CN101231286B - 乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，它通过在石英晶体上固定的胆碱酯酶抗体与待测神经样本中所含的乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中发生石英晶体振荡频率的改变，继而通过计算机监测系统检测并反映出乙酰胆碱酯酶的含量高低，含量高的待测神经束为运动束，含量低的待测神经束则为感觉束。本发明从周围神经运动束与感觉束中的乙酰胆碱酯酶含量的差别入手，可快速检测乙酰胆碱酯酶的压电生物传感系统、快速鉴别出周围神经运动束与感觉束，实现运动束对运动束、感觉束对感觉束正确缝合。在以后的临床应用中可得到广泛推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测周围神经束性质的传感器，具体地说是一种乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测周围神经束性质中的应用。
背景技术
在现有的技术中，对神经束性质进行判断的方式主要有以下几种：
1、解剖方式：对神经干内的神经束的定位图谱进行研究，很多学者已将周围神经(如正中神经、桡神经、尺桡神经干、坐骨神经干等)分别进行了分析，观察了神经干的位置、形态、束数，测量其大小，绘制了神经断面的神经束局部定位图，但在临床中，往往因神经损伤后两断端易发生扭曲，改变了原有的正常解剖位置，故临床应用收到限制。
2、电刺激法：通过电刺激神经束所产生的反应来鉴别，若电刺激出现肌肉收缩则为运动束，而感觉束则无反应。但此法需保持病人清醒，且限于新鲜损伤，个体差异大，而且刺激引起肌肉收缩是神经传导结果还是电流扩散所致，不能区分。故临床应用价值不大。
3、放射生物化学法：用放射性同位素标记酶的底物，再根据酶反应所产生的放射性产物来测定酶的含量，推测神经束的性质，但此法涉及同位素技术，设备要求高，且放射物质对患者及术者都有损害，故实用性不大。
4、酶组织化学法：根据运动束与感觉束中某些生物含量物质的含量差别，作为鉴别运动束与感觉束的标准，如运动束神经纤维中乙酰胆碱酯酶含量远高于感觉束，因此以乙酰胆碱酯酶含量为鉴别运动束与感觉束的方法得到广泛认可。目前检测乙酰胆碱酯酶主要为酶组织化学染色法，根据反应形成亚铁氰化铜(一种棕色沉淀)出现于酶含量部位，运动纤维呈强阳性，感觉纤维大部位呈阴性，少部分呈弱阳性的原理，对神经束性质进行判定。但此法存在问题是：(1)染色时间长(约50分钟)，过程复杂；(2)需切取两断端神经片段，不能进行原位染色。故临床应用也收到一定的限制。
5、免疫组化法：利用特异性抗原抗体反应，观察研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量技术，发现了感觉神经元的特异蛋白，并以该蛋白作为抗原制备了单克隆抗体，通过免疫染色来鉴别感觉纤维，其特点是特异性高，对人体无毒，染色时间较以往方法缩短，需25至30分钟。但这种方法现阶段仍需要切取组织片段，且存在染色特异性与时间问题，时间过短染色不深，过长则其它组织亦染上色，临床医生难以控制，且操作比较复杂，实用性不够。
目前，生物传感器在生物医学中得到了广泛应用，主要表现在以下方面：
1、免疫生物传感器
压电免疫传感器在生物学领域应用十分的广泛，检测范围不断拓宽，可以用来检测环境中的硫磷农药、有机磷神经毒气、可卡因，白色念珠菌、大肠杆菌、沙门氏菌、疱疹病毒、甲肝乙肝病毒、霍乱弧菌等病原微生物的检测，人的补体、酶等蛋白质分析，甲状腺素、人绒毛膜性腺激素、皮质醇等激素检测，血液中红细胞、T细胞及粒细胞含量测定，此外还可用于免疫反应的动力学分析，可对免疫反应过程进行实时监测。
2、DNA生物传感器
最初被用于测定RNA/DNA分子杂交反应，现在可以用于对DNA与蛋白质的分子交联，DNase、RNase、DNA连接酶的水解、聚合、连接功能的实时、原位监控检测及分子杂交过程的动力学分析，食品的卫生检测等。
3、仿生传感
可以用来模拟人或生物的嗅、味觉感官细胞，早期主要是采用与之功能相近的类脂或既亲水又亲脂的高分子物质来修饰压电晶体表面，从而对香味或气味物质、苦味或甜味食品实现物品种类、浓度及作用机理的判定；最近被用于实现多组分同时测定，采用分子印记技术提高传感器选择性和使用寿命，采用人工神经网络等化学计量学方法用于仿生传感可对数据进行智能化处理。
此外，将酶、细胞固定于晶体表面可制成酶、细胞传感器，除了使用单一酶外，采用多种酶构成复合酶传感器亦有报道。到目前为止，未见有关于检测乙酰胆碱酯酶含量的压电生物传感器的报道。
发明内容
为了克服以往对神经束性质进行判断方法的不足，本发明的目的是提供一种乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用及其使用方法。该生物传感器从周围神经运动束与感觉束中的乙酰胆碱酯酶(AchE)含量的差别入手，可快速检测AchE的压电生物传感系统、快速鉴别出周围神经运动束与感觉束，实现运动束对运动束、感觉束对感觉束正确缝合。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，其特征在于：它通过在石英晶体芯片上固定的乙酰胆碱酯酶抗体与待测神经样本中所含的乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中发生石英晶体芯片振荡频率的改变，继而通过计算机监测系统检测并反映出乙酰胆碱酯酶的含量高低，含量高的待测神经束为运动束，含量低的待测神经束则为感觉束。
本发明中，使用乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质时，包括以下步骤：
1)石英晶体芯片上结合戊二醛；
2)在石英晶体芯片上标记乙酰胆碱酯酶抗体；
3)剪取1～2mm神经片断，放入200ul改良细胞裂解液中振荡数次；
4)将振荡后的改良细胞裂解液加入进样孔，在监测器上观察到乙酰胆碱酯酶的含量高低变化，含量高的神经束为运动束，反之则为感觉束。在等待180秒之后在监测器上观察乙酰胆碱酯酶的含量变化。
本发明所述的乙酰胆碱酯酶压电生物传感器，由压电晶体、振荡电路、差频电路、频率计数器及计算机等部分组成。使用乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的流程见图1。
本发明所述改良细胞裂解液为0.5％Triton X-100细胞裂解缓冲液，配方如下：
Triton X-100 0.5％
三异丙基乙磺酰(Tris) 5mmol/L
EDTA 2mmol/L
蔗糖(Sucrose) 0.3mol/L
调节pH至7.4，-70℃保存，临用前加
PMSF 100mmol/L 5μl/ml
Na3VO4 200mmol/L 5μl/ml
Cocktail 10μl/ml
花萼海绵体诱癌素A(Calyculin A) 1.0μg/ml
本发明通过胆碱酯酶抗体与结合在石英晶体芯片表面的戊二醛交联，在晶体表面包被胆碱酯酶抗体，待测神经样品中若有与之相对应的乙酰胆碱酯酶抗原，则与待测神经样品中乙酰胆碱酯酶的特异性结合，增加了晶体的质量并改变振荡频率。频率的变化与待检测神经内所含得乙酰胆碱酯酶抗原的浓度呈正比，这种变化可以通过电信号从监测器中直观的反应出来，既准确又方便。
①Sauerbrey导出压电石英晶体频率变化ΔF与晶体表面均匀吸附外加质量ΔM的关系为：
ΔF＝-F2ΔM/(ANp)
式中，ΔF是石英晶体的频率、F2是谐振频率、ΔM是晶体表面的沉积质量、A是参与晶振的面积、N是频率常数、p是晶体密度。
②由经验公式ΔF＝c1d1/2+c2η1/2-c3ε-c4κ+c0
式中d代表液体的密度、η代表粘度、ε代表介电常数、κ代表电导率，c1、c2、c3、c4、c0分别是由晶体和电路决定的常数。可得：石英晶体在液相中有稳定的振荡频率。
由此可以看出当外来物质沉积于石英晶体表面时，其质量的变化于谐振频率的变化成正比。
本发明采用戊二醛交联法：首先在晶体金属表面建立一层惰性疏水物质，主要是聚乙烯亚胺和3-氨丙基-三乙氧基硅烷，然后再用戊二醛作为交联试剂乙酰胆碱酯酶抗体结合。戊二醛是一种常用的双功能基试剂，很容易使蛋白质交联，这种交联是通过蛋白质中赖氨酸残基进行的。
本发明采用目前使用较为广泛的固定方法。固定化之前，首先在基质表面上建立一层聚乙烯亚胺(PEI)或r-氨丙基三乙氧基硅烷(3-APTES)惰性疏水性水性物质，然后用交联试剂联接乙酰胆碱酯酶抗体。戊二醛是一个常用的双功能团交联试剂，极易与蛋白中赖氨酸残基交联。具体方法如下：
①PEI固定法：室温下用含4％(V/V)的PEI甲醇5ml涂在晶体的电极上，干燥后用甲醇冲洗晶体，然后浸入浓度为0.4mol/L戊二醛(PH＝7)溶液中30min，然后用低浓度抗原溶液涂在晶体两侧，未发生反应的水合醛类用0.5mol/L的甘氨酸(在20mmol/L PBS中，pH7)封闭，随后用PBS和蒸馏水冲洗，空气中干澡。
②硅烷(APTES)固化法：把晶体浸入35mmol/L的APTES的丙酮溶液中1h，在70℃条件下真空干燥，用丙酮洗几次，在0.6mol/L的戊二醛(pH＝7)中孵育1h，然后用蒸馏水洗，再用5μl的5mg/ml抗原液涂在晶体的两侧，干燥30～45min，晶体用PBS和蒸馏水冲洗之后，在空气中干燥。
本发明将压电生物传感器技术应用到周围神经运动束与感觉束的鉴别，利用生物传感器灵敏、快速、准确、特异性强的特点，制成了可以检测乙酰胆碱酯酶含量的压电生物传感器。该传感器可以检测每根神经束上乙酰胆碱酯酶的含量，原理是在石英晶体上固定的胆碱酯酶抗体与神经样本中所含的乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中有石英晶体振荡频率的改变，继而通过计算机监测系统检测并反映出乙酰胆碱酯酶的含量高低，含量高的神经束为运动束，反之则为感觉束。整个反应过程在3分钟之内，较以往方法大大缩短了时间，使用方便，满足了临床要求并减少了误差及干扰。通过动物实验取得了较好的效果。
与现有技术相比，本发明的显著优点是：
①该检测装置简单而且灵敏度高达10-12mol/L，因此样本不需特别处理，而且只需切取极少组织就能检测出很明显地差异；
②检测效率很高，一个样本只需3分钟；
③由于检测样本中的物质是通过抗原和抗体的形式结合的，因此特异性很高；
④此装置可以实时定量的检测样本中需检测的物质，可以形象直观的在计算机上显示出来；
⑤检测物质不需要事先做任何物理、化学修饰；
⑥芯片可以反复多次应用等优点。因此改装置可以做到快速、准确、直观地鉴定神经断端两侧神经束地性质，方法简单快捷，无需化学试剂，对人体无害，实现机械化、集成化和智能化。
这种鉴别周围神经束性质的压电生物传感器，将为周围神经损伤后地显微外科修复提供一种快捷有效的方法，大大提高周围神经损伤修复后的功能恢复率。有利于在以后的临床应用中得到广泛推广。
附图说明
图1是使用乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的流程图；
图2是采用本发明得到的动物实验结果曲线图。
具体实施方式
一种本发明所述的乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，它通过在石英晶体上固定的胆碱酯酶抗体与待测神经样本中所含的乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中发生石英晶体振荡频率的改变，继而通过计算机监测系统检测并反映出乙酰胆碱酯酶的含量高低，含量高的待测神经束为运动束，含量低的待测神经束则为感觉束。乙酰胆碱酯酶压电生物传感器由压电晶体、振荡电路、差频电路、频率计数器及计算机等部分组成。使用乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的流程见附图1。
首先在石英晶体芯片上结合戊二醛；然后在石英晶体芯片上标记胆碱酯酶抗体；剪取1～2mm神经片断，放入200ul改良细胞裂解液中振荡数次；将振荡后的改良细胞裂解液加入进样孔，在等待180秒之后，在监测器上观察到乙酰胆碱酯酶的含量高低变化，含量高的神经束为运动束，反之则为感觉束。
本发明将压电生物传感器技术应用到周围神经运动束与感觉束的鉴别，利用生物传感器灵敏、快速、准确、特异性强的特点，制成了可以检测乙酰胆碱酯酶含量的压电生物传感器。该传感器可以检测每根神经束上乙酰胆碱酯酶的含量，整个反应过程在3分钟之内，较以往方法大大缩短了时间，使用方便，满足了临床要求并减少了误差及干扰。通过动物实验取得了较好的效果。
动物实验
材料：胆碱酯酶单克隆抗体(南京医科大学抗体中心提供，犬坐骨神经、颈丛神经、面神经，细胞裂解液，磷酸盐缓冲液，1M Glycine，10％谷胱甘肽溶液。设备：ADS plus Affinity Sensor压电生物传感器(台湾ANT公司出品，亚新科技股份有限公司提供)。
实验步骤：
1、10％谷胱甘肽溶液孵育芯片10min。
2、抗体用磷酸盐缓冲液稀释后(1∶1000)孵育芯片10min。
3、1M Glycine孵育芯片1min。
4、分别取犬坐骨神经、臂神经从、面神经断端1mm，放入细胞裂解液中，震荡5-10s，放入ADS plus Affinity Sensor压电生物传感器中，读取数据。结果如图2。
(1)运动神经1
(2)运动神经2
(3)运动神经3
(4)感觉运动混合神经1
(5)感觉运动混合神经2
(6)运动神经4
(7)运动神经4
(8)运动神经5
(9)感觉神经1
(10)感觉神经1
(11)感觉神经1
(12)感觉神经1
备注：GA：谷胱甘肽感觉和运动神经编号代表不同的标本来源。
结论；感觉、运动和混合神经，其胆碱酯酶的含量不同，通过本方法在传感器的显示屏上呈现不同的曲线。差异明显，并且重复性好。本法具有良好的可行性。
Claims (3)
1.一种乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，其特征在于：它通过在石英晶体芯片上固定的乙酰胆碱酯酶抗体与待测神经样本中所含的乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中发生石英晶体芯片振荡频率的改变，继而通过计算机监测系统检测并反映出乙酰胆碱酯酶的含量高低，含量高的待测神经束为运动束，含量低的待测神经束则为感觉束。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，其特征在于它包括以下步骤：
1)在石英晶体芯片上结合戊二醛；
2)在石英晶体芯片上标记乙酰胆碱酯酶抗体；
3)剪取神经片断，放入改良细胞裂解液中振荡数次；
4)将振荡后的改良细胞裂解液加入进样孔，在监测器上观察到乙酰胆碱酯酶的含量高低变化，含量高的神经束为运动束，反之则为感觉束。
3.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用，其特征在于：所述改良细胞裂解液为0.5％Triton X-100细胞裂解缓冲液，配方如下：
Triton X-100 0.5％
三异丙基乙磺酰 5mmol/L
EDTA 2mmol/L
蔗糖 0.3mol/L
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