CN102356315A - 含有在其表面固定的细胞的质量敏感性传感器及利用所述传感器检测配体结合的方法 - Google Patents

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Abstract

一种质量敏感型化学传感器，所述化学传感器具有粘附于其敏感表面的失活的细胞，并且适用于通过由于分析物配体与细胞的结合而在传感器表面处引起的质量的变化来检测分析物配体与粘附的失活的细胞之间的相互作用，其中，所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。

Description

含有在其表面固定的细胞的质量敏感性传感器及利用所述传感器检测配体结合的方法
技术领域
本发明涉及一种分析方法和适用于实现所述方法的传感器。特别地但并非排它性地，本发明涉及一种制备质量敏感型化学传感器的方法，所述质量敏感型化学传感器能检测分析物种与包括细胞的表面的结合。
背景技术
质量敏感型化学传感器可以定义为考虑到测量与质量成比例的尺度的性质的任何装置，所述质量与所述装置的敏感表面相关或结合。可以利用一些这种传感器技术，如基于渐逝波的传感器例如表面等离子体共振(SPR，其能够通过表面折射率的相关变化指示质量的变化)、光波导(也是基于与质量结合事件相关的折射率的变化)、光衍射、光干涉、椭圆偏振和声波装置(例如石英晶体微天平(QCMs))。这些传感器方法在现有技术中是熟知的(例如参见生物分子传感器(Biomolecular Sensors)，Gizeli和Lowe.Taylor和Francis，伦敦；2002)，并且这些类型的仪器可以用于研究原位化学反应和在试样中检测特定的分子。
QCM系统利用石英晶体的压电效应。在这种系统中，如果AC电压的频率接近石英晶体振动模式的共振频率，则位于连接到AC电压的两个电极之间的石英晶体开始振动。石英晶体的共振频率是多个参数的函数，例如温度、压力、晶体的切割角度、晶体的机械应力和厚度。共振频率与晶体的厚度成反比。
用在液体应用中的典型的共振频率的范围从1MHz到50MHz。晶体通常是具有圆形或者方形形状的AT切型，并且具有大约5-10mm的直径。电极(驱动电极和对电极)通常在其两个侧面是金的，但其他金属也并不稀奇。相对于石英晶体板而言，电极是非常薄的，因此可以认为是晶体板的一部分。当在电极的一极上添加材料或者移除材料时，电极将变厚或者变薄，即电极的有关重量改变。作为电极质量的变化的结果，晶体板的共振频率会减小或者增大，从而可以测量共振频率的改变以检测电极质量的改变。QCM系统的质量分辨率可以低到1pg/cm2，对应于不到单层氢原子的1％。
典型的QCM压电传感器包括传感元件、试样插入单元、用于确定石英晶体压电性质(包括振动频率)的设备、和信号显示设备以及缓冲剂和废料容器(不同于传感元件，这些部件可以被称为传感器的“相关设备”)。含有任何有关化学物质的试样通过试样插入单元进入传感元件。传感元件包括压电共振器(QCM传感器)、试样室、从试样室流入和流出的流动通道、以及振动电路。试样引起与压电传感器表面的相互作用，这随之可以通过监测晶体板的振动特征被观察到，例如通过测量压电共振器频率的变化。晶体板在其表面提供有用于驱动电极和对电极的电接触区域，该电接触区域可以像连接到测量装置上一样连接到信号源(例如交流电源)。为了测量，压电晶体板的一侧与待检验的流体(例如液体)试样接触。晶体通过改变其共振频率和/或振动振幅响应待检测物质质量的聚集或者试样物理性质的变化。
压电传感器可以用于分析液体试样的粘性，且特别适用于研究化学和生物化学相互作用。如果压电传感器用于后者，则暴露于试样的电极具有特殊的表面涂层，该表面涂层将与试样相互作用。Cooper和Singleton(J.Mol.Recognit.，2007，20，154)提供了使用QCM传感器进行研究的相互作用的类型的综述。无论化学传感器的类型怎样，常用的表面涂层方法包括自装配的单层(例如在金上吸附的烷基硫醇)和/或聚合物基体，其中每一种可携带可用于固定有关的第一化学物质的官能团。通常，已固定的第一化学物质为有机小分子或抗体。随后携带第一化学物质的传感器与第二化学物质或细胞的分散体接触，并且通过在敏感表面上所得到的质量的变化来监测第二化学物质或细胞与第一化学物质的结合。Fung和Wong(Anal.Chem.2001，73，5302)描述了使用这种方法来检测液体分散体中的沙门氏菌细胞，并且Cooper和Singleton描述了其他类似的研究(参见上面)。
更具有挑战性的方法是采用细胞作为化学传感器中的固定的第一物质。少数的研究已实现这一点，但是所报道的方法采用活的细胞并且未分析结合的相互作用本身；更确切地说，这些方法使用生物传感器技术来监测结合后的细胞中的形态学或其他的改变(参见Marx等人，Anal.Biochem.，2007，361，77)。由于在结合事件之后来自细胞变化的已检测的信号的干扰，这些方法很少或不用于准确监测结合的相互作用。
现有技术未描述或提出一种制备具有已固定的细胞，并且适用于准确检测和监测细胞与分析物配体之间的结合的相互作用的质量敏感型化学传感器的方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种质量敏感型化学传感器，所述化学传感器具有粘附于其敏感表面的失活的细胞，并且适用于通过由于分析物配体与细胞的结合而在传感器表面处的质量的变化来检测分析物配体与粘附的失活的细胞之间的相互作用，其中，所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。
在一种优选的实施方式中，所述细胞被固定。
在第一方面的某些实施方式中，通过以下方法来制备质量敏感型化学传感器，所述方法包括以下步骤：使含有细胞的悬浮液与传感元件的敏感表面接触；使得细胞粘附于敏感表面并可能在所述敏感表面上生长；以及，在适当的时间之后，处理所述粘附的细胞，以便使得它们失活。
本发明的质量敏感型化学传感器能潜在地实时准确检测和监测分析物配体与细胞表面上的结构之间的结合事件本身。与通过现有技术方法制备的传感器不同，由于细胞生长和/或形态学变化的影响最小，通过本发明的传感器产生的信号与在敏感表面上结合的材料的质量更直接相关。此外，通过使用固定的细胞(其中可通过化学手段或物理手段来实现固定，如以下更详细描述的)，在使用过程中细胞对在流路池中出现的任何剪切力更具有抗性，否则会面临细胞被破坏或细胞从传感器表面剥离的风险。本文使用的关于细胞的术语“失活的”是指细胞的正常的生物化学基本上停止，使得细胞基本上不再能生长、分裂、运动和/或形态学变化。
根据第二方面，本发明还提供了一种制备质量敏感型化学传感器的方法，所述质量敏感型化学传感器能检测分析物配体与固定的细胞之间的相互作用，所述方法包括以下步骤：使含有细胞的悬浮液与传感元件的敏感表面接触；使得细胞粘附于敏感表面并可能在所述敏感表面上生长；以及，在适当的时间之后，处理所述粘附的细胞，以便使得它们失活。
第二方面的方法能制备质量敏感型化学传感器，该质量敏感型化学传感器能潜在地实时准确检测和监测分析物配体与细胞表面上的结构之间的结合事件本身，与第一方面的传感器一样。与通过现有技术方法制备的传感器不同，由通过该方法制备的传感器所产生的信号与在敏感表面上结合的材料的质量更直接相关，如上所解释。
在一种优选的实施方式中，所述方法包括将所述传感器整合到流路池中的另外的步骤，使得所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。将传感器整合到流路池中可发生在所述方法的任何阶段，即，在传感器与细胞接触之前；在细胞已粘附于敏感表面并可能在敏感表面上生长之前、期间或之后；或在处理细胞以使得它们失活之前、期间或之后。
根据本发明使用或形成的流路池应优选为适于确定所研究的相互作用的动态速率参数的流路池。流路池应由生物学相容的材料制成，所述材料优选选自，但不限于，聚甲醛、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和诸如聚苯乙烯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯的可注塑的热塑性塑料。流路池的尺寸应适于确定分子相互作用的动态速率参数，即，流动特性应考虑到保持分析物配体的体内溶液浓度，分析物配体在带有已固定的细胞的表面上或非常接近于带有已固定的细胞的表面，而不考虑分析物配体到细胞表面上的目标分子的大量的扩散的限制。流路池的优选的高度应为50μm或更低(从传感器表面到流路池的顶部进行测量)。合适的流路池例如描述于PCT/GB2008/001515(WO2008/132487)。
含有细胞的悬浮液优选含有细胞生长介质。用于多种细胞的合适的细胞生长介质为本领域技术人员所熟知，并且现有技术充分提供了关于用于培养大多数原核细胞和真核细胞的介质的优选的和必需的组分的信息。优选的介质含有血清蛋白。虽然本发明人不希望束缚于该信念，但是我们认为在这种生长介质中存在的血清蛋白在细胞之前(或者，较少可能，与细胞同时)吸附于敏感表面；随后已吸附的蛋白提供具有基序(motifs)的表面，该基序能被细胞的细胞表面组分识别，从而增强细胞在敏感表面上或附近的粘附。在所述方法的某些优选的实施方式中，细胞悬浮液还含有与所关注细胞有关联的细胞外基质蛋白。这种基质蛋白可根据所关注的细胞类型而变，但是，同样可参考标准实验室教科书来确定，通过提供被细胞表面组分识别和结合的另外的基序来帮助细胞粘附。在一些实施方式中，可使用被蛋白质覆盖的传感器表面，或者通过使敏感表面与血清蛋白和/或细胞外基质蛋白的溶液接触以使得该溶液吸附于表面，来预处理敏感表面；在这种情况下，可容易地使用不含血清的细胞悬浮液。
在第一和第二方面的某些实施方式中，所述细胞为真核细胞。具体地，所述细胞可为动物细胞，例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞。
在具体的实施方式中，在与含有细胞的悬浮液接触之前，将所述敏感表面改性，以便提高表面能，从而增强血清蛋白和/或细胞与表面的粘附。
多种材料可形成第一方面的传感元件的敏感表面或在第二方面与细胞悬浮液接触的传感元件的敏感表面。在一些情况下，可使用未经处理的金属传感器表面，例如，如可在一些基于光波导的装置中发现的，QCM的金电极，或SPR生物传感器的贵金属表面，或玻璃表面。然而，在许多实施方式中，可能期望通过化学处理或物理处理将表面改性，以增大血清蛋白和/或细胞在该表面上吸附的速率和/或程度。化学处理包括向表面吸附极性的、亲水性的和/或带电荷的物质(例如聚氨基酸，例如聚赖氨酸；或血清和/或细胞外基质蛋白，如上所提及的，在这种情况下，除了对表面极性等的任何影响以外，特定的可识别的生物化学基序在细胞粘附中起作用)。物理处理包括使用适当类型的等离子体轰击或电磁辐射来引起敏感表面的表面化学性质的改性。这种方法可特别用于另外的疏水性表面的情况，例如某些涂有聚合物的表面。在任何情况下，用于粘附细胞的表面的适合性及其任何改性的效果可容易地通过将传感器与和传感器相关的设备偶联来确定，随后通过来自传感器的信号的变化来确定，而无论血清蛋白和/或细胞是否与敏感表面粘附接触以及粘附接触程度如何。作为一种选择或除此以外，可使用显微术来监测细胞与敏感表面的粘附。可采用这种方式优化敏感表面并随后在本发明的方法中使用以得到甚至更大的效果。
在许多情况下，在将细胞固定之前，敏感表面的接触角为10-90度，优选20-80度，更优选30-70度。特别优选60度左右的接触角。可通过本领域的标准方法来确定接触角，本文使用的，涉及使用高纯度水来确定接触角。
在第一方面和第二方面的某些实施方式中，敏感表面提供有与含有细胞的悬浮液接触的聚合物涂层。这种聚合物涂层可含有聚苯乙烯。质量敏感型化学传感器的聚合物涂层是常见的方法，并且就什么可随后与敏感表面偶联而论具有灵活性。聚苯乙烯为用于培养细胞的常用的表面，因此，在本发明的方法中特别有用。然而，由于聚苯乙烯涂层的疏水性，优选通过等离子体轰击或电磁辐射处理将聚苯乙烯涂层改性。特别优选UV处理。可通过用聚合物溶液旋涂传感元件来制备聚合物涂层(例如聚苯乙烯)。在传感器与细胞悬浮液接触之前，聚合物涂层可与血清和/或细胞外基质蛋白的分散体接触，使得它们吸附。
在粘附的细胞失活之前，允许细胞在敏感表面上生长一定时间是有用的。这样可减少在悬浮液培养过程中发生的细胞的任何破坏或扰乱。以上所涉及的“合适的时间”可根据实验的需要和目标以及采用的细胞类型来确定，并且该时间段可容易地通过反复试验来估计。具体地，许多细胞在悬浮液中采用球形形态，而与表面的粘附则涉及细胞铺展和变平的程度。就为了在传感器的表面上接种而收获细胞的生长阶段而论，应理想地为生长的指数阶段-在该阶段细胞更丰富地表达受体。
可通过物理手段(例如将细胞保持在降低的温度下(例如2-8℃)、急速冷冻或减压热处理；参见www.denator.com)或更优选通过化学手段(例如毒素处理或化学交联)实现使细胞失活的细胞处理。在优选的实施方式中，通过物理手段或者更优选通过化学手段，通过将细胞固定来实现粘附的细胞的失活。化学手段包括基于有机溶剂的方法或更优选交联方法。基于有机溶剂的方法通常通过将脂质和水从细胞中除去并沉淀细胞蛋白质来进行，而交联剂在细胞的表面组分之间形成分子间桥键。基于溶剂的方法包括使用丙酮、甲醇和/或乙醇，通常在大约-20℃。交联方法可使用，例如，福尔马林、甲醛或多聚甲醛，任选与表面活性剂和/或甲醇配合使用。多种可选的固定方案还描述于Brock等人(Cytometry，1999，35，353)。
在传感器表面上固定细胞防止细胞进一步生长、迁移和/或形态学变化，但是保持细胞的表面组分在其中至少一部分仍可用于与分析物配体结合的状态。固定细胞还使得在随后的分析过程中粘附的细胞不太可能从敏感表面离解。如关于第一方面所提及的，在传感器提供有流路池或形成部分流路池的实施方式中，这是特别有利的。固定细胞还增大了细胞层的刚性，这样可改善化学传感器的敏感性，如以下将更详细讨论的。
在使得细胞失活之前，可使用显微术的任选的步骤检查传感器表面上的细胞的布置和密度。可使用多种显微术方法，但是可提及荧光显微术，在这种情况下，在显微术之前使用荧光染料(例如核染料)进行粘附的和/或固定的细胞的培养。如果未达到适当的细胞计数和/或密度，则在失活之前允许细胞进一步生长。可在所述方法的任何阶段或所有阶段进行敏感表面的显微监测，以确定细胞层形成的进展。还可在失活步骤之后以及在固定细胞的任选的步骤之后使用显微术。
在粘附和使得细胞失活之后，优选将敏感表面用酸性溶液处理，以除去未粘附的细胞和非细胞物质。该酸性溶液的pH可小于5，优选小于3，在一些情况下，pH大约为1，该酸性溶液还可含有低分子量盐。该酸性溶液还可含有适当的缓冲剂，例如甘氨酸。
在本发明的传感器和方法的某些实施方式中，传感器为声波装置。在具体的实施方式中，这种装置可为压电传感器或石英晶体微天平。
当传感器为QCM时，可将传感器封装在传感元件中，该传感元件具有可进入传感器表面的可移动的盖，而无需从外壳移动传感器/QCM晶体。这种传感元件排列描述于WO 2008/132487。
在相关的第三方面，本发明提供了一种检测分析物配体与细胞之间的相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：提供质量敏感型化学传感器，所述质量敏感型化学传感器为根据第一方面的质量敏感型化学传感器或根据第二方面的方法得到的质量敏感型化学传感器，并且所述质量敏感型化学传感器具有粘附于其敏感表面或接近其敏感表面的失活的细胞；将分析物配体引入至敏感表面的附近，使得分析物配体与细胞之间相互作用；以及，当存在相互作用时，通过由于分析物配体与细胞的结合而在敏感表面处质量的变化来检测该相互作用。
在本发明的第三方面的实施方式中，在引入分析物之前，通过与用于相互作用检测的预期的流动缓冲剂接触来稳定传感器表面。该稳定可进行数小时。在某些实施方式中，使用已事先用于稳定传感器的流动缓冲溶液来稀释分析物配体。在传感器提供有流路池或形成部分流路池的实施方式中，流动缓冲剂可取自流路池的出口，并用于在将分析物试样引入至流路池之前稀释该分析物试样。在优选的实施方式中，流动缓冲剂取自出口，并用于基本上在将分析物注射至流路池入口之前立即稀释该分析物。应理解的是，根据该步骤使用的流动缓冲剂仅可在当在流路池中不存在分析物的阶段得到。
通过使用已事先用于稳定传感器表面的流动缓冲剂，可改善分析物缓冲剂与流动缓冲剂之间的匹配。这样有助于降低当引入分析物时由于缓冲特性的变化而引起的信号伪差。在优选的实施方式中，还进行对照分析，其中将来自稳定步骤的流动缓冲剂重新引入到传感器，而不包括分析物。
在某些实施方式中，在分析物配体的多个不同浓度下检测分析物配体与细胞之间的结合的相互作用。这种方法能确定分析物与细胞之间的结合的相互作用的动态参数。例如，使用由Myszka(J.Molec.Recognit.，1999，12，279)或Morton和Myszka(Methods Enzymol.，1998，295，268-294)描述的方法，可实现在分析物的多个浓度下由收集的数据确定动态参数。
在第四方面，本发明提供了一种质量敏感型化学传感器，所述质量敏感型化学传感器可通过第二方面的方法得到，所述化学传感器适于通过由于分析物配体与细胞的结合而在传感器表面处质量的变化来检测分析物配体与粘附的失活的细胞之间的相互作用。第四方面的传感器优选提供有流路池或形成部分流路池。
应理解的是，第四方面的传感器可用于第三方面的方法。与具有在传感器的敏感表面或敏感表面附近粘附的细胞的现有技术的传感器相比，第四方面的传感器的优点在于，细胞为失活的，因此传感器能提供代表结合的相互作用本身的准确的信号。
在第五方面，本发明提供了使用质量敏感型化学传感器来分析分析物配体与在化学传感器的传感器表面上或附近固定的细胞之间的结合的相互作用。
与现有技术方法不同，第五方面关注分析分析物与细胞之间的结合的相互作用本身。在现有技术中，涉及固定的细胞的那些研究使用传感器来分析结合后的在细胞中发生的形态学和其他变化。
在第五方面的优选的实施方式中，所述细胞为失活的。在某些实施方式中，所述细胞被固定。固定方法描述于以上关于本发明的第一方面。在某些实施方式中，结合的相互作用是定量的；特别是可在分析物配体的一个特定浓度下或优选在分析物配体的多个不同浓度下检测分析物配体与细胞之间的结合的相互作用。这种方法能确定分析物与细胞之间的结合的相互作用的动态参数，如上所述。
在第六方面，本发明提供了一种改善质量敏感型化学传感器的敏感性和/或敏感范围的方法，所述质量敏感型化学传感器包含声波装置，例如石英晶体微天平，并且具有在其传感器表面上或附近固定的细胞，所述方法包括将细胞固定或将细胞嵌入交联的聚合物基体内的步骤。
在某些实施方式中，所述细胞为失活的(例如固定的)。此外或可选地，传感器可提供有流路池或形成部分流路池。
声传感器具有有限的衰变长度，该衰变长度确定距敏感表面的敏感距离。尺寸在10μm范围的真核细胞可能不能被压电传感器完全感应。然而，本发明人已发现，如果细胞层具有充分的刚性，则距表面的敏感范围可扩大。在本发明中，固定细胞(例如使用交联剂，如上所述)，或者将细胞嵌入交联的聚合物基体内，为敏感表面上的细胞层提供刚性。这很可能扩大细胞层中声传感器的敏感范围，并因此提高传感器的敏感性。
如果在第六方面使用交联的聚合物基体，该交联的聚合物基体可选自生物传感器领域已知的多种基体，例如，基于多糖的基体。通过常规实验可容易地确定细胞与聚合物基体组分的适当的比率。应理解的是，在敏感表面远端的基体表面处需要以某一最小密度的细胞来接近分析物配体，以便提供可靠的敏感响应。
在第七方面，本发明提供了一种改善质量敏感型化学传感器的敏感性和/或敏感范围的方法，所述质量敏感型化学传感器基于声波装置，例如石英晶体微天平，所述方法包括在其传感器表面上或附近固定聚合物颗粒。
第七方面的聚合物颗粒(由交联的聚合物组成，并且为例如珠粒形式，例如多糖珠粒，例如琼脂糖)可采用类似的方式用于第六方面的固定的或嵌入的细胞。可使用常规方法(例如使用生物传感器领域中的有机偶联化学标准，例如EDC/NHS偶联)将颗粒与敏感表面连接。在珠粒与敏感表面连接(同样使用常规有机偶联技术)之前或更优选之后，用于化学传感研究的有关分子(受体、配体、酶、凝集素等)可与珠粒连接，使得敏感表面呈现该分子的刚性层。如第六方面，距离根据第七方面制备的传感器的表面的敏感范围被扩大，因此增强了传感器的敏感性。
当以第六方面的方法固定或嵌入一层细胞时，可进行将一层有关的其他化学物质与细胞层连接的另外的步骤。这样形成的其他化学物质(例如受体、受体配体、凝集素、糖等)的层则可用于化学传感研究，将获得刚性细胞层的有益效果。
在第八方面，本发明还提供了一种质量敏感型化学传感器，该质量敏感型化学传感器可根据第七方面的方法得到。
在第九方面，本发明提供了一种在质量敏感型化学传感器中增强信号与噪声的比率的方法，所述方法包括在将分析物试样引入至敏感表面之前，使用已事先用于稳定传感器的流动缓冲溶液来稀释分析物试样的步骤。
第九方面的优点描述于以上关于第三方面中。在一种优选的实施方式中，质量敏感型化学传感器提供有流路池或形成部分流路池，并且所述方法包括在将分析物试样注射至流路池之前，使用来自流路池出口的流动缓冲剂来稀释分析物试样的步骤。
附图说明
现在仅通过举例并参考附图来更详细地描述本发明，在附图中：
图1为其上具有固定的人类乳腺癌细胞的QCM传感器的荧光显微照片；
图2显示来自使用根据图1的QCM传感器进行的一系列伴刀豆球蛋白A(ConA)结合实验的数据。分别以12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml注射Con A，以增加的顺序作出各自的反应。确定亲和力为15nM；
图3显示来自使用根据图1的QCM传感器进行的一系列小麦胚芽凝集素(WGA)结合实验的数据。分别以6.5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml注射WGA，以增加的顺序作出各自的反应。确定亲和力为93nM；
图4为其上具有固定的人类表皮癌(A-431)细胞的QCM传感器的荧光显微照片；
图5显示使用图4的QCM传感器和抗-EGFR抗体进行的一系列结合实验得到的数据。分别以6、12.5和25μg/ml注射抗体，以增加的顺序作出各自的反应。确定亲和力为1.2nM；
图6举例说明由筛选用于结合到其上具有固定的A-431细胞的QCM传感器的一系列凝集素得到的数据(a)，以及其中不存在细胞的等价实验的数据(b)；
图7a和图7b显示与含有和不含固定的A-431细胞的QCM传感器结合的ConA与WGA之间的比较；
图8显示研究与固定在金或聚苯乙烯(PS)表面上的A-431细胞结合的ConA的实验的结果。对于每一种表面，使用两种固定方法，甲醛(F)或甲醛+甲醇(FM)。该图编制了作为对于四种条件PSFM、PSF、金FM(GoldFM)和金F(GoldF)，Con A以12.5μg/ml和6.25μg/ml结合到A-431细胞的结果，由Attana Cell 200仪器记录的最大频率；
图9显示依赖Con A与A-431细胞的结合和释放的时间的频率变化。在图8中所描述的实验所采用的四种条件即，PSFM、PSF、金FM和金F下，评价该相互作用；
图10显示由GalNAc结合凝集素与GalNAc结合两种不同的细胞系之间的相互作用得到的数据，在它们各自的细胞表面上暴露不同的糖型(glycotopes)。
具体实施方式
实施例1通用方案
本发明提供了一种方法，该方法最终致力于确定细胞与蛋白质或其他生物学相关分子(例如药物、抗体或受体)之间的动态和亲和力数据。虽然对细胞表面受体和它们的受体/结合剂作为分离蛋白已事先确定了相互作用亲和力和速率，但是对于实际的细胞还未确定相互作用亲和力和速率。在为了例如药物开发而追求更多的生物学相关的检测中，用真核全细胞的实时相互作用检测应构成一个主要的前进步骤。本文研发了一种用于真核细胞及其相互作用搭档的实时相互作用研究的方法。一种示例性方案包括以下步骤：
1、在传感器上旋涂聚苯乙烯表面
2、UV处理聚苯乙烯表面
3、在传感器表面上生长细胞
4、在传感器表面上固定细胞
5、使用甘氨酸任选地预处理传感器表面
6、在生物传感器中稳定传感器表面
7、注射配体/分析物以确定结合的动态和亲和力
固定的全细胞的生物传感器分析提供了一些需要克服的困难。首先，由于预期的信号水平低并且显著的信号漂移将使得相互作用常数的确定困难，具有固定的真核细胞的表面构成的显著更复杂的表面需要稳健的方法来稳定传感器系统中的细胞表面。该示例性方法的步骤4促进细胞的稳定的表面，该细胞稳固地连接到传感器表面并且不离解。步骤5和6在系统中提供了传感器表面所需的的稳定以实现显著低的漂移来进行检测。
第二，声传感器具有有限的衰变长度，该衰变长度决定在液体中距敏感表面的敏感距离。尺寸在10μm范围的真核细胞不可能完全被压电传感器感应。然而，实验已表明，如果增加的层具有充分的刚性，则距表面的敏感范围可扩大。在本发明中，使用根据步骤4的交联剂固定细胞使在敏感表面上的细胞刚性化，这样可能扩大细胞层中的声传感器的敏感范围，并因此增大敏感性。
第三，由于有限的敏感距离以及由于通常存在于真核细胞上的相对低浓度的表面受体，用于细胞表面的相互作用研究的预期信号水平低，因此需要消除不需要的实验副作用，例如来自缓冲基体的信号作用(缓冲效果)。如在该示例性方法的步骤7中所描述的，例如通过精确匹配试样缓冲剂可实现这一点。
方法步骤的详细描述
1、在传感器上旋涂聚苯乙烯表面
在旋涂之前，将传导率-检查的(Smart Tweezers，Siborg Systems Inc.)未抛光的QCM晶体进行氧等离子体处理(Electronic Diener，Femto)，接着在乙醇中超声处理，以确保晶体表面的适当清洁。通过旋涂完成晶体的聚苯乙烯涂层。简单地说，将事先在甲苯中制备为5mg/ml浓度的10μl的聚苯乙烯溶液在晶体的中心沉积，并旋涂(Spin型号P6700系列，SpecialtyCoating Systems，INC.)。在每个晶体上涂布平均
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的聚苯乙烯。随后，在UV处理之前，将涂有聚苯乙烯的晶体在+4℃下储存。
2、UV处理聚苯乙烯表面
为了使优化的细胞连接和生长，通过UV辐射来氧化聚苯乙烯表面是优选的步骤。进行UV处理以确保表面更好的润湿性，润湿性通过水滴与聚苯乙烯表面的接触角来测定(The pocket Goniometer，PG-3，FIBRO System AB)。事先确定UV暴露时间以得到60-65度的接触角，与传统的组织培养表面一致。
3、在传感器表面上生长细胞
在37℃、5％的CO2培养箱中胰酶消化(trypsinised)(根据标准细胞胰酶消化(trypsination)程序)在适当培养基(根据细胞系)中生长的细胞，以制备单细胞悬浮液。使用血球计数器进行细胞计数，并将细胞在聚苯乙烯表面上接种至适当的密度/浓度，以在24小时培养之后达到约70-80％传感器表面的覆盖，通过核染色(描述于下一段)固定之后进行评价。
4、在传感器表面上固定细胞
在24小时培养之后，将事先在晶体上接种的细胞在甲醛(Sigma)中进行固定。将细胞培养基移除，并将细胞在冰冷的PBS中洗涤。随后，通过在+4℃下用0.5ml在冰冷的PBS中新制备的3.7％甲醛溶液培养细胞10分钟，进行细胞的固定。进行三次5分钟的洗涤步骤，以除去剩余的甲醛。随后进行核染色以评价晶体的细胞覆盖率。简单地说，将细胞用制备成最终浓度为2.8μM的核染料DAPI(Invitrogen，λEx/Em：358-461nm)培养3分钟。在PBS中进行洗涤步骤之后，在荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)下目测细胞-晶体。随后在+4℃下将细胞-晶体保存在PBS中。
5、使用甘氨酸预处理传感器表面
在安装到碎片夹具中并在Attana Cell 200仪器(www.attana.com)中操作之前，使用再生溶液(甘氨酸10mM，NaCl 500mM，pH1)对细胞进行任选的预处理。该处理进一步清洁表面，因此能更快地稳定细胞-晶体以及在AttanaCell 200仪器中更稳定的基线。
6、在生物传感器中稳定传感器表面
以25-50μl/min、在补充0.025％Tween(PBST)的PBS中，将已预处理的细胞-晶体安装在Attana Cell 200仪器碎片夹具中，并插入至该仪器中以稳定数小时或整夜。在20℃下，以25μl/min进行凝集素和/或抗体结合的操作及评价。
7、注射配体/分析物以确定结合的动态和亲和力
设计检测，通过确定亲和力常数来表征在细胞表面，细胞受体或其他特定组分(例如碳水化合物结构)所导向的配体分析物(例如抗体或凝集素)的分子相互作用的机理。目的是提供在固定的细胞(例如人类癌性粘附细胞)的表面发生的相互作用的生物物理解释。在生物分子结合反应中结合常数的评价的质量取决于进行检测的条件。通过在分析物的一个特定浓度下或在分析物的多个不同浓度下监测结合的相互作用可确定亲和力和速率常数，任选在分析物注射之间具有细胞表面的中间体再生(使用补充有0.5M NaCl的pH为1的10mM甘氨酸可实现这一点)。
在本文报道的实施例中，被70-80％细胞覆盖的细胞-晶体、流速(25μl/ml)、流动缓冲剂(PBST)和80-170秒的接触时间用于使响应最大化以及使非特异性相互作用最小化，降低质量输送效果和分散。为了稳健和精确地确定动态和亲和力常数，可使用一组浓度，并且在典型的实施方式中，该组包括3-5种不同的浓度，每个浓度重复至少两次。浓度范围应为至少10倍，并且在最高浓度时，分析物应与至少一半的可用的表面受体结合。分析物分子的适当的浓度取决于分析物对受体的亲和力。对于lnM亲和力抗体，发现3-50μg/ml的范围是适当的，而对于15nM亲和力凝集素，需要高达100μg/ml的浓度范围来达到最大响应(对于与细胞表面受体结合的抗体，通常为5-10Hz，而对于与细胞表面碳水化合物结合的凝集素，通常为250Hz)。
具有小的预期的信号响应，具有高度复杂的传感器表面，流动缓冲剂与试样缓冲剂的匹配变得高度优选。在提供试样缓冲剂与流经传感器表面的流动缓冲剂之间的最优化匹配的任选的方法中，从出口收集通过传感器表面的缓冲剂并再次用于试样稀释。优选地，恰好在试样注射之前收集缓冲剂，以提供缓冲剂之间的最佳可能的匹配。任选地，采用相同的方式进行对照注射，但是未加入任何分析物。缓冲剂对照物则可用于消除伪差并提供有效的高品质生物传感器分析。
与常规相互作用检测类似，用开/关速率和亲和力常数(Kd)(参见以上Myszka参考书)的确定进行动态分析。
实施例2a在Attana Cell 200仪器上细胞-凝集素相互作用
将MDAMB468细胞(人类乳腺癌细胞系)在经UV处理的PS晶体上接种，在3.7％甲醛中24小时后固定，核染色如图1所示。
在20℃下、在25μl/min流速下进行实验。补充0.025％Tween的PBS用作流动缓冲剂。将各种浓度的凝集素(conA和WGA)在细胞上注射，其中接触时间为85秒，并监测离解至少300秒。数据示于图2和图3。使用softwareClamp(TIBS，1998，23，149)进行动态评价。
两种凝集素(Con A和WGA)携带不同的结构和糖特异性。本文呈现的实验表明，在具有不同强度和亲和力的细胞的表面，两种凝集素均与碳水化合物相互作用，由此提供关于MDAMB468细胞表面的复合糖的聚糖组合物的有价值的信息。对于Con A和WGA，细胞表面碳水化合物与两种凝集素之间的相互作用的亲和力常数分别为15nM和93nM。
实施例2b凝集素-细胞表面相互作用的特异性
为了进一步证实凝集素-细胞表面碳水化合物相互作用的特异性，让结合凝集素的GalNAc在不同的浓度下与两种不同的细胞系(SW480和HT29)相互作用，在它们各自的表面上暴露不同的糖型。在浓度为6.25μg/ml-200μg/ml的流动缓冲剂中制备凝集素，随后在各自的传感器表面上在SW480和HT29细胞上注射凝集素。将凝集素注射85秒，随后让其离解200秒。如图10所示，在SW480细胞上仅检测到少量结合，而与HT29细胞的结合是依赖浓度的并且显著更大。
实施例3在Attana Cell 200仪器上的细胞抗体相互作用
A-431细胞系为过量表达EGFR受体的人类上皮粘着细胞系(表皮癌)。
在经UV处理的聚苯乙烯QCM晶体上的经固定和DAPI染色的A-431细胞示于图4。
于室温下，将晶体在pH为1的10mM甘氨酸、500mM的NaCl中预处理20分钟，并在PBS-T中洗涤，随后安装到碎片夹具中。将该晶体在20℃和40μl/min流速下在PBS-T(0.025％Tween)中稳定过夜。在抗体注射期间流速降至25μl/min。
抗体：在2mg/ml的PBS(Santa Cruz)中的抗-EGFR sc 101。测试3种不同的抗体浓度：25、12.5和6μg/ml。
分析结果示于图5。确定在抗-EGFR与细胞表面EGFR受体之间的相互作用的动态速率和亲和力常数(Kd＝1.2nM)。
实施例4在Attana Cell 200仪器上细胞-凝集素相互作用-通过细胞固定对敏感性的改善
将A-431细胞(人类上皮癌细胞系)在经UV处理的PS晶体上接种，在3.7％甲醛中24小时后进行固定。在20℃、25μl/min流速下，在补充有0.025％Tween的PBS中进行实验。以50μg/ml的浓度将凝集素WGA和ConA在细胞上注射，接触时间为85秒，并监测离解215秒。由不含细胞但经同样处理和制备的经UV处理的PS晶体组成对照晶体，在实验中包括该对照晶体以评价非凝集素-细胞相互作用的贡献。在相同的条件下，使用多种其他凝集素进行筛选实验，以说明ConA和WGA相互作用的特异性(图6a中存在A-431细胞，而图6b中不存在细胞)。
WGA(＞800Hz)与A-431细胞表面的高结合响应(图7a)说明，与含有相关碳水化合物的相同或更高的表面密度的两种尺寸的表面的预期的响应相比，其响应显著增大。由于在表面上存在分子堆积密度的实际限制，在两种尺寸的表面上能达到的预期的最大响应应为100Hz，条件是WGA的分子量为35000Da。敏感性增大约8倍可解释为固定在表面上的固定的细胞提供的表面增强。虽然细胞的厚度在10μm范围并且QCM传感器通常的衰变长度在几百nm范围内，但如果不是为了固定所提供的细胞的刚性化，那么由于表面增强而对敏感性的改善应该是有限的。因此，提供的数据表明，通过向表面加入和固定细胞，可改善传感器的敏感性和动力学范围。图7b直接比较了对于ConA和WGA结合，A-431和对照晶体的频率位移。
实施例5表面和固定方法
将A-431细胞固定在金或聚苯乙烯(PS)表面上。随后根据两种不同的方法来固定已固定的细胞。固定策略通常分为添加固定(基于在蛋白质之间形成共价键)和变性固定(包括各种细胞组分的脱水)。在本实验中，测试基于这两种原则中的每一种的固定方法。进行对经核染色的细胞的显微评价，来评价固定的程度。
所测试的4种条件如下所示：
-在聚苯乙烯上固定并用甲醛+甲醇固定(PSFM)的A-431
-在聚苯乙烯上固定并用甲醛固定(PSF)的A-431
-在金上固定并用甲醛+甲醇固定(金FM)的A-431
-在金上固定并用甲醛固定(金F)的A-431
除了以前描述的聚苯乙烯表面以外，凝集素ConA与A-431的结合用于评价金表面作为宿主哺乳动物细胞的供选。另外，将使用甲醛和甲醇的变性固定方法与先前描述的基于甲醛的添加固定策略相比较。
由图8和图9清楚地表明，PS为用于细胞连接的较好的底物，其具有使用变性固定得到的最高信号；然而，金表面可用作供选。类似地，虽然可使用两种固定方法，但是在该具体的实施例中变性固定看起来是有利的。
固定方法以及表面类型的优选取决于待研究的系统。这些实施例表明，不仅添加固定方法和变性固定方法，而且金或聚苯乙烯表面，与使用AttanaCell 200仪器的高品质测量均是条件相容的。
上述实施例只是为了举例说明本发明的具体实施方式，而不是限定其范围，范围由附加的权利要求限定。本文中所有引用的文献全文引入作为参考。

Claims (28)

1.一种质量敏感型化学传感器，所述化学传感器具有粘附于其敏感表面的失活的细胞，并且适用于通过由于分析物配体与细胞的结合而在传感器表面处引起的质量的变化来检测分析物配体与粘附的失活的细胞之间的相互作用，其中，所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。
2.根据权利要求1所述的质量敏感型化学传感器，其中，所述细胞被固定。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其中，所述细胞为真核的。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的传感器，其中，在将细胞固定之前，使用高纯度水测定，所述敏感表面的接触角为10-90度，优选为20-80度，更优选为30-70度。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的传感器，其中，所述敏感表面提供有聚合物涂层，所述细胞粘附于所述聚合物涂层上。
6.根据权利要求5所述的传感器，其中，所述聚合物涂层含有聚苯乙烯，所述聚苯乙烯优选通过用等离子体轰击或电磁辐射处理来改性。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的传感器，其中，所述传感器为声波装置，例如石英晶体微天平。
8.一种用于检测分析物配体与细胞之间的相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：提供根据权利要求1-7中任意一项所述的质量敏感型化学传感器；将所述分析物配体引入至所述敏感表面的附近，使得分析物配体与细胞之间相互作用；以及，当存在相互作用时，通过在所述敏感表面处的质量的变化来检测所述相互作用。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，使用流动缓冲溶液稀释所述分析物配体，所述流动缓冲溶液事先已与所述敏感表面接触。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，在分析物配体的一个特定浓度下或在分析物配体的多个不同浓度下检测分析物配体与细胞之间的结合的相互作用。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，使用在分析物配体的一个特定浓度下或在分析物配体的多个不同浓度下收集的数据进行分析物与细胞之间的结合的相互作用的动态参数的确定。
12.质量敏感型化学传感器在分析分析物配体与在所述化学传感器的传感器表面上或附近固定的细胞之间的结合的相互作用中的用途，其中，所述细胞为失活的。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述细胞被固定。
14.一种用于改善质量敏感型化学传感器的敏感性和/或敏感范围的方法，所述质量敏感型化学传感器包括声波装置，例如石英晶体微天平，并且具有在所述质量敏感型化学传感器的传感器表面上或附近固定的细胞，所述方法包括将细胞固定或将细胞嵌入交联的聚合物基体内的步骤，其中，所述细胞为失活的，并且其中，所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。
15.一种用于改善质量敏感型化学传感器的敏感性和/或敏感范围的方法，所述质量敏感型化学传感器基于声波装置，例如石英晶体微天平，所述方法包括在所述质量敏感型化学传感器的传感器表面上或附近固定聚合物颗粒。
16.一种根据权利要求15所述的方法得到的质量敏感型化学传感器。
17.一种用于增强质量敏感型化学传感器中信号与噪声比率的方法，所述方法包括在将分析物试样引入所述敏感表面之前，使用流动缓冲溶液来稀释分析物试样的步骤，所述流动缓冲溶液已事先用于稳定所述传感器。
18.一种用于制备质量敏感型化学传感器的方法，所述质量敏感型化学传感器能检测分析物配体与固定的细胞之间的相互作用，所述方法包括以下步骤：使含有细胞的悬浮液与传感元件的敏感表面接触；使得细胞粘附于所述敏感表面并可能在所述敏感表面上生长；在适当的时间之后，处理所述粘附的细胞，使得它们失活；以及，将所述传感器整合到流路池中，使得所述传感器提供有流路池或形成部分流路池。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述细胞为真核的。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，在与含有细胞的悬浮液接触之前，将所述敏感表面改性，以提高表面能，从而增强细胞与该表面的粘附。
21.根据权利要求18-20中任意一项所述的方法，其中，在将细胞固定之前，使用高纯度水测定，所述敏感表面的接触角为10-90度，优选20-80度，更优选30-70度。
22.根据权利要求18-21中任意一项所述的方法，其中，所述敏感表面提供有聚合物涂层，该聚合物涂层与所述含有细胞的悬浮液接触。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述聚合物涂层含有聚苯乙烯，所述聚苯乙烯优选通过用等离子体轰击或电磁辐处理来改性。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述聚合物涂层通过用聚合物溶液旋涂所述传感元件来制备。
25.根据权利要求18-24中任意一项所述的方法，其中，通过物理手段或通过化学手段实现所述粘附的细胞的失活，所述物理手段例如将细胞保持在降低的温度下、急速冷冻或减压热处理，所述化学手段例如毒素处理或化学交联。
26.根据权利要求18-25中任意一项所述的方法，其中，通过将细胞固定实现所述粘附的细胞的失活。
27.根据权利要求18-26中任意一项所述的方法，其中，在失活之后，将所述敏感表面用酸性溶液处理，以除去未粘附的细胞和非细胞物质。
28.根据权利要求18-27中任意一项所述的方法，其中，所述传感器为声波装置，例如石英晶体微天平。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105891474A (zh) * 2016-04-07 2016-08-24 江南大学 一种基于磁弹性传感器的细菌检测方法
CN113167793A (zh) * 2018-11-20 2021-07-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于在传感器表面上接种细胞的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2515111A1 (en) 2011-04-19 2012-10-24 SAW instruments GmbH Analytical method to investigate binding of analyte ligands to cells
US9182376B2 (en) * 2013-02-28 2015-11-10 Halliburton Energy Services, Inc. Determining constituents of a wellbore fluid
US10809194B2 (en) 2018-05-27 2020-10-20 Biosensing Instrument Inc. Surface plasmon resonance imaging system and method for measuring molecular interactions
JP7357050B2 (ja) 2018-05-27 2023-10-05 バイオセンシング インストラメント インコーポレイテッド 分子間相互作用を測定するための表面プラズモン共鳴イメージングシステム及び方法
WO2020057737A1 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 Applied Materials, Inc. Method of pretreating an oscillation crystal for measuring a deposition rate, deposition rate measurement device, evaporation source and deposition apparatus
WO2023152188A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Attana Ab Analytical method

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283270A (zh) * 1997-11-24 2001-02-07 Q－森斯公司 用来检测生物物质的传感器
WO2001025780A1 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. Chemical sensor and coating for same
CN1487278A (zh) * 2003-09-02 2004-04-07 侯邦义 在试液中利用石英晶体微天平检测病毒的方法
CN1598577A (zh) * 2004-07-28 2005-03-23 南开大学 中药作用机理的测定方法
CN1834653A (zh) * 2006-04-20 2006-09-20 上海交通大学 利用生物磁感应压电传感阵列探测癌细胞的方法
CN101231286A (zh) * 2008-02-21 2008-07-30 江苏省人民医院 乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用
WO2008132487A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Attana Ab Mass-sensitive chemical sensor
CN101371139A (zh) * 2005-12-29 2009-02-18 康宁股份有限公司 用于检测分析物的支持物以及制造和利用该支持物的方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0875629A (ja) * 1994-09-09 1996-03-22 Nippon Steel Corp 流体中吸着物量連続測定素子及び材料層コーティング方法
US6123819A (en) * 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
ATE307881T1 (de) * 1999-03-30 2005-11-15 Netech Inc Methode zur selektiven trennung von blutzellen unter verwendung von lektin
US6289717B1 (en) * 1999-03-30 2001-09-18 U. T. Battelle, Llc Micromechanical antibody sensor
US6884628B2 (en) * 1999-04-28 2005-04-26 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Multifunctional polymeric surface coatings in analytic and sensor devices
CA2348398C (en) * 1999-09-22 2007-11-20 Surmodics, Inc. Water-soluble coating agents bearing initiator groups and coating process
JP4992000B2 (ja) * 1999-11-03 2012-08-08 インターナショナル・ビジネス・マシーンズ・コーポレーション ターゲット・オリゴヌクレオチド・ストランドを検出するセンサ・システム及び方法
US6428749B1 (en) * 1999-12-15 2002-08-06 Hitachi, Ltd. Advanced thermal gradient DNA chip (ATGC), the substrate for ATGC, method for manufacturing for ATGC, method and apparatus for biochemical reaction, and storage medium
ATE342225T1 (de) * 2000-08-09 2006-11-15 California Inst Of Techn Nanoelektromechanische vorrichtung zur durchführung biochemischer analysen
US20030008335A1 (en) 2001-05-11 2003-01-09 Marx Kenneth A. Biosensor for drug candidates
US20030068655A1 (en) * 2001-09-12 2003-04-10 Protiveris, Inc. Microcantilever apparatus and methods for detection of enzymes
JP2003083973A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Initium:Kk レセプター−リガンド間の相互作用の解析方法
US20070237676A1 (en) * 2002-04-15 2007-10-11 Colton Jonathan S Polymer micro-cantilever with probe tip and method for making same
US7288404B2 (en) * 2002-04-29 2007-10-30 Regents Of The University Of California Microcantilevers for biological and chemical assays and methods of making and using thereof
US7566531B2 (en) 2003-03-03 2009-07-28 University Of Massachusetts Selective whole cell quartz crystal microbalance biosensors
JP2004305095A (ja) * 2003-04-07 2004-11-04 Limuloid Science Kk 細胞活性化検出方法
US7207206B2 (en) * 2004-02-19 2007-04-24 Ut-Battelle, Llc Chemically-functionalized microcantilevers for detection of chemical, biological and explosive material
WO2005095968A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-13 Toray Industries, Inc. センシングツール
AU2005245996A1 (en) 2004-05-21 2005-12-01 Atonomics A/S Surface acoustic wave sensor comprising a hydrogel
GB2437753B8 (en) * 2004-10-01 2009-05-20 Nevada System Of Higher Education Cantilevered probe detector with piezoelectric element
US7765854B2 (en) * 2004-11-16 2010-08-03 Exxonmobil Research And Engineering Company Microcantilever stress sensor for fluid analysis
JP4657867B2 (ja) * 2005-09-27 2011-03-23 セイコーインスツル株式会社 マイクロリアクター及びマイクロリアクターシステム
US8510056B2 (en) 2005-10-24 2013-08-13 Western Michigan University Research Foundation Method and integrated microsystem for detecting biomolecules in liquid
AU2007208310B2 (en) * 2006-01-23 2012-05-31 Drexel University Self-exciting, self-sensing piezoelectric cantilever sensor
US8481335B2 (en) * 2006-11-27 2013-07-09 Drexel University Specificity and sensitivity enhancement in cantilever sensing
WO2008106048A1 (en) * 2007-02-28 2008-09-04 Corning Incorporated Surfaces and methods for biosensor cellular assays
GB0705088D0 (en) * 2007-03-16 2007-04-25 Akubio Ltd Improvements in or relating to detection and/or characterisation of aggregates
US20100227372A1 (en) * 2007-07-27 2010-09-09 The University Of Sydney Biological functionalisation of substrates
WO2010138486A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Corning Incorporated Substrates for adhering, culturing and assaying cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283270A (zh) * 1997-11-24 2001-02-07 Q－森斯公司 用来检测生物物质的传感器
WO2001025780A1 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. Chemical sensor and coating for same
CN1487278A (zh) * 2003-09-02 2004-04-07 侯邦义 在试液中利用石英晶体微天平检测病毒的方法
CN1598577A (zh) * 2004-07-28 2005-03-23 南开大学 中药作用机理的测定方法
CN101371139A (zh) * 2005-12-29 2009-02-18 康宁股份有限公司 用于检测分析物的支持物以及制造和利用该支持物的方法
CN1834653A (zh) * 2006-04-20 2006-09-20 上海交通大学 利用生物磁感应压电传感阵列探测癌细胞的方法
WO2008132487A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Attana Ab Mass-sensitive chemical sensor
CN101231286A (zh) * 2008-02-21 2008-07-30 江苏省人民医院 乙酰胆碱酯酶压电生物传感器在检测神经束性质中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENNETH BARBEE, SUN KWOUN, RYSZARD M. LEC AND JOSEPH SORIAL: "The study of a cell-based TSM piezoelectric sensor", 《FREQUENCY CONTROL SYMPOSIUM AND PDA EXHIBITION, 2002. IEEE INTERNATIONAL》 *
RON BLONDER，IDDO BEN-DOV，ET AL.: "Photochemically-Activated electrodes:application in design of reversible immunosensors and antibody patterned interfaces", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS 》 *
刘光明，张广照: "石英晶体微天平在高分子科学中的应用", 《高分子通报》 *
李晓玉: "压电传感器对非刚性膜的响应及其应用研究", 《中国优秀硕士学位论文数据库》 *
李柳应 等: "压电生物传感器检测肝癌细胞的粘弹性", 《传感器世界》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105891474A (zh) * 2016-04-07 2016-08-24 江南大学 一种基于磁弹性传感器的细菌检测方法
CN113167793A (zh) * 2018-11-20 2021-07-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于在传感器表面上接种细胞的方法

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