CN103675031B - 一种高通量细胞毒性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量细胞毒性评估方法，所用系统包括用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机/笔记本电脑、细胞培养箱、高通量的384x微电极板、靶细胞、待测化合物和阻抗信号传递电缆。该方法首先将靶细胞暴露在具有不同浓度的待测化合物中，并利用实时细胞监控软件记录整个靶细胞暴露过程的响应曲线；然后根据响应曲线所体现的细胞数量的变化，计算细胞毒性指标，该指标为靶细胞在整个指数增长期的数量变化，即靶细胞响应面积，且采用多浓度测试方法，得到基于靶细胞响应面积的“浓度-响应曲线”；在此基础上，计算得到新的细胞毒性指标。本发明采用了非侵入式的检测手段，无需生物标记，即可实现高通量的细胞毒性测定。

Description

一种高通量细胞毒性检测方法

技术领域

本发明涉及一种化学物质细胞毒性的测定技术，具体说是涉及一种基于无侵入、无标记、高通量实时细胞分析仪的细胞毒性测定系统及其细胞毒性检测新方法，属于细胞基因毒性分析领域。

背景技术

细胞毒性是指由化学物质引起的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。化学物质的细胞毒性测试，对人类健康风险评估、药物筛选、食品添加剂的安全测试，以及农药的毒性检定都具有重要的意义。目前，有很多技术可以实现化合物的细胞毒性测定，如：MTT、XTT法(利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测)，LDH方法(通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性)。尽管这些方法可以实现细胞毒性测定，但存在诸多弊端，(1)大部分方法的测定程序繁琐，无法实现高通量筛选(High Throughput Screening，HTS)；(2)中性红染料染色对靶细胞也存在干扰，测定结果不易校正；(3)受到细胞培养皿体积限制，高通量筛选(High Throughput Screening，HTS)比较困难；(4)现有的细胞毒性评估方法采用终点法，忽略了靶细胞在暴露过程中的动态响应过程，从而导致评估结果受测定时间点的选取影响较大，例如：在细胞暴露24小时的评估结果可能完全不同于细胞暴露后48小时的评估结果。

美国专利No.6,982,1152提供了一种细胞毒性的评估方法，该方法将靶细胞暴露在一定浓度的待测化合物中，并加入具有两种状态的中性红染料，系统自动检测该染料的状态，并减去背景值，即可得到由待测化合物所引起的细胞死亡数量，从而实现该待测化合物的细胞毒性评估。该方法采用单器皿测定，无法实现高通量，且利用终点法计算细胞毒性指标，无法得到细胞在暴露期间的动态响应信息。

美国专利No.7,202,081提供了一种检测细胞增殖抑制技术，与其待测化合物细胞增殖抑制活性的筛选方法。该方法采用传统的IC₅₀评估待测化合物细胞毒性大小，忽略了细胞在暴露期间的动态响应信息，导致检测结果受到测定时间点的选取影响较大。因此，无法确定哪个时间点(比如：24小时或者48小时)是最佳的、或是有效的。此外，该方法使用荧光法确定细胞的数目，而荧光强度受pH值和温度波动影响较大，检测信号不容易校正。

发明内容

本发明针对上述不足，提出一种结合实时细胞分析仪(Real Time Cell Analyzer，RTCA)的细胞毒性检测方法，实现对多个待化合物细胞毒性的测定，并为检测各种化合物对细胞死亡，或增殖抑制的影响提供依据，以满足人类健康风险评估的需求。同时，体外细胞毒性分析，也有利于确定体内急性毒性最适宜的开始剂量，大大减少实验动物的使用。

依据本发明的目的，提出一种高通量细胞毒性测定系统，该系统包含一用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机/笔记本电脑，一用于维持细胞生长环境的细胞培养箱(incubator)，一高通量的384x微电极板(E-Plate)，一靶细胞，一待测化合物，一阻抗信号传递电缆。

其中，PC机/笔记本电脑安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件平台RTCA，该平台能控制细胞培养箱的环境参数，如：温度、湿度，以及二氧化碳浓度，从而保持细胞生长环境条件的一致性；并能实时检测微电极板E-Plate的阻抗变化信号，并将该信号转化成细胞指数(Cell Index，CI)显示在屏幕上，同时也存储在PC机/笔记本电脑硬盘中。

其中，384x微电极板置于细胞培养箱中，细胞培养箱的环境参数(温湿度，二氧化碳浓度)由实时细胞监控软件控制，从而保持在整个细胞暴露过程中稳定的环境条件。

其中，靶细胞接种在384x微电极板(E-Plate)中，靶细胞会贴壁生长，其数量变化会促使E-Plate底部的金箔传感器的阻抗发生变化，微电极上的贴壁细胞越多，阻抗值变化就越大，

其中，安装在PC机上的实时细胞监控软件通过电缆，获取阻抗信号变化，并将这种阻抗信号变化转化成细胞指数(CI)，显示在系统中。

其中，在靶细胞接种在微电极板24小时后，在微电极板的不同微孔(well)中加入不同浓度的待测化合物，靶细胞的生长过程会受到该化合物的影响，或出现细胞增殖抑制，或出现死亡，实时细胞监控软件记录整个靶细胞的动态响应过程。

本发明的细胞毒性检测方法包括以下步骤：

1)将培养基加入384x细胞培养板的每个微孔中，RTCA检测培养基的阻抗信号变化，并自动扣除由培养基引起的阻抗信号变化的背景值；

2)将定量的靶细胞接种到384x的细胞培养板的微孔中；

3)在室温的培养箱中培育30分钟，置于RTCA的培养箱中；

4)接种24小时后，细胞进入指数增长期，此时细胞指数(cell index，CI值)达到1.0-1.2，用自动移液器将11个浓度(按着1:3比例稀释)的待测化合物添加到细胞培养板的微孔中；

5)RTCA软件自动记录89小时的细胞指数(CI值)，记录频率为每小时记录一次；

6)为减少实验内，每个微孔的初始接种细胞数量微弱差异，将RTCA采集的细胞指数(CI值)归一化处理，得到新的细胞指数(NCI)，亦即：

$\mathrm{NCI}\left[k\right]=\frac{\mathrm{CI}\left[k\right]}{\mathrm{CI}\left[0\right]}---\left(1\right)$

式中，CI[0]为刚注入待测化合物时，RTCA所记录的细胞指数值，k是RTCA软件的采样频率；

7)选择靶细胞的指数增长期为评估时间段，即：以正常对照组(negative control)的NCI指数最大值所在的时间为截止时间：

$N=\underset{k}{\arg \max }\left\{{\mathrm{NCI}}_c\right[k\left]\right\}---\left(2\right)$

式中，NCI_c[k]为对照组的NCI指数值，N为截止时间；

这样，避免了终点评估法需要确定最佳评估时间的弊端；

8)计算对照组细胞响应曲线的线下面积(area under the negative control,AUC_c)，即：对照组响应曲线和细胞单位指数(NCI＝1)所构成的面积：

${\mathrm{AUC}}_c=\underset{k=2}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{\left({\mathrm{MCI}}_c\right[k]+{\mathrm{NCI}}_c[k-1]-2)\left(t\right[k]-t[k-1\left]\right)}{2}---\left(3\right)$

其中t[k]为采样时间，N为所选评估时间段(即：细胞指数增长期)；AUC_c值的大小体现了靶细胞在整个指数增长期，细胞增殖的数量；

同时，计算靶细胞的暴露响应曲线与靶细胞的对照组响应曲线，在所选评估时间段所围成面积AUC_j，即：细胞对照组响应曲线与加入j^th浓度待测化合物所记录响应曲线之间的面积：

${\mathrm{AUC}}_j=\underset{k=2}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{(\left({\mathrm{NCI}}_c\right[k]-{\mathrm{NCI}}_j[k\left]\right)+\left({\mathrm{NCI}}_c\right[k-1]-{\mathrm{NCI}}_j[k-1\left]\right))\left(t\right[k]-t[k-1\left]\right)}{2}---\left(4\right)$

其中NCI_j[k]是待测化合物第j^th个浓度所对应的NCI指数值，j＝1,2,…11为浓度值的代号；AUC_j值的大小体现了靶细胞在待测化合物作用下，相对于对照组，细胞死亡的数量，亦即：细胞毒性的大小；

9)将AUC_j除以AUC_c得到靶细胞相对响应面积R(x_j)：

$R\left(x_j\right)=100\×\frac{{\mathrm{AUC}}_j}{{\mathrm{AUC}}_c}\%---\left(5\right)$

其中x_j为待测化合物对应的浓度值，j＝1，2，…，11；

10)用11个靶细胞相对响应面积R(x_j)和其相应的浓度x_j，采用非线性回归算法，得到评估该待测化合物细胞毒性的“浓度-响应曲线”方程：

$R\left(x\right)=p_1+\frac{p_2-p_1}{1+\exp (-\frac{\log \left(x\right)-p_3}{p_4})}---\left(6\right)$

其中x表示每个待测化合物的浓度，p₁、p₂，p₃，p₄为“浓度-响应曲线”方程的系数；

11)依据细胞“浓度-响应曲线”方程，算出新的细胞毒性评估指数AUC₅₀，也就是说，减少对照组响应曲线面积一半时(50％)，所需要待测化合物的浓度值，

${\mathrm{AUC}}_{50}=\exp (-\ln (\frac{p_2-p_1}{50-p_1}-1)\×p_4+p_3)---\left(7\right)$

AUC₅₀数值直接反映在整个细胞指数增长期，杀死对照组一半的增殖细胞所需要的待测化合物浓度大小，亦即反映了该待测化合物细胞毒性大小。

本发明细胞毒性检测方法给出一种新的细胞毒性指标计算方法，计算靶细胞响应面积，而不是仅仅检测终点的细胞数量，避免了终点检测方法的弊端。该检测方法最大的优势在于，采用了非侵入式的检测手段，无需生物标记，即可实现高通量的细胞毒性测定，且检测方法体现了在整个细胞指数增长期，靶细胞受待测化合物作用后，其细胞数量变化的动态响应过程。

附图说明

图1为高通量细胞毒性测定系统的结构原理图；其中，101-靶细胞，102-待测化合物，103-微电极板,104-阻抗信号传输电缆，105-细胞培养箱，106-PC机；

图2为高通量细胞毒性检测方法的流程图；

图3为细胞对照组与细胞暴露在11种浓度的待测化合物中，细胞指数NCI的动态响应图；

图4为在细胞指数增长期，细胞对照组响应曲线与单位细胞指数所围成面积；

图5为在细胞指数增长期，对照组细胞响应曲线与细胞暴露响应曲线所围成的面积；

图6为基于细胞相对响应面积的细胞毒性“浓度-响应曲线”。

具体实施方式

请参阅第1图，其为本发明用于高通量细胞毒性测定系统结构原理图，如图1所示，本发明包括一用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机106，一用于维持细胞生长环境的细胞培养箱105(incubator)，一高通量的384x微电极板103(E-Plate)，一靶细胞101，一待测化合物102，一阻抗信号传输电缆104。

其中，PC机106中安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件平台RTCA，该平台能控制细胞培养箱的环境参数，如：温度、湿度，以及二氧化碳浓度，从而保持细胞生长环境条件的均匀性；并能实时检测微电极板103的阻抗变化信号，并将该信号转化成细胞指数(CellIndex，CI)显示在屏幕上，同时也存储在PC机硬盘中。

其中，384x微电极板103置于细胞培养箱105中，细胞培养箱105的环境参数(温湿度，二氧化碳浓度)由RTCA软件控制，从而保持在整个细胞暴露过程中稳定的环境条件。

其中，靶细胞101接种在384x微电极板103(E-Plate)中，靶细胞101会贴壁生长，其数量变化会促使E-Plate底部的金箔传感器的阻抗发生变化，微电极103的微孔里的贴壁细胞越多，阻抗值变化就越大。

其中，安装在PC机106上的实时细胞监控软件通过电缆104，获取阻抗信号变化，并将这种电信号变化转化成细胞指数(CI)，显示在系统中。

其中，在靶细胞101接种在微电极板24小时后，在微电极板的不同微孔(well)中加入11种浓度的秋水仙碱，靶细胞101的生长过程会受到该化合物的影响，或出现细胞增殖抑制，或出现死亡，实时细胞监控软件记录整个细胞暴露过程的动态响应。

如图2所示，本发明的细胞毒性检测方法具体包含如下步骤：

第1步，将培养基加入384x细胞培养板的每个微孔中，RTCA检测培养基的阻抗信号变化，并自动扣除由培养基引起阻抗信号变化的背景值。

第2步，将定量的靶细胞(以肝癌细胞HepG2为实施例)接种到384x的细胞培养板的微孔中，每孔的细胞初始数量为4000个/孔。

第3步，在室温的培养箱中培育30分钟后，置于RTCA的培养箱中。

第4步，接种24小时后，细胞进入指数增长期，此时细胞指数(cell index，CI值)达到1.0-1.2，用自动移液器将11个浓度(按着1:3比例稀释)的待测秋水仙碱(Colchincine)添加到细胞培养板的微孔中。

第5步，RTCA自动记录89小时的细胞指数(CI值)，记录频率为每小时记录一次。

第6步，将记录的细胞指数(CI值)归一化处理，得到新的细胞指数(NCI)，其结果如图3所示，其中各曲线代表的含义如下：a---肝癌细胞HepG2对照组NCI响应曲线；b---HepG2细胞暴露在0.17nM秋水仙碱后NCI响应曲线；c---HepG2细胞暴露在0.51nM秋水仙碱后NCI响应曲线；d---HepG2细胞暴露在1.52nM秋水仙碱后NCI响应曲线；e---HepG2细胞暴露在4.57nM秋水仙碱后NCI响应曲线；f---HepG2细胞暴露在13.72nM秋水仙碱后NCI响应曲线；g---HepG2细胞暴露在41.15nM秋水仙碱后NCI响应曲线；h---HepG2细胞暴露在0.12uM秋水仙碱后NCI响应曲线；i---HepG2细胞暴露在0.37uM秋水仙碱后NCI响应曲线；j---HepG2细胞暴露在1.11uM秋水仙碱后NCI响应曲线；k---HepG2细胞暴露在3.33uM秋水仙碱后NCI响应曲线；l---HepG2细胞暴露在10uM秋水仙碱后NCI响应曲线。

第7步，以正常对照组(negative control)的NCI指数最大值所在的时间为截止时间，从而选择细胞指数增长期为评估时间段，亦即图3和图4中的t_N。

第8步，用公式(3)计算细胞对照组响应曲线和细胞单位指数(NCI＝1)在评估时间段t_N时所围成的面积AUC_c，计算结果如图4所示，此AUC_c的值为37。其中各曲线代表的含义如下：a---肝癌HepG2细胞对照组NCI响应曲线；b---单位细胞指数。

同时，用公式(4)计算细胞暴露响应曲线与细胞对照组响应曲线在评估时间段t_N内的面积AUC_j，如图5所示，此时，j＝6,(即第6个浓度41.15nM)，并且AUC₆的值为14.57。其中各曲线代表的含义如下：a---肝癌HepG2细胞对照组NCI响应曲线；b---HepG2细胞暴露在41.15nM秋水仙碱后NCI响应曲线(j＝6)。

第9步，用公式(5)计算肝癌细胞HepG2的相对响应面积R(x_j)，得到39.39％，此值直接反映了在41.15nM浓度下，秋水仙碱对肝癌细胞HepG2细胞毒性大小。

第10步，采用非线性回归算法，计算得到公式(6)的“浓度-响应曲线”方程系数：p₁＝2.515，p₂＝106.156，p₃＝-1.22和p₄＝0.297，因此，秋水仙碱的肝癌细胞HepG2“浓度-响应曲线”方程为：

$R\left(x\right)=2.525+\frac{106.156}{1+\exp (-\frac{\log \left(x\right)+1.22}{0.297})}---\left(8\right)$

第11步，用公式(7)计算本发明所提出的细胞毒性指标AUC₅₀值，即为0.0549uM。

这表示：在肝癌细胞HepG2的指数增长期，杀死对照组HepG2增殖细胞一半时，需要0.0549μM的秋水仙碱。此细胞毒性指标直接反映了秋水仙碱的毒性强度的，可用于细胞毒性筛选。

Claims (3)

1.一种高通量细胞毒性检测方法，所用的系统包括用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机或笔记本电脑、用于维持细胞生长环境的细胞培养箱、高通量的384x细胞培养板、靶细胞、待测化合物和阻抗信号传递电缆，PC机或笔记本电脑安装有艾森生物科学有限公司开发的实时细胞监控软件，实时细胞监控软件通过电缆获取阻抗信号变化，并将这种阻抗信号变化转化成细胞指数显示在系统中，384x细胞培养板置于细胞培养箱中，靶细胞接种在384x细胞培养板中，其特征在于，该方法首先将靶细胞暴露在具有不同浓度的待测化合物中，并利用实时细胞监控软件记录整个靶细胞暴露过程的响应曲线；然后根据响应曲线所体现的细胞数量的变化，计算细胞毒性指标，该指标为靶细胞在整个指数增长期的数量变化，即靶细胞响应面积，且采用多浓度测试方法，得到基于靶细胞响应面积的“浓度-响应曲线”；最后，在“浓度-响应曲线”所反映的待测化合物细胞毒性随浓度变化规律的基础上，计算得到新的细胞毒性指标。

2.根据权利要求1所述的一种高通量细胞毒性检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)将培养基加入384x细胞培养板的每个微孔中，实时细胞监控软件检测培养基的阻抗信号变化，并自动扣除由培养基引起的阻抗信号变化的背景值；

2)将定量的靶细胞接种到384x的细胞培养板的微孔中；

3)在室温的细胞培养箱中培育30分钟后，置于实时细胞监控软件的培养箱中；

4)接种24小时后，细胞进入指数增长期，此时细胞指数CI值达到1.0-1.2，用自动移液器将11个浓度的待测化合物添加到细胞培养板的微孔中；

5)实时细胞监控软件自动记录89小时的细胞指数CI值；

6)为减少实验内每个微孔的初始接种细胞数量微弱差异，将实时细胞监控软件采集的细胞指数CI值归一化处理，得到新的细胞指数NCI，亦即：

$\mathrm{NCI}\left[k\right]=\frac{\mathrm{CI}\left[k\right]}{\mathrm{CI}\left[0\right]}---\left(1\right)$

式中，CI[0]为刚注入待测化合物时，RTCA所记录的细胞指数值，k是实时细胞监控软件的采样频率；

7)选择靶细胞的指数增长期为评估时间段，即：以正常对照组的细胞指数NCI最大值所在的时间为截止时间：

$N=\underset{k}{\arg \max }\left\{{\mathrm{NCI}}_c\right[k\left]\right\}---\left(2\right)$

式中，NCI_c[k]为对照组的NCI指数值，N为截止时间；这样，避免了终点评估法需要确定最佳评估时间的弊端；

8)计算对照组细胞响应曲线的线下面积AUC_c，即：对照组响应曲线和细胞单位指数所构成的面积：

${\mathrm{AUC}}_c=\underset{k=2}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{\left({\mathrm{NCI}}_c\right[k]+{\mathrm{NCI}}_c[k-1]-2)\left(t\right[k]-t[t-1\left]\right)}{2}---\left(3{}_{}\right)$

其中，细胞单位指数即NCI＝1，t[k]为采样时间；N为所选评估时间段，即：细胞指数增长期；AUC_c值的大小体现了靶细胞在整个指数增长期，细胞增殖的数量；

同时，计算靶细胞的暴露响应曲线与靶细胞的对照组响应曲线，在所选评估时间段所围成面积AUC_j，即：细胞对照组响应曲线与加入j^th浓度待测化合物所记录响应曲线之间的面积：

${\mathrm{AUC}}_j=\underset{k=2}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{(\left({\mathrm{NCI}}_c\right[k]-{\mathrm{NCI}}_j[k\left]\right)+\left({\mathrm{NCI}}_c\right[k-1]-{\mathrm{NCI}}_j[k-1\left]\right))\left(t\right[k]-t[k-1\left]\right)}{2}---\left(4\right)$

其中NCI_j[k]是待测化合物第j^th个浓度所对应的指数NCI值，j＝1,2,…11为浓度值的代号；AUC_j值的大小体现了靶细胞在待测化合物作用下，相对于对照组，细胞死亡的数量，亦即：细胞毒性的大小；

9)计算得到靶细胞相对响应面积R(x_j)：

$R\left(x_j\right)=100\×\frac{{\mathrm{AUC}}_j}{A{\mathrm{UC}}_c}\%---\left(5\right)$

其中x_j为待测化合物对应的浓度值，j＝1，2，…，11；

10)用11个靶细胞相对响应面积R(x_j)和其相应的浓度x_j，采用非线性回归算法，得到评估该待测化合物细胞毒性的“浓度-响应曲线”方程：

$R\left(x\right)=p_1+\frac{p_2-p_1}{1+\exp (-\frac{\log \left(x\right)-p_3}{p_4})}---\left(6\right)$

其中x表示每个待测化合物的浓度，p₁、p₂，p₃，p₄为“浓度-响应曲线”方程的系数；

11)依据细胞“浓度-响应曲线”方程，算出新的细胞毒性评估指数AUC₅₀，也就是说，减少对照组响应曲线面积一半时，所需要待测化合物的浓度值，

${\mathrm{AUC}}_{50}=\exp (-\ln (\frac{p_2-p_1}{50-p_1}-1)\×p_4+p_3)---\left(7\right)$

AUC₅₀数值直接反映在整个细胞指数增长期，杀死对照组一半的增殖细胞所需要的待测化合物浓度大小，亦即反映了该待测化合物细胞毒性大小。

3.根据权利要求2所述的一种高通量细胞毒性检测方法，其特征在于，所述步骤5)中，实时细胞监控软件记录细胞指数CI值的记录频率为每小时记录一次。