CN104232480A - 一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置与方法 - Google Patents

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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Abstract

本发明公开了一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置与方法，包括精密阻抗分析仪、多通道控制开关模块、QCM传感器阵列、细胞培养池阵列、细胞培养箱、控制器，其中，细胞培养池阵列中的QCM传感器阵列的每个QCM传感器分别接在多通道控制开关模块的各个开关上，各个QCM传感器放置在不同的细胞培养池中，各个细胞培养池放置于相同或不同的细胞培养箱中；控制器与多通道开关模块连接，驱动多通道开关模块中各个开关的开、合。本发明在相同培养环境下监测正常细胞和肿瘤细胞生长过程对比实验、在不同培养环境下相同细胞生长过程对比实验、用不同种凝集素修饰石英晶体监测其诱导正常细胞凝集生长过程的对比实验。

Description

一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置与方法
技术领域
本发明涉及一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置与方法。
背景技术
压电石英晶体微天平(QCM)是一种对质量变化高度敏感的化学传感器，具有灵敏度高，无需标记处理、可原位，实时监测界面过程的优点，被广泛用于分析化学的各个领域。QCM具有操作简便、连续监测、高灵敏度和特异性等特点。作为研究固液界面吸附过程和反应的有力工具,它在蛋白质、酶、抗原/抗体、核酸、细菌和细胞等生物学研究领域得到了广泛应用，目前已有大量关于使用QCM实时监测细胞培养过程的文献报道。
目前，采集QCM信息的方法主要包括主动分析法和被动分析法两种，前者QCM作为振荡电路的组成部分直接参与谐波的产生并起频率控制作用，具有仪器设备简单、信号连续、采样速率高的优点，易于构成传感器阵列。但主动法的主要缺点是只能提供频率变化一种信号，当QCM在液相中谐振时，仅从频率变化不能区分质量与非质量效应，而且在损耗较大的体系中由于不能实现稳定的谐振而不能应用。被动法将QCM作为一种无源的电子器件，用阻抗分析仪等测试其谐振频率与等效电路等，该方法的优点是信息量大，可以区分质量与非质量效应的影响，能监测电极表面的质量负载变化也可提供电极附近包括粘密度在内的某些物理量变化的信息，而且在损耗严重的体系中仍然可以应用，其缺点是仪器设备较为昂贵，响应速率较主动法低。
当用QCM实时监测细胞培养动力学过程时，细胞在QCM表面生长时，QCM的频率变化不仅来自表面的质量变化，同时还与细胞与表面的作用力、培养液的粘度、电导率等参数的变化有关，而且QCM在培养液中谐振损耗较大，因此多采用被动法进行监测。但细胞的培养通常需要较长的时间，而当前大多数精密阻抗分析仪只配备一个测量端，一次只能测定单个QCM的谐振参数，又因QCM对测定的电学环境敏感，监测过程中不宜拆换在测QCM传感器进行其它待测QCM的测定。当需要进行多组细胞实验时，单通道测定造成阻抗分析仪的使用效率低下，严重影响分析速度。虽然可以采用人工切换方法测定多个压电石英晶体的阻抗-时间曲线时，即依次将各石英晶体接入阻抗仪测量端，可分别测定各个QCM的谐振参数，但由于切换操作过程中，晶体和导线与测量端位置会发生细微变化，易导致监测结果误差增大，而且大幅度增加人工操作的工作量。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提出了一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置与方法，本装置通过智能控制精密阻抗分析仪和连接压电石英晶体的多通道开关系统，实现多通道的寻址访问与测定，使精密阻抗分析仪实时监测细胞生长过程的效率提高，并使实验结果更准确，可以将此方法再加以扩展应用到其他分析领域。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，包括精密阻抗分析仪、多通道控制开关模块、QCM传感器阵列、细胞培养池阵列、细胞培养箱、控制器，其中，精密阻抗分析仪与多通道控制开关模块相连，细胞培养池阵列中的QCM传感器阵列的每个QCM传感器分别接在多通道控制开关模块的各个开关上，由控制器发送连接与断开指令，实现各QCM传感器的信息采集与分析，各个QCM传感器放置在不同的细胞培养池中，各个细胞培养池放置于相同或不同的细胞培养箱中。
所述QCM传感器为AT切型压电石英晶体，其表面喷镀两个反对称的“钥匙孔”型的金膜电极，基频在5～100MHz，或用3倍、5倍频率。
所述精密阻抗分析仪与QCM传感器连接。
所述细胞培养箱中填充有二氧化碳，二氧化碳浓度为4％-7％，所述培养箱的温度为35-38℃，所述培养箱底部加有高纯水。
所述细胞培养池中装设有培养基，且培养基高过压电石英晶体的设置位置。
所述培养基为RPMI-1640培养基，其中含有10％胎牛血清。
所述控制器与多通道开关模块连接，驱动多通道开关模块中各个开关的开、合。
一种基于上述系统的检测方法，包括以下步骤：
(1)连接控制器、多通道开关模块和精密阻抗分析仪；
(2)清洗整个装置，并制备悬浮细胞；
(3)清洗培养池，加入培养基，将各压电石英晶体放入培养池内，不加待测细胞；
(4)培养池放入培养箱，将多通道开关与各压电石英晶体连接，当测量基线达到稳定后，同时将含相同数量细胞的培养基分别加入各培养池中；
(5)实时监测细胞贴壁和生长过程中的QCM的谐振频率和动态电阻随时间的变化曲线，存储分析数据；
(6)清洗压电石英晶体、培养池和培养箱。
所述步骤(2)中，其具体方法为：在进行细胞传代实验前，先用pH＝7.3-7.5磷酸盐缓冲液清洗培养瓶内待测贴壁细胞2-3次，洗去死细胞和未贴壁细胞；再用0.20％-0.30％胰蛋白酶消化贴壁细胞，获得悬浮细胞；悬浮细胞经离心后，用RPMI-1640培养基重新分散，并用细胞计数板数出经分散后待测细胞的个数，最后转入一个新的培养瓶中。
所述步骤(3)中：细胞培养池在紫外灯光照下用体积分数75％酒精消毒0.5-1小时，再用磷酸盐缓冲液清洗2-5次；然后加入培养基，将各压电石英晶体放入培养池内，再将整个细胞培养池放入培养箱中。
所述步骤(4)中，利用控制器控制多通道开关，当测量基线达到稳定后，同时将含相同数量细胞的培养基加入各培养池中，监测细胞贴壁和生长过程中的f0和R1值的变化，监测时间为12-36小时。
所述步骤(6)中，一次实验完成后，需及时清洗压电石英晶体，除去上面的细胞，用胰蛋白酶浸泡10-20小时，再滴加重铬酸钾洗液洗涤，接着用高纯水冲洗，反复清洗多次。
所述磷酸盐缓冲液的成分包括：1.50-1.60g·L-1Na2HPO4·H2O、0.15-0.25g·L-1KH2PO4、7.50-8.50g·L-1NaCl和0.15-0.25g·L-1KCl。
所述重铬酸钾洗液的成分包括：20g K2Cr2O7、40mL H2O、360mL浓H2SO4。
本发明的工作原理为：此系统可同时做多组实时监测细胞生长过程对比实验，如：在相同培养环境下监测正常细胞和肿瘤细胞生长过程对比实验、在不同培养环境下相同细胞生长过程对比实验、用不同种凝集素修饰石英晶体监测其诱导正常细胞凝集生长过程的对比实验等；各个对比实验可在同一培养箱中同时进行监测，两两互不干扰，这样只需一天左右就可得到多组可靠的实验结果，提高了精密阻抗分析仪的工作效率。
本发明的有益效果为：
(1)实现多个压电石英晶体同时监测，通过控制精密阻抗分析仪和多通道开关，各晶体依次轮流监测，几秒钟就可以采集一遍数据、提高了精密阻抗分析仪的工作效率；
(2)利于减小误差，提高精确度；在同一个细胞培养箱中，可同时做多组细胞生长对比实验，这样消除了许多干扰因素，大大减小了测量误差。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
其中：1、二氧化碳；2、细胞培养箱；3、细胞培养池；4、QCM传感器；5、高纯水；6、多通道开关模块；7、电源；8、精密阻抗分析仪；9、控制器。
具体实施方式：
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
如图1所示，一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，包括精密阻抗分析仪8、多通道控制开关模块6、QCM传感器阵列、细胞培养池阵列、细胞培养箱2、控制器9，其中，精密阻抗分析仪8与多通道控制开关模块6相连，QCM传感器阵列的每个QCM传感器4与细胞培养池阵列的细胞培养池3分别接在多通道控制开关模块6的各个开关上，由控制器9发送连接与断开指令，实现各QCM传感器4的采集与分析，各个QCM传感器4放置在不同的细胞培养池3中，各个细胞培养池3放置于相同或不同的细胞培养箱2中。
QCM传感器4为AT切型压电石英晶体，其表面喷镀两个反对称的“钥匙孔”型的金膜电极，基频在5～100MHz，或用3倍、5倍频率，QCM的全称是石英晶体微天平(Quartz CrystalMicrobalance，QCM)。压电传感器是一种高灵敏的质量型化学传感器，其研究始于1959年Sauerbrey的开创性工作，其基本原理就是传感器的谐振频率随表面质量负载的增加而线性下降，由于这种传感器对表面质量变化非常敏感，因此压电传感器又称为石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM)，在化学及生物传感领域得到广泛应用。
精密阻抗分析仪8与QCM传感器4连接。
细胞培养箱2中填充有二氧化碳，二氧化碳浓度为4％-7％，所述培养箱的温度为35-38℃，所述培养箱底部加有高纯水5。
细胞培养池3中装设有培养基，且培养基高过压电石英晶体的设置位置。
培养基为RPMI-1640培养基，其中含有10％胎牛血清。
控制器9与多通道开关模块6连接，驱动多通道开关模块中各个开关的开、合。
电源7为精密阻抗分析仪8、控制器9和多通道开关模块6提供电力。
本发明提供一种多通道压电监测细胞生长过程的装置与方法，包括如下步骤：
1)首先自行设计一个可连接压电石英晶体多通道开关，此装置包括：单片机、USB接口、交流电源插头等。在PC机上设计VB程序，此程序包括：控制精密阻抗分析仪运行的程序和控制多通道开关轮流通断的程序。此程序为一个整体程序，控制按钮在同一个界面上，可灵活控制各个命令。
2)按照常规方法对压电石英晶体进行处理清洗，备用。
在进行细胞传代实验前，先用pH＝7.3-7.5的磷酸盐缓冲液(PBS，1.50-1.60g·L-1Na2HPO4·H2O、0.15-0.25g·L-1KH2PO4、7.50-8.50g·L-1NaCl、0.15-0.25g·L-1KCl。)清洗培养瓶内待测贴壁细胞2-3次，洗去死细胞和未贴壁细胞。再用0.20％-0.30％胰蛋白酶消化贴壁细胞，获得悬浮细胞。悬浮细胞经离心后，用RPMI-1640培养基(其中含有10％胎牛血清)重新分散，并用细胞计数板数出经分散后待测细胞的个数。最后转入一个新的培养瓶中。
3)细胞培养池在紫外灯光照下用体积分数75％的酒精浸泡消毒0.5-1小时,再用磷酸盐缓冲液(同上)清洗3次。然后将RPMI-1640培养基加入该细胞培养池内，将各压电石英晶体放入培养池内，再将整个细胞培养池放入培养箱中。
4)将多通道开关连接好，再打开PC机上相应的VB程序开始检测，当测量基线达到稳定后，将步骤3)中培养瓶内含相同数量待测细胞的培养基加入细胞培养池中。开始监测细胞贴壁和生长过程中的谐振频率f0和动态电阻R1值的变化，监测时间为12-36小时。
5)在整个监测过程中，全部由计算机VB程序控制，不需人为干扰，分析数据以Txt格式存于计算机，方便处理。
6)一次实验完成后，需及时清洗压电石英晶体，除去上面的细胞，用0.20％-0.30％胰蛋白酶浸泡10-20小时，再滴加重铬酸钾洗液(20g K2Cr2O7+40mLH2O+360mL浓H2SO4)洗涤，接着用高纯水冲洗，反复清洗多次。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，其特征是：包括精密阻抗分析仪、多通道控制开关模块、QCM传感器阵列、细胞培养池阵列、细胞培养箱、控制器，其中，精密阻抗分析仪与多通道控制开关模块相连，细胞培养池阵列中的QCM传感器阵列的每个QCM传感器分别接在多通道控制开关模块的各个开关上，由控制器发送连接与断开指令，实现各QCM传感器的信息采集与分析，各个QCM传感器放置在不同的细胞培养池中，各个细胞培养池放置于相同或不同的细胞培养箱中；所述控制器与多通道开关模块连接，驱动多通道开关模块中各个开关的开、合。
2.如权利要求1中所述的一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，其特征是：所述QCM传感器为AT切型压电石英晶体，其表面喷镀两个反对称的“钥匙孔”型的金膜电极，基频在5～100MHz，或用3倍、5倍频率；所述精密阻抗分析仪与QCM传感器连接。
3.如权利要求1中所述的一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，其特征是：所述细胞培养箱中填充有二氧化碳，二氧化碳浓度为4％-7％，所述培养箱的温度为35-38℃，所述培养箱底部加有高纯水。
4.如权利要求1中所述的一种多通道压电监测细胞生长动态过程的装置，其特征是：所述细胞培养池中装设有培养基，且培养基高过压电石英晶体的设置位置；所述培养基为RPMI-1640培养基，其中含有10％胎牛血清。
5.一种基于如权利要求1-4中任一项所述的装置的检测方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)连接控制器、多通道开关模块和精密阻抗分析仪；
(2)清洗整个装置，并制备悬浮细胞；
(3)清洗培养池，加入培养基，将各压电石英晶体放入培养池内，不加待测细胞；
(4)培养池放入培养箱，将多通道开关与各压电石英晶体连接，当测量基线达到稳定后，同时将含相同数量细胞的培养基加入各培养池中；
(5)实时监测细胞贴壁和生长过程中的QCM的谐振频率和动态电阻随时间的变化曲线，存储分析数据；
(6)清洗压电石英晶体、培养池和培养箱。
6.如权利要求5中所述的检测方法，其特征是：所述步骤(3)中，其具体方法为：在进行细胞传代实验前，先用pH＝7.3-7.5的磷酸盐缓冲液清洗培养瓶内待测贴壁细胞2-3次，洗去死细胞和未贴壁细胞。再用0.20％-0.30％胰蛋白酶消化贴壁细胞，获得悬浮细胞；悬浮细胞经离心后，用RPMI-1640培养基重新分散，并用细胞计数板数出经分散后待测细胞的个数，最后转入一个新的培养瓶中。
7.如权利要求5中所述的检测方法，其特征是：所述步骤(3)中：细胞培养池在紫外灯光照下用体积分数75％的酒精消毒0.5-1小时，再用磷酸盐生理缓冲液清洗2-5次；然后加入培养基，将各压电石英晶体放入培养池内，再将整个细胞培养池放入培养箱中。
8.如权利要求5中所述的检测方法，其特征是：所述步骤(4)中，利用控制器控制多通道开关，当测量基线达到稳定后，同时将含相同数量细胞的培养基加入各培养池中，监测细胞贴壁和生长过程中的f0和R1值的变化，监测时间为12-36小时。
9.如权利要求5中所述的检测方法，其特征是：所述步骤(6)中，一次实验完成后，需及时清洗压电石英晶体，除去上面的细胞，用胰蛋白酶浸泡10-20小时，再滴加重铬酸钾洗液洗涤，接着用高纯水冲洗，反复清洗多次。
10.如权利要求5中所述的检测方法，其特征是：所述步骤(3)或步骤(4)中，所述磷酸盐生理缓冲液的成分包括：1.50-1.60g·L-1Na2HPO4·H2O、0.15-0.25g·L-1KH2PO4、7.50-8.50g·L-1NaCl和0.15-0.25g·L-1KCl；
所述重铬酸钾洗液的成分包括：20g K2Cr2O7、40mL H2O、360mL浓H2SO4。
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