portion and fitted together with the receiving portion.
  • the cell liquid substance contained in the ink ejecting member 10 is pressed in the A direction to eject printing ink through the ejecting portion 20 or the nozzle 80 to complete the final object 50.
  • the piston 60 is preferably controlled to pass through the nozzle 20 is reduced in size while maintaining the same shape of the cross section of the printing material ,.
  • the base may be a container containing a liquid substance.
  • the pressure is too high, the load on the nozzle may be increased and damage may occur, or the hydrogel may not be discharged in the form of a thread smoothly and may be discharged in an unbalanced shape in a lump, and the pressure may be too weak. In this case, due to the resistance due to the viscosity of the hydrogel may not be smooth discharge from the nozzle.
  • the diameter is too small, the discharge pressure increases, so that the risks when the pressure is strong may occur equally, and when the diameter is too large, the precision of the three-dimensional shape in the manufacture of the scaffold may be reduced.
  • the pressure ranges and diameter ranges described above have all of the points described above. In consideration of the above, the hydrogel can be discharged smoothly and easily, while being experimentally determined as a range capable of properly achieving a desired level of precision of the manufactured scaffold shape.
  • the printing method according to the present invention includes the steps of accommodating ink in the accommodating part, and applying a pressure within the range of 0.1 to 500 kPa to the accommodating part, for example, an outlet diameter within the range of 0.1 to 1 kPa. Discharging the ink to the nozzle having a; and printing the ink while moving the nozzle at a speed within the range of 1 ⁇ 700mm / min by the moving part of the printing device.
  • the cell liquid substance contained in the ink ejecting member 10 is pressed in the A direction to eject the printing material to the base 100 through the nozzle 20 to complete the final object 50.
  • the piston 60 is preferably controlled to pass through the nozzle 20 is reduced in size while maintaining the same shape of the cross-section of the printing material, the base may be a container containing the axing material in some cases .
  • the volume of material discharged in proportion to the number of multiple inks can be reduced, so that precise jetting is possible compared to the prior art.
  • the area of contact between each material and the inner surface of the nozzle passage is reduced, and the shear stress generated is also reduced than when discharging a single material.
  • FIG. 1 is a view schematically showing an ink ejecting member having a receiving portion partitioned into four spaces according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view schematically showing an ink ejecting member having a receiving portion partitioned into five spaces according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 and 4 are schematic and exploded views schematically showing an ink ejecting member having a hollow portion and a partition member according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph showing a partition member used for an ink ejecting member according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the result of observing an RGB hydrogel printed with a confocal microscope using a discharge member including a receiving part divided into four sections according to Example 1.
  • FIG. 7 illustrates a confocal microscope observation result showing printing results of a RGB hydrogel according to a change in the size of a nozzle using a discharge member including a receiving part divided into four sections according to Example 2.
  • FIG. 7 illustrates a confocal microscope observation result showing printing results of a RGB hydrogel according to a change in the size of a nozzle using a discharge member including a receiving part divided into four sections according to Example 2.
  • the four-compartment member is made of polylactic acid by a three-dimensional printing method.
  • PLA polyactic acid
  • 3 w / v% sodium alginate containing green, blue, and red fluorescent particles were added to the syringe with four compartment compartment, and the other one contained no fluorescent particles.
  • 3 w / v% sodium alginate was added to the fluorescence by confocal microscopy, it was confirmed by confocal microscopy to print the RGB hydrogel in each compartment containing the fluorescent particles.
  • Figure 6 shows the results of observation with a confocal microscope that the RGB hydrogel is printed using a discharge member comprising a receiving portion divided into four compartments according to Example 1. That is, when fluorescence is observed by the confocal microscope, the discharged result is as shown in the left figure of Figure 6, cross-sect ional view of the discharged result is shown in the right figure (all scale bar is 100 urn). As a result of analyzing the cross section by the diameter passing through the center of the fragment pattern in the cross-sectional view of the right side of Figure 6, it shows a plot of the fluorescence intensity value of the graph. Indicates.
  • Example 2 shows the results of observation with a confocal microscope that the RGB hydrogel is printed using a discharge member comprising a receiving portion divided into four compartments according to Example 1. That is, when fluorescence is observed by the confocal microscope, the discharged result is as shown in the left figure of Figure 6, cross-sect ional view of the discharged result is shown in the right figure (all scale bar is
  • FIG. 6 is a confocal .microscope showing the results of the printing result according to the variation of the size of the nozzle using the discharge member including the receiving section divided into four compartments according to the second embodiment. As shown in the cross-sect ional view, miniaturization was possible in the same shape as the cross-sectional shape of the ink discharge member.
  • the ratio could be downsized to 98.7% (200 ⁇ ) from the total diameter (15 mm) of the specific shape (eg Lobule). It was calculated according to the above equation.
  • Fig. 7 shows a discharge member including a receiving portion divided into four sections according to the second embodiment. Confocal microscopy results show that the RGB hydrogel shows printing results as the size of the nozzle changes.
  • the partition members of various shapes were manufactured by using polyactic acid (PLA) as a material by three-dimensional printing.
  • PLA polyactic acid
  • FIG. 8 and 9 show the results of observation with a confocal microscope that the RGB hydrogel is printed using the discharge member having a partition member of various shapes according to the third embodiment. According to the test results, it can be seen that the accommodating part of the ink ejecting member can simulate not only four compartments but also various types of tissues.
  • FIG. 9 is a graph illustrating fluorescence intensities from the discharges of various shapes of FIG. 8, and the left graph shows a two-dimensional fluorescence intensity graph from the yellow dotted line of FIG. 8 to the one-dimensional dotted line, and the right graph shows the white square box of FIG. 8. Shows a three-dimensional fluorescence intensity graph for the surface.
  • the two-dimensional fluorescent RGB light intensity from the yellow dotted line of FIG. 8 to the one-dimensional dotted line is shown, and the graph 2 shows the second partition of FIG.
  • the intensity of the three-dimensional fluorescent RGB light from the white box of FIG. 8 to the two-dimensional surface is shown.

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Abstract

본 발명은 다중 잉크의 프린팅 장치 및 이를 이용한 프린팅 방법으로서, 더욱 자세하게는, 상기 다중 잉크 각각이 수용되는 복수 개의 수용부가 구획되어 있는 수용부와 상기 수용부에 수용된 다중 잉크가 함께 통과하여 단일 통로를 구비한 토출부를 포함하는 잉크 토출 부재를 포함하며, 상기 프린팅 장치를 이용하여 각 구획된 공간에 각각 상이한 잉크를 제공하고 수용된 잉크에 동일 조건의 압력을 가하여, 둘 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 잉크 토출물을 제조하여 인쇄하는 단계를 포함하는 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서 I.
【발명의 명칭】
단면 패턴을 갖는 인쇄물의 제조 방법 및 장치
【기술분야】
본 발명은 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 제조 장치 및 이를 이용한 제조 방법에 관한 것으로서 보디- 자세하게는 들 이상의 상이한 잉크로부터 얻어지는 하나의 토출물을 이용하여，단면 패턴을 갖는 인쇄물 제조할 수 있는 프린팅 장치 및 이를 이용한 프린팅 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
인체를 구성하는 장기 혹은 조직은 다종의 세포와 세포 외 기질을 구성하는 생체 재료로 구성되어 있다 할 수 있다. 3D 바이오 프린팅 기술을 이용하여 인체를 구성하는 조직과 유사한 세포 구조체의 제작을 통하여 필요로 하는 기능성 조직을 재생하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
바이오 프린팅 기술에 응용된 해드 모들은 크게 잉크젯 기반 프린팅 ( inkj et-based pr int ing) 모들과 토출 기반 프린팅 (extrusion— based print ing) 모들로 나뉘어 진다. 그 외에도 레이저， 초음파 등을 이용한 다양한 방법들이 제시되었지만, 앞의 두 가자모들이 가장 널리 사용되고 있다.
이러한 바이오 프린팅 기술이 요구하는 바이오 잉크의 물리적 성질은 사용되는 프린팅 헤드 모들에 따라 크게 달라진다. 미세 노즐과 시린지를 이용하는 토출 기반 프린팅 시스템에서는 젯팅 기반 기술에 비하여 재료의 점성에 큰 제약을 받지 않는다. 따라서 잉크젯 기반 프린팅 기술에 비해서 응용 가능한 생체 재료의 폭이 훨씬 넓어지게 된디- . 또한 두꺼운 층의 가공이 용이해 임상에서 요구하는 크기의 세포 구조물 제작이 용이하다.
그러나, 현재까지 개발된 압출 적층 조형 기반의 바이오 프린팅 기법의 해상도는 수백 마이크로미터지만 인체 내 조직이나 장기의 기본 구조는 수십마이크로미터 이하로 큰 차이가 있다. 특히 장기나 조직을 구성하는 세포에 영양분을 공급하는 모세혈관의 직경은 3 내지 4 마이크로미터이므로 현재의 바이오 프린팅 기법으로는 구현이 어렵다.
- 또한，바이오 프린팅을 할 때에 다증 잉크를 사용 프린팅하는 경우가 있다. 예를 들어, 하이드로겔괴— 경화제를 같이 경화시키는 경우 또는， 여러 종류의 세포를 공배양하는 경우 단순히 세포를 섞어 분사하는 사용하는 방식보다 이종 세포간 구획을 나누어 사용하는 경우 세포의 기능이 향상되는 것으로 알려져 있으므로 다중 잉크를 분사하여 바이오 프린팅을 해야 한다. 이러한 종래 방식에 의하면 다중 재료가 이질적으로 함유된 다증 헤드를 사용하여 이를 해결하고자 하였으나 프린팅 공정 시간이 증가하여 세포 생존율에 악영향을 미치고 시스템이 복잡해지는 단점이 있다.
프린팅 기법의 해상도를 높이기 위해서는 직경이 작은 노즐을 사용하여야 하는데 직경이 작은 노즐을 사용하게 되면 토출 시에 노즐 안쪽에서 토출되는 재료와 벽면 사이에 전단 응력이 발생하여 세포의 활성을 저하시키는 부작용이 있다. 또한， 전단 웅력에 의하여 세포가 사멸하는 문제가 빈번하게 발생하는 문제기 있기 때문에 노즐의 직경을 무작정 소형화하는 것도 어려운 실정이다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 괴 -제】
본 발명은 둘 이상의 상이한 잉크를 포함하는 하나의 토출물을 이용하여 단면 패턴을 갖는 인쇄물을 제조하는 잉크 토출 부재 및 이를 이용한 프린팅 방법에 관한 것이다.
본 발명은 둘 이상의 상이한 잉크를 포함하는 하나의 토출물을 이용하여 단면 패턴을 갖는 인쇄물을 제조하는 프린팅 장치 및 이를 이용한 프린팅 방법에 관한 것이다.
본 발명은 복잡한 단면 구조를 가지는 생체 조직 형상을 높은 정밀도와 해상도로 프린팅하는 장치 및 이를 이용한 프린팅 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 원하는 형상을 이질적으로 프린팅하는 동시에 세포의 전단응력도 크게 줄여즐 수 있는 프린팅 장치 및 프린팅 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 둘 이상의 상이한' 잉크를 포함하는 하나의 토출물을 이용하여 단면 패턴을 갖는 인쇄물을 제조하는 잉크 토출 부재， 이를 포함하는 프린팅 장치 및 이를 이용한 프린팅 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 프린팅 장치는 인공 조직， 장기 등을 제작에 사용되는 바이오 프린팅 장치 및 방법일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일예는， 삼차원 프린팅 장치에 구비된, 잉크를 수용하는 수용부, 토출부 및 둘 이상의 구획된 공간을 제공하는 구획부재를 포함하는 잉크 토출 부재의 각 구획된 공간에 상이한 잉크를 제공하는 단계； 상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 동일 조건의 압력을 가하여， 들 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 잉크 토출물을 제조하는 단계 ; 및 상기 잉크 토출물을 기판에 인쇄하는 단계를 포함하는， 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법에 관한 것이다ᅳ 상기 잉크 토출 부재는, 상기 구획부재로 삼차원 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 것일 수 있다.
구체적으로， 본 발명에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물을 제조하는 방법은, 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고,상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와，상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 포함하는 잉크 토출 부재의 각 구획된 공간에 상이한 잉크를 제공하는 단계，
상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 압력을 가하여, 토출부와 이에 연결된 노즐을 통해 잉크를 토출하여 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖는 잉크 토출물을 제조하는 단계， 및
상기 잉크 토출물을 기판에 인쇄하는 단계를 포함하는， 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법에 관한 것이다.
상기 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법에서， 하나의 수용부에서 구획부재에 의하여 구획된 각 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 제공되고 동일한 가압 부재 또는 동시에 가압하여 토출부 또는 노즐을 통해 하나의 토출물로 인쇄되며， 상기 토출물 또는 인쇄물은 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 가지며 바람직하게는 수용부의 단면 패턴이 상기 토출물 또는 인쇄물의 단면 패턴의 비율이， 예를 들면 단면의 직경이 100 : 99 내지 1.00 : 0. 1， 또는 100 : 50 내지 100 : 1 , 100：18 내지 100 : 1 비율로 축소될 수 있다. 본 발명의 또 다른 일예는 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 장치로서 ,
인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고， 상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와, 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 포함하는 잉크 토출 부재,
상기 토출부의 말단에 연결된 노즐， 및
상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 압력을 가하는 가압부재를 포함하며 , 각각 상이한 잉크가 단일 통로를 구비한 토출부를 통해 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 인쇄되는 삼차원 프린팅 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프린팅 장치는 상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 동일 조건의 압력을 가하기 위하여, 단일 가압부재를 사용하여 압력을 수행하거나， 둘 이상의 가압부재를 사용하여 동일 압력으로 가압하여 수행할 수 있다. 상기 가압부재로 가압하여 각각 상이한 잉크가 단일 통로를 구비한 토출부를 통해 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 인쇄할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 프린팅 장치를 이용할 경우， 다양한 단면 패턴을 갖는 인쇄물을 제조할 수 있으며, 특히 복잡한 단면 구조를 가지는 생체 조직 형상을 높은 정밀도와 해상도로 인쇄하여 삼차원 프린팅 방법으로 제조할 수 있으며， 생체조직에 세포를 포함하는 경우， 원하는 형상을 이질적으로 프린팅하는 동시에 세포의 전단웅력도 크게 줄여줄 수 있는 장점이 있다.
' 이하， 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법은, 삼차원 프린팅 장치에 구비된， 잉크를 수용하는 수용부， 토출부 및 둘 이상의 구획된 공간을 제공하는 구획부재를 포함하는 잉크 토출 부재의 각 구획된 공간에 상이한 잉크를 제공하는 단계;상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 동일 조건의 압력을 가하여， 둘 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 잉크 토출물을 제조하는 단계; 및 상기 잉크 토출물을 기판에 인쇄하는 단계를 포함하는-， 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법에 관한 것이다.
상기 동일 조건의 압력을 가하는 것은， 단일 가압부재를 사용하여 압력을 수행하거니—， 둘 이상의 가압부재롤 사용하여 동일 압력으로 가압하여 수행할 수 있다. 상기 동일 조건의 압력 이라 함은 둘 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 단일 잉크 토출물이 형성될 수 있는 압력 조건이며， 바람직하게는 둘 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 단일 잉크 토출물이 형성되며，상기 잉크 토출물 및 이로 제조되는 인쇄물이 목적 대상 인쇄물의 단면 패턴과 동일한 모양을 갖도록 하는 압력 조건을 의미한다. 본 발명에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법은， 본 발명에 따른 잉크 토출 부재 또는 상기 잉크 토출 부재를 포함하는 삼차원 프린팅 장치를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 장치는 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고, 상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와， 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 포함하는 잉크 토출 부재를 포함하며, 또한， 추가로 상기 토출부에 연결된 노즐, 및 상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 압력을 가하는 가압부재를 포함할 수 있다ᅳ
또한 상기 삼차원 프린팅 장치는 상기 토출물을 인쇄하는 기판 (plate)와 인쇄를 위한 추가 장치는 통상의 삼차원 프린팅 장치에 포함하는 구성요소를 포함할 수 있다. '
구체적으로, 본 발명에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법， 상기 잉크 토출 부재의 수용부의 각 구획된 공간에 각각 상이한 잉크를 제공하는 단계, 상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 압력을 가하여， 토출부를 통해 잉크를 토출하여， 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖는 잉크 토출물을 제조하는 단계， 및 상기 잉크 토출물을 기판에 인쇄하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 잉크 토출 부재 또는 상기 잉크 토출 부재를 포함하는 삼차원 프린팅 장치, 및 상기 잉크 토출 부재 또는 싱ᅳ기 잉크 토출 부재를 포함하는 삼차원 프린팅 장치를 이용한 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 제조방법은 장치의 구성요소 별 및 방법의 단계별로 이하에서 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에 따른 잉크 토출 부재는 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고， 상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와， 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 ¾크를 토출하는 토출부를 포함한다.
본 발명에 따른 잉크 토출 부재를 사용하는 경우， 프린팅이 가능하고 상용화된 수용부의 직경은 매우 크므로 바이오 잉크가 토출되기 때문에 잉크 또는 이에 포함된 세포에 전단웅력이 거의 가해지지 않는다. 또한， 다중 재료가 이질적으로 함유된 다중 헤드를 사용하는 종래 기술에 비해， 본 발명은 하나의 잉크 토출 부재를 사용하여 2이상의 상이한 잉크를 함께 토출하여. 인쇄할 수 있으므로， 단일 프란팅 헤드를 사용할 수 있어 프린팅 공정 시간이 감소하고， 잉크 또는 이에 포함된 세포에 .전단응력이 거의 가해지지 않는다. 따라서， 본 발명에 따른 프린팅 방법 또는 장치를 이용하여 세포를 포함하는 잉크를 이용하는 경우， 세포 생존율이 높고 시스템이 단순해지는 장점이 있다.
상기 토출 부재는 의부로부터 압력이 가해져 잉크를 밀어냄으로써 잉크를 공급하는 구성요소로서， 통상 삼차원 프린팅 장치에 사용되는 카트리지 또는 시린지 (Syr inge)일 수 있다.
상기 수용부는 토출물과 동일한 모양의 단면 패턴,을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하며， 상기 구획부재에 의해 구획된 공간에는 각각 상이한 잉크를 수용할 수 있다.상기 각 구획된 공간에 제공된 2종 이상의 잉크에 압력을 동일 압력 조건으로 가하여， 단일 통로를 구비한 토출부를 통해， 인쇄물과 동일한 단면 패턴을 갖는 잉크 토출물을 제조할 수 있다.
상기 잉크 토출 부재에 포함되는 구획부재는 수용부와 일체로 형성된 것이거나, 상기 잉크 토출 부재로부터 탈착 가능한 것이다. 또한 구획부재는 수용부에 둘 이상의 공간을 제공하기 위해， 그 자체로 수용부의 내부에 구비되거나, 또는 상기 수용부 내부에 장착 가능한 중공부를 추가로 포함하여 장착될 수 있다. 상기 중공부를 포함하는 경우， 구획부재는 중공부와 일체 형태로 또는 탈착 가능한 형태로 제공될 수 있다. 상기 구획부재는 사출, 압출, 또는 삼차원 프린팅 방법 등 다양한 방법으로 제조될 수 있으나, 바람직하게는 삼차원 프린팅 방법으로 제조될 수 있디ᅳ.
상기 구획부재의 크기는 수용부 내부에 들어갈 수 있도록 하되， 원통형， 사각형， 삼각뿔 등 어느 크기 및 형상도 가능하다. 상기 구획부의 단면 패턴은 다양한 모양으로 제조될 수 있으며， 예를 들면 제조하고자 하는 인공 조직의 단면적과 동일한 패턴을 가질 수 있다. 구획부재의 다양한 단면 모양의 예는 도 5에 나타냈고 있으며， 요도 형상과 유사한 모양， 다수의 동심원을 포함하는 모양 등을 포함할 수 있다. 도 5는 본 발명의 일예에 따른 잉크 토출 부재에 사용되는 구획부재를 나타내는 사진이다.
본 발명에 따른 중공부의 일예는 도 3 및 도 4에 도시하고 있으며， 중공부 (70)은 일체형 또는 탈착 가능한 형태로 제작된 구획부재 (30)과 조합되어, 잉크 토출 부재 ( 10)의 내부로 장착될 수 있다.
싱 -기 구획부재의 재질은 ABS (Acryloni tr i le butadiene styrene) , PCL (polycaprolactone) , ASA (Acryloni tri le-Stryrene-Acrylate) , SAN (St. ryrene一 Acryloni tr i le copolymer ) , PS (Polystyrene) , PPSF/PPSU (Pol y heny 1 s u.1 f one ) , Polyether imide , PLA (Polylact i c acid) , PDL (Poly— d— lysine) 등의 FDM프린팅이 가능한 열가소성 수지와 광경합성 수지， 기계 가공이 가능한 비철 /비철합금 재료 등 고체 재료가 적합하다.
상기 잉크 토출 부재는 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 다중 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며， 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 포함한다. 상기 토출부는 단일 통로를 구비하여, 다수의 공간으로 구획된 수용부에 수용된 잉크를 다중 채널 제어가 아닌 단일 채널 쎄어방식으로 토출할 수 있다.
상기 토출구의 내경은 매우 작게 형성되어 있다. 상기 토출구를 통해 상기 수용부에 수용되어 있는 잉크는 그 수용부의 외부로 토출 가능하다. 상기 토출부에서 배출된 잉크 토출물은 단면 패턴이 상기 수용부의 단면 패턴과 동일하며， 다만 크기가축소될 수 있다.
—본 발명에 따른 삼차원 프린팅 장치는 상기 토출 부재의 토출부 끝단에 연결된 노즐을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 노출을 통해 잉크가 배출되며， 상기 노즐의 하부에 플레이트가 위치하여 노즐에서 배출된 인쇄용 잉크가 플레이트 상부에 적층됨으로써 인쇄물을 제조하게 된디-.
본 발명에 따른 단면 패턴을 갖는 인쇄물은, 인체 모사 조직인 것이 바람직하다. 예롤 돌면， 근육 조직 (b皿 die구조)， 뼈 조직 ( l amel lae &canal 구조) , 신경 조직 (per ineur ium 구조)， 혈관 조직 (mul t i— layer 구조)， 척수 (spinal cord) 조직 등이 있다.
압출 적층 조형 기반의 바이오 프린팅 기법의 해상도를 높이기 위해서는 프린팅 노즐의 직경을 줄이는 것이 필수적인데 노즐의 직경이 작아질수록 노즐 안쪽에서 토출되는 재료와 벽면 사이에 발생하는 전단 응력에 의하여 세포가 사멸하는 문제가 빈번하게 발생하는 문제가 있기 때문에 노즐의 직경을 무작정 소형화하는 것도 어려운 실정이다. 따라서， 본 발명에 따라 동일한 단면 패턴을 가지는 수용부와 이를 단일 통로로 토출하는 토출부를 구비하여, 높은 해상도를 구현 가능한다.
본 발명에 의힌 · 생체 조직을 프린팅하는 방법은 인쇄물의 형상과 비율은 동일하지만 확대된 단면 형상을 가지는 프린팅 잉크를 수용부에 제공하고， 상기 수용부의 단면 패턴이 동일한 형태를 유지하면서，수용부의 단면보다 작은 단면을 가지는 토출부를 통과하도록 압력을 제어할 수 있다. 토출된 토출물의 단면 패턴이 상기 수용부의 단면 패턴과 동일한 모양을 유지할 수 있는 수준인 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 비교적 용이하게 제조할 수 있는 큰 크기의 프린팅 잉크를 이용하여 복잡하고 크기가 매우 작은 미세구조를 용이하게 프린팅할 수 있는 효과가 있다.
본 명세서에서 "동일''의 의미는 동일한 것뿐만 아니라, 실질적으로 동일한 기능을 수행할 수 있는 정도로 동일한 것까지도 포함하는 의미로 정의된다. 명세서에서 "단면이 동일한 형태를 유지' '한다 함은, 단면의 크기만 작아질 뿐 원래의 단면의 형태는 그대로 유지하는 것을 의미한다. 그렇게 함으로써 보다 성형하기 용이한 큰 단면을 가지는 프린팅 소재를 먼저 만든 후에 원하는 크기 즉 실제 조직 세포의 크기에 상응하는 조직 세포의 프린팅이 가능해진다.
상기 프린팅 잉크의 점성은 노즐을 통과하여 토출된 토출물의 단면이 상기 프린팅 소재의 단면과 동일한 형태를 유지할 수 있는 수준인 것이 바람직하다. 프린팅된 결과물의 단면은 현재의 바이오 프린팅 기술로는 구현할 수 없는 정도의 작은 크기이거나 프린팅되었을 때 생존률이 현저하게 낮아질 수 있는 미세 구조이며， 전술한 바와 같이 근육 조직 (bundle 구조)， 뼈 조직 ( l amel lae & canal 구조)， 신경 2：^ (per ineur ium 구조) , 혈관 조직 (mul t i— layer 구조) , 척수 (spinal cord) 조직 등이 있다.
본 발명에 따른 프린트 장치 수용부의 단면은， 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 가지고， 수용부의 단면 패턴이 상기 토출물 또는 인쇄물의 단면 패턴의 비율이은 단면의 면적비율, 직경비율 등으로 다양한 방법으로 표시될 수 있다. 예를 들면, 수용부의 단면 패턴이 싱-기 토출물 또는 인쇄물의 단면 패턴의 비율이, 예를 들면 단면 패턴의 직경이 100 : 99 내지 100 : 0. 1， 또는 100 : 50내지 100 : 1 , 100：18 내지 1.00 : 1 비율로 축소될 수 있다. 그러나， 상기 축소비율은， 수용부의 단면 직경， 토출부의 단편직경， 또는 노즐의 직경 등에 직접적으로 영향을 받으며， 목적하는 인쇄물의 단면 패턴 크기에 맞추어 적절히 조절하여 다양하게 설계할 수 있다. 인쇄물의 단면 직경은 노즐의 크기에 따라 변화되는데， 이 범위는 0. 1 ram ~ lmm 가 통상 사용할 수 있으며， 재료의 특성, 압력, 프린팅 헤드의 속도, 프린팅 결과물이 놓여지는 위치 (프린팅 베드) 등의 프린팅 공정에 따라 변화할 수 있다.
본 명의 실시 예에 따르면 비율은 특정 형상 (실시 예: Lobule)의 전체 직경 ( 15 圍)으로 부터 98.7% (200 μ πι)까지 소형화 가능하다. 예를 들면， 축소비율은 하기 수학식 1을 따라 계산할 수 있다.
[수학식 1]
축소비율 =100— (수용부 단면 직경 /인쇄물 단면 직경) Χ100(%)
본 발명에 따른 잉크 토출 부재에 제공되는 잉크는 인공 장기 등을 제조할 수 있는 바이오잉크인 것이 바람직하다. 구체적으로， 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록， 둘 이상의 구획된 공간을 제공하는 구획부를 포함하는 잉크 수용부에， 각 구획된 공간에 상이한 잉크를 제공하여 프린팅을 수행할 수 있다. 상기 상이한 잉크라 함은 잉크는 구성성분， 구성성분의 함량 및 물성으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 상이한 것을 의미한다.
본 명세서에서 '바이오 잉크'는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며 , 바아오 프린팅 기술에 웅용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 용어이다. 본 발명의 바이오 잉크는 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체, 또는 고체 조성물을 포함한다.
따라서 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하여 주어야 한다. 프린팅 공정이 길어질 때에는 잉크 토출 부재 내에서 세포의 생존에 필요한 영양분과 산소의 공급이 적절히 이루어지는 것이 바람직하다. 또한 프린팅 과정에서 발생하는 물리적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있어야 한다. 그 외에도 바이오 잉크는 3차원 패터닝의 반복성， 생산성， 노즐의 막힘이 없어야 하는 등 프린팅 공정상에서 필요로 하는 물리적 성질을 가져야 한다.
본 발명에 따른 잉크는 하이드로젤인 것이 바람직하며, 이에 상기 잉크는 겔화 고분자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 겔화 고분자， 세포， 성장인자， 및 세포외기질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 바이오잉크는 예를 들면， 원하는 세포를 흔합한 /비흔합 하이드로 겔， 특정 성장인자 (growth f actor )가 함유된 하이드로겔. 세포와 /성장인자가 함유된 하이드로겔,시토카인 (cytokine)이 함유된 하이드로겔, 서로 다른 종류의 하이드로겔 등. 하이드로겔은 콜라겐, 마트리겔， 알지네이트, 젤라틴， 아가로스. 탈세포화된 조직유래 세포잉크, 히알루론산， 피브린겔 등 혹은 흔합 하이드로겔이 적합하다.
또한 바이오잉크는 저점도 일수록 빠르게 확산 되므로 물 ( 1 cp)보다 진한 점도로서 25°C 온도에서 측정한 점도가 2 cp 내지 1 , 000 , 000 Cp , 예를 들면 2 cp 내지 10 , 000 cp , 또는 5 cP 내지 1 , 000 , 000 cP의 점성을 가지는 겔 상의 물질 정도기- 적합하다. 본 발명에 의한 방법에 사용되는 겔 형태의 물질의 점도는 후술하는 토출과정에서 프린팅 소재가 토출될 수 있도록 적절한 점성을 가지는 것이 바람직하다. 본 발명의 일예에 파르면 토출식 삼차원 프린팅 방법을 적용하므로 잉크젯 방식에 비해 비교적 높은 점도의 잉크를 제공하는 것이 바람직하다. 일예에서， 본 발명에 적용 가능한 잉크는 토출에 적절한 점도를 제공하고자， 다양한 점도 증진제를 사용할 수도 있다. 상기 프린팅 소재의 점성은 노즐을 통과하여 토출된 토출물의 단면이 상기 프린팅 소재의 단면과 동일한 형태를 유지할 수 있는 수준이다.
삼차원 바이오 프린팅 분야에서 천연유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성， 프린팅 적.합성， 기하학적 정밀성， 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 우수하여 사용되고 있다.
상기 "압출 가능한' '이란 토출부， 노즐 (nozzle) 또는 오리피스 (예， 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어， 압력 하에서) 통과시킴으로써 성형될 수 있는 것을 의미한다. 또한 바이오 잉크의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 바이오 밍크에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다.
본 발명은 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 조직유래 성분이 추가로 포함된 것을 톡징으로 히-는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 조직유래 성분은 연골， 신장， 심장, 간, 근육 등과 같은 동물의 특정조직이 탈세포화 되고 세포외기질을 주성분으로 하는 물질의 겔 (gel )화 된 것을 의미하며, 이는 바이오 잉크 조성물의 조직특이성을 강화하기 위하여 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 배양 배지를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 잉크는 겔화 고분자를 포함할 수 있으며， 이러한 프린팅에 사용되는 겔화 고분자 용액은 다양한 종류를 사용할 수 있는데， 이러한 고분자 용액이 가져야 할조건은 다음과 같다ᅳ먼저 3차원 인쇄가 잘 이루어질 수 있도록 하기 위해서 적당한 점성을 가져 노즐로의 분출이 용이해야 하며, 배출된 후 빠르게 경화됨으로써 만들어지는 대상의 형태가 뭉그러지는 등의 문제가 발생되지 않아야 한다. 또한 근본적으로 제조 목적상， 인체 내 조직과 유사한 세포 배양 환경을 조성할 수 있어야 한다.
상기 겔화 고분자의 예는 푸코이단, 콜라겐， 알지네이트， 키토산， 히알루론산, 실크, 폴리이미드 (polyimides), 폴리아믹스 산 (polyamix acid), 폴리카프로락론 (polycarprolactone)， 폴리에테르이미드 (polyetheriniide)， 나일론 (nylon), 폴리아라미드 (polyaramid)， 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈 ( o 1 y i ny I yr rol i done ) ,
폴리벤질글루타메이트 (po 1 y-benzy 1 -g 1 ut amat e ) ,
폴리페닐렌테레프탈아마이드 ( ί)ο 1 ypheny 1 enet ereph t ha 1 am ide),
폴리아닐린 (polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴 (polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드 (polyethylene . oxide), 폴리스티렌 (polystyrene)， 셀를로오스 (cellulose), . 폴리아크릴레이트 (polyacrylate) , 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate), 폴리락산 (polylact ic acid; ■ PLA), 플리글리콜산 (polyglycolic acid; PGA) , 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체 (PLGA), 폴리 {폴리 (에틸렌옥사이드)테레프탈레이트— co—부틸렌테레프탈레이트 KPE0T/PBT)， 폴리포스포에스터 (polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠 (PPA), 폴리안하이드라이드 (Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(()rtho ester ;P0E}, 폴리 (프로필렌푸마레이트)—디아크릴레이트 { po 1 y ( pr opy 1 ene fumarate)— diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트 {polyethylene glycol) diacrylate; PEG— DA }로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상또는 상기 재료들의 조합일 수 있다. _하지만， 본실시예로 재료가 제한 되는 것은 아니다. 또한， 상기 겔화 고분자는 천연 고분자를 화학적 변형한 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 gelatin과 methacrylate (MA)를 화학적을 결합하고 photohiitiator를 결합한 GelMA, Alginate/Gelat in, Alginate의 binding site를 추가하기 위해 pentapept ide sequencing Tyr— Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)과 EDC/NHS를 결합한 alginate 등을 포함할 수 있다.
특히， 상기 폴리에틸렌글라이콜, 알지네이트, 콜라겐 및 젤라틴을 비롯한 하이드로겔은 수분 함량이 높고， 생체 적합성이 뛰어나고 기계적 특성을 조절할 수 있고 생분해성이 우수하여 세포가 포매된 담체의 제조에 널리 이용되어 왔다. 이러한 이유 때문에， 하이드로겔은 세포가 탑재된 구조의 제조에 매우 적합하며, 다양한 타입의 조직재생 골격을 얻기 위해 직접 프린트할 수 있다.
상기 젤라틴은 온도-민감성 특성을 나타내기 때문에 상기 세포 운반물질로서 특히 적합하다ᅳ 즉， ¾라틴은 370C에서 액상화되며 상온 이하에서 고체화 되는 특성을 지니고 있다.
상기 겔화 고분자는 물리적 처리 또는 화학적 처리를 이용하여 가교결합을 형성할 수 있으며, 상기 화학적 처리에는 가교 용액을 사용할 수 있으며, 선택된 겔화 고분자에 따라 적절히 가교 용액을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면， 상기 가교 용액은 석고; 또는 히드록시아파타이트， 탄산 아파타이트, 불화 아파타이트， 염화 아파타이트， o TCP, β-TCP, 메타인산칼슘， 인산 4칼슘， 인산수소칼슘, 인산 2수소칼슴， 피로인산칼슘， 탄산칼슘， 황산칼슘， EDC { 1-e t hy 1 - ( 3-3-d i me t hy 1 am i nopr opy 1 ) carbodi imide hydrochloride} 또는 이들의 염으로부터 선택되는 1종 이상의 흔합물의 용액일 수 있다.
상기 겔화 고분자 용액을 포함하는 잉크는， 통상 액상 형태의 콜라겐 용액에서의 콜라겐 농도 비율이 0.1 ~ 30 <¾범위 내로 형성되는 것이 바람직하다. 하이드로젤의 제조방법은 통상의 삼차원 인쇄용으로 잉크를 제조할 때 사용하는 제조방법을 적용하여 수행할 수 있으나 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 바이오잉크는 세포를 포함할 수 있으며 , 적용 가능한 세포 또는 조직은 특별히 한정되지 않으며， 동물세포 또는 식물세포이거니-, 동물 또는 식물의 조직일 수 있다.상기 세포는 줄기세포 (stem cell),조골세포 (osteoblast), 근아세포 (myoblast), 건세포 (tenocyte)， 신경아세포 (neuroblast )， 섬유아세포 ( f i br ob 1 as t ) , 신경교아세포 (g Π ob 1 as t )ᅳ 배세포 (germce 11), 간세포 (hepatocyte), 신장세포 (renal cell), 지대세포 (Sertoli cell), 연골세포 (chondrocyte), 상피세포 (epithel ial cell), 심혈관세포， 각질세포 (keratinocyte), 평활근세포 (smooth muscle cell), 심장근세포 (cardiomyocyte),신경교세포 (glial cell),내피세포 (endothel ial cell), 호르몬 분비세포， 면역세포， 췌장섬세포 (pancreatic islet cell) 및 신경세포 (neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 제조된 인공 조직에서 사용되는 세포 유형은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있다.
세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질과 배양될 수도 있다. 예를 들면， 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상기 줄기 세포는 비제한적 예로서 골원성 (osteogenic) 분화 배지 , 연골원성 (chondrogeni c) 분화 배지， 지방생성 (adipogenic) 분화 배지， 신경 분화 배지， 심근세포 분화 배지, 및 장세포 분화 배지 (예, 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 될 수 있다.
추가적으로, 세포는 성장인자, 사이토카인 등과 배양될 수 있디- . "성장인자' '는 세포에 의해 생성되고 그 자체 및 /또는 여러 가지의 다른 인접한 또는 동떨어진 세포에게 영향을 줄 수 있는， 사이토카인을 포함하는 단백질， 폴리펩티드， 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 통상， 성장인자는 발생적으로 또는 다수의 생화학적인 또는 환경적인 자극에 반응하여 특정 유형의 세포의 성장 및 /또는 분화에 영향을 미친다. 전부는 아니지만 일부의 성장인자는 호르몬이다ᅳ 예시적 성장인자는 인슐린， 인슐린 유사 성장인자 ( IGF) , 신경 성장인자 (NGF) , 혈관 내피 성장인자 (VEGF) , 케라티노사이트 성장인자 (KGF) , 기본 FGF(bFGF)를 포함하는 섬유아세포 성장인자 (FGF) , PDGFM및 PDGF— AB를 포함하는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) , BMP— 2 및 BMP— 7등을 포함하는 뼈형성단백질 (BMP) , 간세포 성장인자 (HGF) , 형질전환 성장인자 알파 (TGF— a) , TGF i 및 TGF 3을 포함하는 형질전환 성장인자 베타 (TGF-β) , 표피 성장인자 (EGF) , 과립구—대식세포 콜로니-자극인자 (GM— CSF) , 과립구 콜로니—자극인자 (G— CSF) ,인터류킨— 6( IL— 6)， IL-8 등이 있다.
본 발명에서의 "바이오 프린팅 "이란 자동화된 , 컴퓨터 보조의， 삼차원 시제품회- 장치 (예， 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착 (예，세포 용액，세포 함유 겔，세포 현탁액,세포 농축물，다세포 응집체， 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. 3D 프린팅은 바이오플로터 (bio— plotter)를 이용하여 생분해성 고분자를 노즐로부터 압출하여 스테이지에 적층함으로써 수행되는 것을 특징으로 한다.
다양한 종류의 조직 유사기관이 상기한 방법에 의해 생성될 수 있다. 바이오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 조직 유사기관의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다ᅳ 또한, 조직 유사기관을 제조하기 위해 사용되는 바이오 잉크에 포함되는 세포의 개수는 세포의 종류， 바이오 잉크 조성물에 포함된 세포 영양성분의 함량 등에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물에 포함되는 세포의 종류는 상기 방법에 따라 제조하고자 하는 조직 유사기관의 종류에 따라 다양하게 변경이 가능하다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자라면, 삼차원 바이오 프린팅으로 통해 제조하고자 하는 조직 유사기관의 종류에 따라 적절한 세포를 선택하여 이에 적용할 수 있을 것이디- .
바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적충된 이후에는 이를 가열하거나， 자외선에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 51도록 해준다. 상기 가교결합을 촉진하기 위해서 광학개시제 (photoini t i ator )를 사용할 수 있다.
인쇄물과 동일한 단면 패턴을 가지나 크기가 동일 또는 상이한 단면 패턴을 가지는 잉크 토출 부재를 제조하고자， 잉크 토출 부재 수용부의 구획된 각 공간에 상이한 잉크를 수용하고，상기 수용부의 하부에 위치하고 잉크가통과하는 단일 통로를 구비하며 잉크를 토출하는 토출부를 통과하도록 압력， 예를 들면 피스톤을 제어한다. 수용부에 바이오잉크가 충진된 후에는， 바이오잉크가 쏟아지지 않도록 미리 지지물질로서 하이드로겔을 0. 1 mL~2 raL 정도 소량 넣어둔 후에 수용부에 넣는 것이 바람직하다. 그 후에 배럴에 하이드로겔을 추가하거나 흑은 추가하지 않는다. 다시 프린팅 하면 인쇄 초기에는 충진된 하이드로겔이 빠져 나오고， 그 후에 원하는 형상이 프린팅 된다. 원하는 형상의 인쇄물의 프린팅이 끝나면 위에 채워둔 하이드로겔이 빠져 나오게 된다. 초기, 후기에 지지물질 (support mater i al )을 넣는 이유는 프린팅이 안정적으로 이루어지도록 하기 위함이다. 이하에서는 첨부도면을 참조하여 본 발명에 대해서 자세하게 설명한다. 도 1에는 본 발명의 일예에 따른 4개의 공간으로 구획된 수용부를 갖는 바이오 프린팅 장치의 잉크 토출 부재를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 1에는 잉크 토출 부재 ( 10)의 내부는 각각의 잉크 ( 11， 12 , .1.3 , 14)를 수용하는 복수 개의 공간이 구획되어 있다. 잉크 토출 부재의 수용부를 특정 개수의 공간이 형성되도록 일체로 제작할 수도 있고, 또는 수용부로부터 탈착 가능한 구획부재 (30)에 의해서 복수 개의 공간으로 서로 구획할 수도 있다. 잉크 토출 부재로부터 탈착 가능한 구획부재를 이용하는 경우 단일의 수용부 ( 10)에서 구획부만 바꿈으로써 여러 종류의 패턴으로 인쇄할 수 있는 장점이 있다. 각 잉크의 면적 비율에 따라서 구획부가 구획하는 공간의 크기를 조절할 수 있다.도 2에는 본 발명의 일예에 따라 5가지 잉크 ( 1 , 2 , 3 , 4， 5)롤 토출하는 예에 적용할 수 있는 바이오 프린팅 징 -치가 도시되어 있다.
잉크 토출 부재에서 탈착 가능한 형태로 제거 가능한 구획부재를 이용하는 실시예의 경우에는 도 1 및 도 2과 같은 예에서는 구획부재 (30)를 수용부에 끼우면 되고， 도 3 및 도 4와 같은 예에서는.구획부재를 중공부와 장착하여 함께 수용부에 끼우면 된다.
다음으로 잉크 토출 부재 ( 10)에 수용된 세포 액상 물질올 A방향으로 눌러서 토출부 (20) 또는 노즐 (80)을 통해 프린팅 잉크를 토출시켜서 최종 목적물 (50)을 완성한디- . 이 때 피스톤 (60)은 프린팅 소재의 단면이 동일한 형태를 유지하면서 크기만 축소되어 노즐 (20)을 통과하도록 제어되는 것이 바람직하며，. 경우에 따라 베이스는 액상 물질이 담겨 있는 용기가 될 수도 있다.
상기 압력이 너무 강할 경우 상기 노즐에 걸리는 부하가 커져서 손상이 발생하거나 또는 상기 하이드로겔이 부드럽게 쓰레드 (thread) 형태로 배출되지 못하고 덩어리를 지어 불균형한 형상으로 배출될 위험성이 있으며， 상기 압력이 너무 약할 경우 상기 하이드로겔의 점성에 의한 저항 때문에 상기 노즐로부터 원활한 배출이 이루어지지 못할 수 있다. 한편 상기 직경이 너무 작을 경우 배출 압력이 커져서 상기 압력이 강할 때의 위험성들이 동일하게 발생할 수 있으며, 상기 직경이 너무 클 경우 스캐폴드 제조 시 3차원 형상의 정밀도가 떨어지게 될 수 있다. 상술한 압력 범위 및 직경 범위는 상술한 바와 같은 점들을 모두 고려하여， 상기 하이드로겔의 배출이 적절히 원활하고 용이하게 이루어질 수 있음과 동시에 제조되는 스캐폴드 형상의 정밀도를 적절히 원하는 수준으로 달성할 수 있도록 하는 범위로서 실험적으로 결정된 것이다.
예를 들면， 본 발명에 따른 프린팅 방법은， 상기 수용부에 잉크를 수용시키는 단계,상기 수용부에 0. 1 ~ 500kPa범위 내의 압력을 가하여 예를 들면， 0. 1 ~ 1 隱 범위 내의 배출구 직경을 가지는 상기 노즐로 상기 잉크를 토출하는 단계， 프린팅 장치의 이동부에 의하여 상기 노즐이 1 ~ 700mm/min 범위 내의 속도로 이동하면서 잉크를 인쇄하는 단계롤 포함하여 이루어질 수 있다.
다음으로 잉크 토출 부재 (10)에 수용된 세포 액상 물질을 A방향으로 눌러서 노즐 (20)을 통해 프린팅 소재를 베이스 ( 100)로 토출시켜서 최종 목적물 (50)을 완성한다. 이 때 피스톤 (60)은 프린팅 소재의 단면이 동일한 형태를 유지하면서 크기만 축소되어 노즐 (20)을 통과하도록 제어되는 것이 바람직하며， 경우에 따라 베이스는 액싱- 물질이 담겨 있는 용기가 될 수도 있다.
종래 기술에서처럼 하나씩의 재료를 분사하여 바이오 프린팅을 하는 경우에는 토출부의 노즐 내경 크기 감소에 제한이 있기 때문에 재료의 부피 감소에 한계가 있었다. 그러나 본 발명에 의하면 다중 잉크의 개수에 비례하여 토출되는 잉크의 부피를 감소시킬 수 있기 때문에 종래 기술에 비해 정밀한 분사가 가능해진디- .그리고 다중 잉크가토출부 (20)의 통로를 통과할 때에 각각의 잉크와 토출부 통로의 안쪽면과의 사이에 접촉하는 면적이 감소하므로， 발생하는 전단웅력이 단일 재료를 토출할 때보다 저감된다. 따라서 세포 활성 측면에서 종래 기술에 비해 유리한 효과가 있다.
【발명의 효과】
본 발명에 의하면 다중 잉크의 개수에 비례하여 토출되는 재료의 부피를 감소시킬 수 있기 때문에 종래 기술에 비해 정밀한 분사가 가능해진다. 또한， 다중 잉크가 토출부 또는 노즐의 통로를 통과할 때에 각각의 재료와 노즐 통로의 안쪽면과의 사이에 접촉하는 면적이 감소하고， 발생하는 전단응력도 단일 재료를 토출할 때보다 저감된다.따라서 세포 활성 및 프린팅 정밀도 향상 측면에서 종래 기술에 비해 유리한 효과가 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일예에 따른 4개의 공간으로 구획된 수용부를 갖는 잉크 토출 부재를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일예에 따른 5개의 공간으로 구획된 수용부를 갖는 잉크 토출 부재를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일예에 따른 중공부와 구획부재를 구비한 잉크 토출 부재를 개략적으로 도시한 결합도 및 분해도이다.
도 5는 본 발명의 일예에 따른 잉크 토출 부재에 사용되는 구획부재를 나타내는 사진이다- .
도 6은 실시예 1에 따라 4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 2에 따라 4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 노즐의 크기의 변화에 따른 프린팅 결과물을 보여주는 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 실시예 3에 따라 다양한 모양의 구획부재를 구비한 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 【발명의 실시를 위한 형태】
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 하나， 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다. 실시예 1
4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 삼차원 프린팅을 수행하고자， 4구획 구획부재를 삼차원 인쇄방법으로 폴리락산
(polyact i c acid ;PLA)을 재질로 하여 쩨조하였다.
4구획 구획부재를 구비한 시린지에 각각 Green, Blue , Red 형광 파티클이 함유된 3 w/v % sodium alginate를 넣고 다른 한곳에는 형광파티클이 함유되지 않은 3 w/v % sodi um alginate를 넣은 뒤 이를 공초점 현미경으로 형광 관찰한 결과 형광 파티클이 함유된 각각 구획에서 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 확인하였다.
도 6은 실시예 1에 따라 4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸디- . 즉, 토출된 결과물을 공초점 현미경으로 형광 관찰하면 도 6의 왼쪽 도면과 같으며， 토출된 결과물의 cross— sect ional view는 오른쪽 도면과 같다 (스케일바는 모두 100 urn) . 도 6의 오른쪽 단면도에서 단편 패턴의 중심을 지나는 직경으로 단면을 분석한 결과로서， 그래프의 형광 세기 값의 plot을 나타낸다.본 발명의 따른 4개의 구획에서 높은 해상도로 구분되어 잉크가 인쇄가 가능함을 나타낸다. 실시예 2
실시예 1과 동일한 잉크 토출 부재를 사용한 삼차원 프린팅 장치를 사용하되 노즐의 크기를 18， 20， 22， 25 및 27 Gauge로 RGB 하이드로겔이 프린팅되는- 것을 공초점 현미경으로 확인하였다. 도 6은 실시예 2에 따라 4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 노즐의 크기의 변황예 따른 프린팅 결과물을 보여주는 공초점 .현미경 관찰 결과를 나타낸디- . 단면도 (Cross-sect ional View)에 도시된 바와 같이, 잉크 토출 부재의 단면 형상과 같은 형상으로 소형화가가능하였디- .
본 발명의 실시 예에 따르면 비율은 특정 형상 (실시 예: Lobul e)의 전체 직경 ( 15 mm)으로 부터 98.7% (200 μηι)까지 소형화 가능하였다. 상기 수학식 따라 계산하였다.
[수학식 1]
축소비율 =100- (수용부 직경 /인쇄된 직경) X100
[표 1]
구분 수용부 一
Inner 15mm 0.83隱 0.62 隱 0.41 讓 0.25 隱 0.2 mm di ameter Print ing 15mm 1 mm 0.725 mm 0.55 匪 0.375 mm 0.2 mm diameter
축소 (%) - 93.4 95.2 96.4 97.5 98.7 축소율 - 100:15 100:11 100:3.7 100:2.5 10(3:1.3 도 7은 실시예 2에 따라 4개 구획으로 구분된 수용부를 포함하는 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 노즐의 크기의 변화에 따른 프린팅 결과물을 보여주는 공초점 현미경 관찰 결과를 나타낸다. 실시예 3
다양한 형상의 구획부를 구비한 잉크 토출 부재를 이용하여 삼차원 프린팅을 수행하고자， 다양한 모양의 구획부재를 삼차원 인쇄방법으로 폴리락산 (polyactic acid;PLA)을 재질로 하여 제조하였다.
구획부재를 구비한 시린지에 각각 Green, Blue, Red형광 파티클이 함유된 3 w/v % sodium alginate를 넣은 결과 각각 구획에서 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 확인하였다.
도 8 및 도 9는 실시예 3에 따라 다양한 모양의 구획부재를 구비한 토출부재를 이용하여 RGB 하이드로겔이 프린팅되는 것을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 상기 실험결과에 따르면， 잉크 토출 부재의 수용부가 4개 구획뿐만 아니라， 여러 가지 형태의 조직도 모사할수 있음을 확인할 수 있다-. 도 9는 도 8의 다양한 모양의 토출물로부터 형광 세기를 그래프로 나타낸 것으로， 왼쪽 그래프는 도 8의 노란 점선으로부터 1차원 점선에 대한 2차원 형광 세기 그래프를 나타내며 오른쪽 그래프는 도 8의 흰색 네모박스로부터 표면에 대한 3차원 형광 세기 그래프를 나타낸디-. 도 9에 대해서 위로부터 1번 그래프는 도
8의 첫번째 구획 부재를 이용한 삼차원 프린팅 결과의 2차원 빛의 세기 분석으로서， 도 8의 노란색 점선으로부터 1차원 점선에 대한 2차원 형광 RGB빛의 세기를 나타내며, 2번 그래프는 도 8의 두 번째 구획 부재를 이용한 삼차원 프린팅 결과의 3차원 빛의 세기 분석으로서 , 도 8의 흰색 박스로부터 2차원 표면에 대한 3차원 형광 RGB 빛의 세기를 나타낸다. 이상 첨부 도면을 참고하여 본 발명에 대해서 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 결정되며 전술한 실시예 및 /또는 도면에 제한되는 의도는 아니다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
삼차원 프린팅 장치에 구비된, 잉크를 수용하는 수용부, 토출부 및 둘 이상의 구획된 공간을 제공하는 구획부재를 포함하는 잉크 토출 부재의 각 구획된 공간에 상이한 잉크를 제공하는 단계,
상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 동일 조건의 압력을 가하여， 둘 이상의 구획된 공간에 수용된 잉크가 단일 토출구로 토출하여 잉크 토출물을 제조하는 단계 , 및
상기 잉크 토출물을 기판에 인쇄하는 단계를 포함하는, 단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 방법.
【청구항 2】
게 1항에 있어서， 상기 잉크 토출 부재는, 상기.구획부재로 삼차원 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 들 이상의 공간을 제공하는 것인 방법.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 싱-기 잉크 토출 부재는， 삼차원 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고, 상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와, 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 ί함하는 것인 방법.
【청구항 4]
제 1항에 있어서, 상기 인쇄물은 인공 조직인 것인 방법.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기 수용부의 단면 직경과 인쇄물의 단면 직경의 비율이 100:99 내지, 100:0.1 인 방법.
【청구항 6】
제 1항에 있어서, 상기 구획부재는， 삼차원 프린팅 방법으로 제조되는 것이 방법. .
【청구항 7] 제 1항에 있어세 상기 잉크 토출물을 제조하는 단계는， 상기 잉크를 수용하는 단계와동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
【청구항 8]
제 13항에 있어서， 상기 잉크는- 구성성분， 구성성분의 함량 및 물성으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 상이한 것인 방법 . .
【청구항 9】
제 10항에 있어서 , 상기 잉크는 25°C에서 측정한 점도가 2cp내지 1 , 000 , 000 cp의 점도를 갖는 것인 방법 .
【청구항 10]
제 1항에 있어서, 상기 잉크는 겔화 고분자를 포함하는 것인 방법.
【청구항 11】
제 1항에 있어서, 상기 잉크는 겔화 고분자， 세포， 성장인자, 및 세포외기질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
【청구항 12】
게 1항에 있어서, 싱ᅳ기 동일 조건의 압력을 가하는 것은， 단일 가압부재를 사용하여 압력을 수행하거나， 둘 이상의 가압부재를 사용하여 동일 압력으로 가압하여 수행하는 것인 방법.
【청구힝ᅳ 13】
단면 패턴을 갖는 인쇄물의 삼차원 프린팅 장치로서,
인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도톡 구획된 둘 이상의 공간을 제공하는 구획부재를 포함하고， 상기 구획부재에 의하여 구획된 공간에 각각 상이한 인쇄용 잉크가 수용되는 수용부와， 상기 수용부의 하부에 위치하고 상기 잉크가 통과하는 단일 통로를 구비하며 수용부에 수용된 잉크를 토출하는 토출부를 포함하는 잉크 토출 부재 ,
상기 토출부의 말단에 연결된 노즐， 및
상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 압력을 가하는 가압부재를 포함하며,
각각 상이한 잉크가 단일 통로를 구비한 토출부를 통해 인쇄물과 동일한 모양의 단면 패턴을 갖도록 인쇄되는 삼차원 프린팅 장치. 【청구항 14]
제 13항에 있어서 , 상기 각 구획된 공간에 수용된 잉크에 동일 가압부재로 압력을 가하여， 각 구획된 공간에 수용된 잉크기■ 함께 토출되는 것인 프린팅 장치.
[청구항 .15】
제 13 항에 있어서， 상기 구획부재는 상기 잉크 토출 부재로부터 탈착 가능한 것인， 프린팅 장치.
ί청구항 16】
제 13 항에 있어서, 상기 구획부재는 상기 수용부 내부에 장착 가능한 중공부를 추가로 포함하는 것인 프린팅 장치.
【청구항 17】
제 13 항에 있어서， 상기 구획부재는 삼차원 프린팅 방법으로 제작된 것인 프린팅 장치 .
【청구항 18]
제 13 항에 있어서, 상기 잉크 토출 부재에 연결되며， 토출 부재의 각 구획된 공간에 잉크를 제공하는 잉크 제공 부재를 추가로 포함하는 프린팅 장치. 【청구항 19】
제 18 항에 있어서, 상기 잉크 제공 부재는， 잉크 저장조와， 상기 저장조로부터 공급관을 통해 수용부로 공급되는 잉크의 공급을 조절하는 공급 제어부롤 포함하는 것인 프린팅 장치.
【청구항 20】
제 13 항에 있어서, 상기 인쇄물은 인공 조직인 것인 프린팅 장치.
【청구항 21】'
제 13 항에 있어서， 상기 잉크는 구성성분， 함량조성 및 물성으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이 상이한 것인 프린팅 장치.
【청구항 22]
제 13 항에 있어서， 상기 잉크는 겔화 고분자를 포함하는 것인 프린팅 장치 .
【청구항 23] 제 22 항에 있어서, 상기 잉크는 겔화 고분자， 세포， 성장인자， 및 세포외기질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 프린팅 장치.
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