SE520046C2 - Förfarande för att mäta växelverkan mellan en målmolekyl och en receptormolekyl med piezoelektrisk kristallmikrovåg - Google Patents

Description

.. z... 520 046 Flera patent beskriver hur QCM (förkortning av engelskans Quartz Crystal Microbalance, dvs en metod att väga med en piezoelektrisk kristall av kvarts) används för att analysera antigener och antikroppar. I det amerikanska patentet nr 4,242,096 (1980) beskrivs hur man använder adsorption av antigen till en kristall för att bestämma närvaron av antigenet i ett prov. Den antigen-täckta kristallen utsätts för ett prov med förbestämd mängd antikropp, varpå man, med en standardkurva, kan bestämma mängden antigen utifrån frekvensskiftet.

I Rices amerikanska patent 4,236,893 (1980) och 4,3 14,821 (1982) beskrivs metoder där man detekterar antikroppar med QCM. I det förstnämnda patentet immobiliserades antigen på en kristrall täckt med en polymer. F rekvensändringen från antikroppinbindningen relaterades till koncentrationen av antikropp i provet, men ospecifik bindning till kristallen störde analysen. I det andra patentet beskrivs hur lågmolekylära föreningar detekteras med en kristall täckt med anti-antikroppar. Alla dessa analyser utfördes genom att behandla kristallen i lösning och därefter mäta frekvensen i luft. Denna tvåstegsprocedur med lösning/ gas förbättrar känslighet hos oscillerande QCM, men medför tekniska komplikationer och stör hydreringen/dehydreringen som påverkar frekvensparametrarna.

Piezoelektrisk immunoassay-teknik i vätskefas har tekniska fördelar då man kan utföra stationära analyser samt flödes analyser av en lösning. Metoden har dock haft fysikaliska begränsningar p.g.a. en liten frekvensändring. Piezoelektrisk-immunassays i lösning rapporterades av J .E. Roederer, G.J. Bastiaans, Anal. Chem., 55, 2333 (1983) samt i deras amerikanska patentet 4,73 5,906. Kvartskristallen var här modifierad med glycidoxypropyltrimetoxysilan (GOPS), och den ytmodifierade kristallen modifierades därefter ytterligare med anti-humant IgG antikropp och användes därefter för piezoelektrisk detektering av humant IgG. En liknande metod beskrivs av H. Muramatu, J .M. Dicks, E.

Tamiya och I. Karube, Anal. Chem., 59, 2769 (1987) där kvartskristallers yta modifierades med y-aminopropyltrietoxysilan och därefter med protein A. Den ytmodifierade kristallen användes därefter för att bestämma koncentrationen av humant IgG.

I PCT ansökan WO 97/04314 beskrivs en metod där man bestämmer bindning av t.ex. antigen-antikropp komplex i vätska med piezoelektrisk kristall. Svagheten hos detta system samt ovannämnda vätskefassystem är att man inte kan skilja på två nära besläktade antikroppar, med t.ex. olika viskoelastiska egenskaper, då man endast mäter ändring i resonansfrekvenen. . « . . u 520 1046 Kort beskrivning av uppfinningen Ändamålet med föreliggande uppfinning är att, med piezoelektrrisk kristallmikrovåg, tillhandahålla ett förfarande för mätning av växelverkan mellan minst en målmolekyl och minst en receptonnolekyl, varav åtminstone den ena molekylen är immobiliserad.

Karakteriseringen av växelverkan mellan målmolekylen och receptormolekylen innefattar mätning av dissipationen (D) och/eller mätning av dissipationensförändring (AD). Man kan även kombinera dissipationsmätningen med mätning av resonansfrekvens (f) och/eller resonansfrekvensändring (Af).

Dissipationen enligt föreliggande uppfinning, en ny storhet för piezoelektriska kristallmikrovågsmätningar av målmolekyl-receptormolekyl komplex. Tidigare har endast resonansfrekvensen bestämmas, och denna uppfinningen tillhandahåller ett förfarande som möjliggör mätning av både dissipationen och resonansfrekvensen.

Informationen om ändringen av dissipationen och resonansfrekvensen för ett system kan relateras till koncentrationen av målmolekylen i lösningen samt affiniteten mellan målmolekylen och receptorrnolekylen. Detta är möjligt då olika målkomplex har olika viskoelastiska egenskaper eftersom komplexens konformationer skiljer sig åt. Dessutom påverkar målkomplexen det adsorberade skiktet olika, vilket även påverkar mätresultatet.

Följaktligen kan växelverkan mellan olika målmolekyl-receptormolekylkomplex, enligt föreliggande uppfinning, särskiljas utifrån deras dissipation, eller dissipations och frekvens respons för ett visst system. Man kan t.ex. säga att f och D utgör tillsammans ett slags fingeravtryck av det uppmätta systemet. Ändringen av dissipationen, eller frekvensen och dissipationen, då målmolekylen växelverkar med receptommolekylen kan då användas som ett mått och/eller signatur på processen.

För att använda metoden enligt föreliggande uppfinning krävs l. receptormolekyl med specificitet för målmolekylen; 2. metod att binda receptormolekylen till den piezoelektriska kristallytan; 3. lämpliga reaktionsbetingelser för att bilda reaktionsprodukt såsom målanalyt-receptor komplex, och 4. utrustning för att följa ändringen i dissipation och resonansfrekvens, eller bara dissipationen.

Med uttrycket “växelverkan” menas all sorts växelverkan som kan vara, men inte behöver vara, temporär och som kan innefatta flera molekyler, samt även reaktionsproduktens växelverkan med ytan.

Metod att binda receptorrnolekylen till piezoelektriska kristallytan kan antingen ske direkt via adhesion eller, via bindningsytor.

Med uttrycket ”målmolekyl” avses substansen som skall detekteras vilket inbegriper, men begränsas inte till, antigen, antikroppar, droger, nukleinsyror, hormoner, proteiner, enzymer, karbohydrater. Målmolekylen måste kunna binda receptormolekylen som också kan vara, men begränsas inte till ovannämnda substanser.

Målmolekylen och receptonnolekylen kan bilda målkomplex t.ex. antigen-antikropp, ligand- receptor, socker-lectin, biotin-avidin, enzym-substrat, oligonukleotid- oligonukleotid med en 520 4046 komplementär sekvens , oligonukleotid-protein, oligonukleotid-cell, etc. Bildandet av dessa målkomplex kan detekteras, liksom upplösningen av motsvarande komplex.

Den piezoelektriska kristallmikrovågen är företrädesvis av typen QCM, och används här företrädesvis vid mätningar i vätska, men mätningama kan också utföras i gasfas eller i vakum. Uppfinningen är en snabb och känslig teknologi för t.ex. immunoreaktioner, och speciellt för antikropp-antigenreaktioner. Jämfört med andra tekniker för realtidsmätningar av proteinadsorptionskinetik i vätskefas, tex. ellipsonietri, denna teknik relativt billig, då kvartskristaller används som sensor chip även inom andra tillärnpningsområden.

Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett instrument som utnyttjar ett förfarande enligt ovan. 5205 046 :riff Beskrivning av figurerna Figur 1 visar Af avsatt mot tiden for bindning av antigenet gG-2 med koncentrationen lpg/ml for två separata, men identiskt behandlade, TiOg-kristaller.

Figur 2 visar AD avsatt mot tiden för bindning av gG-2 med koncentrationen 1 ug/ml för två separata, men identiskt behandlade, Ti02-kristaller.

Figur 3 visar Af avsatt mot tiden för tre separata mätningar med en kvartskristall som är identiskt behandlad med TiO2-gG2-Hb, for bindning av 0.5 mg/ml B9, Gll och Bl.

Figur 4 visar AD avsatt mot tiden för tre separata mätningar med en kvartskristall som är identiskt behandlad med TiO2-gG2-Hb, för bindning av 0.5 mg/ml B9, Gll och Bl.

Figur 5 visar AD avsatt mot Af fór två separata mätningar med en kvartskristall som är identiskt behandlad med TiO2-gG2-Hb, for bindning av 0.5 mg/ml B9 och G11. w. t» 520 046 ifirggqyfiïeæ Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning hänför sig till en ett förfarande att mäta växelverkan mellan minst en målmolekyl och minst en receptormolekyl, med piezoelektrisk kristallmikrovåg, företrädesvis av typen QCM.

Sökandes svenska patent 504 199 beskriver en anordning och teknik för mätning av resonansfrekvens och/eller dissipationsfaktor hos en piezoelektrisk kristallmikrovåg, företrädesvis av typen QCM (Quartz Crystal Microbalance). Föreliggande uppfinning är en vidareutveckling av tekniken för ett förfarande för mätning av biologiska målkomplex.

QCM:en är en extremt känslig våg avsedd att väga små mängder material som läggs till eller tas bort från elektroden. QCM:en, enligt föreliggande uppfinning, består av en skiva enkristall av ett piezoelektriskt material, företrädesvis kvarts, mer företrädesvis AT- eller BT-skuren kvarts-kristall. En sådan kristall kan oscillera i skjuvmod med amplituden ca. l-l0 nm, och med grundfrekvensen f=konstantd1 där d är kristallens tjocklek. Med d z 0.17 ärf= 10 MHz. Svängningen uppkommer då ett AC fält läggs vinkelrätt mot kristallens yta. AC fältets frekvens skall vara centrerat runt kristallens egenfrekvens. Praktiskt går det till så att elektrodema läggs på genom t.ex. förångning på var sin sida om kristallen. Elektrodema är sedan i elektrisk kontakt med en extem oscillatorkrets.

Denna anordning kan mäta mycket små massändringar på kvartselektroderna, i storleksordningen l ng/cmz, eller, under fördelaktiga förhållanden, ärmu mindre.

Under ideala betingelser är, som tidigare nämnts, ändringen i resonansfrekvens, Af, proportionell mot massändringen, Am, dvs AF -konstant-Am Konstantens storlek beror bl.a. på valet av kristall och snitt. Ekvationen förutsätter att massan som representeras av Am sitter stelt, är jämnt fördelad på elektroden och följ er med QCM:ens ocillation utan dissipativa förluster. Ekvationen är inte generellt giltig när den pålagda massan består av ett visköst material och/eller är ojämnt fördelat över kristallens masskänsliga area. I så fall kan en given mängd pålagd massa även ge upphov till olika frekvensskift, vilket är den samma som att ett visst frekvensskift kan motsvara olika mängd massa. Det kan således i dessa fall vara av begränsat värde att enbart mäta resonansfrekvensen. Ändamålet med uppfinningen är att med förbättrad QCM-teknik konstruera en känsligt förfarande för detektering av biologiska mâlkomplex. Detta åstadkoms genom att bättre kunna karakterisera systemet som mäts med sensom. Genom att simultant med f mäta QCM:ens dissipationsfaktor, (dissipationen är inversen av den sk Q-faktom) kan mängden och värdet av informationen hos det studerade systemet ökas signifikant. Ett typiskt mätförfarande enligt föreliggande uppfinning är att både mäta_ f och D som funktion av tiden. Storheternaf och D mäter olika egenskaper hos systemet. Tillsammans utgör f och D ett slags fingeravtryck av det studerade systemet. För vissa system räcker det dock att enbart mäta dissipationen. ...-» 5207 046 Metoden enligt föreliggande uppfinning möjliggör systemspecífika fingeravtryck. Man karakteriserar processer/system genom att avsätta varje uppmätt Af mot AD i XY-graf, eller i något annat kordinatsystem, med Af på ena axeln och AD på den andra. Den erhållna kurvan, kallad Df-kurva, är inte explicit, men implicit, tidsberoende eftersom varje Af-AD par kan markeras i grafen. Formen för Df-kurvan fungerar som fingeravtrycket för en given process.

Ytterligare fingeravtryck kan erhållas genom att exeitera kristallen i dess övertoner (3:e, 5:e, osv), och registrera Df-kurvan vid varje överton. Man kan vidare tänka sig att använda olika kristallsnitt samtidigt, inte bara AT-snittet, och registrera Df-kurvan för dess olika snitt.

Vidare kan Df-kurvan uppmätas vid olika svängningsamplituder Det som enligt uppfinningen kallas för Df-fingeravtrycket eller Df-signaturen för ett system innefattar alla de Df-kurvor som kan mätas för det studerade/uppmätta systemet vid olika svängningsfrekvenser, olika svängningsmoder och olika amplituder.

Df-kurvans form kan direkt avslöja att interaktionen mellan olika typer av målmolekyl- receptorrnolekyl komplex är olika, utan att en detaljerad tolkning av interaktionens natur behöver vara känd. Varje skikt eller lager för, t.ex. icke-rigida och viskösta skikt, på kristallens yta har följaktligen en egen Df-signatur. Om två systems signatur vid en frekvens och/eller amplitud är alltför lika kan skillnaden öka vid andra frekvenser och amplituder.

För att använda metoden enligt föreliggande uppfinning krävs: 1. Receptormolekyl med specificitet för målmolekylen Receptorn kan vara någon eller några av följ ande substanser: antikroppar, syntetiska antikroppar, antikroppfragments, antigener, syntetiska antigener, haptener, nukleinsyror, syntetiska nukelinsyror, celler, receptorer, hormoner, proteiner, prioner, droger, enzymer, kolhydrater, biotiner, lektiner, bakterier, virus och sackarider. Det enda kravet som föreligger på receptormolekylen är att den måste kunna binda till målmolekylen som också kan vara någon eller några av ovannämnda substanser. Målmolekylen och receptorrnolekylen bildar målkomplex t.ex. antigen-antikropp, ligand-receptor, socker-lectin, biotin-avidin, enzym- substrat, oligonukleotid- oligonukleotid med en komplementär sekvens, oligonukleotid- protein, oligonukleotid-cell, etc. Receptor molekylen kan även väljas på ett sådant sätt den är mindre än målmolekylen och/eller att receptorrnolekylen binder nära en ända av målmolekylen så att stor hävarrn skapas. 2. Metod att binda receptormolekylen till den piezoelektriska kristallytan Receptormolekylen kan vara fäst direkt till den piezoelektriska kristallens yta med adhesion eller via en annan yta med eller utan ytterligare skikt, tillsammans benämnd bindningsytan, med adhesion eller med en kemisk reaktion. Bindningsytan kan innefatta oxid, metalloxid såsom TiOz och SiOZ, halvledare, oorganisk förening, organisk förening, lipidskikt, polymer, avidin eller streptavidin, biotin, protein, samt självorganiserande skikt. Valet av bindningsyta kan komma att påverka fingeravtrycket, dvs vissa ytor, t.ex. TiOg, kan komma att förstärka analysutslaget. 3. Lämpliga reaktionsbetingelser för att bilda reaktionsprodukt såsom målanalyt-receptor komplex Dessa beror helt och hållet på vilket system som man vill studera, och det är oftast känt vilka reaktionsbetingelser är lämpliga för ett visst system. Exempel på lämpliga 520 046 giggjzzh; -çjggf == 8 ; 1, š . u ' reaktionsbetingelser är, men begränsas inte till, från 4°C till 80°C, pH 4-9.0, saltkoncentrationer mellan 1 uM-lM. 4. Utrustning för att följa ändringen i dissipation och resonansfrekvens, eller bara dissipationen.

Mätningen utförs med utrustning innefattande minst en kristall med minst en uppsättning elektroder (applicerade direkt på kristallen eller i nära anslutning till denna) anslutna till en drivkrets för att försätta kristallen/kristallerna i svängning, som är anordnad att utföra manuell eller automatiserad mätning i realtid av (1) dissipationsfaktom (D), och/eller ändringen av denna (AD), eller (ii) dissipationsfaktom (D), och/eller ändringen av denna (AD) samt resonansfrekvensen (f), och/eller ändringen av denna (Af), vid drivning och/eller genom att drivkretsen bryts, och att dissipationen mäts, eller dissipationen och frekvens mäts som funktion av tiden.

Mätningarna kan utföras i gasfas, vakuum men företrädesvis i vätsfas. Mätningen kan utföras vid såväl grundtonsfrekvens som övertoner och/eller olika oscillationsamplitud och den kan utföras såväl automatiskt som manuellt.

För att reducera ospecifikt inbindning av målanalyten kan man använda en blockerare. Den täcker då de områden eller delar av områden, på kristallytan eller på bindningsytan, som inte täcks av receptonnolekylen. Som blockerare kan ett flertalet proteiner, eller andra molekyler, användas. De bör dock ha liten, eller minsta möjliga, affinitet till målmolekylen.

Man kan även mäta på ett provflöde som bringas i kontakt med detektom så att halten målmolekyl bestäms som funktion av tid.

Det behöver inte vara själva inbindningsförloppet som är det huvudsakliga som detekteras utan den produkt som blir resultatet av inbindningen. Man kan alltså även mäta hur målkomplexet inverkar på bindningsytan samt hur viskösa och/eller viskoelastiska molekyler växelverkar. Dessutom kan man mäta upplösning av målkomplex t.ex. om antigen-antikropp komplexet upplöses p.g.a. yttre påverkan.

Man kan även använda metoden enligt uppfinningen för att påvisa, och/eller bestämma halten av, nukleinsyra av viss sekvens i ett prov med en receptor molekyl som är enkelsträngad nukleinsyra med komplementär sekvens till målmolekylen som skall påvisas. Dessutom kan man påvisa punktmutationer i nukleinsyra genom att sätta ett prov i samtidig kontakt med två, eller flera sensorytor, utrustade med receptor nukleotid-strängar som är komplementära till den muterade respektive normala sekvensen, och mäta skillnaden i deras svar.

Enligt föreliggande uppfinning kan man konstruera ett instrument som utnyttjar ett förfarande enligt ovan.

Nedan exemplifieras uppfinningen med ett system där målmolekylen är en antikropp och receptommolekylen är ett antigen. QCM-tekniken, enligt föreliggande uppfinning, möjliggör här en snabb (mindre än en timme ) realtidsmätning av en antikropp-antigen reaktion. Det sker genom mätning av dissipationen och frekvensskifiet under tiden då antikroppama binder till antigen som täcker kristallytan. Dessutom kan man mäta kinetiken hos antikropp-antigen reaktionen.

Med metoden enligt föreliggande uppfinning kan man direkt relatera reaktionskinetiken till 520 046 9 (z) koncentrationen av antikroppar i lösningen, och (ii) affiniteten mellan antigen och antikropp.

Dessa två parametrar har stor betydelse for t.ex. medicinsk analys. . . , » . . n ny. 520 046 10 Exempel 1 Receptonnolekylen var antigenet glykoprotein G (gG-2) från Herpes Simplex virus typ 2 (HSV-2). Detta protein, med molekylvikten 120kD, var framrenat från virusinfekterade cell membraner med helix promatia lektin affinetetskromatografi. Uppfinningen demonstrerades med tre olika målmolekyler, de monoklonala y-globulin (IgG) antikropparna B9, G11 och B 1 .

Det är känt att antikroppama B9 och G1 1 är typ-specifika och inte binder till andra Herpes Simpex virus proteiner än HSV-2. Med ELISA-tekniken har det visat sig att dessa antikroppar är specifika för två olika epitoper på gGZ (Líljequist, J. Å.; Tribala, E.; Svennerholm, B.; Jansson, S.; Sjögren-Jansson, E.; Bergström, T. Submitted to Joumal of General Virology 1997). Bindningsaffiniteten till antigenet är ca 100 gånger större för B9 än för Bl 1. Den monoklonala antikroppen (Bl) som är typ-specifik för glykoprotein C, från Herpes Simplex typ l användes som kontroll, då det är känt att den inte binder till gG-2.

Substratytan som användes var titanoxid (TiOg). Mellan reaktionerna tvättades substratytan flera gånger. Den kunde då användas upp till 10 gånger med hög reproducerbarhet.

För att binda antigenet till ytan användes en 50 mM TRIS/200 mM KCl buffert med pH 9.6.

För antikropps ínbindningen användes en 50 mM HEPES/200 mM KCl buffert med pH 7.0.

Figur l visar Af avsatt mot tiden och figur 2 visar AD mot tiden för bindning av antigenet gG- 2 med koncentrationen l ug/ml för två separata, men identiskt behandlade, Ti02-kristaller.

Dvs antigenet immobiliserades här inför antikroppsdetektionen. Adsorptionen nådde inte mättnad under mätningama, men ínbindningen av anti genen avbröts när frekvensskiftet nådde ca 20Hz. Mätningar utfördes vid tredje övertonen. lnbindningen av antigen till olika kristaller utfördes med god reproducerbarhet, vilket illustreras i Figur l-2.

För att undvika ospecifik bindning av antikroppar till fri yta användes 30 pg/ml hemoglobin (Hb) som en blockreare (bovin hemoglobin, Sigma). Därefter utsattes gG2-Hb ytan med den antikropps lösningen som skulle undersökas.

Figur 3 och figur 4 visar Af avsatt mot tiden och AD avsatt mot tiden för tre separata mätningar med identiska behandlade TiOZ-gGZ-Hb kristaller för bindning av 0.5 mg/ml B9, Gll och Bl.

Kontroll antikroppen, Bl, gav en mycket litet ändring av f och D, vilket visar att den ospecifika bindningen var låg. Motsvarande f- och D-shift för B9 och Gll är betydligt större.

Det framgår också att antikroppen B9 med, högre affinitet än Gl l, binder med en högre hastighet och ger en två-gånger större frekvensändring än för Gl 1, men utan någon större ändring i D-shift.

Riktigt intressanta blir resultaten från figur 5 där AD avsätts mot Af för inbindningen av B9 och G11. Både B9 och G11 uppvisar linjäritet mellan Af och AD, men lutningen för Gl 1, är ca 1.7 gånger större än för B9. Det bör också noteras att lutningama, dvs dD/dF, var identiska för respektive antikropp vid både höga och låga koncentrationer. Detta visar att antikroppar specifika för olika epitop på samma antigen, kan särskiljas ej endast från hastighet eller absolut frekvensshifi för reaktionen, utan också från inducerat AD per Af. F ingeravtrycket erhållet från Df-signaturen gör det alltså möjligt att särskilja antikroppar specifika för olika epitop, men med en snarlika affiniteter. Detta beror på att de observerade r . . . t. 520 046 11 dissipationsändringama orsakas av att antigen-antikropp komplexen, skapade från olika antikropp-epitop reaktioner, har olika konformationer. Dessutom påverkar de olika antigen- antikropp komplexen det adsorberade skiktet olika.

Följaktligen kan olika antikropp-antigen reaktioner, enligt föreliggande uppfinning, på ett unikt sätt särskiljas utifrån deras dissipations- och frekvenssvar. Detta är av största vikt då antikroppar för olika batkterie- och vimsinfektioner kan detekteras med hög känslighet och specificitet.

Claims (19)

10 15 20 25 30 5 2 Û Û 4 6 /2 SE 9704354-1 PATENTKRAV

1. Förfarande för att mäta växelverkan mellan minst en målmolekyl och minst en receptor- molekyl med piezoelektrisk kristallmikrovâg, varav åtminstone ena molekyltypen är immobiliserad, kännetecknat av, att man immobiliserar en receptonnolekyl till en piezoelektrisk kristallmikrovåg, att man försätter minst en kristall i svängning medelst drivkrets, att man tillför en målmolekyl till kristallmikrovågens yta omfattande den immobiliserade receptormolekylen, och medger en reaktion mellan målmolekyl och receptorrnolekyl, och att man mäter dissipation (D) och/eller förändring i dissipation (AD) under drivning och/eller efter avstängning av drivkretsen.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av, att även resonansfrekvensen (f) och/eller ändringen i resonansfrekvens (At) mäts under drivning och/eller efter avstängning av drivkretsen.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, kännetecknat av, att storheterna resonansfrekvens och dissipationsfaktor är ett mått eller signatur på en process på kristallmikrovågens yta som påverkar resonansfrekvensen och/eller dissipationsfaktorn.

4. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att man använder ett eller flera, t.ex., XY-diagram, sk Df-signatur(-er) bestående av storheterna resonansfrekvens och dissipationsfaktor hos den piezoelektriska kristallmikrovågen, med resonansfrekvensen på den ena axeln och dissipationsfaktom på den andra axeln. 10 l5 20 25 30 520 046 13

5. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att målmolekyl och receptorrnolekyl väljs från någon eller några av följ ande grupper omfattande antikroppar, syntetiska antikroppar, antikroppsfragment, antigener, syntetiska antigener, haptener, nukleinsyror, syntetiska nukleinsyror, celler, receptorer, hormoner, proteiner, prioner, droger, enzymer, kolhydrater, biotiner, lektiner, bakterier, virus och sackarider.

6. F örfarande enligt krav 5, kännetecknat av, att målmolekyl är en antikropp och receptonnolekyl är ett antigen.

7. F örfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att receptormolekylen väljs på ett sådant sätt att den är mindre än målmolekylen och/eller att receptormolekylen binder nära en ände av målmolekylen, så att en stor hävarm skapas.

8. F örfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen utföres med en utrustning innefattande minst en kristall med minst en uppsättning elektroder anslutna till en drivkrets för att försätta kristallen/kristallema i svängning, vilken utrustning är anordnad att utföra manuell eller automatiserad mätning i realtid av (i) dissipationsfaktom (D), och/eller ändringen av denna (AD), eller (ii) dissipationsfaktom (D), och/eller ändringen i denna (AD), samt resonansfrekvensen (f) och/eller ändringen i denna (Af), vid drivning och/eller genom att drivkretsen bryts, och att dissipationen mäts, eller dissipationen och frekvensen mäts som funktion av tiden, och att piezoelektriska kristallmikrovågen/kristallmikrovågama är belagd(-a) med bindningsyta, som kan innefatta oxid, metalloxid, halvledare, oorganisk förening, organisk förening, lipidskikt, polymer, avidin ener strepavidin, biotin, protein samt sj älvorganiserande skikt. 10 15 20 25 30 520 046 /4

9. F örfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att piezoelektriska kristallmikrovågen är av typ QCM (Quartz Crystal Microbalance).

10. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen utföres i gasfas, vacuum eller vätskefas.

11. 1 1. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen utföres vid såväl grundtonsfrekvens som övertonsfrekvens och/eller olika oscillationsamplituder.

12. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen utföres såväl automatiskt som manuellt.

13. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen utföres med olika typer av piezoelektriska kristaller, såsom kvarts, och olika kristallografiska skärningar, såsom AT- och BT-kristallografiska skärningar.

14. F örfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen av piezoelektriska kristallens resonansfrekvens och dissipation utföres som funktion av tiden.

15. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att mätningen användes för att ge ett mått på viskösa och/eller viskoelastiska molekylers växelverkan, och/eller deras inverkan på bindningsytan 10 15 20 25 ' “ 5 2 O D 4 6 ' i /5

16. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att man bestämmer mängden av viss målmolekyl, såsom antikroppar, antikroppsfragment, antigener, haptener, nukleinsyror, syntetiska nukleinsyror, celler, bakterier, receptorer, honnoner, proteiner, prioner, droger, enzymer, kolhydrater, biotiner, lektiner, virus, metabolit(-er), vitamin och sackarider innehållande även andra komponenter, genom att utrusta ytan med en receptormolekyl.

17. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att ett provflöde bringas i kontakt med detektorn så att halten målmolekyl bestämrnes som funktion av tid.

18. Förfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att man påvisar och/eller bestämmer halten av nukleinsyra av viss sekvens i ett prov med en receptormolekyl, som är enkelsträngad nukleinsyra med komplementär sekvens till molekylen som skall påvisas.

19. F örfarande enligt ett eller flera av föregående krav, kännetecknat av, att man påvisar punktmutationer i en nukleinsyra genom att sätta ett prov i samtidig kontakt med två eller flera sensorytor utrustade med receptomukleinsyra-strängar, som är komplementära till den muterade respektive normala sekvensen, och bestämmer skillnaden i deras svar.