ES2856174T3 - Procedimientos para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas, en el que los sensores son sensores para la detección cuantitativa de analitos en soluciones acuosas, en el que se proporciona un sensor electroquímico con un electrodo de trabajo (1) y un contraelectrodo, comprendiendo el electrodo de trabajo un conductor eléctrico (3), una matriz de estado sólido (4) que está conectada eléctricamente con dicho conductor y que contiene una enzima inmovilizada que puede convertir catalíticamente un analito primario en un analito secundario que se puede oxidar o reducir cuando se aplica un potencial adecuado al electrodo de trabajo, y una membrana (5) que cubre dicha matriz y la separa del exterior, siendo dicha membrana permeable al analito primario, de modo que las moléculas de analito primario presentes en una solución acuosa con la que se pone en contacto el electrodo de trabajo pueden pasar a través de la membrana hasta la matriz, donde se pueden convertir catalíticamente en moléculas del segundo analito; se proporciona una configuración de medición, que está operativamente acoplada al sensor electroquímico, proporcionando una señal de salida Z, por ejemplo, una corriente de señal medida, del sensor electroquímico; y el sensor electroquímico se pone en contacto adecuadamente con, por ejemplo, se sumerge en, una solución de prueba que comprende una determinada concentración del analito primario; caracterizado por que el sensor electroquímico se somete a una determinada temperatura T, en el que se hace un barrido de esta temperatura dentro de un determinado intervalo; se mide una señal de salida Z para diferentes valores de temperatura T; se determina una derivada Z' de la señal de salida Z como una función de la temperatura T o la inversa de la temperatura 1/T; se determina una derivada relativa Z'/Z a una determinada temperatura T o inversa de temperatura 1/T, como la proporción entre la derivada Z' y la señal de salida Z; y en el que los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos se comparan con conjuntos de datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa, en el que un valor Z'/Z incrementado indica una constante de velocidad de reacción catalítica reducida y una actividad enzimática global reducida en comparación con el valor nominal.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas para la detección cuantitativa de analitos en soluciones acuosas, en particular sensores implantables para detectar analitos en líquidos corporales.

Antecedentes de la invención

Los sensores electroquímicos implantables son herramientas útiles para la monitorización continua in vivo de analitos biológicos en líquidos corporales, tales como sangre o líquido intersticial. En una clase de dichos sensores, un analito primario reacciona continuamente en una reacción catalizada por enzima adecuada, produciendo un analito secundario, que a continuación se detecta electroquímicamente con una configuración de detección amperométrica. Dichos sensores son en particular útiles para monitorizar continuamente la concentración de glucosa en el líquido intersticial de pacientes con diabetes mellitus.

El documento US 2009/0156920 A1, cuya divulgación se incluye en el presente documento como referencia en su totalidad, divulga un sensor de glucosa implantable ventajoso. El sensor comprende un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo. Todos los electrodos están dispuestos en un eje sensor oblongo, para colocarse en el tejido de un paciente. Tanto el contraelectrodo como el electrodo de referencia se pueden realizar como electrodos de Ag/AgCl. Los tres electrodos están cubiertos por una membrana semipermeable.

El electrodo de trabajo 1, cuya sección transversal esquemática se muestra en la figura 1, comprende una capa de detección 4 que consiste en una matriz insoluble de partículas de grafito y dióxido de manganeso y una cantidad abundante de enzima glucosa oxidasa (GOx) inmovilizada. El electrodo de trabajo, el contraelectrodo y el electrodo de referencia están cubiertos por una membrana de poliuretano hidrofilizado semipermeable 5. La membrana es permeable al agua, oxígeno e iones más pequeños presentes en el electrolito del líquido corporal 6, pero impermeable a la glucosa oxidasa y otros compuestos en los electrodos potencialmente dañinos fisiológicamente. La membrana 5 proporciona solo una permeabilidad restringida para la glucosa como analito primario, para disminuir la proporción entre la concentración de glucosa y la concentración de oxígeno en la superficie del electrodo de trabajo, en comparación con la proporción en el líquido corporal 6.

En la superficie 4a de la capa de detección 4, la glucosa oxidasa cataliza una reacción redox en la que, en una primera etapa, la glucosa como analito primario se oxida a gluconolactona, mientras que, en una segunda etapa, el oxígeno se reduce a peróxido de hidrógeno como analito secundario. Con los parámetros correctamente establecidos, y la reacción catalizada por enzima estando limitada por difusión, la velocidad de formación de peróxido de hidrógeno es proporcional a la concentración de glucosa en el líquido corporal 6. El peróxido de hidrógeno que se forma se oxida electroquímicamente a oxígeno mediante el dióxido de manganeso y, por tanto, se consume continuamente. Los electrones resultantes se transfieren del dióxido de manganeso a las partículas conductoras de grafito, que forman una conexión eléctrica a una capa conductora 3.

Usando una configuración de potenciostato, se mide la corriente resultante entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo, mientras que el potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia se mantiene activamente constante en un valor predefinido. La señal de salida en forma de corriente de señal medida es proporcional a la velocidad de formación continua de peróxido de hidrógeno y, por tanto, también a la concentración de glucosa en el líquido corporal.

Los documentos WO2008/042625 A2, WO 2010/028708 A1 y WO 2014/001382 A1 divulgan otros modos de realización de dichos sensores, incluyendo otros ejemplos de enzimas, mediadores de carga y membranas usados.

Jadán et al. (Food Anal. Methods 2016, 9, 2484-2490) divulgan un sensor enzimático que emplea lisina oxidasa con un sistema enzimático inmovilizado reticulando glutaraldehído usando una membrana de nailon ABC de inmunodina en combinación con un electrodo de oxígeno para determinar el contenido de lisina en jamón curado en seco y salchicha fermentada en seco a diferentes temperaturas y tiempos de curación.

El documento US 5250419 divulga un biosensor que comprende una membrana en la que se inmoviliza una enzima que cataliza la transformación de un sustrato usado en el metabolismo cutáneo, medios para detectar y medir un fenómeno provocado por dicha transformación que es representativo de la concentración del sustrato que se va a medir, poniendo en contacto dicho sustrato con la membrana enzimática, y una celda de medición cuya área de pared está formada por la membrana y que se puede cerrar, durante la medición, por un área de cobertura cutánea, combinándose la celda con medios para hacer circular en la misma un líquido para colocar en solución el sustrato que se va a medir.

Fortier et al. (Biosensors & Bioelectronics 1990, 5, 473-490) divulgan la fabricación de un biosensor de glucosa amperométrico mediante la polimerización electroquímica de pirrol en un electrodo de platino en presencia de la enzima glucosa oxidasa en una solución de KCI a un potencial de 65 V frente a SCE. La enzima queda atrapada en la película de polipirrol durante el proceso de electropolimerización.

Emregul et al. (J. Biomaterials Sc. Polymer Ed. 2012, 16, 505-519) divulgan la investigación de propiedades de un bionsensor de glucosa hecho mediante la inmovilización de glucosa oxidasa sobre gelatina en una capa de polianilina depositada electroquímicamente.

El documento AU 2015258264 A1 divulga el uso de un mediador reducido que se corrige mediante un factor de corrección aditivo que se determina como una función de la temperatura de la muestra y una medición que refleja la capacidad de transporte de oxígeno de la muestra. La capacidad de transporte de oxígeno medida también se puede usar para determinar el hematocrito y para distinguir entre muestras de sangre y soluciones de control aplicadas a una tira reactiva.

El documento WO 2006 109249 A2 divulga la corrección de la presencia de oxígeno o glóbulos rojos sanguíneos en una muestra aplicada a una tira reactiva electroquímica que hace uso de un mediador reducido mediante un factor de corrección aditivo que se determina como una función de la temperatura de la muestra y una medición que refleja la capacidad de transporte de oxígeno de la muestra.

El documento US 20090156920 A1 divulga un sensor implantable que se puede usar para determinar una concentración de al menos un analito en un medio, en particular, un tejido corporal y/o un líquido corporal. El sensor implantable tiene una construcción estratificada con al menos un sustrato de soporte aislante y al menos dos electrodos que están dispuestos en al menos dos planos de capa diferentes del sensor implantable y están eléctricamente aislados entre sí por al menos un sustrato de soporte aislante. Los electrodos tienen áreas de electrodos que miran hacia el medio cuando se ha implantado el sensor y están en contacto con el medio en un área grande y sustancialmente uniforme, directamente o por medio en general de una capa de membrana permeable al analito.

Los sensores de glucosa como se describen anteriormente se configuran en general de modo que se controlen por difusión. Esto significa que todas las reacciones y procesos involucrados, incluyendo la oxidación de glucosa catalizada enzimáticamente, son mucho más rápidos que la velocidad de transporte del reactivo relevante, aquí glucosa, al sitio de reacción en la enzima a través del medio de reacción, aquí esencialmente la membrana semipermeable 5. La velocidad de reacción está limitada por la velocidad de la etapa que determina la velocidad más lenta, que en el caso dado es la difusión de glucosa a través de la membrana semipermeable. El comportamiento requerido del sensor se puede lograr proporcionando la enzima GOx en abundancia, mientras que al mismo tiempo se establece la velocidad de difusión en un determinado nivel mediante el uso de una combinación adecuada de espesor y permeabilidad de membrana.

El mal funcionamiento de dispositivos médicos, tales como los sensores de glucosa descritos anteriormente, puede tener un impacto considerablemente negativo en la salud de sus usuarios. Los resultados erróneos de las mediciones pueden dar lugar, por ejemplo, a decisiones terapéuticas potencialmente dañinas o al funcionamiento incorrecto de otros dispositivos médicos que usan dichos datos, tales como, por ejemplo, bombas de infusión. Una concentración de glucosa en sangre medida que sea superior al valor real puede provocar, por ejemplo, que un usuario se inyecte un determinado bolo de insulina para evitar una situación hiperglucémica. En combinación con la concentración real de glucosa en sangre realmente más baja, esta dosis de insulina administrada innecesariamente puede dar lugar, a continuación, a un episodio hipoglucémico peligroso. Una concentración de glucosa en sangre medida que sea inferior al valor real, por otra parte, dará lugar a un estado hiperglucémico que causa daños a largo plazo.

Por lo tanto, el control de calidad de dichos sensores es de suma importancia. Esto incluye el control de calidad durante y después de la fabricación, así como la monitorización de la estabilidad del almacenamiento a largo plazo y el estudio del comportamiento de los sensores durante el uso previsto. Un parámetro esencial que se debe someter a prueba y monitorizar es la cantidad de enzima activa que cataliza la reacción del analito primario, ya que una cantidad demasiado baja de enzima puede dar lugar a lecturas de glucosa demasiado bajas.

Sin embargo, la actividad de la enzima en un sensor con control de difusión adecuado normalmente se oculta detrás del proceso de difusión que determina la velocidad.

En un procedimiento de prueba conocido, se aísla la enzima de la capa de detección del electrodo de trabajo de un sensor que se va a examinar y se determina la cantidad de enzima. Sin embargo, dado que las moléculas de enzima están incrustadas en una matriz seca e insoluble de dióxido de manganeso y carbono, cubierta por una membrana de polímero, y que el electrodo de trabajo como tal es muy pequeño, dicho proceso es difícil. Además, la cantidad encontrada de enzima activa no es necesariamente idéntica a la cantidad de enzima activa realmente accesible en la superficie de la capa de detección. La mayoría de las moléculas de enzima en la matriz no son accesibles por el analito y, por tanto, no contribuyen a la función del sensor. Por lo tanto, medir el contenido de enzima es, en la mayoría de los casos, un procedimiento analítico inadecuado para esta clase de sensores.

Para evaluar la estabilidad de almacenamiento a largo plazo, un enfoque común es observar un comportamiento inicial controlado por la reacción de un sensor. Los compuestos biológicos complejos, tal como las enzimas, son termodinámicamente menos estables que las moléculas pequeñas, en particular en soluciones acuosas, pero también en estado seco, e inevitablemente se deterioran con el tiempo. Esta inestabilidad termodinámica inherente de las enzimas restringe el tiempo de vida útil de los sensores mostrados. La velocidad de disminución de la cantidad de enzima activa en un sensor se puede determinar por el punto temporal en el que la cantidad de enzima activa ya no es suficiente para proporcionar una velocidad de reacción que sea mayor que la velocidad de difusión, y el sensor comienza a actuar de forma controlada por reacción en lugar de controlada por difusión.

Para reducir los tiempos de prueba globales, los sensores se pueden almacenar a temperaturas más altas, lo que incrementa la velocidad de deterioro térmico. Sin embargo, para la clase de sensores mencionada anteriormente, este enfoque tiene la desventaja de que el incremento de temperatura también tiene efectos sobre la permeabilidad de la membrana. Los cambios de permeabilidad de la membrana de poliuretano hidrofilizada usada en dichas condiciones dominan realmente el cambio de sensibilidad durante el tiempo de almacenamiento, ocultando nuevamente el efecto de una actividad enzimática reducida.

Para someter realmente a prueba el comportamiento de un sensor después de un determinado tiempo de almacenamiento, se evalúa la disminución de la actividad enzimática en condiciones de funcionamiento, observando la disminución de la sensibilidad (proporción entre la señal medida y la concentración de analito dada) a lo largo del tiempo (lo que se denomina deriva negativa) o el cambio en la curvatura de la señal medida en función de la concentración de analito a lo largo del tiempo. Dichas pruebas de funcionalidad se deben llevar a cabo durante varios días.

Como se explica anteriormente, con los procedimientos conocidos, un cambio del comportamiento del sensor de control de difusión a control de reacción solo se puede observar con mediciones en tiempo real durante el periodo de tiempo de servicio completo (semanas), después de diferentes periodos de tiempo de almacenamiento en condiciones normales de almacenamiento. Por tanto, las mediciones de la actividad enzimática actualmente requieren mucho tiempo y recursos, y pueden proporcionar resultados de precisión limitada.

Las pruebas de la funcionalidad de los sensores antes de liberar lotes de sensores fabricados se llevan a cabo poco después de la fabricación. En ese momento, la actividad enzimática se encuentra todavía en el nivel alto original y la permeabilidad de la membrana no ha cambiado. En dichas condiciones, la actividad enzimática no es de hecho accesible para realizar mediciones.

Por lo tanto, existe una necesidad general de mejorar los procedimientos de prueba para la clase mencionada anteriormente de sensores electroquímicos basados en enzimas.

Sumario de la invención

El objetivo global de la presente invención es proporcionar procedimientos ventajosos para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas.

Estos y otros objetivos se consiguen sustancialmente mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación independiente. Otros modos de realización ventajosos se derivan de las reivindicaciones dependientes y de la descripción.

La presente invención puede comprender uno o más de los rasgos característicos enumerados en las reivindicaciones adjuntas y/o uno o más de los siguientes rasgos característicos y combinaciones de los mismos.

En un procedimiento de acuerdo con la invención para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas para la detección cuantitativa de analitos en soluciones acuosas, se proporciona un sensor electroquímico con un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. El electrodo de trabajo comprende un conductor eléctrico, una matriz de estado sólido que está conectada eléctricamente con dicho conductor y que contiene una enzima inmovilizada que puede convertir catalíticamente un analito primario en un analito secundario que se puede oxidar o reducir cuando se aplica un potencial adecuado al electrodo de trabajo, y una membrana que cubre dicha matriz y la separa del exterior. Dicha membrana es permeable al analito primario, de modo que las moléculas de analito primario presentes en una solución acuosa con la que se pone en contacto el electrodo de trabajo pueden pasar a través de la membrana hasta la matriz, donde se pueden convertir catalíticamente en moléculas del segundo analito. Se proporciona una configuración de medición, que está operativamente acoplada al sensor electroquímico, proporcionando una señal de salida Z, por ejemplo, una corriente de señal medida, del sensor electroquímico. El sensor electroquímico se pone en contacto adecuadamente con, por ejemplo, se sumerge en, una solución de prueba que comprende una determinada concentración del analito primario. El sensor electroquímico se somete a una determinada temperatura T, en el que se hace un barrido de esta temperatura dentro de un determinado intervalo, y se mide una señal de salida Z para diferentes valores de temperatura T. Se determina una derivada Z' de la señal de salida Z como una función de la temperatura T o la inversa de la temperatura 1/T; y se determina una derivada relativa Z'/Z a una determinada temperatura T o inversa de temperatura 1/T, como la proporción entre la derivada Z' y la señal de salida Z. Los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos se comparan con conjuntos de datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa, en los que un valor de Z'/Z incrementado indica una constante de velocidad de reacción catalítica reducida y una actividad enzimática global reducida en comparación con el valor nominal.

En una variante ventajosa de dicho procedimiento de acuerdo con la invención, una función de desviación Zdesviación, por ejemplo una desviación constante, se resta de la señal de salida Z antes de usar la señal de salida Z para determinar la derivada Z'. En una variante particularmente ventajosa, la función de desviación Zdesviación se determina en un proceso iterativo con al menos una ronda de iteración, comprendiendo dicho proceso iterativo la evaluación de una derivada Z' y/o una derivada relativa Z'/Z obtenidas usando una determinada función de desviación, por ejemplo, la desviación de la derivada y/o la derivada relativa con respecto a una determinada función modelo, y la determinación de cambios en la función de desviación en base a dicha evaluación de la derivada y/o de la derivada relativa.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, de forma ventajosa la enzima es glucosa oxidasa, el analito primario es D-glucosa y el analito secundario es peróxido de hidrógeno.

De forma ventajosa, en un procedimiento de acuerdo con la invención, la temperatura se incrementa o disminuye gradualmente.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, se hace un barrido de la temperatura de forma ventajosa en un determinado intervalo, por ejemplo, entre 2 °C y 42 °C. Los límites de temperatura inferior y superior vienen dados por las condiciones operativas necesarias para llevar a cabo las mediciones. No es posible realizar mediciones por debajo del punto de congelación del agua y, a temperaturas cercanas a los 0 °C, la viscosidad creciente de las soluciones acuosas comienza a ser relevante. Por encima de un determinado intervalo de temperatura, las enzimas comienzan a desnaturalizarse, en particular en un ambiente acuoso. Dependiendo de la configuración, un barrido de temperatura también puede comenzar, por ejemplo, a 0,5 °C o 1 °C o a temperaturas más altas, por ejemplo, 5 °C o 10 °C. El límite superior de barrido se puede establecer en un valor menor, por ejemplo, 37 °C o 40 °C, o el barrido puede terminar a 45 °C.

En otra variante ventajosa de los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, la temperatura aplicada se modula con una determinada desviación de temperatura, frecuencia y amplitud, dando como resultado una señal de salida modulada con una amplitud de modulación y desviación; y la derivada relativa Z'/Z se determina como el cociente de la amplitud de modulación de la señal de salida y la desviación de la señal de salida.

En los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos se comparan con conjuntos de datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa.

En otra variante ventajosa de los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, en base a los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos, se determina un desplazamiento de temperatura como la temperatura o la inversa de la temperatura a la que una función ajustada a los datos de derivada relativa Z'/Z alcanza un determinado valor. En una variante en particular ventajosa de dicho procedimiento, el desplazamiento de temperatura determinado se compara con datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa.

En otra variante de los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, el sensor que se va a analizar se somete a un determinado tratamiento antes de llevar a cabo la medición, por ejemplo, sometiendo el sensor a una determinada temperatura durante un determinado periodo de tiempo; o sometiendo el sensor a condiciones operativas durante un determinado periodo de tiempo.

En aún otra variante de los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, después de llevar a cabo la medición en el sensor que se va a analizar, dicho sensor se somete a un determinado tratamiento antes de llevar a cabo otra medición, por ejemplo, sometiendo el sensor a una determinada temperatura durante un determinado periodo de tiempo; o sometiendo el sensor a condiciones operativas durante un determinado periodo de tiempo.

En aún otra variante de los procedimientos analizados de acuerdo con la invención, la medición se lleva a cabo con dos o más soluciones de prueba que tienen diferentes propiedades, por ejemplo, diferentes concentraciones del analito primario, diferentes propiedades de los agentes inhibidores de enzimas y/o diferentes valores de pH.

Breve descripción de los dibujos

Para facilitar la comprensión de la presente invención, se hace ahora referencia a los dibujos adjuntos. Estas referencias no se deben interpretar como limitantes de la presente invención, sino que se pretende que sean únicamente a modo de ejemplo.

Figura 1 muestra esquemáticamente una sección transversal a través de un electrodo de trabajo de un sensor de glucosa electroquímico como es conocido por la técnica anterior.

Figura 2 muestra esquemáticamente los procesos que tienen lugar durante la detección de glucosa con el sensor de la figura 1.

Figura 3 representa esquemáticamente una función modelo para la dependencia de temperatura de la derivada relativa de la sensibilidad del sensor.

Figura 4 muestra resultados experimentales de mediciones de sensores de glucosa electroquímicos, con (a) la corriente de señal I frente a temperatura T, (b) la sensibilidad S frente a temperatura T, y (c) la derivada relativa (dS/dT)/S de la sensibilidad frente a temperatura T.

Figura 5 muestra resultados experimentales de mediciones de sensores de glucosa electroquímicos, con (a) la sensibilidad S frente a la inversa de la temperatura 1/T, y (b) la derivada relativa (dS/d(1/T))/S de la sensibilidad frente a inversa de la temperatura 1/T.

Figura 6 muestra (a) la sensibilidad S de un sensor determinada experimentalmente, como una función de la temperatura, para dos soluciones de prueba con diferentes concentraciones de glucosa; y (b) la derivada relativa correspondiente (dS/dT)/S de la sensibilidad.

Figura 7 muestra (a) la sensibilidad S de un sensor determinada experimentalmente, como una función de la temperatura, para dos sensores almacenados en diferentes condiciones; y (b) la derivada relativa correspondiente (dS/dT)/S de la sensibilidad.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento divulgado para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas se basa en observar la sensibilidad de un sensor dependiendo de la temperatura, y aplicar determinadas etapas analíticas a los resultados, para obtener información sobre la actividad enzimática en condiciones operativas.

Modelo cinético

La figura 2 muestra esquemáticamente un modelo matemático de los diferentes procesos químicos cinéticamente relevantes que tienen lugar en un electrodo de trabajo 1 como se muestra en la figura 1, durante la detección de glucosa.

El sensor está en contacto con una solución de analito 6 que, para el uso previsto del sensor, será un líquido corporal tal como líquido intersticial o sangre, o, para propósitos de prueba, una solución fisiológica correspondiente con una concentración de glucosa cGlc^,1 conocida. Las moléculas de glucosa difunden a través de la membrana con una constante de velocidad kd dada. La velocidad global de difusión de glucosa desde la solución de analito 6 a la capa de detección 4, 4a es entonces proporcional al gradiente de concentración de glucosa a través de la membrana 5, AcGlc,dif/At = kd cGlc,1 - kd cGlc,2 = kd (cGlc,1 - cGlc,2).

Las moléculas de glucosa en el área superficial 4a de la capa de detección se oxidan continuamente por moléculas de glucosa oxidasa, mientras que el oxígeno molecular se reduce a peróxido de hidrógeno. El mecanismo de reacción y la cinética enzimática correspondientes son conocidos para los expertos en la técnica. La velocidad global de producción de peróxido de hidrógeno (el analito secundario) es una función de las concentraciones locales de enzima, oxígeno y glucosa (el analito primario). Dado que la membrana 5 es altamente permeable al oxígeno, pero solo es permeable a la glucosa a una velocidad reducida, la concentración local de oxígeno co^2,2 en la capa de detección es considerablemente más alta que la concentración local de glucosa cgic^,2. La cantidad de enzima en la capa de detección se elige de modo que, en condiciones de funcionamiento normales, la concentración eficaz de enzima cenz en el área activa sea también considerablemente más alta que cgic^,2. Como resultado, la velocidad global de producción de peróxido de hidrógeno es esencialmente proporcional solo a la concentración de glucosa, AcH²⁰²,cat/At = -AcGic,cat/At = kc cgic^,2, con la velocidad de reacción catalítica eficaz kc siendo una función de kcat, co^2,2, cenz y cgic^,2. Como se menciona anteriormente, para cenz >> cgic^,2, la velocidad catalítica kc será esencialmente independiente de cenz y cgic^,2. Para cenz << cgic^,2, por otra parte, kc será proporcional a cenz.

El peróxido de hidrógeno producido se consume continuamente en la reacción de reducción electroquímica y se oxida a oxígeno a una velocidad de reacción redox kr. Los electrones resultantes dan lugar a una corriente de señal I que se mide con una configuración de potenciostato. El potencial de trabajo de la configuración de potenciostato se establece muy por encima del potencial de Nernst para la oxidación electroquímica del peróxido de hidrógeno.

La corriente de señal es proporcional a la velocidad del peróxido de hidrógeno oxidado y, por tanto, a la concentración de peróxido de hidrógeno, I a AcH²⁰²,red/At = F (-kr ch²⁰²).

En un equilibrio de estado estacionario con AcH²⁰²,red/At AcH²⁰²,cat/At = 0 y AcGic,cat/At AcGic,dif/At = 0, el resultado es una corriente de señal I que es proporcional a la concentración de analito primario en la solución de analito c^gic,ⁱ : I = B kr kc cGlc,2 = B kr [kc kd / (kc kd)] cGlc,1

B es un factor específico del sistema que puede variar dentro de un determinado intervalo para sensores individuales y entre distintos lotes de producción. La sensibilidad S de un sensor se define como S = I/cgic^,1, de modo que S = B kr kc kd / (kc kd).

En un sensor operativo, la cantidad de enzima GOx activa y accesible y las propiedades de la membrana con respecto a la permeabilidad a la glucosa se establecerán de tal manera que kc >> kd, lo que simplifica la relación entre la sensibilidad y las velocidades cinéticas a S = B kr kd. Por tanto, dicho sensor está esencialmente controlado por difusión.

En el procedimiento según la invención, la dependencia de temperatura de la sensibilidad S se usa para obtener información sobre las velocidades cinéticas implicadas, en particular sobre la velocidad de reacción catalítica eficaz. La velocidad de reacción catalítica eficaz comprende información valiosa sobre la actividad enzimática real que, de otro modo, como se explica adicionalmente anteriormente, no sería accesible o lo sería solo a altos costes y después de experimentos muy largos.

Para el propósito del procedimiento según la invención, la corriente de señal de un sensor se mide en condiciones operativas para diferentes temperaturas, en el intervalo entre 2 °C y 42 °C, en el que los sensores electroquímicos basados en enzimas en soluciones acuosas están realmente operativos. A continuación, la sensibilidad se determina en base a la corriente de señal y la concentración de glucosa usada.

La velocidad de difusión kd, la velocidad de reacción catalítica eficaz kc y la velocidad de reacción redox kr dependen de la temperatura, que en el caso general más simple, como para la difusión, se puede describir mediante una ecuación de Arrhenius kd(T) = kd0 exp(-Ad/T). Aunque la cinética es más complicada para la reacción catalítica, la dependencia de temperatura de kc(T) se puede, no obstante, describir mediante una función exponencial similar a una ecuación de Arrhenius. También se puede esperar que kr(T) muestre dicho comportamiento exponencial.

Para intervalos de temperatura pequeños, la dependencia de la temperatura se puede describir de forma alternativa mediante una función exponencial que depende de la temperatura T, como se explicará a continuación, en lugar de depender de la inversa de la temperatura 1/T como en la ecuación de Arrhenius.

Análisis de los datos

A continuación se describen dos enfoques para analizar los datos de medición obtenidos.

En un primer enfoque, se asume que en el intervalo de temperatura comparativamente pequeño de 40 K entre el intervalo operativo entre 2 °C y 42 °C, la dependencia de la temperatura de las velocidades de reacción kd y kc se puede describir por aproximación mediante

ki(T) = ki (T0) p¡A[(T-Tci)/1 K].

Para lo siguiente, se asume que, para un sensor como se describe, pd = 1,03 y pc = 1,07, mientras que la literatura científica sugiere valores de pd = 1,015-1,022. Sin embargo, como se mostrará, dichos valores en realidad no son directamente relevantes para evaluar la actividad enzimática. Con los valores estimados, la ecuación anterior corresponde a un incremento de la velocidad de reacción correspondiente de aproximadamente un 7 % por grado Celsius para kc y aproximadamente un 3 % por grado Celsius para kd. Por supuesto, en la práctica, dichos valores dependerán de la química y la construcción específicas de un determinado sistema de sensor electroquímico basado en enzimas.

Por tanto, la sensibilidad S(T) = B kr(T) kc(T) kd(T)/[kc(T) kd(T)] se puede aproximar mediante

S(x) = B kr0 prx kc0 pcx kd0 pdx / [kc0 pcx kd0 pdx],

con ki⁰ = ki(T⁰) y x = (T-T0)/1 K. La derivada S'(x) = dS(x)/dx de S(x) es entonces

S'(x) = S {ln(pr pc pd) - ln(pc) [1 (kd/kc)]-1 - ln(pd) [1 (kc/kd)]-1}

Esto se puede simplificar a una derivada relativa de la sensibilidad:

S'(x)/S = ln(pr pc pd) - ln(pc) [1 exp{ln(kd⁰/kc⁰) ln(pd/pc) x}]-1 - ln(pd) [1 exp{ln(kc⁰/kd⁰) ln(pc/pd) x}]-1

= ln(pr) ln(pc) sig(-a - b x) ln(pd) sig(a b x),

= ln(pr pc) - ln(pc/pd) sig(a b x),

respectivamente

S'(T)/S = ln(pr pc) - b sig(a b [T-T⁰]),

con la función logística sig(y) = e(y)/[1 exp(y)], a = ln(kc⁰/kd⁰), y b = ln(pc/pd).

Cabe destacar que la derivada relativa S'(T)/S de la sensibilidad S es idéntica a una derivada relativa l'(T)/I correspondiente de la corriente de señal I (o cualquier otra señal de salida Z correspondiente), ya que S(T) = I(T)/cgic^,1. Por tanto, la derivada relativa S'/S se puede obtener directamente de la señal de salida medida. A continuación, todas las referencias a la derivada relativa S'/S de la sensibilidad engloban también las derivadas relativas l'/l y Z'/Z idénticas. Para corrientes de señal pequeñas, una desviación en el eje Y debido a corrientes residuales pequeñas tendrá una influencia perturbadora mayor en la derivada relativa l'(T)/l que para señales de corriente más grandes, donde dicha influencia es insignificante. Por tanto, de forma ventajosa se tienen en cuenta dichas corrientes residuales para evitar errores sistemáticos.

Dicha función S'(T)/S se representa esquemáticamente en la figura 3 (línea negra), con parámetros pr = 1,06; pc = 1,07; pd = 1,03; kr⁰ = 100 (unidades arbitrarias); kc⁰ = 10 (unidades arbitrarias); y kd⁰ = 5 (unidades arbitrarias). La función muestra la transición desde el intervalo de temperatura controlada por reacción por debajo de T¹, donde la dependencia de la temperatura se rige esencialmente por la reacción catalítica, S = B kr kc, hasta el intervalo de temperatura controlada por difusión por encima de T¹, donde la dependencia de la temperatura se rige esencialmente por el proceso de difusión de glucosa, S = B kr kd. La temperatura de transición T¹ viene dada por

T¹ = T⁰ - a/b = T⁰ - ln(kc⁰/kd⁰)/ln(pc/pd)

Cabe destacar que la temperatura básica T⁰ como tal es realmente irrelevante para el modelo matemático, ya que un cambio de T⁰ será compensado por el cambio correspondiente de kc⁰ = kc(T⁰) y kd⁰ = kd(T⁰).

El gradiente S"/S = (dS2/dx2)/S de la función S'(x)/S a la temperatura de transición T¹, respectivamente en x = 0, es [(dS2/dx2)/S]x⁼⁰ = -b2/4 = -[ln(pc/pd)]2/4, que proporcionó información sobre los parámetros pc y pd, a saber, pc/pd = exp[2(-[(dS2/dx2)/S]x=0)1/2].

Si un sensor tiene una actividad enzimática global que se reduce en comparación con el valor nominal, esto dará lugar a una constante de velocidad de reacción catalítica eficaz reducida kc* < kc. En una situación en la que la concentración eficaz de enzima no sea considerablemente mayor que la concentración de glucosa, la velocidad de reacción catalítica eficaz comenzará a mostrar una dependencia lineal de la cantidad de enzima accesible y catalíticamente activa como el factor limitante. Sin embargo, la dependencia de la temperatura de la reacción catalítica no se verá influenciada y, por tanto, pc* = pc.

En la función modelo S'(T)/S como se describe anteriormente y se muestra en la figura 3, una constante de velocidad de reacción catalítica reducida kc* dará lugar a un desplazamiento de la temperatura de transición hacia temperaturas más altas, T¹* = T⁰ - ln(kc⁰*/kd⁰)/ln(pc/pd), sin cambiar más la función. Dicha función desplazada se muestra en la figura 3 (línea discontinua), con kc⁰* = 1 (unidades arbitrarias).

El desplazamiento de la temperatura de transición puede proporcionar información útil sobre el cambio relativo en kc: AT¹ = T¹* - T¹ = -ln(kc⁰*/kd⁰)/ln(pc/pd) ln(kc⁰/kd⁰)/ln(pc/pd)

= -ln(kc⁰*/kc⁰)/ln(pc/pd).

Con kc⁰*/kc⁰ = kc*/kc, da como resultado ln(kc*/kc) = -AT¹ ln(pc/pd). Si ahora se pudiera medir una función S'(x)/S esencialmente completa, la diferencia entre el valor máximo y el valor mínimo sería igual a A(SVS) = ln(pc/pd), dando como resultado

kc*/kc = exp[-AT ¹ A(S'/S)]

De forma alternativa, el gradiente a la temperatura de transición, [S"/S]x⁼⁰ = -[ln(pc/pd)]2/4, se puede usar para calcular el cambio relativo de kc,

kc*/kc = exp(-2AT ¹ {-[S"/S]x⁼⁰}1/2).

Sin embargo, como se puede observar en la figura 3, la función sigmoide de S'(x) es bastante amplia para los parámetros dados, de modo que, en una ventana comparativamente pequeña de aproximadamente 40 K en la que está operativo un sensor electroquímico basado en enzimas (véase más anteriormente), solo se tendrá acceso a una pequeña parte de dicha función, lo que no permitirá determinar ln(pc/pd) a partir de [S"/S]x⁼⁰ o A(S'/S). No obstante, también se puede obtener AT¹ para dichos casos. Además, está claro que, en cualquier caso, un gradiente determinado será igual o menor que el gradiente en T ¹, [S"/S]medido s [S"/S]x⁼⁰, lo que permite al menos un enunciado cualitativo con respecto a la disminución de la velocidad de reacción:

kc*/kc < exp(-2AT1 {-[S’7S]medido}1/2).

Se puede obtener información cualitativa similar a partir del valor medido más bajo y más alto para S'/S:

kc/kc < exp[-AT¹ {(S/S)máx -(S/S)mín}]

Segundo enfoque: Si bien el enfoque mencionado anteriormente para el análisis de datos se basa en un modelo matemático que aplica una aproximación ki(T) = ki(T⁰) piA[(T-T0)/1 K] para las constantes de velocidad de reacción, una evaluación similar es posible en base a la ecuación de Arrhenius más exacta ki(T) = ki0 exp(-Ai/T), siendo ki0 una velocidad de reacción máxima para T tendiendo a infinito. En este segundo enfoque se obtiene una derivada relativa de la sensibilidad como una función de la inversa de la temperatura T-1 en lugar de x = T - T⁰ ,

S'(T-1)/S = (-Ar - Ac) - d sig(c d T-1),

con la función logística sig(y) = e(y)/[1 exp(y)], c = ln(kc0/kd0) y d = (-Ac Ad).

De forma similar al primer modelo de sistema, se puede utilizar un desplazamiento de la curva S'(T_1)/S y su gradiente para obtener información sobre el cambio relativo en la velocidad de reacción catalítica eficaz kc0*/kd0

Ambos enfoques, que esencialmente solo difieren por el eje x usado, ya sea T o 1/T, proporcionan resultados similares, ya que la función 1/T es aproximadamente lineal en el intervalo de temperatura usado de 279-315 K, y viceversa. Si bien el primer enfoque es más intuitivo con respecto a la interpretación de datos, el segundo enfoque basado en la ecuación de Arrhenius es en realidad más exacto.

Resultados experimentales

La aplicación del modelo mencionado anteriormente para la evaluación de sensores electroquímicos se muestra en la figura 4. Para sensores de glucosa electroquímicos basados en GOx como se describen adicionalmente anteriormente, la corriente de señal se mide para diferentes temperaturas entre 4 °C (277,15 K) y 42 °C (315,15 K), en condiciones operativas en una solución de prueba fisiológica estabilizada con acida sódica (acida sódica al 0,095 % en peso, aproximadamente 15 pM), que tiene una concentración de glucosa de cgiu = 480 mg/dl.

La concentración de glucosa usada está muy por encima del intervalo normal de valores de glucosa en sangre para individuos sanos (72-140 mg/dl). Las mediciones a una concentración de glucosa más alta permiten incrementar la proporción de señal con respecto a ruido, lo que es en particular ventajoso para las corrientes de señal bajas a bajas temperaturas. Además, una mayor concentración de glucosa da lugar a una velocidad de penetración de glucosa proporcionalmente mayor a través de la membrana y, por tanto, a una mayor concentración de glucosa local en la capa de detección, lo que disminuye la diferencia entre la concentración de enzima activa y la concentración de glucosa local en la capa de detección, amplificando de este modo la influencia de la actividad enzimática en la sensibilidad mediante la reducción de la velocidad de reacción eficaz kc, en comparación con los valores fisiológicos de concentración de glucosa.

Para los experimentos, la temperatura de la configuración de medición preparada se incrementa de 37 °C a 42 °C y, a continuación, se disminuye gradualmente en incrementos de 1 K, manteniendo la temperatura constante para cada etapa durante 12 minutos.

El experimento se ha llevado a cabo para seis sensores diferentes: El sensor S1A es un sensor de nueva fabricación inalterado que se ha hinchado en la solución de prueba durante un día a 37 °C, antes de comenzar el experimento de barrido de temperatura. El sensor S2A es equivalente al sensor S1A, pero se ha sometido a un tratamiento térmico, dando como resultado la desnaturalización de una gran parte de los módulos enzimáticos, quedando solo un 20 % de moléculas de enzima activas, como se ha confirmado con las correspondientes mediciones del contenido de enzima activa restante en la capa de detección. Al igual que el sensor S1A, se ha hinchado en solución de prueba durante un día a 37 °C antes de la medición. Para el sensor S3A, la concentración de enzima en la pasta de dióxido de manganeso aplicada a la capa conductora durante el proceso de fabricación, que posteriormente forma la capa de detección, se había reducido al 20 % de la concentración nominal, dando como resultado un sensor similar al sensor S1A pero con solo el 20 % de su enzima activa. Al igual que el sensor S1A, se ha hinchado en solución de prueba durante un día a 37 °C antes del experimento de barrido de temperatura. Los sensores S2A y S3A sirven como modelo de prueba bien definido para sensores con actividad enzimática reducida que se evaluarán con el procedimiento de acuerdo con la invención.

Los sensores S1B, S2B y S3B son idénticos a los sensores S1A, S2A y S3A, respectivamente. Sin embargo, después de haber sido hinchados en solución de prueba durante un día a 37 °C, y antes de llevar a cabo el experimento de barrido de temperatura, dichos sensores S1B, S2B, S3B se han sometidos a 19 días de condiciones operativas continuas a 37 °C. Esto significa que dichos sensores han estado midiendo activamente una concentración de glucosa durante este periodo, lo que equivale a que un sensor haya sido usado por un paciente durante el tiempo de vida útil sugerido cuando se implantó en el tejido subcutáneo del paciente.

A continuación, los sensores S1A, S2A, S3A se denominarán "sensores no debilitados" y los sensores S1B, S2B, S3B se denominarán "sensores debilitados".

Se puede esperar que la pérdida de actividad enzimática después de un periodo de servicio de 19 días, que es el resultado de una degradación constante inevitable de la enzima en condiciones operativas, tendrá efectos más destacados para los sensores S2B, S3B que para el sensor S1B, dado que ya comienzan con una actividad enzimática considerablemente reducida.

La corriente de señal I medida representada frente a la temperatura T se muestra en la figura 4(a). Para analizar los datos en base al primer enfoque, la sensibilidad S se determina en base a la corriente de señal medida y la concentración de glucosa conocida de la solución de prueba, como se muestra en la figura 4(b). El gradiente relativo calculado S'/S = (dS/dT)/S se representa en la figura 4(c).

La corriente de señal disminuye considerablemente durante el barrido de temperatura (en los datos experimentales dados en un factor de aproximadamente 2,5-3). Un error de medición AS de la sensibilidad S, que es proporcional a un error de medición AI de la corriente de señal I, será más significativo en la derivada relativa correspondiente S'(T)/S para temperaturas más bajas, ya que A(S'/S) = (AS/S)2. Por tanto, para 6 °C, la proporción de señal con respecto a ruido en (S'/S) es 6,25-9 veces mayor que para 42 °C. Como se puede observar en la figura 4(c), las diferencias entre los valores medidos para los sensores S2A y S3A, así como para los sensores S2B y S3B, que esencialmente deberían ser cero, son mayores para temperaturas más bajas que para temperaturas más altas.

Como se puede observar en la figura 4(c); la curva de un determinado sensor debilitado S1B, S2B, S3B se desplaza a temperaturas más altas, en comparación con el correspondiente sensor no debilitado S1A, S2A, S3A. En base al modelo de función explicado adicionalmente anteriormente, esto corresponde a un desplazamiento positivo AT¹ de la temperatura de transición. Este efecto era de esperar, ya que la enzima GOx se deteriora parcialmente durante el periodo de servicio operativo de 19 días, lo que disminuye la velocidad de reacción catalítica eficaz kc. Mientras que para los sensores no debilitados el efecto visible de una reducción de la velocidad enzimática global del 100 % (S1A) al 20 % (S2A, S3A) es pequeño, el efecto se vuelve claramente visible para los sensores debilitados (S1B frente a S2B, S3B).

Como predice el modelo, se puede observar un efecto similar entre el sensor no debilitado S1A, que tiene el 100 % de la concentración enzimática nominal, y los sensores no debilitados S2A, S3A, ambos con el 20 % de la concentración enzimática nominal y, por tanto, con una velocidad de reacción catalítica eficaz kc reducida.

Sorprendentemente, se descubrió que el efecto de desplazamiento de la temperatura de transición es considerablemente mayor entre el sensor debilitado S1B con contenido nominal de enzima y los sensores S2B, S3B con el 20 % del contenido nominal de enzima, que entre el sensor no debilitado S1A y los sensores no debilitados S2A, S3A. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, los solicitantes creen que cualquier diferencia en la actividad enzimática entre los sensores que se van a someter a prueba (representados aquí por S2A, S3A / S2B, S3B) y un sensor ideal que representa el estándar (representado aquí por S1A / S1B) se incrementa considerablemente al debilitar los sensores antes del experimento de barrido de temperatura.

En base a los datos de medición de la figura 4(c), parece que la disminución de la actividad enzimática en un sensor estándar después de un periodo de servicio de 19 días (comparación del desplazamiento de la temperatura de transición entre S1A y s 1b ) es considerablemente mayor que el 80 % (comparación del desplazamiento de la temperatura de transición entre los sensores S1A y S2A, S3A).

Este factor de reducción, aplicado a un sensor con actividad enzimática inicialmente reducida, da como resultado una multiplicación de los factores de reducción implicados. Si, por ejemplo, un periodo de servicio de 19 días reduce la cantidad de enzima activa en un sensor al 10 % del valor original, esto dará como resultado un sensor estándar con una actividad enzimática restante del 10 %. Para un sensor para el que el contenido inicial de enzima es solo el 20 % del valor nominal, por ejemplo, debido a un problema de fabricación o debido al almacenamiento a largo plazo, la actividad enzimática restante será del 2 % del valor nominal.

Para exponer una posible evaluación cuantitativa de los datos experimentales obtenidos, en la figura 4(c) la curva de datos para el sensor S1B y las curvas de datos para los sensores S2B, S3B se han aproximado mediante dos funciones lineales con gradiente idéntico (líneas discontinuas). El desplazamiento horizontal de las dos funciones lineales es AT¹ = 11 K, mientras que el gradiente es [S"/S]medido = -1,4*10-3. Usando las fórmulas desarrolladas adicionalmente anteriormente, se obtiene un límite inferior de la proporción entre pc y pd, a saber, pc/pd s exp[2(-[S"/S]med¡do)1/2]) = 1,077, y un límite superior para la proporción de la velocidad de reacción catalítica eficaz de los sensores S2B, S3B y el sensor S1B:

kc,S2B,S3B/kc,S1B ^ eXp(-2AT1 {-[S"/S]medido}1/2) = 0,44.

Usando las aproximaciones lineales para calcular el (S'/S) más bajo y más alto, se obtiene una diferencia (S'/S)máx -(S'/S)mín = 0,065, que nuevamente proporciona un límite superior de

kc,S2B,S3B/kc,S1B ^ eXp[-AT1 {(S'/S)máx -(S'/S)mín}] = 0,49.

Similar al primer enfoque, se puede derivar una derivada relativa de la sensibilidad basada en el segundo enfoque, como una función de la inversa de la temperatura T '1 en lugar de la temperatura T. Los datos experimentales de sensibilidad como se muestran en la figura 4(b) representados frente a la inversa de la temperatura 1/T se muestran en la figura 5(a), mientras que la figura 5(b) muestra el gradiente relativo (dS/d(T_1))/S como una función de T-1.

En una aplicación del procedimiento según la invención para someter a prueba el contenido de enzima activa de sensores recién fabricados, una muestra de sensores de un lote de fabricación dado se someterá al tratamiento como se describe anteriormente, que comprende un periodo de hinchamiento preparatorio en la solución de prueba, y un posterior periodo de funcionamiento constante en condiciones operativas normales. El periodo de tiempo de la condición operativa puede ser de 19 días, para emular el tiempo de vida operativa máximo de un sensor, o más corto o incluso más largo. Después de esta preparación de la muestra, la corriente de señal se medirá como una función de la temperatura, y se usará uno de los dos enfoques mencionados anteriormente para analizar la derivada relativa de la sensibilidad.

Para mejorar la exactitud de los datos, se pueden elegir incrementos de temperatura más pequeños, proporcionando por tanto más puntos de datos durante un barrido de temperatura. Además, para incrementar la proporción de señal con respecto a ruido, las corrientes de señal muy bajas durante una etapa de temperatura se pueden integrar electrónicamente o se pueden promediar en un procesador de señales digitales.

También es posible aplicar un barrido de temperatura continuo, siempre que el cambio de temperatura sea lo suficientemente lento como para evitar efectos de retardo.

Para el efecto cinético, es irrelevante si la temperatura se incrementa o disminuye durante el barrido.

En aún otro enfoque, la temperatura se puede modular, T(t) = T⁰ + AT sen(wt), lo que da como resultado una sensibilidad modulada S(t) = S⁰ + AS sen(wt). Para amplitudes de modulación de temperatura AT pequeñas, la amplitud de modulación de sensibilidad AS será proporcional a la derivada dS/dT, mientras que la sensibilidad S⁰ viene dada por la señal de sensibilidad modulada promediada. La derivada relativa de la sensibilidad es directamente accesible para una temperatura dada T⁰ como S'(T)/S = AS/S⁰. Además de obtener directamente la derivada requerida, este enfoque tiene la ventaja de reducir la proporción de señal con respecto a ruido, que en general disminuye al incrementar la frecuencia de señal. Además, dicha modulación de temperatura permitirá realizar mediciones continuas tanto de la sensibilidad como de su derivada durante periodos de tiempo más largos a una temperatura constante.

Para evaluar el resultado de una medición, la curva S'/S resultante se puede comparar con un intervalo objetivo predefinido que corresponde a un sensor con valores nominales de actividad enzimática.

Si se dispone de mediciones de calibración con sensores de actividad enzimática reducida conocida (como, por ejemplo, para los sensores S2A, S3A), la curva S'/S medida también se puede evaluar cuantitativamente, por ejemplo, determinando un desplazamiento de la temperatura de transición de la curva y buscando la correspondiente concentración de enzima activa en la tabla de calibración.

En una variante ventajosa, el experimento de barrido de temperatura se llevará a cabo más de una vez, en diferentes momentos durante el periodo de condiciones de funcionamiento continuo. Por ejemplo, se puede interrumpir el modo de funcionamiento constante cada 3 días y se puede llevar a cabo un experimento de barrido de temperatura. Después del experimento, la temperatura volverá a las condiciones de funcionamiento normal hasta que tenga lugar el siguiente barrido de temperatura. Este enfoque permite monitorizar el cambio de la curva S'/S a lo largo del tiempo, lo que proporcionará información adicional.

En lugar de llevar a cabo un barrido de temperatura en el intervalo completo, también es posible llevar a cabo el barrido de temperatura en un intervalo comparativamente corto, por ejemplo, entre 36 y 38 °C. Si bien la curva S'/S resultante será en general demasiado corta para determinar un desplazamiento horizontal (de temperatura) de la curva, será posible determinar un desplazamiento vertical o un incremento de S'/S para una temperatura dada con respecto a un valor nominal, respectivamente, que en combinación con una tabla de calibración correspondiente también permitirá evaluar la actividad enzimática. Dado que un barrido de temperatura en un intervalo corto alrededor de la temperatura fisiológica de las condiciones operativas se puede llevar a cabo en menos tiempo que un barrido en el intervalo completo, dicho enfoque es en particular útil para mediciones repetidas durante un periodo de condiciones operativas, como se describe anteriormente.

Sorprendentemente, los solicitantes han descubierto que las mediciones con soluciones de prueba de glucosa fisiológicas estabilizadas con acida dan como resultado sensibilidades más altas que con las correspondientes soluciones de prueba de glucosa sin acida. Por ejemplo, la sensibilidad de un sensor S1B se encuentra entre 0,040 a 6 °C y 0,126 a 42 °C para una solución de prueba de glucosa estabilizada con acida (acida sódica al 0,095 % en peso, aproximadamente 15 pM), como se usa en la figura 4(b). Para una solución de prueba de glucosa similar sin acida y una concentración de glucosa de 466 mg/dl, la sensibilidad se encuentra entre 0,008 a 6 °C y 0,028 a 42 °C (véase la figura 6, solución C2).

Si bien los valores de S'/S resultantes se encuentran en el mismo intervalo para ambas soluciones, como era de esperar, el incremento de la sensibilidad (en el ejemplo mencionado anteriormente en un factor de aproximadamente 5) tiene un efecto muy ventajoso sobre la proporción de señal con respecto a ruido de S'/S.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría específica, los solicitantes creen que el incremento de la sensibilidad es el resultado de un incremento del recambio de la reacción redox del peróxido de hidrógeno con dióxido de manganeso debido a la presencia de iones acida, o la inhibición de las vías de reducción del peróxido de hidrógeno parásitas que reducen la cantidad de peróxido de hidrógeno disponible para la reacción de reducción primaria. Dichas reacciones pueden ser el resultado de reacciones catalizadas enzimáticamente de impurezas de otras enzimas usadas en la fabricación de GOx.

Variación de la concentración de glucosa

Un enfoque adicional para obtener información sobre la actividad enzimática es observar la dependencia de la curva S'/S para diferentes concentraciones de glucosa. Como se explica adicionalmente anteriormente, para los casos en los que la concentración de enzima activa no está muy por encima de la concentración de glucosa local, la velocidad de reacción catalítica eficaz dependerá de la concentración de enzima activa y, por lo tanto, de la actividad enzimática. Para una actividad enzimática dada, una variación de la concentración de glucosa puede dar lugar a un cambio en la velocidad de reacción catalítica eficaz, lo que puede dar como resultado un cambio observable en la curva S'/S.

La figura 6 muestra la sensibilidad S y la derivada relativa de la sensibilidad S'(T)/S de un sensor no debilitado S1A para dos soluciones de prueba con diferentes concentraciones de glucosa, medidas como una función de la temperatura, después del prehinchamiento durante un día.

Para cada solución, se han promediado los resultados de dos sensores. Las soluciones de prueba no contenían acida. Solución de prueba C1: concentración de glucosa 233 mg/dl. Solución de prueba C2: concentración de glucosa 466 mg/dl.

Como se puede observar en la figura 6(a), el incremento de la concentración de glucosa en un factor 2 de la solución C1 a la solución C2 da lugar a un incremento de la sensibilidad. Sin embargo, la sensibilidad por sí sola no permite obtener más información. La curva S'/S en la figura 6(b), por otra parte, muestra un desplazamiento positivo de la temperatura de transición, como se podría esperar en base al modelo como se usa anteriormente, de aproximadamente 2 K. Este desplazamiento de la temperatura de transición es el resultado de una velocidad de reacción catalítica eficaz disminuida resultante de una diferencia disminuida entre la concentración de enzima activa y la concentración de glucosa.

Por tanto, se muestra que la variación de la concentración de glucosa puede proporcionar información adicional valiosa sobre la velocidad de reacción catalítica eficaz y, por tanto, sobre la actividad enzimática. En particular, la dependencia entre la velocidad de reacción catalítica eficaz y la concentración de glucosa permite discriminar entre la influencia de los cambios en la actividad enzimática y la influencia de la velocidad de difusión, que también puede cambiar debido a procesos irreversibles en la membrana semipermeable. A continuación se analizará adicionalmente un ejemplo de una disminución de la velocidad de difusión y su efecto sobre la curva S'/S (véase la figura 7).

De forma ventajosa, los experimentos se llevan a cabo para más de dos concentraciones diferentes, cubriendo un amplio intervalo de valores de concentración.

En un enfoque simple, el desplazamiento de la temperatura de transición se determina como una función de la concentración de glucosa. De forma alternativa, las curvas S'/S combinadas proporcionarán un conjunto de datos que describe una superficie por encima del eje de temperatura y del eje de concentración de glucosa. Esto permitirá una evaluación aún más elaborada de la actividad enzimática de un sensor dado.

En una configuración experimental ventajosa, se automatiza el cambio entre diferentes concentraciones de glucosa.

En lugar de llevar a cabo un barrido de temperatura completo, se puede usar un barrido en un intervalo de temperatura pequeño y/o modulación de temperatura, como se describe adicionalmente anteriormente.

Influencia de la temperatura de almacenamiento

Un enfoque común para emular los efectos de largos periodos de almacenamiento en determinados dispositivos en periodos de tiempo más cortos es almacenar dichos dispositivos a temperaturas elevadas.

Por ejemplo, un sensor electroquímico basado en GOx como se analiza anteriormente, con una concentración enzimática normal, se puede almacenar a una temperatura mayor, por ejemplo, 45 °C, para simular el efecto de un periodo de almacenamiento más largo sobre la estabilidad del sensor en condiciones normales a temperatura ambiente, lo que reduce considerablemente de este modo la cantidad de tiempo necesario para realizar dichas pruebas. Al mismo tiempo, dichos periodos de temperatura más elevada se pueden usar para evaluar la estabilidad de envío, ya que durante el envío la temperatura ambiental se puede incrementar hasta dichos intervalos de temperatura durante varios días. En particular, la temperatura de almacenamiento más elevada dará lugar a un deterioro térmico acelerado de la enzima en estado seco y, por tanto, a una disminución de la actividad enzimática.

En la figura 7, dos sensores del mismo lote de producción con contenido nominal de enzima se almacenaron después de la fabricación a dos temperaturas diferentes. Uno de dichos sensores se almacenó a temperatura ambiente (conjunto de datos T1). Otro sensor idéntico se almacenó durante 3 días a 45 °C (conjunto de datos T2), que es una configuración típica para una prueba de estabilidad de envío. Después del prehinchamiento durante un día, se midió la sensibilidad como una función de la temperatura, con la misma solución de prueba que en la figura 4.

Como se puede observar en la figura 7(a), el sensor almacenado a 45 °C muestra una sensibilidad que es aproximadamente la mitad de la sensibilidad del sensor almacenado en condiciones normales. Se conoce una disminución de la sensibilidad a partir de dichas pruebas de almacenamiento, y se conoce que es causada parcialmente por un deterioro térmico de la membrana semipermeable, que da lugar a una disminución de la permeabilidad a la glucosa y, por tanto, a una disminución de la concentración local de glucosa en la capa de detección, que da lugar directamente a una disminución en la corriente de señal resultante para una concentración de glucosa dada. Al mismo tiempo, dicha concentración de glucosa local reducida contrarresta el efecto de un mayor deterioro de la enzima durante el almacenamiento a una temperatura elevada y, por tanto, una concentración de enzima reducida: la diferencia relativa entre la concentración de enzima y la concentración de glucosa es mayor de lo que sería con una permeabilidad inalterada de la membrana, y la sensibilidad del sensor permanece más tiempo en el intervalo lineal.

Aunque los datos para el sensor S1A son parcialmente ruidosos con respecto a la curva S'/S en la figura 7(b), se puede observar que ambas condiciones de almacenamiento dan lugar a un desplazamiento positivo de la temperatura de transición. Sin embargo, el almacenamiento a mayor temperatura en realidad da lugar a un desplazamiento positivo más pequeño de la temperatura de transición, en comparación con las condiciones normales de almacenamiento, en lugar de a un desplazamiento positivo de la temperatura de transición más grande, como se podría esperar de una actividad enzimática más disminuida en comparación con las condiciones normales de almacenamiento, y contrariamente a los datos de sensibilidad como tales. Este efecto se puede explicar mediante el modelo matemático. Asumiendo un caso en el que la velocidad de reacción catalítica eficaz kc* disminuye (debido a una actividad enzimática reducida) y la velocidad de difusión kd* también disminuye (debido a una permeabilidad reducida a la glucosa de la membrana deteriorada), el desplazamiento de la temperatura de transición se puede calcular como

AT¹ = T¹* - T¹ = -ln(kc⁰*/kd⁰*)/ln(pc/pd) ln(kc⁰/kd⁰)/ln(pc/pd)

= -[ln(kc⁰*/ kc⁰) - ln(kd⁰*/ kd⁰)]/ln(pc/pd).

Por tanto, una disminución de la velocidad de difusión da lugar a un desplazamiento negativo de la temperatura de transición, mientras que una disminución de la velocidad de reacción catalítica eficaz da lugar a un desplazamiento positivo de la temperatura de transición.

En el caso de los dos sensores de la figura 7, la temperatura de transición del sensor T2 es menor que la del sensor T1, correspondiente a una AT¹ negativa, lo que significa que la proporción de las velocidades de difusión kd,T²/kd,T¹ es menor que la proporción de las velocidades de reacción catalítica eficaces kc,T²/kc,T¹. Desde el punto de vista cualitativo, las temperaturas de almacenamiento más altas dan lugar a un efecto más dominante de deterioro de la membrana que comienza a anular el efecto de la desnaturalización de la enzima.

No obstante, será posible distinguir los dos efectos llevando a cabo la medición de sensibilidad con soluciones de prueba que tengan diferentes concentraciones de glucosa, como se explica anteriormente en la figura 6. Dado que la velocidad de reacción catalítica eficaz disminuye con una mayor concentración de glucosa, mientras que la velocidad de difusión no se verá influenciada por la concentración de glucosa siempre que la viscosidad no sea demasiado alta, se producirá un desplazamiento positivo de la temperatura de transición para una serie de concentraciones de glucosa crecientes. Usando un modelo cinético adecuado y ajustando la salida del modelo a los datos medidos, será posible a continuación determinar tanto la actividad enzimática como las características de la membrana. Esto permitirá usar temperaturas elevadas para realizar las pruebas de almacenamiento, acortando de este modo el tiempo necesario para realizar las pruebas de estabilidad a largo plazo.

Otro enfoque para diferenciar entre los efectos de la actividad enzimática y los de la velocidad de difusión comprende la medición de la curva S'/S después de diferentes periodos de almacenamiento. Por ejemplo, comenzando con un gran conjunto de sensores, en determinados intervalos se retirarán uno o más de los sensores y se medirá la sensibilidad como una función de la temperatura. Las curvas S'/S resultantes permitirán determinar el desplazamiento de la temperatura de transición como una función del periodo de almacenamiento. De forma alternativa, los datos de S'/S se pueden representar frente al eje de temperatura y el tiempo de almacenamiento.

De forma alternativa o además, se pueden variar otros parámetros experimentales que influyan en la velocidad de reacción catalítica eficaz. Por ejemplo, se puede obtener la curva de sensibilidad frente a temperatura para diferentes valores de pH. Dado que el valor de pH influye en la actividad enzimática, la velocidad de reacción catalítica eficaz dependerá del valor de pH. El intervalo de valores de pH está limitado por la estabilidad del electrodo en dichas condiciones, en particular por la estabilidad de la enzima y de la membrana semipermeable. La enzima GOx es activa en el intervalo de pH de 4 a 7, con un valor óptimo a 5,5.

Otra posibilidad es la medición de la curva de sensibilidad frente a temperatura para diferentes presiones parciales de oxígeno. Reducir la configuración experimental del oxígeno molecular disponible disminuirá la velocidad de reacción catalítica eficaz, ya que el oxígeno es un correactivo para la oxidación enzimática de la glucosa.

En otro enfoque para modular la actividad enzimática, obteniendo de este modo más información sobre los dos efectos que influyen en la sensibilidad, se pueden usar soluciones de prueba con diferentes cantidades de inhibidores de enzimas para reducir artificialmente el recambio de la enzima y, por tanto, la velocidad de reacción catalítica eficaz. Para la enzima GOx, se pueden usar inhibidores tales como iones Ag+, Hg2+ y Cu2+ como inhibidores, o acetato fenilmercúrico (N.° CAS 62-38-4) y (4-carboxifenil)cloromercurio (CAS 59-85-8).

El alcance de la presente invención no se debe limitar a los modos de realización específicos descritos en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la presente invención, además de las descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Por tanto, dichas modificaciones están destinadas a estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para someter a prueba sensores electroquímicos basados en enzimas, en el que los sensores son sensores para la detección cuantitativa de analitos en soluciones acuosas, en el que

se proporciona un sensor electroquímico con un electrodo de trabajo (1) y un contraelectrodo, comprendiendo el electrodo de trabajo un conductor eléctrico (3), una matriz de estado sólido (4) que está conectada eléctricamente con dicho conductor y que contiene una enzima inmovilizada que puede convertir catalíticamente un analito primario en un analito secundario que se puede oxidar o reducir cuando se aplica un potencial adecuado al electrodo de trabajo, y una membrana (5) que cubre dicha matriz y la separa del exterior, siendo dicha membrana permeable al analito primario, de modo que las moléculas de analito primario presentes en una solución acuosa con la que se pone en contacto el electrodo de trabajo pueden pasar a través de la membrana hasta la matriz, donde se pueden convertir catalíticamente en moléculas del segundo analito;

se proporciona una configuración de medición, que está operativamente acoplada al sensor electroquímico, proporcionando una señal de salida Z, por ejemplo, una corriente de señal medida, del sensor electroquímico; y el sensor electroquímico se pone en contacto adecuadamente con, por ejemplo, se sumerge en, una solución de prueba que comprende una determinada concentración del analito primario;

caracterizado por que

el sensor electroquímico se somete a una determinada temperatura T, en el que se hace un barrido de esta temperatura dentro de un determinado intervalo;

se mide una señal de salida Z para diferentes valores de temperatura T;

se determina una derivada Z' de la señal de salida Z como una función de la temperatura T o la inversa de la temperatura 1/T;

se determina una derivada relativa Z'/Z a una determinada temperatura T o inversa de temperatura 1/T, como la proporción entre la derivada Z' y la señal de salida Z; y

en el que los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos se comparan con conjuntos de datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa, en el que un valor Z'/Z incrementado indica una constante de velocidad de reacción catalítica reducida y una actividad enzimática global reducida en comparación con el valor nominal.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una función de desviación Zdesviación, por ejemplo una desviación constante, se resta de la señal de salida Z antes de usar la señal de salida Z para determinar la derivada Z'.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la función de desviación Zdesviación se determina en un proceso iterativo con al menos una ronda de iteración, comprendiendo dicho proceso iterativo la evaluación de una derivada Z' y/o una derivada relativa Z'/Z obtenidas usando una determinada función de desviación, por ejemplo, la desviación con respecto a una determinada función modelo, y la determinación de cambios en la función de desviación en base a dicha evaluación de la derivada y/o de la derivada relativa.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima es glucosa oxidasa, el analito primario es D-glucosa y el analito secundario es peróxido de hidrógeno.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura se incrementa o disminuye gradualmente.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se hace un barrido de la temperatura en un determinado intervalo, por ejemplo, entre 2 °C y 42 °C.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que

la temperatura aplicada se modula con una determinada desviación de temperatura, frecuencia y amplitud, lo que da como resultado una señal de salida modulada con una amplitud de modulación y desviación; y

la derivada relativa Z'/Z se determina como el cociente de la amplitud de modulación de la señal de salida y la desviación de la señal de salida.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, en base a los valores de la derivada relativa Z'/Z obtenidos, se determina un desplazamiento de temperatura como la temperatura o la inversa de la temperatura a la que una función ajustada a los datos de la derivada relativa Z'/Z alcanza un determinado valor.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el desplazamiento de temperatura determinado se compara con datos de calibración dados correspondientes a sensores que comprenden determinadas cantidades de enzima activa.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sensor que se va a analizar se somete a un determinado tratamiento antes de llevar a cabo la medición, por ejemplo, sometiendo el sensor a una determinada temperatura durante un determinado periodo de tiempo; o sometiendo el sensor a condiciones operativas durante un determinado periodo de tiempo.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que después de llevar a cabo la medición en el sensor que se va a analizar, dicho sensor se somete a un determinado tratamiento antes de llevar a cabo otra medición, por ejemplo, sometiendo el sensor a una determinada temperatura durante un determinado periodo de tiempo; o sometiendo el sensor a condiciones operativas durante un determinado periodo de tiempo.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la medición se lleva a cabo con dos o más soluciones de prueba que tienen diferentes propiedades, por ejemplo, diferentes concentraciones del analito primario, diferentes propiedades de los agentes inhibidores de enzimas y/o diferentes valores de pH.