CN101098969A - 使用生物层干涉测量法测量酶活性 - Google Patents
使用生物层干涉测量法测量酶活性 Download PDFInfo
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Abstract
本发明揭示使用生物层干涉测量法实施的酶分析。分析可使用固定底物或使用底物捕获格式进行。在某些实施例中使用未标记底物进行这些分析。这些方法广泛适用于酶分析测量,可于活体内或活体外进行,并可轻易地多次使用。
Description
对相关申请案的交叉参考
本申请案主张2005年1月19日申请的美国临时申请案第60/645,153号及2005年1月7日申请的美国临时申请案第60/642,454号的权利,为了达到各种目的,这两个申请案以引用的方式全部并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
不适用。
技术领域
本发明涉及基于干涉测量法的方法及用于测量酶活性的组合物。
背景技术
酶是一大类能催化生化反应的蛋白质且其具有许多治疗及工业应用。通常在开发及制造酶产品的过程中需要测量酶活性。简单的酶活性方法(最好未标记从而避免酶/底物相互作用的干扰)将会得到广泛应用。在开发及制造用于治疗或工业应用中的以酶或酶抑制剂为主的产品的过程中,在整个制程期间监测酶活性至关重要。酶分析一般需要标记底物以使得作用于底物上的酶产生可检测到的信号变化。经标记的酶底物通常无市售,在该情况下其合成会很复杂。对于开发多种酶产品的公司而言,提供简单且易于在研究与开发及制造环境中实施的活性方法成为一项主要任务。对于标记底物的需要增加了酶活性测量的时间、费用及不便利性。比活性测量也需要定量样品中存在的酶量。定量测定(例如通过基于酶联免疫吸附(ELISA)的分析)亦增加了比活性测量的时间及费用且需要额外的样品。本发明通过提供简单的以纤维为主的实时酶活性分析来解决先前技术的这些及其他缺点,所述实时酶活性分析能提供比活性测量、适于低体积样品、具有高度的多次使用性且在某些实施例中可使用未标记底物进行。
发明内容
本发明由以下权利要求书界定,且本部分中任何内容均不应视为对那些权利要求书的限制。本文揭示了使用以纤维为主的干涉测量法分析酶活性的组件、套组及方法。在一实施例中,该分析包括提供经由光纤偶联至光源的光学元件且该元件包括相隔至少50nm的近侧及远侧反射表面。设置一酶底物分子层以使近侧与远侧反射表面反射的光束间的干涉随酶与底物的反应而改变。反射光束偶联于光纤中。使元件暴露于酶并检测反射光束间的干涉改变。所检测改变可指示酶活性。
在再一实施例中,在光学元件中,用一分析物结合分子层取代酶底物分子层。自近侧及远侧反射表面反射的光束间的干涉随酶与底物的反应而改变,且受到作用的底物或其一部分与分析物结合分子结合。在优选实施例中,分析物结合分子包含抗体、抗体片段、单链Fv分子(“scFv”)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素。
在另一实施例中,将半透膜置于光学元件与分析溶液之间。在又一实施例中,将底物偶联至诸如一微量滴定孔或珠粒等载体上。
在另一实施例中,提供一包括特异性结合于酶的分子层的类似第二元件。使该第二元件暴露于酶(在第一元件暴露的同时或者不同时刻)并检测反射光束间的干涉改变。该改变可指示酶浓度或酶量。此可用于进行比活性测量。在优选实施例中,酶结合分子包含抗酶抗体、抗体片段或scFv分子。
附图说明
参阅下述说明及附图,可对本发明的这些或其他特点、方面及优点获得更好理解,
其中:
图1是绘示最小分子大小检测的图形;
图2是绘示最小分子大小检测的另一图形;
图3是绘示在三个酶浓度下测量枯草杆菌蛋白酶活性的图形;
图4是绘示在50微克/毫升下测量枯草杆菌蛋白酶活性的图形;
图5是绘示蛋白酶抑制剂对枯草杆菌蛋白酶活性影响的图形;
图6是绘示蛋白酶抑制剂对枯草杆菌蛋白酶活性影响的第二图形;
图7是绘示用于底物捕获格式的底物制备的图形;图7A绘示具有多个蛋白酶切割位点的底物;图7B绘示具有单个(或几个)切割位点的底物;
图8是绘示底物捕获格式分析原理的示意图;
图9是绘示检测核苷酸转移酶活性的方法的示意图;
图10是绘示在纳入半抗原时检测核苷酸转移酶活性的方法的示意图;
图11是绘示使用针对磷酸化底物的抗体检测磷酸转移酶活性的方法的示意图;
图12是绘示检测蛋白激酶C活性的方法的示意图;
图13是绘示检测分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的方法的示意图。
具体实施方式
优点及用途
简言之,且更详细地如下文所述,本文所述为使用以纤维为主的干涉测量法分析酶活性的组件、套组及方法。
应注意当前方法的若干特点。测量可使用极少量样品体积(例如nL)进行。测量可于活体内或活体外进行。在某些实施例中,测量可在未标记底物上进行,而在其他实施例中,底物包括一个容许组件捕获的部分。在优选实施例中,该部分是结合对的一个成员,例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、半抗原、抗体、抗体片段、scFv或凝集素,且该光学元件包含该对的互补成员。在这些实施例中,同种类型的光学元件(即,含有结合对的一个成员)可用于多种酶分析中,只要底物包括结合对的另一成员即可。
此方法的优点很多。因为本发明是为以纤维为主的干涉测量法测量而提供,因此其很敏感、具有高度多次使用性、并易于通过纳入用于测量酶量的模块而适用于测量比活性。
本发明可用于在所述活性测量有用的任何场合测量酶活性,其中包括(例如)用于酶或酶抑制剂的发现、修饰、优化、产生等方面。本发明可使用任何种类型的酶(例如水解酶、糖基化酶、酯酶及转移酶)或此类酶的抑制剂实施。
定义
除非另有说明,否则本权利要求书及说明书中所用术语均按下文所述定义。
术语“活体内”是指发生于活生物体中的过程。
本申请案中所用缩写包括以下:dsDNA-双链DNA;dNTPs-脱氧核苷三磷酸;B-ATP-生物素化的ATP;PEG-聚乙二醇;PMSF-苯甲基磺酰氟。
必须注意,除非上下文明确指出,否则,本说明书及随附权利要求书中所用的单数形式“一”及“该”均包括复数个对象。
本发明组件
本发明组件包括适于偶联至生物层干涉仪并含有一层底物或分析物结合分子的生物传感器尖端。该分析物结合分子可以是例如但不制于结合对的一个成员,例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、半抗原、抗体、抗体片段、scFv或凝集素。
本发明套组
本发明套组包括适于偶联至生物层干涉仪的玻璃纤维、用底物层或分析物结合分子层衍生该玻璃纤维的试剂及说明书、视情况用于光学活化玻璃纤维末端及封装的试剂及说明书。
本发明方法
概言之,本发明方法使用包括生物层干涉测量法(BLI)传感器的组件及装置(例如那些阐述于2004年11月4日申请的由Hong Tan等人共同拥有的美国非临时申请案第10/981,901号中者,该案标题为“Fiber-Optic Assay Apparatus Based on Phase-ShiftInterferometry”,档案号为24377-09611US,此案的全部内容以引用的方式并入本文中)实施。
简言之,传感器通过光学激活玻璃纤维的一端来制备。该激活步骤包括抛光纤维表面、用Ta2O5涂覆该表面、随后用SiO2层涂覆该表面、及清洗和通过被动吸附及/或共价键结固定酶底物或结合对的一个成员。
在本发明范围内包括两种用于分析酶活性的广泛通用格式。在第一格式中,将底物固定在生物层干涉测量法(BLI)传感器的表面上。在第二格式中,BLI传感器包括具有能结合底物的分子的表面。在第二格式中,视情况将半透膜纳入BLI传感器与分析溶液之间,或使底物结合于诸如微量滴定孔或珠粒等载体上。这些实施例与水解酶一起使用特别有利于防止或减缓全长底物与BLI传感器的结合。在第二格式中,关于酶活性的信息可通过干涉信号的动力学及稳态分量得到。
生物层干涉测量法(BLI)传感器能测量其光学层检测表面厚度的亚纳米改变。生物样品可通过设计分析格式(其中生物分子结合于传感器表面并改变光学层厚度)进行分析。光学层厚度改变量与结合分子的质量或分子量成正比。生物层干涉仪可构造为使底物固定于传感器表面以测量酶,该等酶的活性会造成底物分子量改变(或增加或降低分子量),从而产生光学层厚度的相应改变。
本发明广泛适用于酶活性测量,包括(例如但不限于)测量水解酶(包括蛋白酶)、糖基化酶、酯酶、转移酶(包括核苷酸转移酶及磷酸转移酶)。这些酶活性测量将在下文中更详细地阐述。
实例
下文是用以实施本发明的具体实施例的实例。所给出的这些实例仅用于说明目的,而不欲以任何形式限制本发明的范围。尽管力求使所用数值(例如数量、温度等)达到精确,但当然应允许某些实验误差及偏差。除非另有说明,否则各程序均于室温(通常20至23摄氏度)下进行。
除非另有说明,否则本发明的实施将采用所属领域内传统的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术及药理学方法。此类技术详细阐述于文献中。参见,例如,T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers公司,最近添加);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan编辑,Academic Press公司);Remington′s Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing公司,1990);Carey及Sundberg,Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A卷及B卷(1992)。
实例1:BLI分子量检测特征。
BLI可检测的结合分子的最低分子量绘示于图1及2中。在图1中展示了分子量为900道尔顿与涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器结合的生物素-PEG共轭物的数据。BLI传感器及涂覆该传感器的方法详细阐述于2004年11月4日申请且由Hong Tan等人共同拥有的美国非临时申请案第10/981,901号中,该案标题为“Fiber-Optic AssayApparatus Based on Phase-Shift Interferometry”,代理人案号为24377-09611US。图2展示了生物素(分子量约230道尔顿)与涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器的结合。这些数据表明所述干涉测量法易于检测分子量约为250道尔顿的分子的结合,且分子量在500至1000道尔顿范围内的分子在光学层厚度上产生显著改变。基于BLI的最小分子大小检测,人们可以构造具有固定底物的BLI传感器以监测底物中产生小到250至1000道尔顿分子大小改变的酶的活性。
BLI的较小最小分子大小检测范围使得有可能将BLI应用于多种酶。例如但不限于,以下所述者为活性可以根据本发明加以测量的酶种类、及此类测量的具体实例。
实例2:水解酶活性测量。
水解酶是催化切割C-O、C-N、C-C或磷酸酐键的酶。
亚群1:蛋白酶(作用于肽键的酶)
固定底物格式
该格式的特征在于固定于BLI玻璃纤维传感器表面的蛋白酶底物,此固定使用2004年11月4日申请且由Hong Tan等人共同拥有的美国非临时申请案第10/981,901号(标题为“Fiber-Optic Assay Apparatus Based on Phase-Shift Interferometry”,档案号为24377-09611US(以引用的方式并入本文中))及下文中阐述的方法达成。将纤维浸没于含酶样品中,并监测光学层厚度的改变。
基本分析方案是培养一生物层干涉仪(BLI)传感器,在该传感器上已经于含酶溶液酶中固定酶底物。使用生物层干涉测量法(BLI)技术通过(例如)光学相移改变来量化底物耗尽量,所述技术详细阐述于2004年11月4日申请且由Hong Tan等人共同拥有的待决美国非临时申请案第10/981,901号中,该案标题为“Fiber-Optic AssayApparatus Based on Phase-Shift Interferometry”,档案号为24377-09611US中,此案以引用的方式并入本文中。例如,光学相移的改变与溶液中酶活性的量成正比,因为水解活性可通过测量由酶活性所致的BLI传感器上底物的耗尽量来估计。
在固定酪蛋白底物上测量枯草杆菌蛋白酶活性
方法
一光学信号基线通过以下操作建立:将纤维传感器尖端的光学激活末端浸没于PBS中,并使用2004年11月4日申请且由Hong Tan等人共同拥有的美国非临时申请案第10/981,901号(标题为“Fiber-Optic Assay Apparatus Based on Phase-ShiftInterferometry”,档案号为24377-09611US(其全文以引用的方式并入本文中))中所述的干涉测量法及设备监测光学信号。接着,通过在0.5毫克/毫升聚-D-赖氨酸溶液(在PBS pH 7.4中)中培养该尖端15分钟使纤维涂覆有聚-D-赖氨酸。未结合的聚-D-赖氨酸通过在PBS中培养尖端10分钟进行漂洗。
通过在50微克/毫升酪蛋白溶液(50mM磷酸钠,150mM NaCl,pH7)中培养尖端15分钟使纤维涂覆有层酪蛋白[Sigma Chemical公司,St Louis,MO]。未结合的酪蛋白通过在PBS中培养尖端10分钟而进行漂洗。
于多种浓度(1、10、50微克/毫升)的枯草杆菌蛋白酶[Sigma Chemical公司,StLouis,MO]溶液(于50mM磷酸钠、150mM NaCl pH7中)中培养具有固定酪蛋白的纤维。进行上述每一程序,同时监测光学信号。
结果及讨论
图3绘示了该实例的结果。光学曲线显示所计算的生物层厚度随时间的变化情况。很明显,生物层厚度在酪蛋白装载期间增加且随后随着枯草杆菌蛋白酶的培养而降低。曲线显示清楚的剂量-响应效应:在测试范围内,枯草杆菌蛋白酶浓度越高,就会出现越快及越大的改变。
蛋白酶抑制剂对酶活性的影响
方法
制备纤维传感器尖端并使用酪蛋白涂覆,如上所述。在50微克/毫升枯草杆菌蛋白酶溶液(于50mM磷酸钠、150mM NaCl pH7中)中培养一纤维。
在50微克/毫升枯草杆菌蛋白酶与3mM PMSF[Sigma Chemical公司,St Louis,MO]溶液(50mM磷酸钠,150mM NaCl,pH7)的预混合及预培养溶液(混合物于37℃下培养20分钟)中培养其他纤维。进行上述每一程序,同时监测光学信号。
结果及讨论
由枯草杆菌蛋白酶溶液中培养的纤维获得的曲线展示酪蛋白自尖端表面的预期耗尽(图4)。此显示为在酶溶液中培养后曲线中的光滑、时间依赖性改变。在枯草杆菌蛋白酶与(蛋白酶抑制剂)PMSF的枯草杆菌蛋白酶/PMSF混合物中所培养的纤维不展示任何光学信号时间依赖性改变(图5及6),此说明3mM PMSF对枯草杆菌蛋白酶的抑制。
底物捕获格式
底物捕获格式需要由呈液相的蛋白酶消化底物,随后使底物结合于BLI传感器表面。底物的结合经设计以使底物的蛋白水解切割产生可检测到的光学层厚度改变。在一优选实施例中,使用链霉抗生物素蛋白/生物素结合对达成底物捕获。图7展示两种用生物素标记肽底物的方法。在蛋白酶具有多个切割位点的情况下,生物素不一定在特定位点处受到取代,因为所达成消化将产生具有充分小分子尺寸的肽。底物亦可经设计以具有单一切割位点且生物素取代位置应使其在蛋白酶解时保持于最小肽片段上。用生物素或结合对另一成员衍生底物的方法已为所属领域的技术人员所熟知,且其包括对已存在底物分子的生化修饰,或使用经衍生亚单元合成。此类方法阐述于(例如)[Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow及D.Lane,1988);BioconjugationProtocols:Strategies and Methods(Methods in Molecular Biology(Clifton,N.J.),283卷,2004),其以引用的方式并入本文中]中,并例示于下文中。
实例3:使用底物捕获测量胰蛋白酶活性。
使用底物捕获格式及细胞色素C作为底物进行胰蛋白酶活性测量。细胞色素C的分子量约为12千道尔顿,且其包括8个胰蛋白酶切割位点。标准生物素-NHS衍生物[Pierce Biotechnology,Rockford IL]用于标记细胞色素C。偶联条件采用标准磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7缓冲液。生物素-NHS与细胞色素C以5∶1(生物素:细胞色素C)的摩尔偶联比率混合,通常产生1个生物素取代/细胞色素C分子。涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器用直径0.6mm的玻璃纤维制备,其中约20nm的氧化钽层及约700nm的二氧化硅层浸渍于上述含0.5毫克/毫升聚-D-赖氨酸的PBS溶液中。在室温下经15分钟后,用PBS冲洗纤维,然后浸没于1毫克/毫升用3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)[Pierce Biotechnology,Rockford IL]标记的牛血清白蛋白(BSA)溶液中,并培养20分钟,随后用PBS实施冲洗步骤。随后于室温下将纤维浸没于50mM二硫醇苏糖醇溶液中30分钟。在PBS中洗涤后,将纤维置于含20毫克/毫升用SMCC标记的链霉抗生物素蛋白溶液中,并培养60分钟,随后用PBS冲洗。将纤维储存于PBS中直至使用。
使用底物捕获格式对蛋白酶活性进行基本分析需要向约1微克/毫升至1毫克/毫升范围内的生物素化细胞色素C溶液中添加胰蛋白酶样品,通常以1%重量/重量比。消化一段时间后,将涂覆链霉抗生物素蛋白的传感器置于酶/底物混合物中用于底物捕获。为避免胰蛋白酶作用于链霉抗生物素蛋白上,可恰在添加玻璃纤维前通过骤沸底物混合物或添加蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶)使酶失活。在结合生物素化肽后,BLI传感器可通过测量光学层厚度来估计底物大小的改变。图8绘示了其中蛋白酶活性产生更小肽及更薄光学层的分析格式。
亚群2:糖基化酶(水解O或S或N糖基键的酶)
固定底物格式
以下实例是针对葡聚糖酶阐述,但同样的方法可施用于其他多糖处理酶,例如淀粉酶及纤维素酶。通过首先使葡聚糖与高碘酸钠反应以在葡聚糖聚合物上引入反应性醛基而使葡聚糖连接至涂覆蛋白的BLI传感器上。然后,将涂覆蛋白的BLI传感器(例如根据以上实例中所述方法制备者)浸没于葡聚糖溶液中。葡聚糖上的醛基与蛋白质上的游离氨基形成键结,产生以葡聚糖作为最终层的BLI传感器。当将涂覆葡聚糖的传感器浸没于含葡聚糖酶的样品中时即可测量葡聚糖酶的活性。葡聚糖酶的水解活性可减小固定葡聚糖的分子大小,此被检测为更薄光学层。
底物捕获格式
在底物捕获格式中,通过生物素化多糖底物来进行糖基化酶测量。在葡聚糖酶实例中,使葡聚糖与高碘酸钠反应以产生醛基,随后添加较大摩尔过量的双胺,例如乙二胺。双胺的一个胺基偶联至葡聚糖的醛上,使第二个胺基可在后续反应中自由偶联至生物素-NHS上。对生物素-NHS反应的摩尔偶联比加以选择以产生约1个生物素取代/葡聚糖。在底物捕获格式中,葡聚糖酶活性分析类似于第二个实例中的蛋白酶,其中生物素化的葡聚糖底物与葡聚糖酶样品一起培养,随后使生物素化的葡聚糖与涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器结合。葡聚糖酶活性产生更小葡聚糖片段,其被测量为更薄光学层。
实例4:测量酯酶活性。
亚群3:酯酶(作用于酯键的酶)
某些酯酶实例包括核酸酶(RNase、DNase等)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。DNase I用作测量酯酶活性的实例。因为DNase I可在长度小至3个碱基的寡核苷酸上切割所有4种碱基,因此由商品卖方使用标准DNA合成技术制备长度约为30至40个碱基对且一个末端具有生物素基团的dsDNA。使生物素化的dsDNA结合于涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器上。然后,将传感器浸没于缓冲液(10mM Tris pH 7.5,2.5MgCl2,0.5nM CaCl2)中含DNase I的样品中,并监测光学层厚度降低。在底物与涂覆链霉抗生物素蛋白的传感器结合前,通过混合生物素标记的dsDNA与呈液相的DNase I来实施替代底物捕获格式。
实例5:测量转移酶活性。
转移酶是催化甲基、糖基或磷酸基转移到其他化合物的酶。不同于水解酶,转移酶可增加底物的分子大小,且其活性由BLI传感器检测为光学层厚度增加。
亚群1:核苷酸转移酶
核苷酸转移酶催化核苷酸到DNA或RNA聚合物中的纳入。图9作为一实例展示了测量DNA聚合酶I活性的格式。介于10至30个核苷酸的DNA模板可自商品卖方获得,其中生物素在任一末端核苷酸处纳入。DNA模板与寡核苷酸引物杂交,使得DNA聚合酶I沿5’至3’方向纳入核苷酸。在DNA聚合酶步骤之前或之后,生物素标记的DNA模板可结合于涂覆链霉抗生物素蛋白的传感器上。聚合酶步骤的条件(例如酶装载量、dNTP、缓冲液配方等)遵循已制定的方案。因为dNTP具有约400 D的分子量,因此少到1至2个核苷酸的纳入可被检测为光学厚度改变。
测量核苷酸转移酶活性的替代方法基于如图10中所示的半抗原纳入。使具有杂交引物的DNA模板与DNA聚合酶I及包括生物素化ATP的dNTP混合物混合。B-ATP由市售来源获得,因为其常用于缺口平移。在聚合酶步骤后,将涂覆链霉抗生物素蛋白的BLI传感器置于样品混合物中。视DNA的分子量而定,在结合链霉抗生物素蛋白后,分子量约为600 D的未纳入B-ATP产生相对较小的光学层增加,而纳入DNA模板中的B-ATP产生较大的光学层增加。
亚群2:磷酸转移酶
磷酸转移酶催化磷酸基团到含羟基化合物(通常为具有酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的肽)上的转移。有超过100种可与磷酸化氨基酸或包含磷酸化氨基酸的特定序列结合的市售单克隆抗体。许多使用针对磷酸化肽底物的抗体的激酶活性分析已有报道并可在商业上获得。图11阐述了使用抗磷酸化酪氨酸抗体的分析。该抗体首先通过标准方法加以生物素化然后结合于涂覆链霉抗生物素蛋白的传感器上。用酪氨酸激酶+ATP来培养底物(G1u4Tyr)n,其后将用抗磷酸化酪氨酸涂覆的传感器置于样品中。磷酸化肽的结合会带来光学层厚度的增加。
图12绘示使用针对特异性激酶的磷酸化氨基酸序列的抗体的分析。在此情况下,激酶为蛋白激酶C及针对磷酸化蛋白激酶C底物的市售抗体。图13展示激酶活化分析的例示性格式。在该实例中,分裂素活化蛋白激酶(MAPK)由另一酶(MEK1)的磷酸化而激活。结合于BLI传感器上的市售抗磷酸MAPK可检测MAPK的活化。
尽管已参照优选实施例及各替代实施例具体展示及阐述了本发明,但熟悉相关技术者应了解,可在形式及细节上对其进行各种改变,此并不背离本发明的精神及范围。
为了达成各种目的,本说明书主体中所引用的所有参考文献、颁发的专利案及专利申请案均以引用的方式全部并入本文中。
Claims (20)
1、一种分析酶活性的方法,其包括:
提供经由光纤偶联至光源的光学元件,所述光学元件包括(a)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(b)酶底物分子层,其经设置以使所述近侧反射表面的反射光束与所述远侧反射表面的反射光束之间的干涉随酶与所述底物的反应而改变,且其中所述反射光束偶联于所述光纤中;
使所述光学元件暴露于酶;以及
检测所述反射光束间的干涉改变,其中所述改变指示酶活性。
2、如权利要求1所述的方法,其中所述酶为水解酶或转移酶。
3、如权利要求2所述的方法,其中所述酶为蛋白酶、磷酸酶、糖基化酶或酯酶。
4、如权利要求2所述的方法,其中所述酶为核苷酸转移酶、糖基转移酶或磷酸转移酶。
5、如权利要求1所述的方法,其进一步包括提供经由第二纤维偶联至所述光源的第二光学元件,所述第二光学元件包括(c)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(d)酶结合分子层,其经设置以使所述第二光学元件近侧反射表面的第二反射光束与所述第二光学元件远侧反射表面的反射光束之间的干涉随所述酶与所述酶结合分子层的结合而改变,且其中所述第二反射光束偶联于所述纤维中;以及
检测所述第二反射光束间的干涉改变,其中所述改变指示酶量。
6、如权利要求5所述的方法,其中所述酶结合分子层包含抗酶抗体、抗酶抗体的片段或抗酶scFv分子。
7、一种分析酶活性的方法,其包括:
提供经由纤维偶联至光源的光学元件,所述光学元件包括(a)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(b)分析物结合分子层,其经设置以使所述近侧反射表面的反射光束与所述远侧反射表面的反射光束之间的干涉随酶底物或其一部分与所述分析物结合分子层的结合而改变,且其中所述反射光束偶联至所述纤维中;
使光学元件暴露于与酶反应的底物下,借此底物或底物的一部分结合于分析物结合分子层;以及
检测所述第一反射表面的光学厚度改变,其中所述改变指示酶活性。
8、如权利要求7所述的方法,其中所述酶为水解酶或转移酶。
9、如权利要求8所述的方法,其中所述酶为蛋白酶、磷酸酶、糖基化酶或酯酶。
10、如权利要求8所述的方法,其中所述酶为核苷酸转移酶、糖基转移酶或磷酸转移酶。
11、如权利要求7所述的方法,其进一步包括将半透膜置于所述光学元件与所述底物之间。
12、如权利要求7所述的方法,其中所述底物结合于载体上。
13、如权利要求7所述的方法,其进一步包括提供经由第二纤维偶联至所述光源的第二光学元件,所述第二光学元件包括(c)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(d)酶结合分子层,其经设置以使所述第二光学元件近侧反射表面的第二反射光束与所述第二光学元件远侧反射表面的反射光束之间的干涉随所述酶与所述酶结合分子层的结合而改变,且其中所述第二反射光束偶联于所述纤维中;以及
检测所述第二反射光束间的干涉改变,其中所述改变指示酶量。
14、如权利要求7所述的方法,其中所述分析物结合分子层包含抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、抗体、抗体片段、scFv或凝集素。
15、如权利要求13所述的方法,其中所述酶结合分子层包含抗酶抗体、抗酶抗体的片段或抗酶scFv分子。
16、如权利要求7所述的方法,其进一步包括在所述暴露步骤前使所述酶失活的步骤。
17、一种组件,其包含适于经由光纤偶联至光源的光学元件,所述光学元件包括(a)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(b)酶底物分子层,其经设置以使所述近侧反射表面的反射光束与所述远侧反射表面的反射光束之间的干涉随酶与所述底物的反应而改变。
18、一种组件,其包含适于经由光纤偶联至光源的光学元件,所述光学元件包括(a)相隔至少50nm的近侧反射表面及远侧反射表面,以及(b)分析物结合分子层,其经设置以使所述近侧反射表面的反射光束与所述远侧反射表面的反射光束之间的干涉随酶与所述底物的反应而改变。
19、一种套组,其包含适于偶联至生物层干涉仪的玻璃纤维、用底物层或分析物结合分子层衍生所述玻璃纤维的试剂及说明书。
20、如权利要求19所述的套组,其进一步包含用于光学激活所述玻璃纤维端的试剂及说明书。
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