CN102692513A

CN102692513A - 致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片及装置

Info

Publication number: CN102692513A
Application number: CN2012102125021A
Authority: CN
Inventors: 曹忠; 周婷; 何婧琳; 田雁飞; 邓婷; 宋铖; 李娇; 张玲
Original assignee: Changsha University of Science and Technology
Current assignee: Changsha University of Science and Technology
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明提供了一种基于石英晶体微天平(QCM)检测致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片及其检测装置。本发明是先封闭压电石英晶体片(7)的一侧单面金膜(6)，在其另一侧未封闭的单面金膜(1)表面上组装一层L-半胱氨酸单分子层(2)，之后再修饰上戊二醛单分子层(3)，通过戊二醛单分子层(3)的共价交联作用，使其与C-myc单克隆抗体(4)结合，形成压电免疫传感芯片；然后通过C-myc单克隆抗体(4)和C-myc重组蛋白(5)的免疫反应结合，引起所述压电免疫传感芯片的石英晶体的振荡频率发生变化，以此来检测癌变组织中C-myc重组蛋白(5)的含量。本发明的效果和益处在于所述压电免疫传感芯片具有组织简便、定量快速、灵敏度高、选择性和再生性能好等优点，可用于液相稳定检测，优于传统的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。

Description

致癌基因 C-myc 重组蛋白的压电免疫传感芯片及装置

技术领域

本发明属于肿瘤细胞中蛋白含量检测技术领域，涉及一种用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片及其检测装置。

背景技术

C-myc基因是最早被发现的与肿瘤细胞增殖活性相关的原癌基因产物之一，主要与Max蛋白形成杂合体，然后转移到细胞核与特异性DNA序列结合，从而抑制或激活许多靶基因的转录，导致细胞生长、分化和凋亡的改变。其过度表达易使细胞转化为恶性表型，癌基因的活化或抑癌基因的失活均可启动或加速肿瘤的发生。因此在线检测C-myc含量的变化，对于癌症的预防、诊治有着非常重要的意义。

目前用于检测C-myc的方法主要有：免疫组化法、原位杂交法、酶联免疫分析法（ELISA)、荧光定量聚合酶链反应法（PCR）、荧光微流珠阵列法等。这些方法多为生物学方法，且所使用仪器价格昂贵、操作复杂、不适于在线检测。与传统的ELISA等方法仅能做到定性或半定量检测相比，便携、价廉的压电石英晶体微天平因灵敏度高和选择性好已广泛用于生化分析领域，目前应用压电传感技术检测病原菌等微生物的专利有ZL200410023232.5，ZL200710035069.8，ZL201010550114.5等，但是应用液相压电免疫传感手段检测致癌基因C-myc重组蛋白的方法还没有报道。因此本发明提供了一种基于自组装传感膜的单面起振的液相压电免疫传感芯片及其检测装置，可达到对癌变组织中C-myc重组蛋白含量的简便、快速、灵敏检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片及其检测装置，其特征在于利用免疫反应结合引起压电石英晶体振荡频率的变化来实现快速、简便、定量地检测癌变组织中C-myc重组蛋白的含量，即所述压电免疫传感芯片是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体和C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起压电石英晶体振荡频率发生变化，与C-myc重组蛋白含量成线性响应关系而达到检测目的。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

设计并制备了一种用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片，其特征在于所述压电免疫传感芯片的组装结构自压电石英晶体到最外层依次为：压电石英晶体片的未封闭的单面金膜、L-半胱氨酸单分子层、戊二醛单分子层、C-myc单克隆抗体。

所述的压电免疫传感芯片的制备组装过程是：首先将压电石英晶体片的一侧单面金膜用与晶体直径相当的聚氯乙烯塑料管（管壁厚度为0.1 ~ 2 mm，管高度为1 ~ 10 mm）和聚对苯二甲酸类塑料片（厚度为0.01 ~ 0.5 mm）通过环氧树脂AB胶作粘连剂封闭在一密闭空腔内，即封闭了压电石英晶体片的一侧单面金膜，得到其另一侧未封闭的单面金膜；值得注意的是，压电石英晶体的基频为5 ~ 12 MHz，其振荡形式为液相单面起振。然后，将Piranha溶液（注：Piranha溶液为浓硫酸：双氧水=7：3的溶液）滴在压电石英晶体片未封闭的单面金膜表面浸润1 ~ 10 min，之后用二次蒸馏水反复冲洗；将上述步骤处理的单面金膜置于1 ~ 100 mmol/L L-半胱氨酸(L-cys)中避光反应1~ 24 h，形成L-半胱氨酸单分子层，之后用pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液冲洗，以优化L-半胱氨酸单分子层；随后，将上述步骤处理的单面金膜置于0.1 ~ 10% (W/W)的戊二醛溶液中活化1 ~ 120 min，用二次蒸馏水反复冲洗后就会在上述步骤处理的单面金膜表面形成戊二醛单分子层，再分别用0.1 ~ 10%（V/V）的乙二胺、0.1 ~ 10 mmol/L的巯基乙醇清洗上述步骤处理的单面金膜表面，以封闭非特异性结合位点；将上述步骤处理的单面金膜于C-myc单克隆抗体中在37℃下温育1 ~ 120 min，取出用PBS缓冲溶液冲洗，即得C-myc单克隆抗体修饰的压电免疫传感芯片。

所述压电免疫传感芯片检测装置的组装过程是：将溶液置于玻璃反应池中，玻璃反应池的底部放置一个磁性搅拌磁子，并置于磁力搅拌器上，在玻璃反应池的下端安装一个放液管和一个开关阀门；随后，将压电石英晶体片未封闭的单面金膜浸入溶液中，通过金电极引脚与TTL振荡电路连接，TTL振荡电路再与频率计数器相连接，构成一个完整的传感检测回路，输出信号接入计算机，从而达到检测的目的。

当C-myc单克隆抗体和C-myc重组蛋白免疫反应结合后，引起所述压电免疫传感芯片的石英晶体的振荡频率发生变化，频率变化值与待测C-myc重组蛋白含量在530 ~ 9600 pg/mL范围内成线性响应关系，检测下限达到530 pg/mL，可实现在线动态监测、快速定量检测致癌基因C-myc重组蛋白的目的。同时，所述压电免疫传感芯片对癌变组织中C-myc重组蛋白含量能进行准确测定，其回收率达到96.2% ~ 108.6%，在肿瘤疾病诊断和治疗等生物医学方面具有十分重要的应用前景和经济价值。

本发明的有益效果是，所述压电免疫传感芯片及其检测装置无须昂贵的仪器设备、酶或者放射性标记物，方法简单，灵敏度高，选择性和重现性好，且具有组装简便，定量快速和在线监测等优点，可用于液相稳定检测，优于传统的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。

附图说明

图1是单面封闭的压电石英晶体片的平面结构图及其AA’剖面示意图。

图2是传感芯片的自组装膜结构示意图。

图3是传感芯片的检测装置结构示意图。

图4是传感芯片石英晶体的频率变化值与C-myc重组蛋白浓度的对应关系曲线图，其在530 ~ 9600 pg/mL范围内的标准曲线（见图4内插图）方程可拟合为：

ΔF = 0.00334C + 18.733

其中ΔF表示频率变化值(Hz)，C表示C-myc蛋白的浓度(pg/mL)。上述关系曲线图是在室温25⁰C时绘制的。

图1、2和3中，1. 石英晶体未封闭的单面金膜，2. L-半胱氨酸单分子层，3. 戊二醛单分子层，4. C-myc单克隆抗体，5. C-myc重组蛋白，6. 被封闭的单面金膜，7. 石英晶片，8. 聚对苯二甲酸类塑料片，9. 聚氯乙烯塑料管，10. 金电极引脚，11. 放液管，12. 开关阀门，13. 玻璃反应池，14. 搅拌磁子，15. 磁力搅拌器，16. TTL振荡电路，17. 频率计数器。

具体实施方式

实施例 1

压电免疫传感芯片的组装制备：

1) 将8.0 MHz压电石英晶体片的一侧单面金膜用与晶体直径相当的聚氯乙烯塑料管(管壁厚度为0.5 mm，管高度为5 mm)和聚对苯二甲酸类塑料片(厚度为0.02 mm)通过环氧树脂AB胶作粘连剂封闭在一密闭空腔内，则其另一侧未封闭的单面金膜可进行传感芯片的表面修饰；

2) 将Piranha溶液（注：Piranha溶液为浓硫酸：双氧水=7：3的溶液）滴在上述压电石英晶体片未封闭的单面金膜表面浸润2 min，之后用二次蒸馏水反复冲洗；

3) 将上述步骤处理的单面金膜置于20 mmol/L L-半胱氨酸中避光反应2 h，形成L-半胱氨酸单分子层，之后用pH=7.4的10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗，以优化L-半胱氨酸单分子层；

4) 将上述步骤处理的单面金膜置于2.5% (W/W)的戊二醛溶液中活化60 min，用二次蒸馏水反复冲洗后就会在上述步骤处理的单面金膜表面形成戊二醛单分子层，再分别用5% (V/V) 的乙二胺、1.0 mmol/L的巯基乙醇清洗上述步骤处理的单面金膜表面，以封闭非特异性结合位点；

5) 将上述步骤处理的单面金膜于C-myc单克隆抗体中在37℃下温育60 min，取出后用PBS缓冲溶液冲洗，即得C-myc单克隆抗体修饰的压电免疫传感芯片。

实施例 2

C-myc重组蛋白标准曲线的绘制：

1) 所用试剂（二次蒸馏水，PBS缓冲溶液）经灭菌处理后均保存于4℃环境中备用；

2) 取1.0 μL C-myc蛋白（抗原）置于1.5 mL 小试管中，用PBS溶液稀释，分别配制成0 ~ 10 ng/mL的一系列溶液备用；

3) 采用上述C-myc单克隆抗体修饰的传感芯片分别测试各浓度的C-myc重组蛋白样品，通过C-myc单克隆抗体和C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起压电石英晶体振荡频率发生变化，该频率变化与C-myc重组蛋白含量成线性响应关系：以C-myc蛋白的浓度(pg/mL)为横坐标，频率变化值(Hz)为纵坐标，绘制测定C-myc重组蛋白样品浓度的标准曲线（见图4内插图），通过C-myc对应浓度的频率变化值，即可测定出癌变组织样品中的C-myc重组蛋白的含量；

4) 测试完后，用0.1 mol/L HCl溶液洗脱回复，再用二次蒸馏水反复冲洗干净，于4℃冰箱中保存备用。

实施例 3

肝癌组织中C-myc重组蛋白含量的测定：

组织中蛋白的提取：取0.2 g组织标本，在4℃环境下用预冷的PBS冲洗干净除去组织异物。用剪刀剪成0.6 mm³小块并加入配置好的1.0 mL裂解液，再用PBS溶液稀释备用。

C-myc重组蛋白含量的测定：将上述制备好的传感芯片置于PBS缓冲溶液中，取上述稀释后的样品溶液进行测定，待频率稳定后记录频率变化值ΔF，把ΔF代入到拟合好的标准曲线方程中，即可算出该肝癌组织样品中C-myc重组蛋白的浓度值为2900 pg/mL。检测结果表明肝癌组织中致癌基因C-myc高表达，与ELISA的检测结果一致，且该芯片能进行定量检测，优于ELISA方法，说明该方法能对癌变组织中的C-myc重组蛋白含量进行准确测定，具有通用性。

实施例 4

乳腺癌细胞中C-myc重组蛋白含量检测：

采集乳腺组织样品，在实验室进行培养，得到C-myc突变的肿瘤细胞(MDA-MB-231)。培养条件：L-15培养基，15% (胎牛或小牛) 血清，5%CO₂，37℃温箱中培养。细胞生长状态：上皮样贴壁生长。

取0.2 g组织标本，在4℃的环境下用预冷的PBS冲洗干净除去组织异物。用剪刀剪成0.6 mm³小块并加入配置好的1.0 mL裂解液，再用PBS稀释备用。

取上述稀释后的样品溶液，用所制备传感芯片进行测试，将频率变化值代入到拟合好的标准曲线方程中，可以算出乳腺癌细胞稀释液中的C-myc含量为5400 pg/mL。检测结果表明致癌基因C-myc高表达，与ELISA的检测结果一致，且该芯片能进行定量检测，优于ELISA方法，说明该方法能对癌变组织中的C-myc重组蛋白含量进行准确测定，具有通用性。

实施例 5

回收率的测定：

本实施例测定所制备压电免疫传感芯片对不同浓度C-myc蛋白样品的回收率，并与ELISA方法比较。在1%的鼠血清样品中加入已知量的C-myc样品溶液，然后测定各样品的频率变化值，计算△F，对照工作曲线找出浓度，比较测得的加入量和实际加入量，所得回收率在范围96.2%-108.6%内，而ELISA仅能做出定性检测，说明本芯片优于ELISA法，且回收率好，在致癌基因C-myc蛋白检测方面具有实际应用价值。

实施例 6

选择性的测定：

固定主响应C-myc重组蛋白浓度为9500 pg/mL，增大干扰物质浓度为主响应蛋白浓度100倍，即干扰蛋白浓度为950 ng/mL。所考察的干扰蛋白分别为：牛血清白蛋白、猪血红蛋白、牛白蛋白、转铁蛋白、人血红蛋白、凝血酶、溶菌酶。当C-myc重组蛋白的浓度为9500 pg/mL的时候，频率变化值为50 ± 2.0 Hz。当加入浓度为响应蛋白浓度100倍的干扰物时，频率变化的移动偏差均在5%以内，由此可见，上述蛋白物质对C-myc单克隆抗体识别C-myc重组蛋白的过程不会产生明显的干扰影响，说明所述压电免疫传感芯片对C-myc重组蛋白有很好的特异选择性。

实施例 7

重现性的测定：

本实施例测定所制备的压电免疫传感芯片对响应不同浓度C-myc重组蛋白溶液的频率变化值的重现性，对3200 pg/mL和9500 pg/mL的C-myc重组蛋白样品重复测定12次，获得的相对标准偏差分别为3.92%和1.52%，说明所述压电免疫传感芯片有着良好的重现性，确保了所测实验数据的准确性。

Claims

1.一种用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的压电免疫传感芯片，其特征在于所述压电免疫传感芯片的组装结构自压电石英晶体到最外层依次为：压电石英晶体片(7)未封闭的单面金膜(1)、L-半胱氨酸单分子层(2)、戊二醛单分子层(3)、C-myc单克隆抗体(4)。

2.根据权利要求1所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片的组装制备过程如下：

1) 首先将压电石英晶体片(7)的一侧单面金膜(6)用与晶体直径相当的聚氯乙烯塑料管(9)和聚对苯二甲酸类塑料片(8)通过环氧树脂AB胶作粘连剂封闭在一密闭空腔内，即封闭了压电石英晶体片(7)的一侧单面金膜(6)，得到其另一侧未封闭的单面金膜(1)；

2) 将Piranha溶液滴在上述压电石英晶体片(7)未封闭的单面金膜(1)表面浸润1 ~ 10 min，之后用二次蒸馏水反复冲洗；其中，Piranha溶液为浓硫酸：双氧水 = 7 ：3的溶液；

3) 将上述步骤处理的单面金膜(1)置于1 ~ 100 mmol/L L-半胱氨酸中避光反应1~ 24 h，形成L-半胱氨酸单分子层(2)，之后用pH=7.4的10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗，以优化L-半胱氨酸单分子层(2)；

4) 将上述步骤处理的单面金膜(1)置于0.1 ~ 10% (W/W)的戊二醛溶液中活化1 ~ 120 min，用二次蒸馏水反复冲洗后就会在上述步骤处理的单面金膜(1)表面形成戊二醛单分子层(3)，再分别用0.1 ~ 10% (V/V)的乙二胺、0.1 ~ 10 mmol/L的巯基乙醇清洗上述步骤处理的单面金膜(1)表面，以封闭非特异性结合位点；

5) 将上述步骤处理的单面金膜(1)于C-myc单克隆抗体(4)中在37℃下温育1 ~ 120 min，取出用PBS缓冲溶液冲洗，即得C-myc单克隆抗体(4)修饰的压电免疫传感芯片。

3.根据权利要求1所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片的检测装置的组装过程如下：

1) 将溶液置于玻璃反应池(13)中，玻璃反应池(13)的底部放置一个搅拌磁子(14)，并置于磁力搅拌器(15)上，在玻璃反应池(13)的下端安装一个放液管(11)和一个开关阀门(12)；

2) 将压电石英晶体片(7)未封闭的单面金膜(1)浸入溶液中，通过金电极引脚(10)与TTL振荡电路(16)连接，TTL振荡电路(16)再与频率计数器(17)相连接，构成一个完整的传感检测回路。

4.根据权利要求1所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片的检测方法是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体(4)和C-myc重组蛋白(5)的免疫反应结合，引起石英晶体振荡频率发生变化，与C-myc重组蛋白(5)含量成线性响应关系而达到检测目的。

5.根据权利要求2所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片上的聚氯乙烯塑料管的管壁厚度为0.1 ~ 2 mm，管高度为1 ~ 10 mm。

6.根据权利要求2所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片上的聚对苯二甲酸类塑料片的厚度为0.01 ~ 0.5 mm。

7.根据权利要求2所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片上的压电石英晶体的基频为5 ~ 12 MHz，其振荡形式为液相单面起振。

8.根据权利要求2所述的压电免疫传感芯片，其特征在于固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体(4)的吸附量为1 ~ 1000 ng∙mL^-1∙mm^-2。

9.根据权利要求4所述的压电免疫传感芯片，其特征在于所述传感芯片对癌变组织中C-myc重组蛋白(5)含量能进行准确测定，其回收率为96.2 ~ 108.6%，线性范围为530 ~ 9600 pg/mL，检测下限达到530 pg/mL。