CN104198706B - 一种肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法，涉及电化学免疫分析技术领域，特别是肿瘤标志物电化学免疫检的测技术方法。首先选用优良性能的特殊形貌半导体纳米结构材料，利用链酶亲和素可以将材料生物功能化，之后通过与生物素化抗体特异性结合制成免疫传感器。该免疫传感器能快速识别并捕获抗原和辣根过氧化酶标记的抗体，形成夹心免疫复合物，以硫堇和过氧化氢作为酶反应底物，可快速实现对肿瘤标志物的高灵敏度检测。该检测方法具有灵敏度高，检测限低，选择性好、重现性和稳定性好等优点，可用于血清中肿瘤标志物的定量检测。

Description

一种肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法
技术领域
本发明属于电化学免疫分析技术领域，特别是肿瘤标志物电化学免疫检的测技术方法。
背景技术
肿瘤标志物是指在恶性肿瘤细胞增殖过程中，由基因表达并合成分泌的一类物质。它们一般存在于肿瘤细胞和组织中，有时也能在血液或其他体液中检测到。理想的肿瘤标记物应具有高特异性，适于人群普查。肿瘤标志物的血清筛查可以简便地诊断癌症。就肝癌而言，甲胎蛋白(AFP)仍是特异性最强的标志物和诊断肝癌的主要指标。现已经广泛用于肝细胞癌的普查、诊断和判断治疗效果、预测复发。正常成人血清中AFP含量很少，高于20ng/ml就有患肝肿瘤的可能，因此，检测痕量AFP具有重要意义。
目前常用于检测肿瘤标志物的技术是免疫学技术。电化学免疫因仪器便携、灵敏度度高、操作简单等因而被广泛用于肿瘤标志物的检测。生物素-亲和素标记技术（Biotin-AvdinSystem，BAS）是免疫标记技术的一种，因为生物素-链酶亲和素系统的高特异性，且四个生物素可与一个链酶亲和素结合，由此将信号放大。
近年来，纳米材料逐步应用到生物传感器的领域中。纳米材料由于其比表面积大、导电性好、生物相容性高等优点被引入到电化学免疫传感器中。纳米材料的生物功能化可以提高它的生物相容性和生物识别能力。因此，利用链霉亲和素将纳米结构材料进行生物功能化，建立一个基于链霉亲和素功能化半导体纳米材料的电化学免疫分析方法检测肿瘤标志物，对肿瘤的早期诊断有重要意义。
发明内容
本发明目的在于：在一般的电化学免疫方法的基础上，提出一种引入生物素-亲和素放大系统，建立快速、简便的检测方法，以期提高灵敏度，降低检出限。
本发明包括以下步骤：
1）将花状形貌的硫化铋纳米结构材料分散于水中制成硫化铋水溶液，然后将硫化铋水溶液与链霉亲和素混合，取得硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液；
2）取硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液滴涂于洁净的玻碳电极表面，置于4℃的温度环境下干燥后，再在玻碳电极表面均匀地修饰一层Nafion膜，再采用牛血清蛋白封闭活性位点，然后滴入生物素化抗体，即制得肿瘤标志物电化学免疫传感器。
本发明通过选用具有优良性能的特殊形貌半导体材料——花状形貌的硫化铋纳米结构材料，利用链霉亲和素将其生物功能化而制得了一种基于链霉亲和素功能化的硫化铋半导体纳米材料的肿瘤标志物电化学免疫传感器。制成的免疫传感器，利用夹心免疫反应，引入生物素-链酶亲和素系统，可为肿瘤标志物检测
提供一种快速、高灵敏、信号放大电化学免疫分析系统检测肿瘤标志物的方法。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）纳米结构材料因其比表面积大、生物相容性高、吸附能力强、表面活性高等优点，可以利用链霉亲和素将其进行生物功能化，来提高稳定性和重复性。
（2）每个亲和素可结合4个生物素，可使反应信号明显放大。此在一般的电化学免疫方法的基础上引入生物素-亲和素放大系统建立快速、简便的检测方法，以期提高灵敏度，降低检出限。
所述步骤1）中，所述硫化铋纳米结构材料与水的混合质量比为1：1。
所述链霉亲和素的浓度为200μg/mL，所述链霉亲和素与硫化铋水溶液的混合体积比为1：1。
另外，所述洁净的玻碳电极的处理方法是：取玻碳电极，先用粒径不大于0.05mm的氧化铝粉抛光，再用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，再放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，取得清洁的玻碳电极。
为了有效去除表面残留的氧化铝和其它杂质，所述稀硝酸溶液是由体积比为1:1的硝酸和水混合形成的稀硝酸水溶液。
附图说明
图1为本发明肿瘤标志物免疫传感器制备及免疫分析示意图。
图2为免疫传感器在不同浓度甲胎蛋白抗原的温育液中温育40min后在含0.5mM硫堇和5.0mM过氧化氢的pH为7.0的PBS中的差分脉冲伏安曲线。
图3为电流与甲胎蛋白抗原浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面对本发明的实验过程进行详细的说明，旨在使本发明的设计流程、设计目的及其创新点和优点更加明了。
实施例1，如图1所示：
（1）取1mg花状形貌硫化铋纳米结构材料超声分散分散于1mL水中，得到硫化铋水溶液，然后将40μL硫化铋水溶液和40μL浓度为200μg/mL的链霉亲和素混合，得到硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液。
（2）取玻碳电极，先用粒径为0.05mm的氧化铝粉抛光电极表面，经用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，再放入硝酸与水1:1的体积比混合的稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，取得清洁的玻碳电极。
（3）取硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液滴涂于经步骤（2）预处理的玻碳电极表面，然后置于4℃的温度环境下干燥，再在玻碳电极表面均匀地修饰一层Nafion膜（聚四氟乙烯的阳离子交换膜），最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点，之后滴入10μL甲胎蛋白生物素化抗体，经过40min，甲胎蛋白生物素化抗体与链霉亲和素结合，制得甲胎蛋白免疫传感器。
（4）将购买的甲胎蛋白抗原标准溶液以磷酸盐缓冲溶液稀释至浓度分别为0.01，0.02，2，4，6，8，10，20，和25ng/mL，再将不同浓度的甲胎蛋白抗原溶液和酶标抗体混合，得到九种含有甲胎蛋白抗原和酶标抗体的温育液。
将制得的甲胎蛋白免疫传感器分别置于九种含有甲胎蛋白抗原和酶标抗体的温育液中温育40min，形成夹心复合物。以含0.5mM硫堇和5.0mM过氧化氢作为酶反应底物，利用三电极体系检测各自的电流信号，取得如图2所示的pH为7.0的PBS中差分脉冲伏安曲线图，并分别记录各峰值电流。
三电极体系是经过前处理的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极。
以峰值电流为纵坐标，以不同浓度的甲胎蛋白抗原溶液为横坐标，制成图3的关系图。
由图3可见：电流随甲胎蛋白抗原浓度的变大而变大，且呈线性关系。
（5）应用：
为考察该方法的准确性与实际应用价值，检测了5份临床血清样本中甲胎蛋白的浓度，所得结果与参考进行了比较。结果如表1，两者具有良好的一致性，相对误差小于10%。
实施例2：
（1）取1mg花状形貌硫化铋纳米结构材料分散于1mL水中超声分散均匀得到硫化铋水溶液，之后将40μL硫化铋水溶液和40μL的200μg/mL链霉亲和素进行混合，得到硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液。
（2）采用粒径小于0.05mm的氧化铝粉对玻碳电极进行表面抛光，经去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，再放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
（3）取硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液滴涂于经步骤（2）预处理的玻碳电极表面，置于4℃的温度环境下干燥后，再在玻碳电极表面均匀地修饰一层Nafion膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点，之后滴入10μL癌胚抗原生物素化抗体，经40min，癌胚抗原生物素化抗体与链霉亲和素结合，制得癌胚抗原免疫传感器。
（4）将制得癌胚抗原免疫传感器置于含有癌胚抗原抗原和酶标抗体的温育液中温育40min，形成夹心复合物。以硫堇和过氧化氢作为酶反应底物，利用三电极体系检测其电流信号。
类同与上例，也可制得电流随癌胚抗原浓度的线性关系图。

Claims (5)

1.一种肿瘤标志物电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将花状形貌的硫化铋纳米结构材料分散于水中制成硫化铋水溶液，然后将硫化铋水溶液与链霉亲和素混合，取得硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液；
2）取硫化铋纳米结构材料/链霉亲和素的混合溶液滴涂于洁净的玻碳电极表面，置于4℃的温度环境下干燥后，再在玻碳电极表面均匀地修饰一层Nafion膜，再采用牛血清蛋白封闭活性位点，然后滴入生物素化抗体，即制得肿瘤标志物电化学免疫传感器。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于所述步骤1）中，所述硫化铋纳米结构材料与水的混合质量比为1：1。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于所述链霉亲和素的浓度为200μg/mL，所述链霉亲和素与硫化铋水溶液的混合体积比为1：1。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于所述洁净的玻碳电极的处理方法是：取玻碳电极，先用粒径不大于0.05mm的氧化铝粉抛光，再用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，再放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，取得清洁的玻碳电极。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述稀硝酸溶液是由体积比为1:1的硝酸和水混合形成的稀硝酸水溶液。
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