CN2525096Y

CN2525096Y - 乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器

Info

Publication number: CN2525096Y
Application number: CN 02218236
Authority: CN
Inventors: 曹晓建; 陆祖宏; 王宏; 柴雪挺; 贾可
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Medical University
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2002-12-11
Anticipated expiration: 2012-01-09

Abstract

本实用新型公开了一种用于鉴别周围神经纤维性质的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特点是它包括光纤和传感膜，传感膜通过共价结合或物理吸附方式固定到光纤头表面。其中传感膜有三种结构形式，其一是由吸附有氧指示剂的高分子膜、胆碱氧化酶和高分子膜复合而成；其二是由吸附有氧指示剂的高分子膜和固定有胆碱氧化酶的高分子膜复合而成；其三是由将氧指示剂、胆碱氧化酶混合在高分子膜的溶液中后凝固所形成的单层膜。本实用新型的优点是在不切取神经断端的前提下，活体、原位、快速、直观、准确地鉴定出神经断端两侧神经束的性质，无需染色，方便快捷，操作简单，对人体无毒无创，实现机械化，集成化和智能化。

Description

乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器

一、技术领域

本实用新型涉及一种用于检测周围神经束性质的传感器，特别是一种乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器。

二、背景技术

在现有技术中，对神经束性质进行判断的方式主要有以下几种：

1.解剖方式：对神经干内的神经束的定位图谱进行研究，很多学者已将周围神经(如正中神经、桡神经、尺桡神经干、坐骨神经干等)分别进行了分析，观察了神经干的位置、形态、束数，测量其大小，绘制了神经断面的神经束局部定位图，但在临床中，往往因神经损伤后两断端易发生扭曲，改变了原有的正常解剖位置，故临床应用受到限制。

2.电刺激法：通过电刺激神经束所产生的反应来鉴别，若电刺激出现肌肉收缩则为运动束，而感觉束则无反应。但此法需保持病人清醒，且限于新鲜损伤，个体差异大，而且刺激引起肌肉收缩是神经传导结果还是电流扩散所致，不能区分。故临床应用价值不大。

3.放射生物化学法：用放射性同位素标记酶的底物，再根据酶反应所产生的放射性产物来测定酶的活性，推测神经束的性质，但此法涉及同位素技术，设备要求高，且放射物质对患者及术者都有损害，故实用性不大。

4.酶组织化学法：根据运动束与感觉束中某些生物活性物质的含量差别，作为鉴别运动束与感觉束的标准，如运动束神经纤维中乙酰胆碱酯酶活性远高于感觉束，因此以乙酰胆碱酯酶活性为标准鉴别运动束与感觉束的方法得到广泛认可。目前检测乙酰胆碱酯酶主要为酶组织化学染色法，根据反应形成亚铁氰化铜(一种棕色沉淀)出现于酶活性部位，运动纤维呈强阳性，感觉纤维大部分呈阴性，少部分呈弱阳性的原理，对神经束性质进行判定。但此法存在问题是：(1)染色时间长(约50分钟)，过程复杂；(2)需切取两断端神经片断，不能进行原位染色。故临床应用也受到一定限制。

5.免疫组化法：利用特异性抗原抗体反应，观察研究组织细胞特定抗原(或抗体)的定位和定量技术，发现了感觉神经元的特异蛋白，并以该蛋白作为抗原制备了单克隆抗体，通过免疫染色来鉴别感觉纤维，其特点是特异性高，对人体无毒，染色时间较以往方法缩短，需25至30分钟。但这种方法现阶段仍需要切取组织片段，且存在染色特异性与时间问题，时间过短染色不深，过长则其它组织亦染上色，临床医生难以控制，且操作比较复杂，实用性不够。

6.化学传感器：针对以往方法的不足，本申请人自98年起，进行了新的探索，与同济医大生物医学工程教研室合作，将生物传感技术应用到周围神经运动束与感觉束的鉴别，利用生物传感器灵敏、快速、准确、特异性强的特点，制成了可以检测乙酰胆碱酯酶活性的化学生物传感器。该传感器可以检测每根神经束上乙酰胆碱酯酶的活性，原理是传感针上固定的乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶起反应，反应过程中有电位和pH改变，传感针通过记录电位与pH值变化，反映出乙酰胆碱酯酶的活性高低，活性高的神经束为运动束，反之则为感觉束。整个反应过程为数十秒至3分钟，较以往方法大大缩短了时间，使用方便，并可单根神经束原位检测，成功实现了原位检测，满足了临床要求并减少了误差及干扰。通过动物实验取得了较好的效果。但此方法存在的问题是传感针每检测一束后须更换，不能重复使用，每检测一根神经束仍需几分钟，时间还稍嫌长。故此传感器仍需改进才能适用于临床。

三、发明内容

1、发明目的：本实用新型的目的是从周围神经运动束与感觉束中的乙酰胆碱酯酶(AchE)含量的差别入手，提供一种可快速检测AchE的光纤生物传感系统、快速鉴别出周围神经运动束与感觉束，实现运动束对运动束、感觉束对感觉束正确缝合的光纤生物传感器。

2、技术方案：为实现上述目的，本实用新型所述的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，它包括光纤和传感膜，传感膜是由具有生物相容性的高分子膜、胆碱氧化酶和氧指示剂组合而成的复合膜，传感膜通过共价结合或物理吸附方式固定到光纤的光纤头表面。所述的光纤为“Y”型。所述的传感膜有三种结构型式，其一是由吸附有氧指示剂的高分子膜、胆碱氧化酶和高分子膜依次复合而成，其二是由吸附有氧指示剂的高分子膜与固定有胆碱氧化酶的高分子膜复合而成，其三是由将氧指示剂、胆碱氧化酶混合在高分子膜的溶液中后凝固所形成的单层膜。

本实用新型的工作原理是：在神经束内和传感膜内存在下列化学反应：

(c)

其中：(a)为神经束内存在的化学反应，(b)、(c)为传感头膜内的反应。

通过反应(c)中氧气的生成量，换算成乙酰胆碱酯酶的活性。

传感膜主要由具有生物相容性的高分子膜，胆碱氧化酶和氧指示剂三部分组成，其中高分子材料要求对人体无毒无害，能有效地通透胆碱，在一定程度上阻止体液中影响检测结果的分子透过，可选用美国杜邦公司生产的全氟磺酸质子交换膜(Nafion)，聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚乙稀醇(PVA)，聚氯乙稀(PVC)等。胆碱氧化酶可以直接与高分子材料混合后凝固成膜，也可先与链状有机分子材料共价结合后如聚六乙醇(PEG-NHS)，再与高分子材料混合后凝固成膜，这能减少酶的泄漏，延长传感膜的寿命，提高检测结果的可重复性。氧指示剂通常采用钌的化合物如三联吡啶钌(Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate)；邻菲咯啉钌(Ru(4，7-diphenyl-1，10-phen)₃Cl₂)等，这类荧光染料对氧含量十分敏感，其荧光寿命也随氧含量变化而变化，因此不仅可以通过荧光强度变化来测量氧含量变化，还可通过测量荧光寿命、散光、染料浓度等制约强度，测量准确性的因素影响在各种环境下准确的变化。

生物相容性高分子膜、胆碱氧化酶、氧指示剂可通过以下三种方法组合成传感膜：

方法一：采用三层结构，分别为修饰了氧指示剂的高分子膜，胆碱氧化酶和高分子膜保护层。

方法二：采用二层结构，分别为修饰了氧指示剂的高分子膜和固定了胆碱氧化酶(Cho)的高分子膜。

方法三：将氧指示剂、胆碱氧化酶混合在高分子材料溶液中，凝固后形成单层膜。

光纤采用直径1mm左右“Y”型分叉光纤。

3、有益效果：本实用新型与现有技术相比，其显著优点是：传感器应用了当今在通讯、电子、医疗、环境检测等领域广泛应用的光纤传感技术。目前临床中光纤传感器可对体液中电解质血气进行检测，已广泛运用在ICU病房监视器中。现代光纤传感器还可进行单分子检测，并可实现表面成像。利用光导纤维数据容量大，灵敏度高达10^-12mol/L，失真率低、体积小等特点，将乙酰胆碱酯酶信息经计算机分析处理并模拟神经束断面成像作为可视化反馈，以期达到：在不切取神经断端的前提下，活体、原位、快速(整个进程数秒内完成)、直观、准确地鉴定神经断端两侧神经束的性质，无需染色，方便快捷，操作简单，对人体无毒无创，实现机械化，集成化和智能化。

该种活体原位鉴别周围神经束性质的光纤生物传感器，将为周围神经损伤后的显微外科修复，提供一种简便而迅速的方法，大大提高周围神经损伤修复后的功能恢复率，并将在临床应用中广泛推广。

四、附图说明

图1是本实用新型的结构示意图。

图2是传感膜第一种结构示意图。

图3是传感膜第二种结构示意图。

图4是传感膜第三种结构示意图。

图5是本实用新型的工作原理示意图。

五、具体实施方式

实施例1：Y型光纤1的直径为1mm，传感膜2为三层结构。第一层为Nafion高分子膜a，中间为胆碱氧化酶层b，第三层为修饰了氧化指示剂c的高分子层，氧指示剂为Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chlorideHexahydrate。将传感膜2通过共价结合的方式固定到Y型光纤1的光纤头表面。

实施例2：Y型光纤1的直径仍为1mm，传感膜2为二层结构。胆碱氧化酶膜和氧指示剂膜。氧指示剂膜是将5mM(bpy)₃ ²⁺的1.25wt％Nafion乙醇溶液滴至光纤端面，室温干燥后制得。胆碱氧化酶溶液是将Nafion溶液用90％乙醇释至1％终浓度，将3mg胆碱氧化酶(10单元/mg)加入50ul％Nafion溶液。制得的胆碱氧化酶液滴至光纤表面干燥后制得传感膜2。

实施例3：Y型光纤1为直径为1mm，传感膜2为单层结构。将氧指示剂C、胆碱氧化酶b和PDMS高分子材料a的溶液混合，经冷凝后形成单层膜。将上述单层的传感膜2通过吸附方式固定到Y型光纤1的光纤头表面。

按照实施例1至实施例3制得的乙酰胆碱酯酶光纤传感器，结合光源3、检测器4、计算机5和图像显示器6(如图5)，即可对神经干7的神经束性质进行快速、直观、准确地测定。光源可用激光、发光二极管、汞灯等。使用汞灯等光谱较宽的光源时，使用相应的滤色片获得所需波长的激发光，光源的波长选择参考所用的氧指示剂的激发波长。如使用Tris(2，2’-bipyridyl)ruthenium(II)chloride Hexahydrate，用480nm左右的光源，经干涉滤色片(中心波长470nm，半峰宽30nm)后，由透镜(f＝5mm)耦合入直径为1mm的Y型光纤1，经光纤传输至传感膜2，激发后的荧光由Y型光纤1的另一臂传至检测器，该检测器用海洋公司(Dcean Ofics Inc)S2000型光纤光谱仪。将乙酰胆碱酯酶信息经计算机分析处理并模拟神经束断面成像后通过显示器进行可视化反馈。

检测过程中，将胆碱用20mM Tris缓冲液(PH＝8.0)稀释至不同浓度。

Claims

1、一种用于鉴别周围神经纤维性质的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特征在于它包括光纤(1)和传感膜(2)，传感膜(2)是由具有生物相容性的高分子膜(a)、胆碱氧化酶(b)和氧指示剂(c)组合而成的复合膜，传感膜(2)通过共价结合或物理吸附方式固定到光纤(2)的光纤头表面。

2、根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特征在于所述的光纤(1)为“Y”型。

3、根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特征在于所述的传感膜(2)是由吸附有氧指示剂(c)的高分子膜、胆碱氧化酶(b)和高分子膜(a)依次复合而成。

4、根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特征在于所述的传感膜(2)是由吸附有氧指示剂(c)的高分子膜与固定有胆碱氧化酶(b)的高分子膜(a)复合而成。

5、根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶光纤生物传感器，其特征在于所述的传感膜(2)是由将氧指示剂(c)、胆碱氧化酶(b)混合在高分子膜(a)的溶液中后凝固所形成的单层膜。