CN113189052A - 一种酸性磷酸酶光纤生物传感器及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种酸性磷酸酶光纤生物传感器及制备方法与应用。一种酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，(1)将微纳光纤干涉仪浸泡在食人鱼溶液中，活化微纳光纤干涉仪表面的羟基；(2)将含有酸性磷酸酶底物的溶液和阳离子聚电解质溶液混合形成离子交联化合物悬浮液；(3)将表面带有活化羟基的微纳光纤干涉仪浸泡于悬浮液，在微纳光纤表面形成被酸性磷酸酶特异性水解的酸性磷酸酶敏感膜，得到酸性磷酸酶光纤生物传感器。本发明的光纤生物传感器，与传统的电化学传感器相比，具有抗电磁干扰、耐腐蚀性的优势，可以应用于酸性磷酸酶在体实时监测。该检测过程不仅对检测样品免标记，且同时具有简便、快速等优点。

Description

一种酸性磷酸酶光纤生物传感器及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种酸性磷酸酶光纤生物传感器及制备方法与应用。
背景技术
酸性磷酸酶是一种可以在酸性条件下水解磷酸酯分子，释放出游离磷酸基团的酶。在人体中，酸性磷酸酶由前列腺、肝脏、脾脏、骨髓等组织产生，广泛存在于各组织、细胞和体液中。人体内酸性磷酸酶通常以低浓度存在，然而，在某些疾病中，酸性磷酸酶合成发生了显著变化，其过高或过低的酶表达被视为病理过程的一部分。酸性磷酸酶水平异常可作为溶酶体酸性磷酸酶缺乏症，骨巨细胞瘤，溶血性贫血，儿童期发育障碍、高雪氏病、前列腺癌等疾病的指征。特别的，酸性磷酸酶已经被广泛用作前列腺癌的血清标志物，当人体出现前列腺癌时，酸性磷酸酶的浓度升高，且酸性磷酸酶的水平和前列腺癌的临床分期显著相关；另一方面，酸性磷酸酶还可以作为前列腺癌切除术后肿瘤复发以及前列腺癌特异性死亡的独立预测因子。因此实现对酸性磷酸酶的精确检测对于疾病的诊断、治疗和预后方面具有重要意义。
目前已有多种检测酸性磷酸酶的方法得到报道，主要包括电化学法、声表面波法、免疫测定法以及荧光分光光度法等。其中电化学法和表面声波法的灵敏度较低，检测极限最低仅为10-3U/ml，难以应用于微量生物样品的检测；而免疫测定法和荧光分光光度法虽然具有较低的检测极限(免疫测定法可达10-5U/ml，荧光分光光度法可达10-9U/ml)，但是依然存在操作过程复杂繁琐、检测成本高、离不开配套的昂贵大型仪器等缺点。因此，开发一种简便快速、价格低廉、灵敏度高的酸性磷酸酶检测方法具有重要作用。
近年来，已有许多基于微纳光纤干涉仪的光纤生物传感器得到报道。中国专利申请CN 110132896 A中将乳腺癌标志物(HER2)的抗体通过共价键作用固定到微纳光纤干涉仪表面，从而可以快速检测出血清中乳腺癌标志物的浓度。中国专利申请CN 109557051 A在微纳光纤干涉仪表面组装上氧化石墨烯spacer层和纳米硫化铜层共同构成界面层，再将探针DNA通过共价键作用固定于界面层的表面，实现了单分子微小RNA的识别和测量。上述发明的光纤生物传感器都是基于抗原-抗体结合、碱基互补配对等方式使目标被测物附着到光纤表面而使光纤周围环境的折射率增高，以此实现对被测物的检测。然而，除了目标被测物可以被特异性吸附到光纤表面外，部分干扰物也可以通过物理吸附、静电吸引、亲疏水相互作用等方式吸附到光纤表面而使光纤周围环境的折射率增高。因此在实际应用时往往很难判断是目标被测物还是干扰物造成的光纤周围环境折射率增高，可能造成“假阳性”诊断。因此，有必要开发一种新的检测策略，在充分利用光纤生物传感器灵敏度高、结构小巧、化学惰性、抗电磁干扰等优点的同时提高光纤生物传感器的特异性，以提升其用于疾病检测的可靠性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法。
本发明另一目的在于提供上述方法制备得到的一种酸性磷酸酶光纤生物传感器。
本发明再一目的在于提供上述酸性磷酸酶光纤生物传感器在检测酸性磷酸酶中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，
(1)将微纳光纤干涉仪浸泡在食人鱼溶液中，活化微纳光纤干涉仪表面的羟基；
(2)将含有酸性磷酸酶底物的溶液和阳离子聚电解质溶液混合形成离子交联化合物悬浮液；
(3)将表面带有活化羟基的微纳光纤干涉仪浸泡于悬浮液中，在微纳光纤表面形成被酸性磷酸酶特异性水解的酸性磷酸酶敏感膜；
(4)重复步骤(3)得到多层酸性磷酸酶敏感膜修饰的酸性磷酸酶光纤生物传感器。
步骤(1)所述微纳光纤干涉仪优选为通过下述方法制备：将光敏光纤两端与单模光纤熔接，然后拉制成微纳光纤。微纳光纤的过渡区和均匀区构成干涉仪；
步骤(1)中所述微纳光纤为5～10微米；
步骤(2)中所述酸性磷酸酶底物包括：对硝基苯磷酸盐(PNPP)，D-葡萄糖6-磷酸二钠盐(DG6P2Na)，D-葡萄糖-6-磷酸钠(DG6PNa)，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(AA2P)，植酸，偏磷酸钠以及聚磷酸盐中的至少一种；所述聚磷酸盐优选为六偏磷酸钠(HMP)三聚磷酸钠等中的至少一种；
步骤(2)中所述阳离子聚电解质包括天然阳离子聚电解质(例如壳聚糖)和/或合成阳离子聚电解质，所述天然阳离子聚电解质优选为壳聚糖，所述合成阳离子聚电解质优选为多聚赖氨酸(PLL)，聚醚酰亚胺(PEI)和聚二甲基丙基二甲基氯化铵(PDDA)等中的至少一种；
步骤(2)所述酸性磷酸酶底物和阳离子聚电解质的质量比为50:1～1:50；当所述酸性磷酸酶底物为三聚磷酸钠，所述阳离子聚电解质为壳聚糖时，质量比优选为1:1。阳离子聚电解质与酸性磷酸酶底物得到离子交联化合物通过非共价键的方式固定到微纳光纤干涉仪表面，形成可以被酸性磷酸酶特异性水解的酸性磷酸酶敏感膜。
步骤(3)所述的浸泡时间为5min～60min，优选为30min。
步骤(4)所述酸性磷酸酶敏感膜的层数为3～6层。
一种酸性磷酸酶光纤生物传感器，通过上述方法制备得到。
所述酸性磷酸酶光纤生物传感器在检测酸性磷酸酶中的应用。
一种检测酸性磷酸酶的方法，具体为：
将表面已修饰有酸性磷酸敏感膜的酸性磷酸酶光纤生物传感器浸入含有酸性磷酸酶的样品液中，并将光源输入到微纳光纤干涉仪中，在微纳光纤干涉仪表面上形成倏逝波，并激发干涉光谱，根据干涉峰的位置变化随时间的响应检测出样品液中酸性磷酸酶的浓度。
随着光纤表面上的酶敏感膜被酸性磷酸酶特异性裂解，酶敏感膜从光纤表面脱离，进而造成微纳光纤干涉仪表面折射率下降，表现为光谱干涉峰蓝移，通过波长解调可以实现对酸性磷酸酶的检测。
所述光源为波长1500nm-1600nm的宽带光源。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1.本发明将光敏光纤两端与单模光纤熔接后在火焰上拉制形成光纤传感探针，并将酸性磷酸酶敏感膜通过非共价键作用固定到光纤表面。当且仅当酶敏感膜被酸性磷酸酶作用而水解时，光纤表面折射率降低，使得光纤干涉谱中干涉峰位置发生变化，根据干涉峰的位置变化就可以检测出样品液中酸性磷酸酶的浓度。该检测过程不仅对检测样品免标记，且同时具有简便、快速等优点。
2.本发明与传统的酸性磷酸酶检测方法相比，拥有灵敏度高、器件小巧灵活的优点，且不需要大型、昂贵的仪器和复杂的提纯、浓缩、标记等操作。
3.本发明相对于其他光纤生物传感器，可以有效区分生物样品中其他成分所造成的干扰，具有更高的特异性。
4.本发明的光纤生物传感器，与传统的电化学传感器相比，具有抗电磁干扰、耐腐蚀性的优势，可以应用于酸性磷酸酶的在体实时监测。
5.本发明中提出的检测策略，理论上可以应用于其他水解酶的检测，是一种普遍适用的检测策略。
附图说明
图1为修饰有酶敏感膜的微纳光纤干涉仪。
图2为修饰有4层酶敏感膜的微纳光纤干涉仪SEM表征图。
图3为不同浓度酸性磷酸酶的输出光谱。
图4为干涉峰的波长漂移量随浓度变化图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
将光敏光纤两端与单模光纤熔接后，在火焰上熔融拉锥制成光纤干涉仪。经过测量得知均匀区直径为6微米，折射率灵敏度为2832nm/RIU.
实施例1
S1.将微纳光纤干涉仪浸入食人鱼溶液中60分钟，活化光纤表面羟基。其中食人鱼溶液制备方法如下：取7毫升浓硫酸于烧杯中，缓慢滴入3毫升双氧水，搅拌均匀。
S2.将10mg壳聚糖溶解于20毫升醋酸钠缓冲液(0.05M,pH 5.0)中，配成0.5mg/ml的壳聚糖溶液。同理将10mg三聚磷酸钠溶解于20毫升醋酸钠缓冲液(0.05M,PH 5.0)中，配成0.5mg/ml的三聚磷酸钠溶液。将0.5mg/ml的壳聚糖溶液和0.5mg/ml的三聚磷酸钠溶液按体积比1:1混合形成悬浮液。
S3.将表面带有活化羟基的微纳光纤干涉仪浸入步骤S2中的悬浮液里30分钟，在微纳光纤干涉仪表面修饰上一层壳聚糖-三聚磷酸钠离子交联化合物。
S4.重复步骤S3使微纳光纤干涉仪上修饰上4层酶敏感膜，制成可以用于酸性磷酸酶检测的光纤生物传感器。
如图1所示，一种用于酸性磷酸酶检测的光纤生物传感器，包括微纳光纤干涉仪1和酸性磷酸酶敏感膜2。微纳光纤干涉仪1由微纳光纤均匀区和其两端的过渡区组成。酸性磷酸酶敏感膜2由壳聚糖和三聚磷酸钠组成的离子交联化合物构成。
使用扫描电子显微镜对光纤生物生物传感器进行了形态学观察。可见壳聚糖-三聚磷酸钠离子交联化合物在光纤表面分布均匀(图2)。
应用实施例
将所制光纤生物传感器浸入含有酸性磷酸酶的样品液中。并将1500nm～1600nm的宽带光源输入到微纳光纤干涉仪中，使用AQ6370D型光谱仪实时记录光谱变化。实验过程为每隔40分钟测量一个浓度。
如图3所示为本发明的光纤传感器检测不同浓度酸性磷酸酶的输出光谱图。图4为干涉峰的波长漂移量随浓度变化图，在10-11～10-7U/ml范围内干涉峰波长漂移量和浓度的对数呈现线性关系，线性关系可以表示为：
△λ＝0.285+0.285Ig(c)
其中△λ为干涉峰波长漂移量，单位为nm；c为酸性磷酸酶的浓度，单位为U/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：
(1)将微纳光纤干涉仪浸泡在食人鱼溶液中，活化微纳光纤干涉仪表面的羟基；
(2)将含有酸性磷酸酶底物的溶液和阳离子聚电解质溶液混合形成离子交联化合物悬浮液；
(3)将表面带有活化羟基的微纳光纤干涉仪浸泡于悬浮液中，在微纳光纤表面形成被酸性磷酸酶特异性水解的酸性磷酸酶敏感膜；
(4)重复步骤(3)得到多层酸性磷酸酶敏感膜修饰的酸性磷酸酶光纤生物传感器。
2.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述酸性磷酸酶底物包括：对硝基苯磷酸盐，D-葡萄糖6-磷酸二钠盐，D-葡萄糖-6-磷酸钠，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，植酸，偏磷酸钠以及聚磷酸盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述阳离子聚电解质包括天然阳离子聚电解质和/或合成阳离子聚电解质。
4.根据权利要求3所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述天然阳离子聚电解质为壳聚糖；所述合成阳离子聚电解质为多聚赖氨酸，聚醚酰亚胺和聚二甲基丙基二甲基氯化铵中的至少一种。
5.根据权利要求1～4任一项所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述酸性磷酸酶底物和阳离子聚电解质的质量比为50：1～1：50。
6.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：当步骤(2)所述酸性磷酸酶底物为三聚磷酸钠，所述阳离子聚电解质为壳聚糖时，质量比为1:1。
7.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的浸泡时间为5min～60min；步骤(4)所述酸性磷酸酶敏感膜的层数为3～6层。
8.一种酸性磷酸酶光纤生物传感器，通过权利要求1～7任一项所述方法制备得到。
9.根据权利要求8所述酸性磷酸酶光纤生物传感器在检测酸性磷酸酶中的应用。
10.一种检测酸性磷酸酶的方法，其特征在于具体为：
将权利要求8所述的酸性磷酸酶光纤生物传感器浸入含有酸性磷酸酶的样品液中，并将光源输入到微纳光纤干涉仪中，在微纳光纤干涉仪表面上形成倏逝波，并激发干涉光谱，根据干涉峰的位置变化随时间的响应检测出样品液中酸性磷酸酶的浓度。
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