CN109790562A - 用于测试基于酶的电化学传感器的方法 - Google Patents

Abstract

用于测试用于定量检测水溶液中的分析物的基于酶的电化学传感器的方法，其中提供了具有工作电极（1）和对电极的电化学传感器，所述工作电极包括电导体（3）、与所述导体电连接并含有固定化酶的固态基质（4）和覆盖所述基质并将其与外部分开的膜（5），所述固定化酶能够将初级分析物催化转化为次级分析物，当在工作电极施加合适的电位时，该次级分析物可被氧化或还原。所述膜对于初级分析物是可渗透的，从而使得存在于与工作电极接触的水溶液中的初级分析物分子可以通过膜到达基质，在那里它们可以被催化转化成第二分析物分子。提供测量装置，其可操作地偶联到电化学传感器，从而提供电化学传感器的输出信号Z，例如，测量的信号电流；且所述电化学传感器适当地接触，例如，浸入包含一定浓度的初级分析物的测试溶液中。使所述电化学传感器经受一定温度T，其中这个温度在一定范围内扫描；测量不同温度值T的输出信号Z；确定作为温度T或温度倒数1/T的函数的输出信号Z的导数Z'；并且将在一定温度T或温度倒数1/T的相对导数Z'/Z确定为导数Z'和输出信号Z之间的比率。

Description

用于测试基于酶的电化学传感器的方法

发明领域

本发明涉及用于测试用于定量检测水溶液中的分析物的基于酶的电化学传感器的方法，特别是用于检测体液中的分析物的可植入传感器。

发明背景

可植入电化学传感器是用于连续体内监控体液（例如血液或组织液）中的生物分析物的有用工具。在一类这种传感器中，初级分析物在合适的酶催化的反应中连续反应，从而产生次级分析物，所述次级分析物然后用电流检测装置进行电化学检测。特别有用的是用于连续监控患有糖尿病的患者的组织液中的葡萄糖浓度的这种传感器。

其公开内容特此整体包括作为参考的US2009/0156920A1公开了一种有利的可植入葡萄糖传感器。所述传感器包括工作电极、参比电极和对电极。所有电极都布置在要放置在患者组织中的椭圆形传感器轴上。对电极和参比电极两者都可以作为Ag/AgCl电极实现。所有三个电极都被半透膜覆盖。

工作电极1的示意性横截面示于图1中，其包括由石墨和二氧化锰颗粒的不溶性基质和大量固定化葡糖氧化酶（GOx）酶组成的检测层4。工作电极、对电极和参比电极由半透性亲水化聚氨基甲酸酯膜5覆盖。该膜对于体液6电解质中存在的水、氧和较小离子是可渗透的，但对于电极上的葡糖氧化酶和其他潜在生理上有害的化合物是不渗透的。与体液6中的比例相比，膜5对初级分析物葡萄糖仅提供限制性透性，以降低工作电极表面处的葡萄糖浓度与氧浓度之间的比例。

在检测层4的表面4a处，葡糖氧化酶催化氧化还原反应，其中在第一步骤中，初级分析物葡萄糖被氧化成葡糖酸内酯，而在第二步骤中，氧被还原成次级分析物过氧化氢。在参数正确设置并且酶催化的反应为扩散限制的情况下，形成过氧化氢的速率与体液6中的葡萄糖浓度成比例。形成的过氧化氢被二氧化锰电化学氧化成氧，并因此被连续消耗。所得到的电子从二氧化锰转移到导电石墨颗粒，其形成与导电层3的电连接。

使用恒电位仪装置，测量工作电极和对电极之间所得到的电流，同时工作电极和参比电极之间的电位在预定值主动保持恒定。测量的信号电流形式的输出信号与连续形成过氧化氢的速率成比例，并因此也与体液中的葡萄糖浓度成比例。

其公开内容特此整体包括作为参考的WO2008/042625 A2、WO2010/028708 A1和WO2014/001382 A1公开了这种传感器的进一步的实施方案，包括使用的酶、电荷介体和膜的其他实例。

如上所述的葡萄糖传感器通常被这样配置以使它们是扩散控制的。这意味着所有有关的反应和过程，包括酶促催化的葡萄糖氧化，都比相关反应物（此处为葡萄糖）通过反应介质（此处基本上是半透膜5）向酶的反应位点转运的速率快得多。反应速率受最慢的决速步骤的速率限制，在给定的情况下，所述步骤是葡萄糖通过半透膜的扩散。传感器的所需行为可以通过提供充足的酶GOx，同时通过使用膜厚度和透性的适当组合将扩散速率设置在一定水平来实现。

诸如上述的葡萄糖传感器的医疗设备的故障可能对其用户的健康具有相当大的负面影响。测量的错误结果可能例如导致潜在有害的治疗决定，或者导致使用这种数据的其他医疗设备例如输注泵的不正确操作。高于真实值的测量的血糖浓度可以例如促使用户注射一定大剂量（bolus）的胰岛素，以避免高血糖情况。结合实际较低的真实血糖浓度，这种不必要地施用的胰岛素剂量可能导致危险的低血糖发作。另一方面，低于真实值的测量的血糖浓度将导致引起长期损害的高血糖状态。

因此，这种传感器的质量控制至关重要。这包括制造期间和制造后的质量控制，以及长期储存稳定性监控，以及在预期使用期间研究传感器的行为。要测试和监控的一个基本参数是催化初级分析物反应的活性酶的量，这是因为过低的酶量可能导致葡萄糖读数过低。

然而，正确扩散控制的传感器中的酶活性通常隐藏在速率决定性扩散过程后。

在一种已知的测试方法中，分离待检查的传感器的工作电极的检测层的酶，并测定酶的量。然而，由于酶分子包埋在被聚合物膜覆盖的二氧化锰和碳的干燥不溶性基质中，并且工作电极本身非常小，所以这种方法是困难的。此外，所发现的活性酶的量不必定与检测层表面上实际可及的活性酶的量相同。基质中的大多数酶分子不是分析物可及的，并因此对传感器的功能没有产生影响。因此，在大多数情况下，测量酶含量对于这类传感器来说是不合适的分析方法。

为了评估长期储存稳定性，观察传感器的开始反应控制的行为是常见的方法。复杂的生物化合物如酶在热力学上不如小分子稳定，特别是在水溶液中，但也在干燥状态中，并且不可避免地随着时间的过去变质。酶的这种固有的热力学不稳定性限制了所示传感器的储存期限。传感器中活性酶量的衰减率可以通过如下时间点来确定，在所述时间点处活性酶的量不再足以提供高于扩散速率的反应速率，并且传感器开始反应控制地而不是扩散控制地起作用。

为了减少总测试次数，传感器可以在升高的温度储存，这增加热变质率。然而，对于上述类型的传感器，这个方法的缺点是升高的温度也对膜的透性有影响。在这种条件下使用的亲水化聚氨基甲酸酯膜的透性的变化实际上超出了灵敏度随着储存时间的过去的变化，从而再次隐藏了降低的酶活性的影响。

为了在一定的储存时间后实际测试传感器的行为，通过观察灵敏度（测量的信号与给定分析物浓度之间的比率）随着时间的过去的降低（所谓的负偏移（negativedrift）），或者随着时间的过去作为分析物浓度的函数的测量的信号曲率的变化，在操作条件下评估酶活性的降低。这种功能性测试必须在几天期间完成。

如上文所解释的，利用已知方法，传感器行为从扩散控制到反应控制的变化仅可以在正常储存条件下的不同储存时间段之后整个服务时间段（周）期间以实时测量来观察。因此，酶活性测量目前非常耗时且资源要求高，并且可能提供有限精度的结果。

在交付制造的传感器批次之前传感器的功能性测试在制造后不久进行。在那时酶活性仍处于原始高水平，且膜透性未改变。在这种条件下，酶活性确实不便于测量。

因此，普遍需要改进用于上述类型的基于酶的电化学传感器的测试方法。

发明概述

本发明总的目的是提供用于测试基于酶的电化学传感器的有利方法。

这些和其他目的基本上通过根据独立权利要求的方法实现。进一步有利的实施方案是根据从属权利要求和说明书得出的。

本发明可包括所附权利要求中所述的一个或多个特征，和/或以下特征中的一个或多个及其组合。

在根据本发明的用于测试用于定量检测水溶液中的分析物的基于酶的电化学传感器的方法中，提供了具有工作电极和对电极的电化学传感器。所述工作电极包括电导体、与所述导体电连接并含有固定化酶的固态基质和覆盖所述基质并将其与外部分开的膜，所述固定化酶能够将初级分析物催化转化为次级分析物，当在工作电极施加合适的电位时，该次级分析物可被氧化或还原。所述膜对于初级分析物是可渗透的，从而使得存在于与工作电极接触的水溶液中的初级分析物分子可以通过膜到达基质，在那里它们可以被催化转化成第二分析物分子。提供测量装置，其可操作地偶联到电化学传感器，从而提供电化学传感器的输出信号Z，例如，测量的信号电流。电化学传感器适当地接触，例如，浸入包含一定浓度的初级分析物的测试溶液中。使电化学传感器经受一定温度T，其中这个温度在一定范围内扫描，并且测量不同温度值T的输出信号Z。确定作为温度T或温度倒数1/T的函数的输出信号Z的导数Z'；并且将在一定温度T或温度倒数1/T的相对导数Z'/Z确定为导数Z'和输出信号Z之间的比率。

在根据本发明的这种方法的有利变化形式中，在使用输出信号Z确定导数Z'之前，从输出信号Z减去补偿（offset）函数Z_补偿，例如恒定补偿。在特定的有利变化形式中，补偿函数Z_补偿在具有至少一个迭代轮次的迭代过程中确定，所述迭代过程包括使用一定的补偿函数获得的导数Z'和/或相对导数Z'/Z的评估，例如，导数和/或相对导数与一定的模型函数的偏差，以及基于所述导数和/或相对导数的评估来确定补偿函数中的变化。

在根据本发明的方法中，有利地，酶是葡糖氧化酶，初级分析物是D-葡萄糖，并且次级分析物是过氧化氢。

有利地，在根据本发明的方法中，温度逐步升高或降低。

在根据本发明的方法中，温度有利地在一定范围内扫描，例如，2℃-42℃。下限温度和上限温度的限制由进行测量所必需的操作条件给出。在水的冰点以下，测量是不可能的，并且在接近0℃的温度，水溶液的渐增粘度开始变得相关。在一定温度范围以上，酶开始变性，特别是在水性环境中。取决于装置，温度扫描也可以例如从0.5℃或1℃，或从更高的温度例如5℃或10℃开始。扫描上限可以定到较低的值，例如， 37℃或40℃，或扫描可能在45℃结束。

在根据本发明所讨论的方法的另一个有利变化形式中，所施加的温度用一定的补偿温度、频率和幅度调制，结果产生具有补偿和调制幅度的调制的输出信号；并且相对导数Z'/Z被确定为输出信号调制幅度和输出信号补偿的商。

在根据本发明所讨论的方法的进一步的有利变化形式中，将获得的相对导数Z'/Z值与给定的校准数据集进行比较，所述校准数据集对应于包含一定量活性酶的传感器。

在根据本发明所讨论的方法的另一有利变化形式中，基于所获得的相对导数Z'/Z值，将温度移动确定为拟合到相对导数Z'/Z数据的函数达到一定值之处的温度或温度倒数。在这种方法的特别有利的变化形式中，将确定的温度移动与对应于包含一定量活性酶的传感器的给定校准数据进行比较。

在根据本发明所讨论的方法的进一步的变化形式中，使待分析的传感器在进行测量之前经受一定的处理，例如，使传感器经受一定温度达一定的时间段；或使传感器经受操作条件达一定的时间段。

在根据本发明所讨论的方法的又一变化形式中，在对待分析的传感器进行测量之后，在进行另一次测量之前使所述传感器经受一定的处理，例如，使传感器经受一定温度达一定的时间段；或使传感器经受操作条件达一定的时间段。

在根据本发明所讨论的方法的又一变化形式中，使用具有不同性质的两种或更多种测试溶液进行测量，例如，不同的初级分析物浓度、不同的酶抑制剂性质和/或不同的pH值。

附图简述

为了便于理解本发明，现在参考附图。这些参考不应被解释为限制本发明，而意图是仅仅示例性的。

图1示意地显示了穿过如现有技术中已知的电化学葡萄糖传感器的工作电极的横截面。

图2示意地显示了用图1的传感器检测葡萄糖期间发生的过程。

图3示意地描绘了传感器灵敏度的相对导数的温度依赖性的模型函数。

图4显示了电化学葡萄糖传感器测量的实验结果，其中（a）信号电流I对温度T，（b）灵敏度S对温度T，和（c）灵敏度的相对导数（dS/dT）/S对温度T。

图5显示了电化学葡萄糖传感器测量的实验结果，其中（a）灵敏度S对温度倒数1/T，和（b）灵敏度的相对导数（dS/d（1/T））/S对温度倒数1/T。

图6显示了（a）对于具有不同葡萄糖浓度的两种测试溶液，实验测定的作为温度的函数的传感器的灵敏度S；和（b）灵敏度的相应相对导数（dS/dT）/S。

图7显示了（a）对于储存在不同条件下的两个传感器，实验测定的作为温度的函数的传感器的灵敏度S；和（b）灵敏度的相应相对导数（dS/dT）/S。

发明详述

所公开的用于测试基于酶的电化学传感器的方法基于观察传感器取决于温度的灵敏度，并对结果应用一定的分析步骤，以获得关于操作条件下酶活性的信息。

动力学模型

图2示意地显示了在葡萄糖检测期间在如图1所示的工作电极1处发生的不同动力学相关化学过程的数学模型。

传感器与分析物溶液6接触，所述分析物溶液6对于传感器的预期用途将是体液，例如组织液或血液，或者对于测试来说将是具有已知葡萄糖浓度c_Glc,1的相应生理溶液。葡萄糖分子以给定的速率常数k_d扩散穿过膜。葡萄糖从分析物溶液6到检测层4, 4a的总扩散速率于是与穿过膜5的葡萄糖的浓度梯度成比例，∆c_Glc,diff/∆t = k_d c_Glc,1 - k_d c_Glc,2 =k_d (c_Glc,1 - c_Glc,2)。

检测层的表面区域4a处的葡萄糖分子被葡糖氧化酶分子连续氧化，而分子氧被还原成过氧化氢。相应的反应机理和酶动力学是本领域技术人员已知的。过氧化氢（次级分析物）的总产生速率是酶、氧和葡萄糖（初级分析物）的局部浓度的函数。由于膜5对氧是高度可渗透的，但对葡萄糖仅以降低的速率可渗透，所以检测层的氧的局部浓度c_O2,2显著高于局部葡萄糖浓度c_Glc,2。选择检测层中的酶量，从而使得在正常操作条件下，活性区中酶的有效浓度c_enz也显著高于c_Glc,2。结果，过氧化氢产生的总速率基本上仅与葡萄糖的浓度成比例，∆c_H2O2,cat/∆t = - ∆c_Glc,cat/∆t= k_c c_Glc,2，而有效催化反应速率k_c是k_cat、c_O2,2、c_enz和c_Glc,2的函数。如上文所提及的，对于c_enz>> c_Glc,2，催化速率k_c将基本上与c_enz和c_Glc,2无关。另一方面，对于c_enz << c_Glc,2，k_c将与c_enz成比例。

产生的过氧化氢在电化学还原反应中连续消耗，并以氧化还原反应速率k_r氧化成氧。所得到的电子产生用恒电位仪装置测量的信号电流I。恒电位仪装置的工作电位远高于过氧化氢电化学氧化的能斯特电位进行设置。

信号电流与氧化的过氧化氢的比例成比例，并因此与过氧化氢浓度成比例，Iα∆c_H2O2,red/∆t = F(- k_rc_H2O2)。

在当∆c_H2O2,red/∆t + ∆c_H2O2,cat/∆t = 0和∆c_Glc,cat/∆t + ∆c_Glc,diff/∆t = 0时的稳态平衡中，结果是与分析物溶液中的初级分析物浓度c_Glc,1成比例的信号电流I：

。

B是系统特异性因子。对于各个传感器，以及在不同的生产批次中，它可能在一定范围内变化。传感器的灵敏度S定义为S = I/c_Glc,1，从而

。

在运行的传感器中，活性且可及的GOx酶的量以及关于葡萄糖透性的膜的性质将以k_c >> k_d的方式设置，这将灵敏度和动力学速率之间的关系简化为S B k_r k_d。因此，这种传感器基本上是扩散控制的。

在本发明方法中，灵敏度S的温度依赖性用于获得关于所涉及的动力学速率的信息，特别是关于有效催化反应速率的信息。有效催化反应速率包括关于实际酶活性的有价值的信息，如上文所进一步解释的，所述信息否则将不可获得，或者仅以高成本和在非常长的实验之后获得。

对本发明的方法来说，传感器的信号电流在2℃-42℃范围内的不同温度的操作条件下测量，在所述操作条件中水溶液中的基于酶的电化学传感器实际运行。然后基于信号电流和使用的葡萄糖浓度测定灵敏度。

扩散速率k_d、有效催化反应速率k_c和氧化还原反应速率k_r是温度依赖性的，在最简单的一般情况中，就扩散而论，其可以用阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程k_d(T)=k_d ⁰ exp(–A_d/T)来描述。尽管催化反应的动力学更复杂，但k_c(T)的温度依赖性仍然可以通过类似于阿伦尼乌斯方程的指数函数来描述。还可以预期k_r(T)显示出这种指数行为。

对于小的温度范围，温度依赖性另一方面可通过取决于温度T的指数函数来描述，如下文将解释的，而不是如在阿伦尼乌斯方程中的温度倒数1/T。

数据分析

在下文中，描述了用于分析所获得的测量数据的两种方法。

在第一种方法中，假定在2℃-42℃的操作范围之间的40K的相对较小的温度范围内，反应速率k_d和k_c的温度依赖性可以近似通过k_i(T) = k_i (T₀) p_i^[(T-T₀)/1K]来描述。

对于以下内容，假定对于如所述的传感器，p_d 1.03且p_c 1.07，而科学文献建议p_d 1.015-1.022的值。然而，如将显示的，所述值实际上对于评估酶活性不直接相关。利用估计的值，上面的方程对应于对于k_c为每摄氏度约7％且对于k_d为每摄氏度约3％的相应反应速率的增加。当然，在实践中，这种值将取决于一定的基于酶的电化学传感器系统的具体化学和构造。

因此灵敏度S(T) = B k_r(T) k_c(T) k_d(T)/[k_c(T) + k_d(T)]可近似为

，

而k_i0 = k_i(T₀)且x = (T-T₀)/1K。S(x)的导数S'(x) = dS(x)/dx则是

这可以分别简化为灵敏度的相对导数：

而对数函数sig(y) = e(y)/[1+exp(y)]，a = ln(k_c0/k_d0)，且b = ln(p_c/p_d)。

应当注意，灵敏度S的相对导数S'(T)/S与信号电流I（或任何其他相应的输出信号Z）的相应的相对导数I'(T)/I相同，这是因为S(T) = I(T)/c_Glc,1。因此，可以从测量的输出信号直接获得相对导数S'/S。在下文中，对灵敏度的相对导数S'/S的所有参考（referral）也包括相同的相对导数I'/I和Z'/Z。

对于小信号电流，由于小的剩余电流导致的Y轴补偿将对相对导数I'(T)/I具有比对于更大电流信号更大的扰动影响，在更大电流信号处这种影响是可忽略的。因此，有利地考虑这种剩余电流，以避免系统误差。

这种函数S'(T)/S在图3中示意性地描绘（黑线），参数p_r = 1.06；p_c = 1.07；p_d =1.03；k_r0 = 100（任意单位）；k_c0 = 10（任意单位）；且k_d0 = 5（任意单位）。该函数显示从低于T₁的反应控制的温度范围，其中温度依赖性基本上由催化反应控制，S B k_r k_c，转变到高于T₁的扩散控制的温度范围，其中温度依赖性基本上由葡萄糖的扩散过程控制，S Bk_r k_d。转变温度T₁由T₁ = T₀ – a/b= T₀ – ln(k_c0/k_d0)/ln(p_c/p_d)给出。应当注意，基础温度T₀本身实际上与数学模型无关，这是因为T₀的变化将通过k_c0 = k_c(T₀)和k_d0= k_d(T₀)的相应变化来补偿。

在转变温度T₁，函数S'(x)/S的陡度S''/S = (dS²/dx²)/S分别在x=0时为[(dS²/dx²)/S]_x=0 = – b²/4 = – [ln(p_c/p_d)]²/4，其提供了关于参数p_c和p_d的信息，即

。

如果传感器具有与标称值相比降低的总酶活性，则这将导致降低的有效催化反应速率常数k_c ^*< k_c。在酶的有效浓度不显著大于葡萄糖浓度的情况中，有效催化反应速率将开始显示对作为限制因子的可及和催化活性酶的量的线性依赖性。然而，催化反应的温度依赖性将不受影响，且因而p_c ^* = p_c。

在如上所述且示于图3的模型函数S'(T)/S中，降低的催化反应速率常数k_c ^*将导致转变温度朝向更高温度的移动，T₁ ^* = T₀ – ln(k_c0 ^*/k_d0)/ln(p_c/p_d)，而不进一步改变所述函数。这种移动的函数在图3中示出（虚线），而k_c0 ^*=1（任意单位）。

转变温度的移动可以提供关于k_c中相对变化的有用信息：

。

当k_c0 ^*/ k_c0 = k_c ^*/ k_c时，其得出ln(k_c ^*/k_c) = –∆T₁ ln(p_c/p_d)。如果现在可以测量基本上完整的函数S'(x)/S，则最大值和最小值之间的差将等于∆(S'/S) = ln(p_c/p_d)，从而得出

另一方面，在转变温度的陡度[S''/S]_x=0 = – [ln(p_c/p_d)]²/4可用于计算k_c的相对变化，

。

然而，如可在图3中看出的，对于给定的参数，S'(x)的S形函数相当宽，从而使得在基于酶的电化学传感器在其中运行的约40K的相对较小的窗口中（进一步参见上文），人们将只能使用这种函数的一小部分，这将不允许从[S''/S]_x=0或∆(S'/S)确定ln(p_c/p_d)。然而，对于这种情况也可以获得∆T₁。此外，很明显，在任何情况下，测定的陡度将等于或小于T₁处的陡度，[S''/S]_测量的 ≥ [S''/S]_x=0，其至少允许关于降低的反应速率的定性陈述：

k_c ^*/k_c ≤ exp(–2∆T₁ {–[S''/S]_测量的}^1/2) 。

可以从S'/S的最低和最高测量值获得类似的定性信息：

。

第二种方法：虽然上述用于数据分析的方法基于应用对反应速率常数的近似k_i(T) = k_i (T₀) p_i^[(T-T₀)/1K]的数学模型，但是基于更准确的阿伦尼乌斯方程k_i(T)=k_i ⁰exp(–A_i/T)的类似评估是可能的，其中k_i ⁰是T接近无穷大的最大反应速率。在第二种方法中，灵敏度的相对导数作为温度倒数T^-1而不是x = T – T₀的函数导出，

，

而对数函数sig(y) = e(y)/[1+exp(y)]，c = ln(k_c ⁰/k_d ⁰)，且d = (–A_c + A_d)。与第一系统模型类似，曲线S'(T^-1)/S的移动及其陡度可用于获得关于有效催化反应速率k_c ^0*/k_d ⁰中的相对变化的信息。

差别基本上仅仅是所使用的x轴（T或1/T）的这两种方法提供了类似的结果，这是因为函数1/T在使用的279-315 K的温度范围内近似线性，且反之亦然。虽然第一种方法在数据解释方面更直观，但基于阿伦尼乌斯方程的第二种方法实际上更准确。

实验结果

上述模型用于评估电化学传感器的应用示于图4中。对于如上文进一步描述的基于GOx的电化学葡萄糖传感器，在操作条件下在具有c_Glu = 480 mg/dl的葡萄糖浓度的叠氮化钠稳定的生理测试溶液（0.095w％叠氮化钠，约15μM）中测量了4℃（277.15 K）-42℃（315.15K）的不同温度的信号电流。

使用的葡萄糖浓度远高于健康个体的正常血糖值范围（72-140 mg/dl）。在较高葡萄糖浓度的测量允许增加信噪比，这对于在低温的低信号电流特别有利。此外，较高的葡萄糖浓度导致成比例地较高的葡萄糖通过膜的渗透率，并因此导致在检测层处较高的局部葡萄糖浓度，这降低了在检测层处活性酶浓度与局部葡萄糖浓度之间的差异，从而与生理葡萄糖浓度值相比，通过降低有效反应速率k_c放大了酶活性对灵敏度的影响。

对于实验，所制备的测量装置的温度从37℃升高到42℃，且然后以1K的增量逐步降低，从而保持每个步骤的温度恒定达12分钟。

已经对于六种不同的传感器进行了该实验：传感器S1A是未改变的新制造的传感器，其在开始温度扫描实验之前已于37℃在测试溶液中溶胀（swell）一天。传感器S2A等同于传感器S1A，但已经经受热处理，从而导致大部分酶模件变性，只留下20％的活性酶分子，如已通过检测层中剩余活性酶的含量的相应测量所证实的。与传感器S1A一样，在测量之前，它已于37℃在测试溶液中溶胀一天。对于传感器S3A，在制造过程期间施加到导电层的较后形成检测层的二氧化锰糊中的酶浓度已经降低到标称浓度的20％，从而得到类似于传感器S1A但仅具有其活性酶的20％的传感器。与传感器S1A一样，在温度扫描实验之前，它已于37℃在测试溶液中溶胀一天。传感器S2A和S3A用作应使用根据本发明的方法评估的具有降低的酶活性的传感器的严格定义的测试模型。

传感器S1B、S2B和S3B分别与传感器S1A、S2A和S3A相同。然而，已于37℃在测试溶液中溶胀一天之后，并且在进行温度扫描实验之前，所述传感器S1B、S2B、S3B已经经受了19天在37℃的连续操作条件。这意味着所述传感器在此时间段期间一直活跃地测量葡萄糖浓度，这等同于在植入患者的皮下组织中时建议的使用寿命期间已由患者使用的传感器。

在下文中，传感器S1A、S2A、S3A将被称为“未应变（unstrained）传感器”，而传感器S1B、S2B、S3B将被称为“应变（strained）传感器”。

可以预期，作为在操作条件下不可避免的正在进行的酶衰减结果的在19天使用时间段后酶活性的丧失对于传感器S2B、S3B将具有比对于传感器S1B更显著的影响，这是因为它们已经从显著降低的酶活性开始。

相对于温度T绘制的测量的信号电流I示于图4（a）中。为了基于第一种方法分析数据，基于测量的信号电流和测试溶液的已知葡萄糖浓度确定灵敏度S，如图4（b）中所示的。计算的相对陡度S'/S = (dS/dT)/S绘制在图4（c）中。

信号电流在温度扫描期间显著降低（在给定的实验数据中降低到约1/3-1/2.5）。与信号电流I的测量误差∆I成比例的灵敏度S的测量误差∆S对于较低温度将在相应的相对导数S'(T)/S中更显著，这是因为∆(S'/S) = (∆S/S)²。因此，对于6℃，（S'/S）中的信噪比是对于42℃的6.25-9倍。如可从图4（c）中看出的，对于传感器S2A和S3A以及传感器S2B和S3B的测量的值之间的差异（其应该基本上为零）对于较低温度而言比对于较高温度更大。

如人们可从图4（c）中看出的；与相应的未应变传感器S1A、S2A、S3A相比，一定的应变传感器S1B、S2B、S3B的曲线移动到更高的温度。基于上面进一步解释的函数模型，这对应于转变温度的正移动∆T₁。由于GOx酶在19天的运行使用时间段期间部分变质，这降低了有效催化反应速率k_c，所以将预期这种效果。虽然对于未应变传感器，总酶率从100％（S1A）降低到20％（S2A、S3A）的可见效果小，但对于应变传感器，效果变得清晰可见（S1B对S2B、S3B）。

如由该模型所预测的，在具有100％标称酶浓度的未应变传感器S1A和具有20％标称酶浓度且因此具有降低的有效催化反应速率k_c的未应变传感器S2A、S3A之间可以看到类似的效果。

令人惊讶的是，发现在具有标称酶含量的应变传感器S1B和具有20％标称酶含量的传感器S2B、S3B之间的转变温度移动效果比在未应变传感器S1A和未应变传感器S2A、S3A之间显著更大。不希望受任何理论束缚，申请人认为待测试的传感器（此处由S2A、3A/S2B、S3B代表）与代表标准的理想传感器（此处由S1A/S1B代表）之间的酶活性的任何差异通过在温度扫描实验之前使传感器应变而显著增加。基于图4（c）中的测量数据，似乎在19天使用时间段后标准传感器中酶活性的降低（S1A和S1B之间的转变温度移动的比较）显著大于80％（传感器S1A和S2A、S3A之间的转变温度移动的比较）。

应用于最初具有降低的酶活性的传感器的这个减缩系数（reduction factor）导致所涉及的减缩系数的放大。如果例如19天的使用时间段将传感器中活性酶的量减少至原始值的10％，这对于标准传感器将导致10％的剩余酶活性。对于最初酶含量仅为标称值的20％的传感器，例如，由于制造问题或由于长期储存，剩余的酶活性将是标称值的2％。

为了解释所获得的实验数据的可能的定量评估，在图4（c）中，传感器S1B的数据曲线和传感器S2B、S3B的数据曲线已经由具有相同陡度的两个线性函数（虚线）近似。两个线性函数的水平移动是∆T₁ 11K，而陡度是[S''/S]_测量的 –1.4 * 10^-3。使用上文进一步开发的公式，其得出p_c和p_d之间的比率的下限，即p_c/p_d ≥ exp[2(–[S''/S]_测量的)^1/2] ) 1.077，以及传感器S2B、S3B和传感器S1B的有效催化反应速率的比率的上限：

k_c,S2B,S3B/k_c,S1B ≤ exp(–2∆T₁ {–[S''/S]_测量的}^1/2) 0.44

使用用于计算最低和最高（S'/S）的线性近似，其得出差(S'/S)_max - (S'/S)_min 0.065，其再次提供了k_c,S2B,S3B/k_c,S1B ≤ exp[–∆T₁ {(S'/S)_max - (S'/S)_min}] 0.49的上限。

与第一种方法类似，灵敏度的相对导数可以基于第二种方法作为温度倒数T^-1而不是温度T的函数导出。相对于温度倒数1/T绘制的如图4（b）中所示的实验灵敏度数据示于图5（a）中，而图5（b）显示作为T^-1的函数的相对陡度(dS/d(T^-1))/S。

在本发明方法用于测试新制造的传感器的活性酶含量的应用中，给定制造批次的传感器样品将经受如上所述的处理，包括在测试溶液中的预备膨胀时间段，以及随后的在正常操作条件下恒定运行的时间段。操作条件时间段可以是19天，以模拟传感器的最大运行寿命，或更短，或甚至更长。在这个样品制备之后，将测量作为温度的函数的信号电流，并且将使用两种上述方法中的一种来分析灵敏度的相对导数。

为了提高数据准确度，可以选择较小的温度增量，从而在温度扫描期间提供更多的数据点。此外，为了增加信噪比，温度步骤期间的非常低的信号电流可以被电子积分（integrate），或者可以在数字信号处理器中平均。

只要温度变化足够慢以避免滞后效果，也可能应用连续温度扫描。

对于动力学效果，在扫描期间温度是升高还是降低是不相干的。

在又一种方法中，可以调制温度，T(t) = T₀ + ∆T sin(ωt)，从而得出调制的灵敏度S(t) = S₀ + ∆S sin(ωt)。对于小的温度调制幅度∆T，灵敏度调制幅度∆S将与导数dS/dT成比例，而灵敏度S₀由平均调制的灵敏度信号给出。如通过S'(T)/S = ∆S/S₀可直接获得对于给定温度T₀的灵敏度的相对导数。除了直接获得所需的导数之外，这个方法还具有降低信噪比的优点，信噪比通常随着增加信号频率而降低。此外，这种温度调制将允许在恒定温度连续测量灵敏度及其导数两者达更长的时间段。

为了评估测量结果，可以将所得到的S'/S曲线与对应于具有标称酶活性值的传感器的预定靶范围进行比较。如果使用具有已知降低的酶活性的传感器的校准测量是可用的（例如关于传感器S2A、S3A），则也可以定量评价测量的曲线S'/S，例如通过确定曲线的转变温度移动并在校准表中查寻相应的活性酶浓度。

在有利的变化形式中，温度扫描实验将在连续操作条件时间段期间的不同时刻进行一次以上。例如，可以每3天中断恒定操作模式，并且可以进行温度扫描实验。在实验之后，温度将回到正常操作条件，直到发生下一次温度扫描。这种方法允许监控S'/S曲线随着时间的过去的变化，其将提供额外的信息。

也可能在相对较短的范围内进行温度扫描，例如36-38℃，而不是在整个范围内进行温度扫描。虽然所得到的S'/S曲线对于确定曲线的水平（温度）移动来说通常将太短，但是其将可能分别确定对于给定温度的S'/S相对于标称值的垂直移动或增加，其与相应的校准表组合也将允许评估酶活性。因为在操作条件的大约生理温度的短范围内的温度扫描可以在比在整个范围内的扫描更短的时间内进行，所以这种方法对于在操作条件时间段期间的重复测量特别有用，如上文所描述的。

令人惊讶的是，申请人已经发现，使用叠氮化物稳定的生理葡萄糖测试溶液的测量导致比利用没有叠氮化物的相应葡萄糖测试溶液更高的灵敏度。例如，对于叠氮化物稳定的葡萄糖测试溶液（0.095 w％叠氮化钠，约15μM），如图4（b）中所用的，S1B传感器的灵敏度为6℃时的0.040-42℃时的0.126。对于没有叠氮化物且葡萄糖浓度为466 mg/dl的类似葡萄糖测试溶液，灵敏度为6℃时的0.008-42℃时的0.028（参见图6，溶液C2）。

虽然所得到的S'/S值对于两种溶液都在相同的范围内，如将预期的那样，但是提高的灵敏度（在上述例子中为约5倍）对S'/S的信噪比具有非常有利的影响。

不希望受任何具体理论束缚，申请人认为增加的灵敏度是由于叠氮化物离子的存在导致过氧化氢与二氧化锰的氧化还原反应的转换增加，或抑制减少可用于初级还原反应的过氧化氢的量的寄生过氧化氢还原途径的结果。这种反应可以是由GOx制造中使用的其他酶的杂质的酶促催化反应产生的结果。

葡萄糖浓度的变化

获得关于酶活性的信息的另一种方法是观察不同浓度葡萄糖的S'/S曲线的依赖性。如上文进一步解释的，对于活性酶浓度不比局部葡萄糖浓度高得多的情况，有效催化反应速率将取决于活性酶浓度，并因此取决于酶活性。对于给定的酶活性，葡萄糖浓度的变化可导致有效催化反应速率的变化，其可导致S'/S曲线的可观察到的变化。

图6示出了在预溶胀一天之后，对于具有不同葡萄糖浓度的两种测试溶液的未应变传感器S1A的灵敏度S和灵敏度的相对导数S'(T)/S，其作为温度的函数测量。

对于每种溶液，两个传感器的结果都已经平均。测试溶液不含叠氮化物。测试溶液C1：葡萄糖浓度233 mg/dl。测试溶液C2：葡萄糖浓度466 mg/dl。

如可从图6（a）中看出的，葡萄糖浓度从溶液C1到溶液C2的2倍增加导致灵敏度的增加。然而，单独考察灵敏度不允许获得更多信息。另一方面，图6（b）中的S'/S曲线显示了约2K的转变温度的正移动，如基于如上文使用的模型所可预期的那样。这个转变温度的移动是由降低的活性酶浓度与葡萄糖浓度之间的差引起的降低的有效催化反应速率的结果。

因此，显示葡萄糖浓度的变化可以提供关于有效催化反应速率并因而关于酶活性的有价值的额外信息。特别地，有效催化反应速率对葡萄糖浓度的依赖性允许区别酶活性变化的影响和扩散速率的影响，其也可能由于半透膜中的不可逆过程而改变。在下文中进一步地，将讨论扩散速率的降低及其对S'/S曲线的影响的实例（参见图7）。

有利地，对于覆盖宽范围的浓度值的超过两种不同浓度进行实验。

在简单的方法中，转变温度移动被确定为葡萄糖浓度的函数。另一方面，组合的S'/S曲线将提供描述温度轴和葡萄糖浓度轴上的面的数据集。这将允许对给定传感器的酶活性进行更精细的评估。

在有利的实验装置中，不同葡萄糖浓度之间的变化是自动化的。

如上文进一步描述的，可以使用小温度范围内的扫描而不是进行全温度扫描，和/或温度调制。

储存温度的影响

在较短时间段内模拟长储存时间段对一定的设备的影响的一种常见方法是将所述设备储存在升高的温度。

例如，如上文所讨论的具有正常酶浓度的基于GOx的电化学传感器可以在升高的温度例如45℃储存，以模拟在室温正常条件下较长储存时间段对传感器稳定性的影响，从而显著减少了这种测试所必需的时间量。同时，这种升高的温度时间段可用于评估运输稳定性，这是因为在运输期间环境温度可以升高到这种温度范围达几天。特别地，较高的储存温度将导致干燥状态中酶的加速热变质，并因而导致酶活性降低。

在图7中，在制造后于两个不同温度储存具有标称酶含量的相同生产批次的两个传感器。一个这种传感器储存在室温（数据集T1）。另一个相同的传感器在45℃储存3天（数据集T2），这是运输稳定性测试的典型配置。在预溶胀一天后，使用与图4相同的测试溶液测量作为温度的函数的灵敏度。

如在图7（a）中可看出的，储存在45℃的传感器显示的灵敏度约为在正常条件下储存的传感器灵敏度的一半。对于这种储存测试灵敏度降低是已知的，并且已知部分是由半透膜的热变质引起的，其导致葡萄糖的透性降低，并因而导致检测层处葡萄糖的局部浓度降低，这对于给定的葡萄糖浓度直接导致所得的信号电流的降低。同时，所述降低的局部葡萄糖浓度抵消了在升高的温度储存期间增加的酶变质的效果，并因此降低了酶浓度：酶浓度和葡萄糖浓度之间的相对差异大于膜透性未改变时将具有的相对差异，并且传感器灵敏度在线性范围内保持更久。

虽然传感器S1A的数据就图7（b）中的S'/S曲线而论是部分有噪声的，但可以看出两种储存条件都导致转变温度的正移动。然而，与正常储存条件相比，在升高的温度的储存实际上导致转变温度的更小正移动，而不是如可从与正常储存条件相比进一步降低的酶活性所预期的更大的正转变温度移动，并且与灵敏度数据本身相反。这种效果可以由数学模型来解释。假定有效催化反应速率k_c ^*降低（由于降低的酶活性），并且扩散速率k_d ^*也降低（由于变质的膜的降低的葡萄糖透性）的情况，转变温度移动可以计算为

。

因此，扩散速率的降低导致负转变温度移动，而有效催化反应速率的降低导致正转变温度移动。

在图7的两个传感器的情况中，传感器T2的转变温度低于传感器T1的转变温度，对应于负ΔT₁，这意味着扩散速率的比率k_d,T2/ k_d,T1小于有效催化反应速率的比率k_c,T2/k_c,T1。定性地说，较高的储存温度导致更占优势的膜变质的影响，其开始掩盖酶变性的影响。

然而，通过用具有不同葡萄糖浓度的测试溶液进行灵敏度测量，将可能区分所述两种影响，如上面用图6所解释的。因为有效催化反应速率随着增加的葡萄糖浓度而降低，而扩散速率将不受葡萄糖浓度的影响，只要粘度不变得太高，所以对于一系列渐增的葡萄糖浓度将发生正转变温度移动。使用合适的动力学模型，并将模型的输出拟合到测量的数据，然后将可能确定酶活性和膜特征两者。这将允许对于储存测试使用升高的温度，从而缩短长期稳定性测试所需的时间。

用于区分酶活性和扩散速率的影响的另一种方法包括在不同的储存时间段后测量S'/S曲线。例如，从一大组传感器开始，在一定的时间间隔内，一个或多个传感器将被取出，且灵敏度将作为温度的函数进行测量。所得到的S'/S曲线将允许确定作为储存时间段的函数的转变温度移动。另一方面，可以相对于温度轴和储存时间绘制S'/S数据。

另一方面或另外，可以改变对有效催化反应速率有影响的其他实验参数。例如，可以对不同的pH值获得灵敏度对温度的曲线。因为pH值对酶活性有影响，所以有效催化反应速率将取决于pH值。pH值的范围受到在这种条件下电极的稳定性的限制，特别是酶和半透膜的稳定性。GOx酶在4-7的pH范围内具有活性，最佳值为5.5。

另一种可能性是测量对于不同氧分压的灵敏度对温度曲线。耗尽实验装置的可用分子氧将降低有效催化反应速率，这是因为氧是葡萄糖的酶促氧化的共反应剂。

在调节酶活性从而获得关于影响灵敏度的两种影响的更多信息的进一步的方法中，可以使用具有不同量的酶抑制剂的测试溶液，以人为地降低酶的周转，并因此降低有效催化反应速率。对于GOx酶，作为抑制剂可以使用诸如Ag⁺、Hg²⁺和Cu²⁺离子的抑制剂，或乙酸苯汞（CAS No. 62-38-4）和（4-羧苯）氯汞（CAS 59-85-8）。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说根据前面的描述和附图将是显而易见的。因此，这种修改意图落入所附权利要求的范围内。另外，在整个说明书自始至终引用了各种参考文献，其公开内容均各自整体引入本文作为参考。

参考数字列表

1 工作电极

2 绝缘载体基底

3 导电层

4 检测层

4a 工作电极层的活性区

5 半透膜

6 分析物溶液，体液

Claims (13)

1.用于测试用于定量检测水溶液中的分析物的基于酶的电化学传感器的方法，其中

提供了具有工作电极（1）和对电极的电化学传感器，所述工作电极包括电导体（3）、与所述导体电连接并含有固定化酶的固态基质（4）和覆盖所述基质并将其与外部分开的膜（5），所述固定化酶能够将初级分析物催化转化为次级分析物，当在工作电极施加合适的电位时，该次级分析物可被氧化或还原，所述膜对于初级分析物是可渗透的，从而使得存在于与工作电极接触的水溶液中的初级分析物分子可以通过膜到达基质，在那里它们可以被催化转化成第二分析物分子；

提供测量装置，其可操作地偶联到电化学传感器，从而提供电化学传感器的输出信号Z，例如，测量的信号电流；且

所述电化学传感器适当地接触，例如，浸入包含一定浓度的初级分析物的测试溶液中；

其特征在于

使所述电化学传感器经受一定温度T，其中这个温度在一定范围内扫描；

测量不同温度值T的输出信号Z；

确定作为温度T或温度倒数1/T的函数的输出信号Z的导数Z'；并且

将在一定温度T或温度倒数1/T的相对导数Z'/Z确定为导数Z'和输出信号Z之间的比率。

2.根据权利要求1的方法，其中在使用输出信号Z确定导数Z'之前，从输出信号Z减去补偿函数Z_补偿，例如恒定补偿。

3.根据权利要求2的方法，其中所述补偿函数Z_补偿在具有至少一个迭代轮次的迭代过程中确定，所述迭代过程包括使用一定的补偿函数获得的导数Z'和/或相对导数Z'/Z的评估，例如，与一定的模型函数的偏差，以及基于所述导数和/或相对导数的评估来确定补偿函数中的变化。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述酶是葡糖氧化酶，所述初级分析物是D-葡萄糖，并且所述次级分析物是过氧化氢。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述温度逐步升高或降低。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述温度在一定范围内扫描，例如，2℃-42℃。

7.根据前述权利要求任一项的方法，其中

所述施加的温度用一定的补偿温度、频率和幅度调制，结果产生具有补偿和调制幅度的调制的输出信号；并且

相对导数Z'/Z被确定为输出信号调制幅度和输出信号补偿的商。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其中将获得的相对导数Z'/Z值与给定的校准数据集进行比较，所述校准数据集对应于包含一定量活性酶的传感器。

9.根据前述权利要求任一项的方法，其中基于所获得的相对导数Z'/Z值，将温度移动确定为拟合到相对导数Z'/Z数据的函数达到一定值之处的温度或温度倒数。

10.根据权利要求9的方法，其中将所述确定的温度移动与对应于包含一定量活性酶的传感器的给定校准数据进行比较。

11.根据前述权利要求任一项的方法，其中使待分析的传感器在进行测量之前经受一定的处理，例如，使传感器经受一定温度达一定的时间段；或使传感器经受操作条件达一定的时间段。

12.根据前述权利要求任一项的方法，其中在对待分析的传感器进行测量之后，在进行另一次测量之前使所述传感器经受一定的处理，例如，使传感器经受一定温度达一定的时间段；或使传感器经受操作条件达一定的时间段。

13.根据前述权利要求任一项的方法，其中使用具有不同性质的两种或更多种测试溶液进行所述测量，例如，不同的初级分析物浓度、不同的酶抑制剂性质和/或不同的pH值。