CN106404915B - 一种细胞牵引力的实时与定量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞牵引力的实时与定量测定方法。所述方法是将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子；向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS：ΔS＝(KAT‑KBT)‑l[tq ATΔfAT/frAT‑tqBTΔfBT/frBT]；式中，KAT＝2.75×10‑ l2cm2dyn‑1，KBT＝‑2.65×10‑l2cm2dyn‑1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数；frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率，tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度，均为常数。tqAT＝1.661/frAT；tqBT＝2.536/frBT。

Description

一种细胞牵引力的实时与定量测定方法
技术领域
本发明涉及一种细胞牵引力的实时与定量测定方法。
背景技术
越来越多的研究表明，除生化信号外，细胞与细胞之间及细胞与其微环境之间通过力信号进行交流。细胞微环境的几何与力学性能对细胞的形态与功能影响巨大。许多生理过程，包括细胞黏附、细胞骨架极性、细胞增生、细胞分化、胚胎形成与发育、癌症转移、伤口愈合等受细胞与它们微环境之间物理力传输与敏感的显著影响。因此准确估算细胞在各种生理条件下施加于其基质上的牵引力能提供有关各种类型细胞与其微环境之间力相互作用许多基本问题的重要启示。过去几十年来，人们开发了几种用于评估细胞牵引力的重要技术，可绝大部分技术仅限用于单个、相互分离的细胞牵引力的计算。这些技术的一个共同特点是采用软弹性基底，通过细胞与弹性基底相互作用引起的基底变形来测定或计算细胞牵引力。弹性基底有连续基底与不连续基底两种形式，前者包括可起皱的薄硅膜和荧光微珠嵌入聚丙烯酰胺凝胶，后者有微加工悬臂阵列和微柱阵列。以微柱阵列为例，细胞主要黏附于与基底垂直微柱的上面，可以直接根据微柱的弯曲变形程度与方向测定与细胞接触点牵引力的大小与方向。这种微制作结构基底制作工艺相对复杂；且由于细胞与基底之间属于非完全接触、微结构的形貌可能显著影响贴壁细胞的形态与功能，显然这种技术只能测得这些非连续、预定接触点的细胞牵引力。
到目前为止应用最广、用于细胞牵引力的技术是基于连续弹性基底的细胞牵引力显微镜(TFM)。基底与细胞之间的接触为面接触，更为接近细胞真实生理环境，因此用于测定细胞牵引力的TFM，也更容易被广大研究人员所接受。自1995年起，Lee,Jacobsen和Dembo等及其他小组开发了几种用于测定迁移或静止细胞在软基质上所产生细胞牵引力的几种牵引力显微镜技术。TFM通过培养在具已知弹性软基底、比如聚丙烯酰胺(PA)胶上细胞所产生的基底变形来计算细胞牵引力。将细胞培养在这种弹性基底上，细胞收缩过程中对基底产生的牵引力使基底产生变形，这种变形反映到荧光微珠的运动；用荧光显微镜采集荧光微珠的运动信息，经图像处理后，得到基底的应变信息，然后通过一定的力学模型，定量反演出细胞的牵引力；细胞收缩或迁移过程中各个时刻的力分布就可以可视化在计算机屏幕上，因此这种方法也形象地称为“牵引力显微镜”(Traction Force Microscopy，TFM)。
从定量理论上说，细胞牵引力的测量计算属于反问题范畴，而反问题的一个共同重要特点是他们的病态，这使得无论是理论分析或是数值计算都有特定的困难，主要表现为方程的解不是连续地依赖于观测数据(输入数据)。换句话说，观测数据的微小偏差都可能导致解的很大变动。在实际问题中，一般观测数据的误差(或噪声)在所难免，因此，通过这些或多或少带有误差(或噪声)的观测数据反推得到的方程解极有可能偏离真解相对较远。
综上，目前绝大部分用于细胞牵引力的测定方法仅限于单细胞分析。微制造软基底工艺复杂，且微柱之间空隙较大，细胞仅能与柱子形成黏附结构，与体内细胞环境差异较大，因而微柱结构与形貌可能对细胞正常生理与功能有影响。软凝胶牵引力显微镜并非对牵引力的直接测定，而是利用荧光显微镜观察埋在凝胶下荧光标记微珠的位移来计算。虽然荧光薄膜制作过程中的倒置步骤可保证大多数荧光微粒沉积于薄膜表面，但是经过24小时或48小时长时间浸泡后，荧光微粒可能会从孔隙逸出至培养基中，还可下降到薄膜中，致使荧光薄膜表面荧光密度减低。在实际的拍摄过程中，一般选取距离表面1μm的薄膜平面，但是普通荧光显微镜相对大的景深可能会拍摄到不同平面的荧光微粒，这为后续的位移计算带来了误差。长时间激光照射可使荧光素淬灭，还可能对细胞活性产生影响。此外凝胶薄膜在培养基长期浸泡过程中其本身的弹性模量将发生变化，必须测量培养基浸泡相应时间点的凝胶弹氏模量，方可得到精确的细胞牵引力。因此目前的细胞牵引力测定方法不适合于对细胞牵引力的长期与连续测定，而细胞功能(如细胞生长和分化)的变化需几天到几周，显然目前的细胞牵引力测定技术是不利于细胞功能研究的，因此也很难反映细胞的真实的生理状况。
由于包括细胞牵引力显微镜在内的方法仅限于单细胞测定，而细胞与细胞之间的异质性，为了比较并得出细胞在不同病理或生理或不同激励下细胞牵引力具有统计意义的变化规律，需要分析大量样本，因此需花大量时间。这些技术都是基于细胞力引起的柔性基底或传感器的变形，必须通过照相和冗长的图像处理、模型建立与计算来求得细胞牵引力的大小。因此细胞牵引力显微镜技术目前仅限于在少数专门的研究实验室(主要是力生物学领域)中使用。
无论是细胞牵引力显微镜用到的凝胶还是微制造软微柱，细胞可在基底上自由运动而呈任意形状，由于几何约束的缺乏而无法实现对细胞力的自动测定，因而不适于大规模实验。采用微图案技术可以将单个细胞固定，降低细胞-细胞之间的差异性且细胞产生力的位置得以控制而使力的计算得以简化，因而提高了细胞牵引力测定的通量数。可是微图案增加了实验步骤与难度，且力的测定仍需由荧光微珠的位移数据经复杂的计算求取。此外，虽细胞形状得以控制，细胞力仍是离散分布的，因此细胞引起的基底变形复杂，不同细胞之间不同。
近年，细胞力显微镜已被扩展到几个细胞及细胞单层牵引力(单层牵引力显微镜，monolayer traction microscopy(MTM))的测定。最新的进展还包括96通道细胞单层牵引力用于药物筛选方法的建立，依据的是细胞单层与加药1小时后牵引力的相对变化，因此只是实现了对固定终点的测试，而细胞黏附及药物作用过程的动态牵引力变化未能跟踪。虽然这些方法是非常有用的，然而更为理想的是能够在通用细胞培养皿构型下实现对不同细胞数目或不同细胞-细胞相至作用下细胞牵引或收缩力的实时、连续、定量测定。唯此，才能真正将细胞牵引力作为一个重要的生物物理指标来表征细胞的表型，从而更好地了解许多重要生物过程的细胞与分子机理而被广大的包括细胞生物学在内的生物学领域所接受与使用。
发明内容
目前的细胞牵引力测定方法主要依赖于细胞引起的软基底形变，需要通过光学或荧光显微镜来测定或跟踪形变。本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种细胞牵引力的实时与定量测定方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述细胞牵引力的实时与定量测定方法包括如下步骤：
(1)将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子；
(2)向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS：ΔS＝(KAT-KBT)-l[tq ATΔfAT/frAT-tqBTΔfBT/frBT]；
式中，KAT＝2.75×10-l2cm2dyn-1，KBT＝-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数；frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率，tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度，均为常数。tqAT＝1.661/frAT；tqBT＝2.536/frBT。
所述细胞黏附分子，主要包括如下几大类：1)能与跨膜蛋白、力敏分子整合素(integrin)相互作用的细胞外基质分子，纤粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(lamnin)、玻璃粘连蛋白(vitronectin)、胶原蛋白(collagen)等；2)上述细胞外基质生物模拟分子，如含有RGD粘附序列多肽；3)能与细胞表面其它受体(如钙粘蛋白)相互作用的分子；4)以其它机制与细胞表面作用而促进细胞粘附的分子，如poly-l-lysine(聚赖氨酸)等。由于细胞培养基中一般添加有一定成分的胎牛血清，而胎牛血清本身含有促进细胞贴壁、铺展与生长的痕量蛋白，因此传感器表面即便没有修饰细胞黏附分子(如祼金电极)，也可通过吸附培养基中的这些成分而实现对细胞的粘附，此外，细胞本身也具备分泌细胞外基质的功能而促进其在传感器表面的粘附。
虽然细胞牵引力一般指的是通过细胞与基质形成粘着斑而施加给基质的力，但只要细胞能粘附于基质上，不管是否形成粘着斑，甚至不管粘附是通过化学作用还是机械作用，都能对所粘附基质施加表面应力。在无粘着斑形成的情况下，细胞与基质的相互作用力叫做细胞粘附力。此外，细胞生长、运动、分化等过程对基质也将产生程度不一的力。一般来说，细胞在基质上可能产生力的大小顺序为：分裂时产生的力>牵引力>粘附力。所有这些力都可用本发明的技术进行实时、定量、连续测定与研究。且本发明可用于研究与比较不同细胞黏附分子及各种机械形貌对这些力响应的动态影响。此外，本发明可用于研究细胞处于不同内外环境激励下细胞力的动态变化规律，如药物的影响。
本发明适用于所有贴壁细胞，包括原代细胞与传代细胞。并可扩展到悬浮细胞，包括直接研究悬浮细胞与基质弱相互作用力、通过基质上修饰与悬浮细胞表面相互作用的分子或材料进行研究。进一步推广该发明适用于所有细胞，包括原核细胞与真核细胞。即除动物细胞外，还可应用于所有细菌、真菌、植物细胞。
下面对本发明作进一步说明：
本发明的核心技术基于压电双谐振技术，具体地采用AT切与BT切石英晶体，AT切与BT切取向晶体的应力系数大小几乎一样，但是符号相反。应力变化，可经所谓的“双谐振器技术”根据两谐振器对同一界面过程的频移来估算。即只要满足外来沉积物在AT切与BT切表面沉积过程产生的质量与应力相同的条件，则表面沉积过程所伴随的质量与应力可据AT与BT切晶体的厚度(或频率)及两切型晶体的频率变化定量求出。这种技术曾被用于石英晶体上离子溅射金属薄膜、氢在金属钯上吸附及pH值变化引起的羧酸自组装硫醇薄膜相变伴随的动态表面应力测定，可该技术尚未应用于活细胞研究。这之前Tan等人首次提出了细胞黏附引起的表面应力是细胞黏附压电石英晶体微天平(QCM)响应的一个主要机制，他们通过假设质量的影响可以忽略不计，并把细胞看成牛顿流体，在用扫描电化学显微镜(SECM)获得了AT切石英晶体的力-频率常数后计算了细胞黏附过程的动态应力变化。这项工作非常重要，它表明了用QCM技术测定细胞收缩或牵引力的潜力，但有一定的局限性。虽然牛顿液滴已被用来作为活细胞的力学模型，但主要用于悬浮细胞，在这里过为简单化了，其假设可能只有在细胞和传感器之间仅存在弱相互作用时成立，对于质量效应的影响亦可能如此，事实上上述研究人员所用的细胞数目均为60,000，此时细胞-细胞作用较强，形成了细胞单层；因而细胞-传感器之间的相互作用才较弱。此外，单一AT切型亦无法确定细胞表面应力的方向。BT切石英晶体尚未应用于活细胞研究，本发明首次提出并利用AT切与BT切两种不同取向的晶体来实现实时定量测定细胞黏附过程及随后药物等作用下细胞施加给石英晶体的表面应力(收缩或牵引力)的大小和方向(压或张应力)。在无其他因素影响下，对这两种取向的晶体，应力变化将引起同样大小但是符号相反的频移变化。特别地，对于频率、表面粗糙度相同，以同样方式在表面修饰相同表面分子的AT切与BT切晶体，它们对质量与粘弹性的响应灵敏度应该相同。因此，在整个细胞粘附过程的任何时间晶体所受的表面应力或细胞牵引力总是可以由下面方程准备求出：
ΔS＝(KAT-KBT)-l[tq ATΔfAT/frAT-tqBTΔfBT/frBT] (1)
式中，KAT＝2.75×10-l2cm2dyn-1，KBT＝-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数；frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率，tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度，均为常数。因此细胞在黏附过程或药物作用下施加给晶体上的表面应力或牵引力可据为AT切、BT切晶体在任意时间相对于其参考点(如在培养基中的稳定值或加药前的稳定值)的频移ΔfAT,ΔfBT(单位为Hz)由(1)式定量求出。而石英晶体频率为数字信号，很容易经频率计数装置或QCM专用仪器高速、连续地采取与测定。
如对于9MHz AT切与BT切晶体，frAT＝frBT＝9MHz＝9×106Hz,tqAT＝0.0185cm，tqBT＝0.0283cm。
则(1)式简化为
ΔS＝2.058×104(0.0185ΔfAT-0.0282ΔfBT)(dyne/cm) (2)
所求出表面应力ΔS的单位为dyn/cm。ΔS为负号时，表明细胞施加的是压应力(细胞收缩或正性肌力作用时)，正号时所施加的为张应力(细胞铺展或时负性肌力作用时)。
本发明最核心的内容在于首次提出并利用AT与BT切双谐振石英微天平技术用于定量测定细胞的牵引力。双谐振器技术用于表面应力测定最早是由Errol P.EerNisse提出来的，本发明所用到的公式亦是基于EerNisse的成果，但我们的研究对象为细胞，除EerNisse考虑到的质量与表面应力效应外，细胞还具一定粘弹性。我们认为并经在不同重量百分比浓度蔗糖水溶液的实验证实相同频率的AT切与BT切石英晶体具有相同的对溶液粘、密度的响应规律，因此可认为同频率两种切型对(细胞)粘弹性的响应规律一致，故仍可用本发明中的公式定量计算细胞牵引力。公式中的KAT与KBT分别为给定晶体取向AT与BT切石英晶体的应力系数，为常数。两种切型的厚度与其频率之间的关系由各自的频率常数N决定，AT切与BT切石英晶体的频率常数分别为NAT＝1.661MHz-mm与NBT＝2.536MHz-mm。因此对于谐振频率fr确定的石英晶体，其厚度tq也就相应确定了，具体地：tqAT＝1.661/frAT；tqBT＝2.536/frBT。因此石英晶体的频率越高，其片子越薄。由于太薄的晶片易碎、不好加工与操作，因而限制了AT与BT切石英晶体基频的频率上限分别为40MHz与60MHz左右。可是通过如下两种途径可大大提高石英晶体的工作频率：1)在石英晶片中间经离子溅射等技术将晶片刻蚀到所需频率厚度，然后仅在刻蚀部分被镀金属电极而将石英晶体振荡限制在薄的能限区域；2)工作在泛音模式，石英晶体除可工作在基频外，还可在3、5、7、9、11等泛音次数下工作。通过这两种方法，目前的技术水平可使石英晶体工作频率提高到400MHz左右。AT与BT切石英晶体的工作频率下限为0.5MHz左右。因此目前可用于细胞牵引力测定的AT与BT切石英晶体的工作频率范围可达0.5-400MHz，对应AT与BT切石英晶体厚度范围分别为5.5μm-3.3mm与6.3μm-5.1mm。
包括细胞牵引力在内所施加给石英晶体上表面应力变化ΔS引起的频率变化由如下公式给出：
Δfs＝fr,s-fr＝-KfrΔS/tq＝-KNfr2ΔS (3)
上式中fr,s为应力状态下的晶体谐振频率，K、N与fr分别为AT或BT切石英晶体的应力系数、频率常数与无应力状态下的谐振频率。因此应力引起的频率变化与晶体的工作谐振频率的平方成正比。由上式可估算出同样细胞牵引力下，300MHz下所引起的频率变化是9MHz时的1,111倍。9MHz石英晶体可检测少到1,000-5,000细胞及其细胞牵引力，因此300MHz石英晶体可望检测到单个细胞及其牵引力的变化。此外，这种极高频的双谐振器传感技术还可望用于分子相互作用(如高分子聚合或解聚)过程伴随力的动态变化监测。而石英晶体工作频率下限为0.5MHz，这样本发明技术可拓展应用到组织(如血管)、器官(如心脏、胚胎)甚至小的动物和植株。因此本发明技术可望用于从分子到单细胞、到细胞群、到组织和器官甚至到小的生物体不同层次所产生力的动态监测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)该方法可以对细胞黏附过程及包括药物等作用下细胞牵引力的实时、连续、动态测定，依据的是对高频AT与BT切石英晶体频率的监测，无需使用光学显微镜，测量的为数字频率信号，采样速度快(可达0.1秒一组数据)。由于该技术无损、且能与培养皿结构相兼容而放置CO2培养箱中长期监测，从而可实现对细胞运动、生长与分化等细胞功能所伴随细胞牵引力的连续与长期监测。所提出的方法所拥有的快速响应时间与采样速度和连续、动态、长期监测能力，是现有细胞牵引力方法无法达到的。
2)该方法可用于不同细胞数目(如100-60000)或不同细胞表面密度下细胞总的牵引力大小与方向的定量测定。通过提高晶体频率和/或采用细胞图案化可使检查细胞的数目进一步减少甚至可实现单细胞的测定。即本发明可望实现从单细胞到细胞单层细胞牵引力的定量测定。
3)动物贴壁细胞不仅与其相邻的细胞产生细胞间相互作用，同时也与细胞外基质相互接触和作用。本发明技术的另一特点是可通过在传感器表面修饰不同的细胞外基质成分与细胞黏附分子并改变它们的表面密度从而定量考察对细胞牵引力的影响并与细胞的功能与行为联系起来。此外，采用光透传感器电极与荧光标记黏着斑蛋白，可将传感器测得的细胞牵引力与细胞形态(铺展程度)及黏着斑结构联系起来。而细胞牵引力主要是通过黏着斑施加到细胞外基质上的；黏着斑上丰富的信号蛋白分子也可将感知到的细胞外微环境中的物理和化学信息传递到细胞内部，引发一系列胞内生物化学反应，从而对细胞的功能和行为产生重要影响(如细胞骨架结构的变化、基因表达的改变、细胞凋亡等)。因此本发明为定量研究细胞力敏和应用于细胞生物学等领域提供了一种新的有效工具。
总之，本发明与基于基底形变测定原理不同，采用的是直接敏感细胞力的传感器技术，细胞牵引力的大小与方向通过施加于传感器上的表面应力引起的传感器输出信号的改变而直接测量，因而无需光学显微镜拍照亦无需用到荧光标记微珠。本发明可适用于不同细胞数目或不同细胞-细胞作用下细胞群总的牵引力大小与方向的定量测定。本发明传感技术无损、可用于不同细胞外基质下细胞黏附过程及随后药物等外部刺激下与细胞运动、生长、分化等过程细胞牵引力的实时、连续、动态测定。本发明所使用传感器可置于常规细胞培养皿的底部而与通用培养皿构型兼容以利推广到细胞生物学等广大领域。
附图说明
图1为用于细胞牵引力测试的两种构型；
图2为同时测定细胞牵引力与细胞形态、粘着斑信息的两种构型；
图3：实例:20,000大鼠心肌细胞(第一个箭头处加入)在AT切与BT切两种裸金电极上黏附及在125nM正性肌力药物ISO和25nM负性肌力药物VRP作用下(第二个箭头处加入最终浓度的ISO或VRP)的动态QCM黏附与力响应曲线。(A)黏附与ISO作用下的频移与动态电阻变化曲线,AT切；(B)黏附与VRP作用下的频移与动态电阻变化曲线,AT切；(C)黏附与ISO作用下的频移与动态电阻变化曲线,BT切；(D)黏附与VRP作用下的频移与动态电阻变化曲线,BT切；(E)黏附与ISO作用下的动态细胞牵引力变化曲线；(F)黏附与VRP作用下的动态细胞牵引力变化曲线；
图4：实例：20,000人脐静脉内皮细胞在不同KRGD浓度下修饰的9MHz AT与BT切石英晶体金电极上黏附过程的QCM频移与牵引力动态响应曲线。(A)黏附过程RGD修饰AT切晶体上的频移响应；(B)黏附过程RGD修饰BT切晶体上的频移响应；(C)黏附过程RGD修饰晶体上的细胞牵引力动态变化；
图5：实例:20,000人脐静脉内皮细胞在不同fibronectin浓度下修饰的9MHz AT与BT切石英晶体金电极上黏附过程的QCM频移、动态电阻变化与牵引力动态响应曲线。(A)黏附过程fibronectin修饰AT切晶体上的频移与动态电阻变化响应；(B)黏附过程fibronectin修饰BT切晶体上的频移与动态电阻变化响应；(C)黏附过程fibronectin修饰晶体上的细胞牵引力动态变化。
具体实施方式
由细胞内部、自身肌球蛋白产生的力一般都是由细胞边缘指向细胞中心，因此细胞牵引力又叫细胞内收缩力。图1给出了用AT与BT切双谐振技术定量测定细胞牵引力的两种构型。图1A中，AT切与BT切晶体处于两个不同的培养皿或检测池内，此时AT切与BT切晶体为相同频率与表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子，在向两个池子加入了相同数目与质量的同一批细胞后，通过实时检测两晶体的频率变化后便可由(1)式定量求出细胞的牵引力。图1B中，AT切与BT切晶体处于同一培养皿或检测池内，同样要求两晶体频率与表面形态一致和/或修饰相同的表面黏附分子，在向池子加入一定数目的细胞后，通过实时检测两晶体的频率变化后便可由(1)式定量求出细胞的牵引力。细胞牵引力的测定不需要显微镜，因此石英晶体表面所被金属电极及所修饰分子与材料不要求透明、可为任何材料、这是该方法的又一优势。具体地石英晶体表面可被有与细胞生物相容的金属金或非金属SiO2等。
理想地，为获得伴随细胞牵引力变化的细胞形态与粘着斑等动态信息，QCM晶体可与光学或荧光显微镜联用，此时需用到光透QCM电极，比如ITO电极，同样可采用两种不同的构型，如图2A与2B所示。
所述细胞牵引力的实时与定量测定方法包括如下步骤：
(1)将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子；
(2)向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS：ΔS＝(KAT-KBT)-l[tq ATΔfAT/frAT-tqBTΔfBT/frBT]；
式中，KAT＝2.75×10-l2cm2dyn-1，KBT＝-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数；frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率，tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度，均为常数。
细胞牵引力双谐振技术实验
祼金电极AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤如下：
1)将1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30％H2O2:H2SO4)滴到石英晶体金电极中央，处理约30s，然后用蒸馏水冲洗，氮气干燥，重复该步骤3次。
2)将晶体组装于Teflon井型池。
3)在用蒸馏水清洗池两次后，加约300μL灭菌水，置于37℃，5％CO2培养箱中。
4)检查确定8通道QCM仪器QCA922有晶体谐振频率与动态电阻输出，依次连接检测池，确定每一检测池(如两个AT切、两个BT切晶体检测池)都工作，启动软件开始采集数据。
5)待每一通道对应的数据稳定后，移除灭菌水，再用灭菌水清洗两次后用PBS清洗，后加入52μL含有胎牛血清的DMEM培养基，采集QCM谐振频率(f)与动态电阻(R)数据2h；再加入250μL含一定数量(如20000个)的H9C2大鼠心肌细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养基后，连续采集f与R数据约20h。每一通道细胞粘附不同时间引起的QCM相对频移Δf与动态电阻变化ΔR以该通道在时间(t)时的QCM响应值减去其在培养基中的相应稳定值而求出。
6)实验完毕，收集培养基，用PBS轻轻清洗，加入胰蛋白酶消化处理，对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
7)细胞粘附过程细胞牵引力的动态变化ΔS可据相应成对AT与BT切石英晶体在时间t时的频移Δft AT与Δft BT由下式定量求出：
ΔSt＝(KAT-KBT)-l[tq ATΔft AT/frAT-tqBTΔft BT/frBT] (1)
式中，ΔSt为细胞在粘附时间为t时的牵引力，KAT＝2.75×10-l2cm2dyn-1，KBT＝-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为给定晶体取向AT与BT切石英晶体的应力系数，为常数。frAT与frBT分别为AT切与BT切石英晶体的谐振频率；tqAT与tqBT分别为AT切与BT切石英晶体的厚度，两种切型的厚度与其频率之间的关系由各自的频率常数N决定，AT切与BT切石英晶体的频率常数分别为NAT＝1.661MHz-mm与NBT＝2.536MHz-mm。因此对于谐振频率fr确定的石英晶体，其厚度tq也就相应确定了，具体地：tqAT＝1.661/frAT；tqBT＝2.536/frBT。本发明实验中采用的晶体频率为9MHz，此时tqAT＝0.0185cm，tqBT＝0.0282cm。因此(1)式可简化为：
ΔSt＝2.058×104(0.0185Δft AT-0.0282Δft BT)(dyne/cm) (2)
修饰有特异性细胞黏附分子RGD与fibronectin的AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤如下：
1)无水乙醇、Millipore清洗，氮气吹干AT与BT切9MHz晶体。
2)滴加1滴Piranha溶液(80℃1:3(v:v)30％H2O2:H2SO4)于石英晶体金电极上处理30S，用Millipore水、无水乙醇清洗，氮气吹干，重复3次。将无水乙醇滴到电极上静置几分钟，灭菌水冲洗，氮气吹干。
3)将表面处理好的AT与BT切石英晶体安装至Teflon井型池中。
4)室温下向池中加入20mM的3-巯基丙酸与1mM的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚的混合无水乙醇溶液，避光静置过夜。
5)取出溶液，用无菌水冲洗；加入溶有150mM EDC和30mM NHS的PBS缓冲溶液(pH＝5.5)，静置约30min。
6)取出溶液，用PBS缓冲溶液(pH＝5.5)、灭菌水冲洗；加入不同浓度的KRGD或fibronectin的PBS溶液，静置反应1-2h(RGDK)或过夜(fibronectin)。
7)取出溶液，用灭菌后的PBS、无菌水冲洗，得到KRGD或fibronectin修饰的金电极。加入20,000HUVEC或H9C2细胞，开启QCM进行监测。
8)实验完毕，收集培养基，用PBS轻轻清洗，加入胰蛋白酶消化处理，对所收集成分中细胞用细胞计数仪测定。
9)细胞粘附过程细胞牵引力的动态变化ΔS可据修饰有同样浓度的RGD或fibronectinAT与BT切石英晶体在时间t时的频移Δft AT与Δft BT由(2)式定量求出。
AT与BT切金电极表面修饰RGD多肽与fibronectin系通过在金电极表面经自组装修饰带有羧基的官能团及防止非特异性细胞粘附的PEG之后经化学耦合而实现。具体地，1)将经过Piranha溶液处理与乙醇清洗的AT切与BT切石英晶体金电极组装到Teflon井型池中，室温下向池中加入20mM的3-巯基丙酸与1mM的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚的混合无水乙醇溶液，避光静置过夜，取出溶液后，用无菌水冲洗；再继续加入溶有150mM EDC和30mM NHS的PBS缓冲溶液(pH＝5.5)，静置约30min后取出，PBS缓冲溶液(pH＝5.5)、灭菌水冲洗；加入不同浓度的RGDK或fibronectin的PBS溶液，静置反应1-2h(RGDK)或过夜(fibronectin)，分别用灭菌后的PBS、无菌水冲洗，取出溶液后得到KRGD或fibronectin修饰的金电极；之后直接加入20,000人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，开启QCM进行监测。
心血管激动药物isoprenaline(ISO)和抑制药物verapamil(VRP)对细胞牵引力的影响实验步骤
取四个Teflon井型池，两个相同的9MHz AT切和两个相同的9MHz BT切被金电极晶体，按前述祼金电极AT与BT切石英晶体测定细胞牵引力的步骤，在四个池子中分别加入20,000个细胞，培养20h后，从四个池中分别取出5μL培养液，向其中的两个AT与BT切晶体检测池分别加入5μL 10μM ISO和5μL 2μM VRP，继续监测20h，收集数据。
大鼠心肌细胞黏附过程及心血管肌力药物作用下细胞牵引力的动态变化
下面我们给出了用裸金9MHz AT与BT切石英晶体检测大鼠心肌H9C2细胞黏附及随后受正性肌力药物ISO和负性肌力药物VRP作用下的动态QCM响应，结果见图3。其中裸金电极是通过吸附DMEM中10％胎牛血清所含的贴壁因子而实现对H9C2细胞的非特异性黏附的。如图3A、C所示，随着ISO的加入，QCM上两种裸金电极AT切、BT切上的f(频率)均下降，R(动态电阻)均上升；在负性肌力药物VRP作用下的结果如图3B、D所示，随着VRP加入，QCM上f(频率)上升，R(动态电阻)下降，该结果与之前在AT切上的细胞黏附实验和药物实验趋势相吻合。此外，我们由双谐振AT与BT切频移据(2)式定量求出了细胞黏附过程及药物作用下细胞所施加给石英晶体表面应力或牵引力ΔS的动态变化(见图3E、F)。(2)式结果表明如ΔS为负号时，细胞施加的是压应力(细胞收缩或正性肌力作用时)，正号时所施加的为张应力(细胞铺展或负性肌力作用时)。由于裸金电极对细胞的黏附能力有限，图3的结果显示ΔS为负，即细胞在裸金电极上主要以收缩状态存在，这与细胞牵引力实际上是内收缩力的结论是一致的。在正性肌力药物ISO作用下，细胞收缩更为加强。在负性肌力药物VRP作用下，细胞收缩减弱。
人脐静脉内皮细胞在KRGD修饰金电极上黏附伴随的细胞牵引力变化
在9MHz AT与BT切石英晶体金电极上于不同KRGD浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)中修饰有不同表面密度细胞特异性黏附多肽RGD后在含2％胎牛血清的DMEM培养基中对20,000HUVECs细胞黏附阶段的QCM频移响应及其细胞牵引力动态变化如图4所示。AT切与BT切的频移响应曲线都表明在中等KRGD浓庋(50μg/mL)下修饰的石英晶体对细胞的黏附效果最好、频移最大(图4A与图4B)。图4C的结果表明细胞牵引力ΔS为正，且随着时间增加、ΔS很快增大到106dyne/cm,于8小时左右达到极值,之后有所降低。因此细胞在修饰有RGD分子的表面能很好铺展，细胞施加的为张应力，ΔS为正。与QCM频移响应结果一致，50μg/mLKRGD浓度下修饰的RGD表面给出最大的细胞牵引力，因此可认为在该RGD表面密度下，细胞与RGD有很好的相互作用并使细胞得以顺利铺展。细胞在较高浓度(100μg/mL)KRGD下修饰的RGD表面上所产生的牵引力最小，而该RGD浓度下QCM的频移响应处于中间值，这可能是由于在该RGD浓度下，细胞与传感器的相互作用由于RGD的取向受空间位阻影呴较之对细胞具最佳黏附效果的50μg/mL KRGD下有所减弱，可较25μg/mL KRGD浓度下还是要强很多，故频移处于中间值；但也正由于较强的细胞-传感器作用而可能影响了细胞铺展过程的细胞-细胞之间的作用而使细胞牵引力处于最小值。
人脐静脉内皮细胞在fibronectin修饰金电极上黏附伴随的细胞牵引力变化
图5给出了9MHz AT与BT切石英晶体金电极于不同fibronectin(FN)浓度(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)中修饰有不同表面密度细胞外基质蛋白FN后在含2％胎牛血清的DMEM培养基中对20,000HUVECs细胞黏附过程的QCM频移与动态电阻响应及其细胞牵引力动态变化，此外也给出了裸金电极的结果对照。可见在没有修饰FN的裸金电极上黏附20,000HUVECs所引起的QCM频移与动态电阻变化最小，说明此时对细胞的黏附最弱，细胞不能很好铺展、主要处于收缩状态，细胞牵引力ΔS为负。但随着黏附时间的增加，电极表面可能从培养基中吸附有利于细胞黏附的贴壁因子及细胞本身分泌的细胞外基质因子，ΔS向正的方向变化、细胞得以逐渐铺展，最后接近低FN浓度下(10μg/mL)修饰金电极上细胞牵引力的值。金电衱上修饰了FN后，细胞牵引力ΔS为正值，表明细胞能很好铺展，对晶体施加引应力。比较这三种FN浓度下修饰金电极ΔS的响应(图5C)，表明如同RGD下的情形，也是在中等浓度(20μg/mL)下ΔS为最大且较稳定，而此时的QCM频移与动态电阻响应也最大。在较低FN浓度(10μg/mL)下，细胞牵引力不仅最小，且随时间逐渐衰减，而相应的QCM频移与动态电阻变化响应也最小。高FN浓度(40μg/mL)下的QCM频移与动态电阻变化响应处于中间值，对应ΔS响应虽开始增加最快，但随时间变化有波动且呈现一定程度的衰减，因此最后稳定值反而低于中等浓度(20μg/mL)下的ΔS值。

Claims (2)

1.一种细胞牵引力的实时与定量测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将AT切石英晶体与BT切石英晶体置于培养皿或检测池内，所述AT切石英晶体与BT切石英晶体具有相同频率、表面形态和/或修饰了相同的表面黏附分子；
(2)向培养皿或检测池中加入待测细胞，通过如下公式测定出细胞牵引力ΔS：
ΔS＝(KAT-KBT)-l[tq ATΔfAT/frAT-tqBTΔfBT/frBT]；
公式中，KAT＝2.75×10-l2cm2dyn-1，KBT＝-2.65×10-l2cm2dyn-1分别为AT切石英晶体与BT切石英晶体的应力系数；frAT为AT切石英晶体的谐振频率、frBT为BT切石英晶体的谐振频率，tqAT为AT切石英晶体的厚度、tqBT为BT切石英晶体的厚度，均为常数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述公式中，tqAT＝1.661/frAT；tqBT＝2.536/frBT。
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