DE69309468T2

DE69309468T2 - Nachweis eines Analyten mittels eines Analyt-sensitiven Polymers

Info

Publication number: DE69309468T2
Application number: DE69309468T
Authority: DE
Inventors: Richard Ebersole; Robert Foss; Michael Ward
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-09
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2013-07-10
Also published as: CA2139242A1; EP0650598B1; DE69309468D1; EP0650598A1; US5695925A; WO1994002852A1; JPH07509264A; ATE151174T1; US5756279A

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer flüssigen Probe, welches die Ausbreitungseigenschaften der Schall- und Lichtenergie eines Polymers nützt, an das ein Sensor angeschlossen ist.

HINTERGRUND

Nachweismechanismen, die chemische und biologische Substanzen im Nanomolbereich nachweisen können, finden auf einer Vielfalt kommerzieller Gebiete einschließlich der Nahrungsmittel-, Gesundheits-, Umwelt- und Abfallbehandlungsindustrie zunehmende Verwendung. Eine Anzahl empfindlicher Vorrichtungen einschließlich derjenigen, die Verschiebungen der Resonanzfrequenz ausnutzen, wie etwa piezoelektrische Meßwertaufnehmer, als auch optische Sensoren, die auf der Grundlage von Brechungsindexänderungen arbeiten, ist entwickelt worden, um diesen Nachweisbedürfnissen zu entsprechen.
Die Fähigkeit piezoelektrischer Meßwertaufnehmer zum Nachweis kleiner Massen-, Viskositäts- und Dichteänderungen an ihrer Oberfläche während sie in Flüssigkeiten eintauchen, hat sie als analytische Werkzeuge dort besonders nützlich gemacht, wo die Messung sehr geringer Materialmengen in Lösung durchgeführt werden muß. Entwurfsstrategien für piezoelektrische Sensoren umfassen hauptsächlich Vorgänge, die zu Massenänderungen an der Kristalloberfläche führen. Der in dieser Hinsicht am ausführlichsten untersuchte Meßwertaufnehmer ist der AT-geschnittene Quarzresonator im Schermodus, der gemeinhin als Quarzkristall- Mikrowaage (QCM) bezeichnet wird, welcher einen zwischen zwei Metallanregungselektroden angebrachten, AT-geschnittenen Quarzkristall umfaßt. Ein Beispiel der Verwendung der zum Nachweisen biologischer Analyte verwendeten QCM ist aus der EPO-Patentveröffentlichung Nr. 0 215 669 (Karube et al.) zu ersehen, wo die Konzentration eines Analyten in Lösung auf der Grundlage der Änderung der Resonanzfrequenz (Δf) berechnet wurde, die durch das Gewicht eines Analyten hervorgerufen wurde, der einem auf der Oberfläche einer piezoelektrischen Anordnung immobilisierten Rezeptormaterial zugesetzt wurde. Die Erfindung von Karube zeigt, daß der piezoelektrische Meßwertaufnehmer beim Messen der Konzentration einiger biologischer Analyte brauchbar ist.
Obschon ein piezoelektrischer Meßwertaufnehmer in Lösungsumgebungen ein nützliches Werkzeug ist, muß seine Oberfläche modifiziert sein, um ihm ein Maß an Spezifität für den nachzuweisenden Analyten zu verleihen und die Herstellung dieser modifizierten piezoelektrischen Vorrichtungen ist verfahrensmäßig komplex und oft schwierig. In dem Fall, wo die zu bestimmenden Analyten biologischer Natur sind, müssen die Rezeptormittel (Antigene, Antikörper oder andere Liganden) auf der Kristalloberfläche immobilisiert sein. Diesem Verfahren sind jedoch bedeutende Einschränkungen zu eigen, da die Rezeptormittel während des Immobilisierungsverfahrens inaktiviert werden können oder sich nach der Immobilisierung von der Kristalloberfläche ablösen können.
Zum Erleichtern der Rezeptormodifizierung der QCM sind polymerüberzogene Quarzoszillatoren entwickelt worden, die ein wirkungsvolleres und spezifischeres Binden von Rezeptormitteln erlauben. Muller-Schulte (DE 37 33 986 Al) beschreiben das Überziehen eines piezoelektrischen Oszillators mit einem wasserunlöslichen Polymer, das die Adsorption verschiedener Biomoleküle erleichtert. Diese immobilisierten Biomoleküle können anschließend Antigene oder Liganden binden und die sich daraus ergebende Massenzunahme des Oszillatorguarzes wird in Änderungen der Resonanzfrequenz übersetzt, die zum mengenmäßigen Bestimmen des Analyten verwendet werden können.
Diese Beispiele der Verwendung der piezoelektrischen Sensoren sind nützlich, sie sind aber darin beschränkt, daß sie alle auf einer Massenänderung auf der Sensoroberfläche beruhen, um eine Anderung der Resonanzfrequenz zu bewirken. Ein einzig auf Massenänderungen beruhender Sensoraufbau kann einschränkend sein, falls die Analyten eine niedrige Molmasse besitzen. Zum Beispiel ist die mit dem Binden eines Proteins an eine aktive Oberfläche eines AT-geschnittenen Kristalls im Schermodus verbundene Massenzunahme im allgemeinen für eine praktische Frequenzantwort nicht ausreichend. Andere Betrachtungen schließen die Starrheit des gebundenen Analyten ein; zum Beispiel ergeben Newton'sche Filme, die an die Oberfläche einer QCM gebunden sind, Frequenzverschiebungen, die viel geringer sind, als von der Sauerbrey- Gleichung vorhergesagt (Sauerbrey, Phys. (1959) 155:206).
Außerdem sind piezoelektrische Oszillatortechniken für kontinuierliche (kinetische) Echtzeitmessungen der biologischen Aktivität von Organismen nicht sehr gut geeignet und die Brauchbarkeit rezeptormodifizierter piezoelektrischer Verfahren ist durch die Spezifität bekannter Reagenzien begrenzt, eine Tatsache, die ein wiederholtes Testen zum Sicherstellen der Anwesenheit verschiedener Typen von Organismen erfordert.
Zum Überwinden dieser Einschränkungen sind Polymerfilme zum Reagieren mit speziellen Reagenzien, Ionen oder Metaboliten in dem Versuch entworfen worden, die Spezifität des Nachweisverfahrens zu erhöhen. Zum Beispiel offenbart das US-Patent 4 735 887 (Foss et al.), daß Propylenimin mit Polyampholyten über einen Ringöffnungsmechanismus unter Bilden primärer Amine reagiert. Die primären Amine können mit gerbenden Entwicklern und mit gewöhnlichen Aldehydvernetzern unter Bilden vernetzter Netzwerke reagieren. Ebersole et al. (internat. Veröffentl. Nr. W091/01381) beschreiben die Verwendung von Polyampholyten in Lösung, die sich beim Kontakt mit den Stoffwechselprodukten eines Organismus auf einer piezoelektrischen Vorrichtung unter Erzeugen einer Änderung der Resonanzfrequenz abscheiden, welche mit der Konzentration oder dem Ausmaß der Änderung in Anwesenheit eines Stoffwechselproduktes korreliert werden kann. Hier wird der Polyampholyt nicht auf der Sensoroberfläche immobilisiert, bevor er einem Analyten ausgesetzt wird, von dem vermutet wird, daß er in einer Probe vorliegt. Tanaka et al. (US-Patent 4 732 930) haben gezeigt, daß gewisse ionische Gele, die durch die Polymerisation von Isopropylacrylamid in Gegenwart eines metallionenhaltigen Monomers, eines Vernetzers und eines geeig neten flüssigen Mediums gebildet wurden, zu drastischen Volumenänderungen als Antwort auf Änderungen der Lösungsmittelzusammensetzung, Temperatur oder des pH oder der Ionenzusammensetzung befähigt sind. Tanaka et al. machen jedoch keinen Versuch, die Natur dieser Gele mit einer Meßvorrichtung zu verknüpfen, die piezoelektrische Oszillatoren oder den Nachweis von Änderungen des Brechungsindex zum Erzielen einer Analyten-Empfindlichkeit verwendet.
Versuche zum Einbinden der dynamischen Eigenschaften physikalischer Größen von Polymerfilmen in analytische Nachweissysteme sind selten und schlecht ausgearbeitet. Verschiedene Änderungen physikalischer Größen sind bei vernetzten Polymeren berichtet worden, die sowohl auf Änderungen der Partialdrücke von Gasen wie etwa Sauerstoff (Irani et al., Entflammbarkeit und Empfindlichkeit von Materialien in sauerstoffangereicherter Atmosphäre: dritter Band, ASTM STP 986, D. W. Schroll, Hrsg., American Society for Testing and Material, Philadelphia, (1988), S. 346- 358) als auch auf Änderungen der Feuchtigkeit und Salzkonzentration ansprechen. Die JP-63-206 653 beschreibt einen Salzkonzentrationssensor, der durch die Tatsache gekennzeichnet ist, daß eine Gelschicht oder Masse aus einem organischen Polymer auf einem Träger zurückgehalten wird, was in Abhängigkeit von der Salzkonzentration zu einer Phasenänderung oder Volumenänderung führt. Die JP-2-212 744 beschreibt einen Halbleiter-Feuchtigkeitssensor, der atmosphärische Feuchtigkeit auf der Grundlage der Ausdehnung oder Kontraktion eines feuchtigkeitsemfindlichen Polymers beim Kontakt mit der Oberfläche einer piezoelektrischen Zelle nachweist. Änderungen des Piezowiderstandes der Zelle werden in prozentuale atmosphärische Feuchtigkeit übersetzt.
Obschon von Gelen und vernetzten Polymeren bekannt ist, daß sie wie in der vorstehenden Technik gezeigt auf verschiedene biologische und ionische Analyte ansprechen, hängt in allen Fällen die Herstellung von dem gemeinsamen physikalischen Prinzip des Quellens des Polymers als Antwort auf eine Salz- oder Feuchtigkeitsänderung ab. Weiterhin ist dem Polymergel nichts zu eigen, was es auf Wasser oder ein besonderes Ion spezifisch antworten läßt, und alle Gele müssen sich in einem vorgequollenen Zustand befinden, um funktionsfähig zu sein.
Optische Sensoren zum Nachweis von Analyten beruhen im allgemeinen auf kleinen Änderungen des Brechungsindex als Antwort auf die Anwesenheit eines Analyten. Gemeinhin verwendete optische Sensoren schließen ebene Wellenleiter, optische Fasern und Beugungsgitter ein. Im allgemeinen leiden optische Sensoren dieser Art an vielen derselben Nachteile wie piezoelektrische Oszillatoren, wie etwa ein Fehlen an Spezifität auf einen Analyten, Schwierigkeiten bei der Oberflächenvorbereitung als auch Schwierigkeiten beim Messen kontinuierlicher (kinetischer) Echtzeitänderungen der biologischen Aktivität. Bis heute sind diese Schwierigkeiten auf dem Gebiet der optischen Sensoren unbeantwortet geblieben.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem neuen, auf einen Analyten reagierenden Polymer, das (1) auf die Anwesenheit eines Analyten durch Ändern seiner Fähigkeit, Licht- und/oder Schallenergie weiterzuleiten, reagiert, (2) eine Spezifität auf einen bestimmten Analyten zeigt und (3) die Fähigkeit behält, mit der Oberfläche eines Sensors einen Verbund zu bilden, so daß die Änderungen der Ausbreitungseigenschaften durch den Sensor nachgewiesen werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Der Gegenstand der Erfindung schließt als einen Aspekt ein Verfahren ein, das zum Nachweisen eines Analyten auf den Ausbreitungseigenschaften von Schall- und/oder Lichtenergie eines auf einen Analyten reagierenden Polymers beruht. Das Verfahren umfaßt das
a. In-Berührung-bringen entweder eines akustischen oder optischen Nachweissystems mit einem Analyten, auf den ein in dem Nachweissystem enthaltenes, auf einen Analyten reagierendes Polymer reagiert;
b. im Falle einer optischen Ausführungsform der Erfindung, Anschließen des Systems aus Schritt a an ein Mittel zum Nachweisen von Änderungen bei der Ausbreitung von Licht des auf den Analyten reagierenden Polymers;
c. Messen von Ausbreitungsänderungen bei den Eigenschaften des Nachweissystems und das
d. Korrelieren der in Schritt c gemessenen Ausbreitungsänderungen mit dem Vorhandensein, der Konzentration oder Bildungsgeschwindigkeit des Analyten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die ein leitendes, auf einen Analyten reagierendes Polymer mit 1-20 Vernetzungen je Polymermolekül umfaßt, das aus amphoteren Cooder Terpolymeren von Acrylsäure, Alkylmethacrylat und N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat mit einem pH zwischen 5,0 bis 8,0 ausgewählt ist, wobei das amphotere Co- oder Terpolymer auf einer Oberfläche immobilisiert ist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist das Verfahren zum Herstellen der beanspruchten Zusammensetzung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 veranschaulicht das zweistufige Herstellungsverfahren für den Polyampholyten.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung des Erreichens des pI von Materialien mit einer engen und breiten Verteilung der Zusammensetzung zeigt.
Figur 3 veranschaulicht ein typisches Schema für die Herstellung eines vernetzten, auf einen Analyten reagierenden Polymers.
Figur 4 (a) veranschaulicht die fGmax-Änderung für einen AT-geschnittenen 5-MHz-Quarzresonator, der mit vernetzten Polymerfilmen überzogen ist, bei unterschiedlichen pH-Werten. ( ) Filmdicke = 0,4 µm, ( ) Filmdicke = 0,8 µm.
Figur 4 (b) veranschaulicht die fGmax-Änderung für einen AT-geschnittenen 5-MHz-Quarzresonator, der mit vernetzten Polymerfilmen überzogen ist, bei unterschiedlichen pH-Werten. ( ) Filmdicke = 0,4 µm, ( ) Filmdicke = 0,8 µm.
Figur 5 veranschaulicht die Frequenzantwort eines AT-geschnittenen 5-MHz-Resonators, der mit einem vernetzten Polymerfilm überzogen ist, auf die Urease-katalysierte Harnstoffhydrolyse bei drei verschiedenen Ureasekonzentrationen: 0,83 µg/ml (kleines ausgefülltes Quadrat), 0,43 µg/ml (unausgefülltes Quadrat), 0,22 Mm (größeres ausgefülltes Quadrat). Einfügung: Abhängigkeit des Zeitpunkts des Frequenzminimums von der Ureasekonzentration.
Figur 6 veranschaulicht die Frequenzantwort eines AT-geschnittenen 5-MHz-Resonators, der mit einem vernetzten Polymerfilm überzogen ist, auf E. coli in verschiedenen Kohlehydraten.
Figur 7 veranschaulicht die Änderung des Brechungsindex eines vernetzten Polymerfilms als Antwort auf die Urease-katalysierte Harnstoffhydrolyse bei verschiedenen Ureasekonzentrationen im Lauf der Zeit.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Anmelder haben ein Verfahren zum Nachweisen spezieller Analyte in Lösung über einen Mechanismus erfunden, der von den Ausbreitungseigenschaften Gebrauch macht, die vernetzten Polymerfilmen zu eigen sind.
Die genaue Natur der Änderungen bei den Ausbreitungseigenschaften wird nicht völlig verstanden, sie wird aber vorläufig Änderungen bei der Viskoelastizität, Starrheit und den Fähigkeiten des auf einen Analyten reagierenden Polymerfilms zur Weiterleitung von Schall- und Lichtwellen zugeschrieben. Obschon Massenänderungen auftreten können, versteht es sich, daß die Erfindung keine Gewichtszunahme mißt. Vielmehr kommt es bei der Erfindung auf den sich daraus ergebenden Polymer-Analyt-Komplex mit Ausbreitungseigenschaften an, die sich von denen des ursprünglichen leitenden Polymers unterscheiden. Diese Ausbreitungsänderungen werden durch Sensoren nachgewiesen, mit denen der Polymer-Analyt-Komplex verbunden ist. Die Änderungen können mit der Menge des vorhandenen Analyten mengenmäßig in Beziehung gebracht werden.
Der Erfindungsgegenstand schließt ferner einzigartige Zusammensetzungen aus vernetzten Polymeren ein, die auf der Oberfläche eines Sensors immobilisiert sind. Die Polymeren können Rezeptoren, die für bestimmte Analyte wie etwa Ionen, Liganden, Antikörper usw. spezifisch sind, enthalten oder nicht. In dem speziellen Fall des Nachweises von Wasserstoffionen zeigen Impedanzanalysen gewisser unlöslicher Filme aus einem vernetzten, auf einen Analyten reagierenden Polymer Änderungen der Eigenschaften des Polymerfilms an, wenn sich der pH des Mediums ändert. Wenn ein derartiges Polymer auf der Oberfläche einer Quarzmikrowaage immobilisiert ist, verringert sich die Resonanzfrequenz des Resonators aus dem Polymer/Quarz-Verbund signifikant im isoelektrischen Bereich. Der der Resonanz entsprechende Widerstand und die Bandbreite erhöhen sich beim Annähern an den pI, erniedrigen sich aber beim pI auf Werte in der Nähe der für die ionischen Formen beobachteten. Bei den pH-Extrema, wo das Polymer entweder vollständig protoniert (kationisch) oder vollständig deprotoniert (anionisch) ist, ist das Polymer aufgrund der elektrostatischen Abstoßung zwischen Stellen ähnlicher Ladungen gequollen. Umgekehrt ist das Polymer am pI aufgrund der elektrostatischen Vernetzung in den Filmen weniger gequollen. Die Änderungen beim Quellen und die zugehörigen Änderungen bei den viskoelastischen Eigenschaften und der Ausbreitung von Licht- und Schallwellen erzeugen unerwartet große Frequenzänderungen.
Die Erfindung beschreibt zwei Wege zum Nachweisen von Änderungen, die in einem dünnen Polymerfilm aufgrund des Einflusses eines Analyten auftreten, bei denen der Polymerfilm entweder auf eine piezoelektrische Schallwellenvorrichtung oder auf eine Vorrichtung aufgetragen ist, die Änderungen des Brechungsindex des Polymerfilms messen kann. Das Prinzip der Meßwertumwandlung bei den beiden Wegen ist darin ähnlich, daß sie beide auf in einem Analyten ausgelösten Änderungen der Ausbreitung von Wellen in dem Polymerfilm beruhen. Dies kann durch eine Schallwellenvorrichtung im Dickenschermodus, zum Beispiel einem mit dem Polymerfilm überzogenen, AT-geschnittenen Quarzkristall, veranschaulicht werden, dessen Kombination hierin als Verbundresonator bezeichnet wird. Die Schallwelle wird innerhalb der Dicke des Quarzkristalls durch die Polymerfilm-Quarz-Zwischenfläche und durch den Polymerfilm hin- und hergeleitet. Dies führt zum Aufbau einer stehenden Welle in dem Verbundresonator mit einer Frequenz, die der Resonanzfrequenz entspricht. Die Resonanzfrequenz wird durch die Dicke des Verbundresonators und die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Schallwelle bestimmt. Die Energieabschwächung der Schallwelle wird durch Viskositätsverluste beeinflußt, die die Schallwelle während der Ausbreitung erleidet. Da die Dicke, Ausbreitungsgeschwindigkeit und Energieabschwächung in dem Quarzkristall durch den Analyt nicht beeinflußt werden, ist der Verbundresonator nur gegenüber durch den Analyt ausgelösten Eigenschaftsänderungen empfindlich, die bei dem Polymerfilm auftreten. Die Resonanzfrequenz wird deshalb durch Änderungen der Ausbreitung, die durch den Analyt ausgelöst wurden, und den Modul des Polymerfilms und die Energieabschwächung durch Viskositätsverluste in dem Polymerfilm beeinflußt. Das heißt, die Energieabschwächung hängt von der Energiemenge ab, die während der Oszillation zurück in den Verbundresonator "reflektiert" wird. Diese wird üblicherweise als Qualitätsfaktor Q definiert, welcher das Verhältnis der bewahrten Energie zu der während der Schwingung des Resonators verlorenen Energie ist. Eine zunehmende Energieabschwächung führt zu niedrigeren Werten von Q, höheren Werten des äquivalenten Widerstandes R und Zunahmen der Bandbreite der elektrischen Leitfähigkeit.
Der Weg des optischen Nachweises ist darin ähnlich, daß sich Lichtwellen durch den Polymerfilm, der mit einem Träger verbunden ist, hin und her und in das Polymer ausbreiten. Im wesentlichen wird in dem optischen Verbundsensor eine stehende Welle aufgebaut. Die stehende Welle kann eine einzelne Frequenz oder häufiger ein Frequenzbereich sein. Die Lichtmenge, die zurück in den Detektor reflektiert wird, hängt von dem Brechungsindex des Polymerfilms ab. Da der Brechungsindex des Trägers vom Analyt unabhängig ist, sind die Änderungen des Brechungsindex des Polymerfilms aufgrund des Einflusses des Analyts für die Änderungen der Lichtmenge verantwortlich, die zurück reflektiert und schließlich durch den optischen Sensor nachgewiesen wird. Die daraus folgenden Änderungen der Lichtintensität sind deshalb zu den Änderungen der Energieabschwächung in der Schallwellenvor richtung analog. Die beiden Vorrichtungen sind im Konzept darin verwandt, daß beide gegenüber Änderungen der Weiterleitung von Wellenenergie empfindlich sind, die sich aus dem Einfluß des Analyts auf die Eigenschaften des Polymerfilms ergeben. Es ist außerdem möglich, daß durch den Polymerfilm spezielle Lichtwellenlängen absorbiert werden können, und der Absorptionsgrad durch die Wechselwirkung des Analyts mit dem Polymer beeinflußt werden kann. Dies kann zu Änderungen bei den Intensitäten verschiedener Wellenlängen führen, die deshalb die gewichtete Durchschnittsfrequenz des den Sensor anregenden Lichtes ändern. Dies ist zu den Änderungen der Resonanzfrequenz analog, die bei der Schallwellenvorrichtung nachgewiesen werden. Beide Vorrichtungen sind deshalb im Konzept ähnlich, wenn sie nach den Prinzipien der Wellenausbreitung beschrieben werden.
Bei der Stütze der Beschreibung dieser Erfindung sollen die folgenden Ausdrücke die folgenden Bedeutungen ausdrücken. "Analyt" ("A") bedeutet jede Substanz, die zu einer Wechselwirkung oder Reaktion mit einem auf einen Analyt reagierenden Polymer einschließlich biologische Rezeptoren enthaltender, auf einen Analyt reagierender Polymere befähigt ist. Der Analyt kann durch chemische oder biologische Verfahren einschließlich des Wachstums und Stoffwechselvorgängen von Zellen, Mikroorganismen oder ihren subzellulären Bestandteilen gebildet oder verbraucht werden. Der Analyt kann sich in einem Medium frei bewegen, an eine Zelloberfläche gebunden, in einer Zelle eingeschlossen sein oder auf der Oberfläche des auf einen Analyt reagierenden Polymers als Ergebnis einer Enzymkatalyse erzeugt werden. Der Analyt kann wahlweise das Produkt katalytischer Reaktionen, ein Enzymimmuntest oder ein DNA-Sondentest sein. Der Analyt kann eine Säure, Puffermittel, Salz, Enzym, Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder ein ähnliches biologisches Produkt oder eine Substanz sein, deren Konzentration durch eine biologische Aktivität vermindert oder erhöht wird.
"Biologische Rezeptoren" sind Substanzen, die mit dem Analyt spezifische Bindungspaare bilden. Diese können verschiedene Chelatbildner, Antikörper, Lectine, Geweberezeptoren, Zellhaftungsfaktoren, Ligandenbindungsproteine und ähnliche Analytrezeptor-Reagenzsubstanzen sein.
"Leitendes Polymer" bedeutet jedes Polymer, das als Ergebnis einer Wechselwirkung mit einem Analyten eine Änderung der Eigenschaften zeigt, die sein Verhalten bei der Ausbreitung von Schall- oder Lichtenergie bestimmen. Das leitende Polymer kann amphoter sein oder nicht.
"Auf einen Analyten reagierendes Polymer" ("ARP") bedeutet ein vernetztes amphoteres Polymer, das 1) zu einer selektiven Wechselwirkung oder Reaktion mit einem Analyten befähigt ist, und 2) als Ergebnis der Wechselwirkung mit einem Analyten eine Änderung der Eigenschaften zeigt, die sein Verhalten bei der Ausbreitung von Schall- oder Lichtenergie bestimmen. Das ARP kann einen biologischen Rezeptor enthalten, der mit einem Analyten ein spezifisches Bindungspaar bilden kann.
Das Polymer wird so gewählt oder geplant, daß es mit einem Analyten durch eine Vielfalt Reaktionen einschließlich des Ionenpaarens, Komplexierungsreaktionen, Redoxreaktionen oder kovalentem Kuppeln reagiert. Dieses Anpassungsvermögen ermöglicht die gleich gute Anwendung der Erfindung auf hochmolekulare oder niedermolekulare Analyte.
"Amphoteres Polymer" bedeutet ein auf einen Analyten reagierendes Polymer (entweder natürlich oder synthetisch), das sowohl saure als auch basische Gruppen enthält. Aminosäuren und Proteine sind amphoter, da sie sowohl saure (-COOH) als auch basische (-NR&sub2;) Gruppen enthalten.
"Polymer-Analyt-Komplex" ("C") bedeutet ein Komplex, der bei der Reaktion oder Wechselwirkung eines Analyts mit einem auf einen Analyten ansprechenden Polymer oder amphoteren Polymer gebildet wird. Der Bequemlichkeit halber bezieht sich hierin verwendetes "Komplex" auf Substanzen, die sich aus der Reaktion eines auf einen Analyten ansprechenden Polymers mit einem Analyten ergeben, ungeachtet des speziellen beteiligten Mechanismus.
"Ausbreitungsänderungen" bedeutet Änderungen der Eigenschaften des auf einen Analyten ansprechenden Polymers als Ergebnis der Komplexierung oder Reaktion eines Polymers mit einem Analyten, welche verglichen mit der des Polymers allein, 1) Änderungen seiner Fähigkeit, entweder Schall- oder Lichtenergie weiterzuleiten oder 2) Änderungen der Starrheit, Elastizität und/oder der Viskosität des Polymer-Analyt-Komplexes oder 3) jede Änderung der Phasenzusammensetzung des Polymers umfassen können. Die Ausbreitungsänderungen des Polymer-Analyt-Komplexes können in Mikrodomänen auf dem oder innerhalb des angebrachten Polymers heterogen verteilt sein oder können auf oder in der Polymermatrix homogen verteilt sein. "Sensor" ("S") bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Nachweisen von Ausbreitungsänderungen bei dem Polymerüberzugsmaterial. Piezoelektrischer Oszillator, Quarzkristall-Mikrowaage und QCM sind Namen für Vorrichtungen, die piezoelektrische Prinzipien als Grundlage für das Nachweisen derartiger Phasen verwenden. Außerdem sind horizontale Akustikplatten im Schermodus (SHAPM) alternative Vorrichtungen zur Verwendung beim Nachweisen dieser Änderungen. Ein optischer Wellenleiter-Biosensor (WB) kann zum Nachweisen von Änderungen der Lichtausbreitungseigenschaften des Komplexes verwendet werden. Das leitende Polymer kann bei Wellenleitern sowohl in flachem als auch faserförmigem (zylindrischem) Format, einschließlich Faseroptiken, Interferometer, Refraktometer, Mach-Zender- und optischer Sortiervorrichtungen angewandt werden.
"QCM" bezieht sich auf eine im Schermodus arbeitende Schallwellen-Massenvorrichtung, die typischerweise entweder einen AT- oder BT-geschnittenen Quarz umfaßt, wo der Quarz zwischen zwei Anregungselektroden angebracht ist.
"Impedanzanalyse" bezieht sich auf jede Analysentechnik, die den Strom entlang der Oberfläche eines Quarzkristalls bei konstanter Spannung über einen angegebenen Frequenzbereich mißt.
"Verbundsensor" bezieht sich auf die Einheit aus einem auf einen Analyten reagierenden Polymerfilm, der an die Oberfläche eines Sensors gebunden ist.
"Nachweissystem" bezieht sich auf die Einheit aus einem auf einen Analyten reagierenden Polymer, Sensor und Testmedium.
"Organismus" soll jeden Organismus einschließen, der als Ergebnis seines Stoffwechsels ein für diesen Organismus einzigartiges Produkt erzeugt, das durch das Verfahren dieser Erfindung nachgewiesen oder identifiziert werden kann. Die Organismen, bei denen diese Erfindung am nützlichsten ist, sind jedoch Mikroorganismen, die normalerweise in wäßrigen Kulturen gezüchtet werden, wie etwa Bakterien, Pilze und Gewebezellen.
"Wachstumsregulatoren" sind Substanzen, die das Wachstum von Organismen anregen oder verzögern.
"Nährstoffe" sind Substanzen, die durch den Organismus verstoffwechselt werden und für sein Wachstum notwendig sind.
Der Ausdruck "XAMA-7 " bezieht sich auf jede reine chemische Zusammensetzung aus Pentaerythrit-tris-(B-aziridinyl)propionat. XAMA-7 ist ein eingetragenes Warenzeichen der Virginia Chemical Co.
Das vernetzte, auf einen Analyten reagierende Polymer (ARP) enthält Analyt-empfindliche Struktureinheiten und ist an der Oberfläche eines einen Verbundsensor bildenden Sensors angebracht. Eine Probe Testmedium, von der vermutet wird, daß sie einen Analyten enthält, wird mit dem Sensor in Berührung gebracht und ein etwaiger vorhandener Analyt tritt mit dem ARP in Wechselwirkung oder reagiert damit unter Bilden eines Polymer- Analyt-Komplexes. Eine Änderung der Ausbreitung wird in dem Komplex, verglichen mit der des unkomplexierten ARP, nachgewiesen. Die Änderung zeigt sich als Änderung der Resonanzfrequenz eines piezoelektrischen Oszillators oder als Änderung der Lichtausbreitungseigenschaften durch einen optischen Wellenleitersensor oder eine andere optische Nachweisvorrichtung.
Die Erfindung ist besonders nützlich zum Überwachen von biologischen Systemen unter Nachweisen von Änderungen der Konzentrationen einer Vielfalt von Substanzen einschließlich Zellmetaboliten, den Produkten enzymatischer Reaktionen, pharmazeutischer Zusammensetzungen, Industriechemikalien oder allen Produkten eines biologischen Systems, das eine kontinuierliche (kinetische) Echtzeitmessung erfordert. Diese Erfindung kann auch teden Organismus nachweisen, der als Ergebnis seines Stoffwechsels ein Produkt herstellt oder verwendet, das für den Organismus kenn zeichnend ist und das durch das Verfahren dieser Erfindung nachgewiesen oder identifiziert werden kann. Die Erfindung kann zum Nachweisen von Organismen verwendet werden, die normalerweise in wäßriger Kultur gezüchtet werden, wie etwa Bakterien, Pilze und Gewebezellen. Es ist jedoch nicht notwendig, daß diese Organismen unversehrt bleiben. Diese Erfindung ist dazu bestimmt, daß sie sowohl mit aufgebrochenen als auch löslich gemachten Bestandteilen des Organismus ausgeführt werden kann.
Eine speziellere Veranschaulichung der Erfindung ist die Verwendung eines Polymers, das so ausgelegt ist, daß es mit Analyten reagiert, die als Ergebnis von pH-Änderungen erzeugt werden.
Ein Beispiel eines derartigen Analyten ist eine H&spplus;-Gruppe. Wenn durch den Stoffwechsel von Organismen erzeugte organische Säuren oder Kohlendioxid das Wachstumsmedium ansäuern, reagieren als Stoffwechselprodukte freigesetzte Protonen (Analyte) mit Protonenrezeptorgruppen auf dem auf einen Analyten reagierenden Polymer, wodurch die Schallausbreitungseigenschaften des Polymers verändert werden. Die Ausbreitungsänderungen finden statt, wenn sich der pH des Mediums dem isoelektrischen Punkt des Komplexes nähert. Diese Ausbreitungsänderung bei dem ARP bewirkt eine Änderung der Resonanzfrequenz des piezoelektrischen Oszillators, die unter Bestimmen der Stoffwechselrate und der Zellwachstumsrate einer Kultur elektronisch abgelesen werden kann. Wahlweise kann die Reaktion der Protonen mit dem Polymer durch einen optischen Wellenleitersensor oder eine andere optische Nachweisvorrichtung als Änderung der Lichtausbreitungseigenschaften nachgewiesen werden.
Die Selektivität der Polymer/Analyt-Wechselwirkung kann auch durch den Aufbau des Polymers gesteuert werden. Zum Beispiel können Antikörper Polynukleinsäuren, Rezeptoren, Chelatbildner, Zellhaftungsfaktoren und Ligandenbindungsmoleküle mit dem Polymer verknüpft werden. Durch Ändern der Zusammensetzung dieser Rezeptorstellen auf dem Polymer kann die Erfindung auf einen speziellen Analyten hochselektiv oder mit einer Anzahl Analyte breit reagierend gemacht werden.
Eine speziellere Veranschaulichung zeigt die Selektivität des Analyts der Erfindung. Ein gutes Beispiel ist ein Antigen, das mit einem ARP komplexiert, das so aufgebaut wurde, daß es den komplementären Antikörper als biologischen Rezeptor enthält. Änderungen beim Ausmaß der Vernetzung des sich daraus ergebenden Antigen/Antikörper-Polymer-Komplexes lösen eine Ausbreitungsänderung bei dem ARP hervor und erzeugen eine Änderung der Resonanzfrequenz des piezoelektrischen Biosensors. Wie bei anderen Beispielen liefert das Überwachen der Resonanzfrequenz des piezoelektrischen Oszillators eine spezifische Messung der Metabolitmenge oder der Metabolitproduktionsrate in dem Medium. Die Messungen können auch mittels eines Lichtausbreitungs- oder optischen Sensors angestellt werden.

Piezoelektrischer Oszillator

Die Fähigkeit piezoelektrischer Meßwertaufnehmer zum Nachweis kleiner Änderungen der Masse, Viskosität und Dichte an ihrer Oberfläche ist in der Technik wohlbekannt (Ward et al., Science (1990) 249:1000-1007, und Frye et al., Appl. Spektroscop. Rev. (1991) 26:73). Außerdem können akustische Vorrichtungen im Schermodus und akustische Plattenvorrichtungen im Biege- und horizontalen Schermodus zur Verwendung als Sensoren entsprechend modifiziert werden (Lu und Czanderna, Hrsg., Elsevier, New York, (1984), S. 351-388, und Guilbault et al., CRC Crit. Rev. Anal. Chem. (1988) 19:1, und Wohltjen et al., ACS Symp. Ser. (1989) 403:157). Am besten auf die vorliegende Erfindung anwendbar ist der AT-geschnittene Quarz-Resonator im Schermodus, der gemeinhin als Quarz-Mikrowaage (QCM) bezeichnet wird, welcher einen zwischen zwei Metallanregungselektroden angeordneten, AT-geschnittenen Quarzkristall umfaßt, der über die Dicke des Quarzkristalls hinweg eine stehende Scherwelle erzeugt. Die Scherwelle erfährt einen Antiknoten an der Oberfläche des Quarzkristalls und breitet sich in den Film auf der Oberfläche des Kristalls fort; die Filmdicke und die Natur der Scherwellenausbreitung in dem Film bestimmen die Frequenzantwort. Die Frequenzantwort der QCM wird im allgemeinen als Massenzunahme auf der Resonatoroberfläche interpretiert, die eine entsprechende Abnahme der Resonanzfrequenz gemäß der Sauerbrey-Beziehung hervorruft (Sauerbrey, Phys. (1959) 155:206) (Gl. 1), worin Δf die gemessene Frequenzverschiebung der anfänglichen (Resonanz-) Frequenz (f) des Quarzkristalls ist, Δm die Massenänderung ist, A die durch die beiden Anregungselektroden definierte piezoelektrisch aktive Fläche ist, Pq die Dichte von Quarz ist (2,648 g/cm&supmin;³) und Uq der Schermodul ist (2,947 x 10¹¹ dynes cm&supmin;² für AT-geschnittenen Quarz).
Oberflächenschallwellen- (SAW) und akustische horizontale Plattenvorrichtungen im Schermodus (SH-AMP) stellen alternative piezoelektrische Leitungstechniken dar, die auf diese Erfindung anwendbar sind. Diese Vorrichtungen umfassen parallelgeschaltete Nikroelektrodenanordnungen auf der Oberfläche eines piezoelektrischen Quarzsubstrates. Sie zeigen Frequenzänderungen, die mit Massenänderungen oder dem Steifigkeitskoeffizienten an ihrer Oberfläche korreliert werden können, die aus Änderungen der Geschwindigkeit einer Oberflächenquerwelle herrühren. Diese Vorrichtungen sind auch als Viskositätssensoren eingesetzt worden.

Optische Sensoren

Die Verwendung optischer Biosensoren zum Nachweisen der Anwesenheit verschiedener Analyte ist üblich und in der Technik lassen sich viele Beispiele finden (Place et al., Optical-Electronic Immunosensor: "A Review of Optical Immunoassay at Continuous Surfaces", Biosensors, 1, 321-353). Geeignete Typen optischer Sensorvorrichtungen schließen flache Wellenleiter (Burgess, Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., 1368 (Chem., Biochem., Environ. Fiber Sens. 2), 224-9 (1991)), optische Fasern (Bluestine et al., "Fiber Optic Evanescent Wave Sensors for Medical Diagnostics", TIBTECH, 8, 161168 (1990)), metallisierte Prismen (Kooyman et al., "Surface Plasmon Resonance Immunosensors", Analytical Chem. Acta., 213, 35-45 (1988)) und Beugungsgitter ein. Die Nachweisoberflächen optischer Sensoren können eben oder zylinderförmig (Fasern) sein.
Im allgemeinen reagieren optische Biosensoren auf kleine Änderungen des Brechungsindex an der Oberfläche eines Wellenleiters. Diese Änderung des Brechungsindex ergibt sich aus dem selektiven Binden eines Analyts an einen immobilisierten Analyt-Rezeptor auf der Oberfläche des optischen Sensors. Im Wellenleiter wanderndes Licht induziert in dem Testmedium über dem Wellenleiter eine Dämpfungswelle. Die Wechselwirkung dieser Dämpfungswelle mit Analyt/Rezeptor-Komplexen ändert entweder die Intensität der Dämpfungswelle oder die Kohärenz des sich in dem Wellenleiter ausbreitenden Lichtes. Die Intensität der Dämpfungswelle kann durch Änderungen der Fluoreszenz-, Adsorptions- oder Lichtstreuungseigenschaften der sich daraus ergebenden Analyt/Rezeptor- Komplexe verändert werden. Auf diese Weise kann die Bildung eines Analyt/Rezeptor-Komplexes die Lichtintensität ändern. Wahlweise kann die Phase oder Kohärenz von Licht, das sich durch Wellenleiter im Einzelmodus bewegt, durch die Analyt/Rezeptor- Wechselwirkung verändert werden, und die Phasen- oder Kohärenzänderungen, die aus der Analyt/Rezeptor-Wechselwirkung folgen, können durch Interferometervorrichtungen (z.B. Mach-Zehnder) gemessen werden.

Auf einen Analyten reagierende Polymere

Bei der Herstellung einer auf einen Analyten reagierenden Polymermatrix verwendete Polymere sind Polyampholyte, die sowohl Säure- als auch Basenfunktionen enthalten und einen definierten isolektrischen Punkt (pI) besitzen. Polyampholyte sowohl synthetischen als auch biologischen Ursprungs können verwendet werden und können sich sowohl aus synthetischen (z. B. Acrylmaterialien usw.) als auch biologischen (z. B. Aminosäuren usw.) Monomeren zusammensetzen. Die Polyampholyte haben im allgemeinen ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 500 000 und bevorzugter im Bereich von 1000 bis 100 000. Das Analyt-spezifische Polymer wird durch Vernetzen der Polyampholyte gebildet, wodurch sich eine auf einen Analyten reagierende Polymermatrix mit einer Vernetzungsdichte von 1 bis 20 Vernetzern je Polymermolekül und mit einer von monomolekular bis mehrere µm und bevorzugter von 0,05 bis 5 µm reichenden Dicke bildet.
Spezielle Polymere, die als auf einen Analyten reagierende Polymere verwendet werden, für die Beispiele einer Nachweisvorrichtung mittels Schall- oder Lichtenergie sind Co- oder Terpolymere vonacrylsäure (AA), Alkylmethacrylat (RMA) und N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat (DMAEMA). Die Polymere können von linearer Struktur sein oder können Seiten- oder Vernetzungsketten enthalten. Sie werden mittels eines im US-Patent 4 749 762 ausgeführten Zweistufenverfahrens hergestellt. Der erste Schritt erzeugt ein Prepolymer aus Methylmethacrylat (MA), RMA und DMAEMA. Der zweite Schritt ist die gesteuerte selektive Hydrolyse von Methylacrylatabschnitten unter Bilden eines Produktes mit Seitenketten und Basengruppen. Figur 1 veranschaulicht das Zweistufenverfahren zur Polyampholytherstellung. Die Herstellung amphoterer Polymere kann auch andere Syntheseverfahren einschließlich der Gruppentransferpolymerisation (GTP) umfassen.
Ein Zweistufenemulsionsverfahren ist aus den folgenden Gründen gegenüber der direkten Lösungspolymerisation bevorzugt. Die Michael-Addition des Amins an das Acrylsäuremonomer wird leichter verhindert. Die Emulsionspolymerisation eines Prepolymers ist bedeutend schneller und leichter zu steuern als die Lösungspolymerisation. Außerdem ist die Verteilung der Zusammensetzung der Monomereinheiten in dem Polymer durch geregelte Zufuhrverfahren viel leichter zu steuern. Die Polymeren sind im allgemeinen bei jedem pH außer an ihrem isoelektrischen Punkt (pI) wasserlöslich. Der isoelelektrische Punkt wird durch das Verhältnis von Säure- zu Basengruppen bestimmt und kann somit durch Synthetisieren von Polymeren mit entsprechenden Verhältnissen verändert werden. Das bei Monomeren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, bevorzugte Verhältnis ist derart, daß der pI des Polymers im physiologischen Bereich liegt (pH 6,2-8,0).
Dies entspricht normalerweise einem Verhältnis von Säure zu Base von 2,0 bis 0,8 für Acrylsäure und DMAEMA. (Der pI hängt notwendigerweise von den pka-Werten für die Gruppenbestandteile ab.) Reaktionen können auch durch die Natur und Größe des neutralen, nicht-ionischen Abschnitts beeinflußt werden, die den pK der Säure- und Basenstrukturbestandteile beeinflussen können. Die Löslichkeitseigenschaften der Polymere werden durch ihren Ionengehalt stark beeinflußt. Polymere mit bedeutenden neutralen Kohlenwasserstoffabschnitten sind an ihrem isoelektrischen Punkt weniger wasserlöslich als Polymere mit weniger oder keinen neutralen Abschnitten. Die Anmelder haben eine Reihe von Polymeren hergestellt, die unterschiedliche Alkylmethacrylate enthalten und veränderliche Abschnittsanteile besitzen, alle mit einem pI im physiologischen Bereich. Von mehreren anderen Polymeren mit unterschiedlicher Löslichkeit und Assoziationseigenschaften kann ebenfalls vorhergesagt werden, daß sie geeignet sind. Einige dieser Polymere werden in Tabelle A aufgeführt. TABELLE A POLYAMPHOLYTE ZUM NACHWEIS VON BAKTERIENWACHSTUM Molverhältnis*
AA = Acrylsäure
RMA = Alkylmethacrylat
DMAEMA = N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat
MA = Methylacrylat
EMA = Ethylmethacrylat
BMA = Butylmethacrylat
MMA = Methylmethacrylat
Mw = über das Gewicht gemitteltes Molekulargewicht
Mv = über die Viskosität gemitteltes Molekulargewicht
* es werden ungefähre Molverhältnisse angeführt
Die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber kleinen pH-Änderungen hängt hauptsächlich von der Enge der Verteilung seiner Zusammensetzung ab. Dies wird in Fig. 2 dargestellt. Eine enge Zusammensetzungsverteilung wird durch Steuern des Verhältnisses des reagierenden Monomers im Reaktionsmedium erzeugt. Dieses Verhältnis ist nicht das, welches bei dem Polymer gefunden wird, sondem wird durch die Reaktivitätsverhältnisse der Monomerbestandteile bestimmt. Das Verhältnis kann durch Verwenden eines Reaktionsverfahrens entweder mit einer ausgeglichenen Zufuhr oder einer begrenzten Zufuhr aufrecht erhalten werden. Das in den US-Patenten 4 735 887 und 4 749 762 beschriebene Verfahren der ausgeglichenen Zufuhr erfordert eine sorgfältige. Reaktionskontrolle, führt aber zur raschen Bildung hochmolekularer Produkte. Das Verfahren der begrenzten Zufuhr ist bevorzugt, wenn eine rasche Produktion hochmolekularen Produktes unnötig ist. Das Verfahren der begrenzten Zufuhr umfaßt die Zugabe von Zufuhrmonomer mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als seine Reaktionsgeschwindigkeit in Masse in dem unverdünnten Medium. Die Reaktion wird im wesentlichen ein Verfahren mit lebenden freien Radikalen, die nur auftritt, wenn ein Monomer auf ein emulsionsteilchen trifft, das ein lebendes Radikal enthält. Es wird genügend "Ausgleichsmonomer" zugesetzt, um die wäßrige Phase zu sättigen (was als der Punkt festgelegt ist, an dem die Lösung eine Transparenz zu entwickeln beginnt) bevor die Initiatorzugabe beginnt. Ein leichter MA-Überschuß sollte zum Ergeben der korrekten Produktzusammensetzung ebenfalls aufrecht erhalten werden. Dies wird wegen der günstigen Beziehung zwischen der gesamten inneren Reaktionsgeschwindigkeit und den Reaktivitätsverhältnissen des Acrylat-Methacrylat-Systems leicht bewerkstelligt. Viele Monomerkombinationen können Polymere mit einem pI im physiologischen pH-Bereich liefern. Amphotere Polymere können aus verschiedenen Kombinationen der folgenden, nachstehend angegebenen Sätze von Monomeren hergestellt werden:
A. Saure Monomere - Molekulare oder ionische Substanzen, die ein Wasserstoffion unter Bilden einer neuen Substanz hefern können. Beispiele sind Acrylsäure, Methacrylsäure und Phosphorsäure und Sulfinsäuregruppen enthaltende Monomere.
B. Basische Monomere - Molekulare oder ionische Substanzen, die sich mit einem Wasserstoffion unter Bilden einer neuen Substanz vereinen können. Beispiele sind DMAEMA, Diethylaminoethylmethacrylat, t-Butylaminoethylmethacrylat, Morpholinoethylmethacrylat, Piperidinoethylmethacrylat.
C. Neutrale Monomere - Molekulare oder ionische Substanzen, die weder sauer noch basisch sind. Beispiele sind Alkylmethacrylate (Methyl-MA, Ethyl-MA, Butyl-MA), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Hydroxypropylmethacrylat, Vinylpyrrolidon, Vinylacetat (Vinylalkohol bei der Hydrolyse), Acrylamide, Vinylether, Styrol. (Die Reaktion von Co-Monomeren mit stark unterschiedlichen Reaktivitätsverhältnissen erfordert die sehr sorgfältige Reaktionskontrolle und ist deshalb nicht bevorzugt.)
Außer den vorstehend und in Tabelle A angeführten Beispielen, kann jedes wäßrige, lösliche, amphotere Polymer mit einem pI im physiologischen Bereich als pH-empfindliches, auf einen Analyten reagierendes Polymer brauchbar sein. Spezielle Beispiele schließen ein:
1) Durch die Reaktion von Dimethylaminoethanol und ähnlichen Verbindungen mit Methylvinylether/Maleinanhydrid-Copolymeren erzeugte Polymere. POLYAMPHOLYT
2) Hydrolysierte Copolymere von Vinylpyridin und Methylacrylat.
Gegebenenfalls kann das auf einen Analyten reagierende Polymer ein Analytrezeptorreagenz enthalten, das zu selektiver Analytbindung befähigt ist. Die Rezeptorreagenzien können mit funktionellen Seitengruppen (wie etwa Hydroxyl, Carboxyl, Amino, Thiol, Aldehyd, Anhydrid, Imid und Epoxy) auf dem Polymer chemisch verknüpft sein oder innerhalb der auf einen Analyten reagierenden Schicht mittels einer Einschließung innerhalb der Polymermatrix immobilisiert sein. Wahlweise können die Analytrezeptorreagenzien durch adsorptive Wechselwirkungen mit dem Polymer oder einem Polymermatrixbestandteil immobilisiert werden. Dies bildet eine Zwischengruppe, die gegenüber dem Analyten reaktionsfähig ist. Bei dem Test bindet der Analyt durch die Reaktion mit der Kupplungszwischengruppe an das aktivierte Polymer.
Eine breite Vielfalt Analytrezeptorreagenzien wird in Betracht gezogen. Diese schließen ein Mitglied eines analytspezifischen Bindungspaares ein. Mitglieder spezifischer Bindungspaare können vom Immun- oder Nicht-immun-Typ sein. Die Immuntypen schließen Antikörper, seien es polyklonale, monoklonale oder immunreaktive Fragmente wie etwa vom Fab-Typ ein, die als Fragmente definiert sind, denen der Fc-Teil des Antikörpers fehlt (z.B. Fab, Fab' und f(ab')&sub2;-Fragmente oder sogenannte "Halbmolekül"-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen erhalten wurden, welche die schweren Ketten verbinden). Falls das Antigen als Mitglied des spezifischen Bindungspaares nicht immunogen ist (z. B. ein Hapten), kann es mit einem Trägerprotein kovalent verknüpft werden, um es immunogen zu machen. Polynukleinsäuren und Rezeptoren werden ebenfalls als Analytrezeptorreagenzien in Betracht gezogen.
Nicht-immune Bindungspaarmitglieder schließen Systeme ein, bei denen sich zwei Bestandteile eine natürliche Affinität für einander teilen, aber keine Antikörper sind. Beispiele nicht-immuner Analytrezeptorreagenzien schließen Avidin, Streptavidin, komplementäre Nukleinsäuresonden, Bindungsproteine, Chelatbildner, Zellhaftungsfaktoren und Ligandenbindungsproteine ein.
Die Chemie der Verknüpfung zur Bindung der Analytrezeptorreagenzien, die Glutaraldehyd, Bromcyan, Hydrazin, Bisepoxiran, Divinylsulfon, Epichlorhydrin, Periodat, Trichlortriazin, Diazonium salze, Carbonyldiimidazol, Carbodiimide, N-Hydroxysuccinimid und Tosylate umfaßt, ist in der Technik ausführlich beschrieben worden. Eine Übersicht dieser Chemie und Verfahren wird in "Practical Guide for Use in Affinity Chromatograph and Related Techniquesu, Reactifs IBF - Société Chimique Pointet-Girard, Villeneuve-La-Garenne - Frankreich, angegeben. Über spezielle Beispiele der Aktivierung von Hydroxyseitengruppen durch Carbonyldumidazol wird in J. Biol. Chem. (1979) 254:2572 und J. Chromatogr. (1981) 219:353-361, berichtet. Die Aktivierung der Carbonsäure-Seitengruppen durch wasserlösliche Carbodiimide wird in Biochemistry (1981) 199:297-419 beschrieben. Die Aktivierung von Carbonsäuren durch N-Hydroxysuccinimid wird in Biochemistry (1972) 111:2291 und Biophys. Acta (1981) 670:163 beschrieben.
Typische wasserlösliche Polymere, die durch diese Verfahren aktiviert werden können, können Polyhydroxyethylmethacrylat und -acrylat, Methylvinylether-Copolymere, Polyvinylalkohole und Copolymere und die vorstehend beschriebenen Polyampholyte einschliessen. Andere wasserlösliche Polymere können ebenfalls verwendet werden.

Polymervernetzung

Die auf einen Analyten reagierenden Polymere der vorliegenden Erfindung können durch mehrere Mechanismen vernetzt werden, wobei die Carbonsäure-Struktureinheit der reaktionsfähige Ort ist. Das Vernetzen kann durch die Reaktion von Carbonsäure-Seitengruppen mit multifunktionellen Aziridinen erfolgen, oder sie können über Carbonsäure-Seitengruppen durch die Reaktion mit multifunktionellen Epoxiden vernetzt werden. Diese Reaktion wird durch das Vernetzen von 1,4-Butandioldiglycidylether verdeutlicht, wobei der Ringöffnungsmechanismus dem der Reaktion der Aziridine ähnlich ist. Wahlweise können primäre Amine als Seitengruppen bei den auf einen Analyten ansprechenden Polymeren durch die Reaktion einiger Carbonsäuregruppen mit Propylenimin oder Ethylenimin gebildet werden, was die Polymere durch die Reaktion mit einer Anzahl Vernetzer vernetzt werden läßt, die normalerweise in photographischen Systemen zum Vernetzen von Gelatine verwendet werden, wie etwa Aldehyde, Carbodiimide bund andere. Eine Anzahl Vernetzer und Vernetzungsreaktionen, die zum Vernetzen von Gelatine verwendet werden und auch die auf einen Analyten reagierenden Polymere der vorliegenden Erfindung entweder durch Säure- oder primäre Aminfunktionen vernetzen können, werden bei Pouradier und Burness (in "Theory of The Photographic Process", 3. Ausg., C. E. K. Mees, Hrsg., S. 54-60) beschrieben. Weniger gebräuchlich verwendet, aber gleichermaßen anwendbar sind sowohl Verfahren, die eine ionische Vernetzung durch Metallionenkoordination und die Reaktion ionischer Cluster umfassen, als auch verschiedene Typen kovalenter Bindung, welche die Reaktion von Aziridinen und der Michael-Addition von Olefinen umfassen. Bei den auf einen Analyten reagierenden Polymeren der vorliegenden Erfindung ist das Vernetzen der Carbonsäure-Seitengruppen mit multifunktionellen Aziridinen am bevorzugtesten.

Wachstumsmedien

Das grundlegende Wachstumsmedium für die Erfindung enthält Nährmaterialien, die zur Fermentation durch die speziellen, zu analysierenden Zellen ausgewählt wurden. Ein spezielles, auf einen Analyten reagierendes Polymer (ARP) des vorstehend beschriebenen Typs reagiert mit dem Medium allein nicht. Das Medium kann gegebenenfalls mit Wachstumsregulatoren, wie etwa Antibiotika, Aminosäuren, Vitamine, Salze oder Lipide, ergänzt sein. Die getrennt oder in Kombination verwendeten Wachstumsregulatoren wie etwa Hormone können dazu verwendet werden, das Medium entweder für einen speziellen Zelltyp hochselektiv zu machen oder für ein breites Spektrum der Zellantwort weniger selektiv zu machen. Die Zusammensetzung aes Nährmediums ermöglicht der Erfindung auf eine Vielfalt analytischer Bedürfnisse flexibel zu reagieren. Bestandteile für Wachstumsmedien sind im Handel neben anderen Quellen von Difco (Detroit, Michigan) und BBL (Coclceysville, Maryland) erhältlich. Eine Übersicht zur genauen Beschreibung des zum Ausführen der vorliegenden Erfindung benötigten Wachstumsmediums wird von Ebersole et al. (int. Veröffentl. Nr. WO91/01381), gegeben.
Vor dem Testen oder auf die Sterilisierung folgend wurde der pH des Nährmediums nach Bedarf auf einen Wert eingestellt, der mit den physiologischen Erfordernissen der Zellkultur und der Ausbreitungsstabilität des Polymers verträglich war.

Zellkonzentrationsbestimmung

Die Zellkonzentration in einem gegebenen Versuch wurde in einer Petroff-Hauser-Zählkammer mikroskopisch abgeschätzt. Das Wachstum der Zellkultur wurde zuerst durch den Zusatz von 0,1% Natriumazidlösung angehalten. In einigen Fällen wurden die Zelldichten in der Petroff-Hauser-Zählkammer mittels eines Olympus Q2-Bildanalysators, der mit einem Compaq 386/25-Computer ausgerüstet war, automatisch gezählt.

Piezoelektrische Biosensorvorrichtung und System

Der Zellnachweis und die Identifizierung, Antibiotikaantwortstudien und Bestimmungen der Wachstumsrate können entweder mit einer einzelnen piezoelektrischen Oszillatorvorrichtung unter den vorstehend ausgeführten Bedingungen oder mit einer piezoelektrischen Oszillatorvorrichtung durchgeführt werden, die mit einem zweiten Quarzkristall als Referenz verbunden ist, welche mit der Temperatur zusammenhängende Instabilitäten kompensiert. Eine derartige Vorrichtung wird durch Ebersole et al. (int. Veröffentl. Nr. WO91/01381) beschrieben.

Anwendung der Imoedanzanalyse

Die Wechselwirkung des Polymers mit der Oberfläche der QCM ist mechanischer Natur und kann durch Impedanzanalyse analysiert werden. Die Impedanzanalyse mißt den Strom quer durch den Quarzkristall bei konstanter Spannung über einen speziellen Frequenzbereich. Die Impedanzanalyse wurde mit einem Hewlett-Packard 4194A Impedanz/Verstärkungs-Phasen-Analysator ausgeführt, der im Impedanzmodus Messungen über einen Frequenzbereich von 100 Hz- 40 MHz ausführen konnte. Die Datensammlung wurde über eine HPIB- Schnittstelle mit einem Macintosh Personalcomputer bewerkstelligt. Impedanzanalyse ist eine dem Fachmann wohlbekannte Technik und wird bei Muramatsu et al., Anal. Chem., 60:2142 (1988), ausgeführt.

Messungen des Brechungsindex

Ein alternatives Nachweissystem für akustische Sensoren sind optische Vorrichtungen, die Änderungen der Brechungsindizes von Polymerfilmen nachweisen können. In der vorliegenden Erfindung erzeugt die Analyt-Rezeptor-Bindung kleine Änderungen des effektiven Brechungsindex (neff) des auf der Oberfläche immobilisierten, auf einen Analyt reagierenden Polymers. Das bevorzugteste Verfahren der Messung von Brechungsindizes macht von optischen Fasern und einem Single Mode Mach-Zehnder-Interferometer Gebrauch, bei dem das geführte Licht in zwei parallele Zweige aufgespalten wird. Ein Zweig des Interferometers ist mit einem Analytrezeptor überzogen, während der andere Zweig zum Liefern eines Referenzweges geschützt ist. Als Ergebnis wird in den Wellenleiter geleitetes Licht in zwei Strahlen aufgespalten. Wenn eine Analytbindung erfolgt, wird der Brechungsindex an der Oberfläche des mit einem Rezeptor überzogenen Zweigs verändert, wogegen der wirksame Index des zweiten Strahles (Referenzzweig) sich nicht ändert. Wenn das Licht in den Interferometerzweigen wieder zusammengeführt wird, kann eine konstruktive oder destruktive Interferenz auftreten. Falls die Interferometerzweige in der Länge gleich sind (L1 = L2 = L), kann der aus der Analytbindung folgende Unterschied bei der Lichtausbreitung (ΔΦ) durch Gleichung 2 mathematisch beschrieben werden, worin λ die Wellenlänge des eintretenden Lichts ist, L die Weglänge ist und n1 und n2 der Index des Referenz- beziehungsweise Testzweigs sind.
Der Phasenunterschied ist dem Unterschied bei dem effektiven Indexunterschied (n2-n1) der Wellenleiterzweige direkt proportional. Da das Ausmaß der Analytbindung neff = (n2-n1) beeinflußt, kann die Austrittsintensität des Interferometers mit Indexänderungen in Beziehung gesetzt werden, die aus der durch die Analytbindung hervorgerufenen Brechung folgen. Vorrichtungen, welche die Änderungen der Brechungsindizes eines auf einen Analyten reagierenden Polymerfilms messen, liefern nützliche Meßwertaufnahmeverfahren, die sowohl direkte Analytbindungsereignisse als auch eine enzymverstärkte Analytbindung nachweisen können.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die grundlegenden Prinzipien und einzigartigen Vorteile der vorliegenden Erfindung.

BEISPIEL 1

Verfahren zum Vernetzen von Polyampholyten mit multifunktionellen Aziridinen und Demonstration der pH-kontrollierten Farbstoffbindung

Testlösungen des Polyampholyts und des multifunktionellen Azindinvernetzers (Xama-7 ) mit Verhältnissen von 1:1, 5:1, 10:1, 50:1 und 100:1 Polymersäure zu Aziridin wurden durch Mischen von Vorratslösungen von 0,154 normalem (1-1-1) AA-MMA-DMAEMA-Polyampholyt (pI = 7,0 in 20% mit HCl auf pH = 6,0 angesäuertem Methanol/Wasser) und 1,405 normalem Xama-7 hergestellt. Vor dem Mischen der Vorratslösungen wurde der Polymerlösung ausreichend Ammoniumhydroxid zugesetzt, um den pH über 11,0 zu verschieben, um eine vorzeitige Reaktion des Aziridins mit der Polymersäure zu verhindern. Die Gemische wurden anschließend auf Glasplatten und piezoelektrische Kristalle bei Zentrifugengeschwindigkeiten von 1000, 2000 und 4000 Upm schleuderbeschichtet. Die überzogenen Materialien wurden anschließend 5 min in einen Umluftofen bei 100ºC gestellt, um den Ammoniak zu vertreiben und die Zusammensetzung zu härten.
Die Platten wurden mit Wasser gewaschen und auf physische Unversehrtheit getestet. Die aus den 1:1- und 5:1-Gemischen hergestellten Überzüge waren hart und im wesentlichen nicht gequollen. Die 10:1- und 50:1-Zusammensetzungen ergaben unlösliche, aber gequollene Gelüberzüge mit guter Haftung am Träger, physischer Unversehrtheit und Abnutzungsfestigkeit. Das 100:1-Gel zeigte einen schlechten Zusammenhalt und wurde leicht vom Träger abgerieben. Deshalb wurden die 10:1- und 50:1-Zusammensetzungen zur weiteren Untersuchung ausgewählt.
Die durch Ellipsometrie gemessene Dicke der 50:1-Überzüge war 0,2 µm, 0,4 µm und 0,8 µm bei Schleuderbeschichtungen, die bei 4000, 2000 beziehungsweise 1000 Upm durchgeführt wurden. Die Ladung auf der Oberfläche jedes Films wurde dadurch gezeigt, daß eine Reihe von Puffern, von denen jeder einen identischen anionischen blauen Farbstoff enthielt, auf jede Überzugszusammensetzung aufgebracht wurde. Nachdem man die Zusammensetzungen 30 min absitzen ließ, wurden die Zusammensetzungen mit neutralem Wasser gewaschen, um ungebundenen oder nicht absorbierten Farbstoff zu entfernen. Alle Farbflecken, die Puffer mit einem pK < 7,0 entsprachen, blieben leicht nachweisbar, während alle Flecken, die Puffer mit einem pK > 7,0 entsprachen, sofort vom Überzug abgewaschen wurden. Dies geschah trotz der Tatsache, daß die basischen Puffer die Zusammensetzung ebenso wie die sauren Puffer quellen ließen. Dies zeigt die für den Polyampholytüberzug kennzeichnende pH-kontrollierte Farbstoffbindung.
Die wie vorstehend beschrieben hergestellten überzogenen piezoelektrischen Kristalle wurde auf eine mikrobielle und enzymatische Antwort getestet und wurden in den folgenden, den Nachweis durch piezoelektrische Mittel betreffenden Beispielen verwendet.

BEISPIEL 2

Polymerherstellung und Immobilisierung

Das Polymer (1) von Fig. 3 wurde gemäß dem durch Foss (US-Patent 4 749 762) ausgeführten Verfahren und durch das folgende Verfahren synthetisiert. Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde Emulgatorlösung (1000 ml destilliertes Wasser, 10 g Triton QS- 30-Tensid (Rohm & Haas, Philadelphia, PA) und 10 g N,N-Dimethylaminoethanol) auf 60ºC erhitzt. Anschließend wurde ein 53 ml Methylacrylat, 53 ml Methylmethacrylat und 98 ml N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat enthaltendes Gemisch mit 4 ml/min zugesetzt. Als die Lösung gesättigt war (eine Sättigung ist offensichtlich, wenn die Lösung eine Transparenz zeigt), wurde eine Initiatorlösung (5 g Ammoniumpersulfat in 250 ml destilliertem Wasser) mit 0,75 ml/min zugesetzt, während gleichzeitig die Monomerzugabe fortgesetzt wurde. Die Zugabe der Initiatorlösung führte zur unmittelbaren Polymerisation, wie durch eine Temperaturerhöhung bewiesen wurde. Nachdem alles Monomer zugegeben worden war, wurde das Gemisch weitere 15 min gerührt und anschließend in ein 2-l-Polyethylen-Becherglas gegossen. Aceton wurde zugesetzt, bis das Produkt koagulierte. Das Produkt wurde anschließend durch Filtration gesammelt und mit Wasser unter Entfernen restlichen Emulgators und anderer Verunreinigungen gewaschen. Das Polymer wurde in einen Kolben überführt, der mit einem Blattrührer mit hoher Scherkraft ausgestattet war, 800 ml Ethanol wurden zugegeben und das Gemisch wurde auf 80ºC erhitzt. Nachdem sich das Polymer gelöst hatte, wurde eine Lösung von 32,65 g KOH in 100 ml destilliertem Wasser über einen Zugabetrichter zugesetzt, um das Methylmethacrylat selektiv zum Acrylsäuresalz zu hydrolysieren. Die Zugangsgeschwindigkeit wurde so eingeregelt, daß das Polymer während dieses Schritts nicht ausfiel. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde das Gemisch weitere 30 min bei 80ºC gerührt. Das Produkt wurde isoliert und durch isoelektrische Fällung gereinigt. Dies erfolgte durch Überführen der ethanolischen Polymerlösung in einen großen Überschuß destilliertes Wasser und anschließend Zusetzen einer äquivalenten Menge Salzsäure unter Verschieben des pH der Lösung zum isoelektrischen Punkt (pI) des Polymers. Das Polymer wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert, mit am pI gepuffertem Wasser gewaschen und erneut in eine geringe Menge Ethanol enthaltendem Wasser entweder über oder unter dem pI gelöst. Das Polymer wurde in leicht saurer oder basischer Lösung aufbewahrt, da, falls es bei seinem pI isoliert und getrocknet wurde, das erneute Auflösen langsam und schwierig war.
Jede Seite eines AT-geschnittenen Quarz-Kristalls wurde mit 2000 Å dicken Goldelektroden überzogen. Grundierungen aus 500 Å dikkem Titan wurden zur Haftung im Mittelpunkt des Quarz-Kristalls verwendet. Eine Seite des Kristalls wurde mit der Vernetzerpolymerlösung 40 sec bei 1000 Upm schleuderbeschichtet. Man ließ den auf diese Weise gebildeten Verbundresonator an der Luft trocknen und er wurde anschließend 10 min in einem Umluftofen auf 100ºC erhitzt.

BEISPIEL 3

Polyampholytvernetzung

Filme aus Polyampholyt (1) (Fig. 3) wurden mit einem multifunktionellen Aziridin gemäß dem in Fig. 3 dargestellten Verfahren vernetzt. Der Vernetzer, Pentaerythrit-tris-(B-aziridinyl)propionat (3) (Xama-7 ) wird durch Michael-Addition von Ethylenimin an Pentaerythrittriacrylat (2) hergestellt. Vernetzte Filme aus Polyampholyt (1) wurden anschließend durch Schleuderbeschichten einer Lösung auf einen Träger hergestellt, die 5,44% Polyampholyt (1) und die erforderliche Menge Zusammensetzung (3) enthielt und zum Blockieren einer vorzeitigen Vernetzung mit Ammoniumhydroxid basisch gemacht worden war. Die Filme wurden anschließend an Ort und Stelle durch 5 min mildes Erhitzen auf 100ºC vernetzt. Es wurde gefunden, daß im allgemeinen ein 50:1 äquivalentes Verhältnis von 1:3 die besten Ergebnisse ergab. Der Erhitzungsschritt entfernt NH&sub3;, wodurch man den Überzug schwach sauer werden läßt und auf diese Weise das Vernetzen des Polymers durch eine protonenassistierte Ringöffnungsreaktion zwischen Aziridingruppen des Vernetzers und einer kleinen Zahl -CO&sub2;H- Gruppen des Polyampholyts (1) ermöglicht. Die Filmdicke wurde durch die Umdrehungsgeschwindigkeit bei der Schleuderbeschich tung geregelt, welche von 1000-4000 Upm reichte. Die Filmdicken wurden unabhängig mit einem Sloan Dektat IIA-Stiftprofilometer bestimmt.

BEISPIEL 4

Piezoelektrische ARP-Polymerantwort auf eine DH-Änderung

Dieses Beispiel veranschaulicht, daß pH-Änderungen des Testmediums die Eigenschaften des vernetzten ARP ändern. Die daraus folgenden Änderungen können als Änderungen der ARP-Dicke, des Kontaktwinkels und viskoelastischer Eigenschaften bestimmt werden, die sich in Änderungen der piezoelektrischen Oszillatorantwort widerspiegeln. Die pH-Messungen wurden gleichzeitig durch Frequenzmessungen oder Netzwerkanalyse und ein pH-Meter Beckman Modell 032 durchgeführt. Der Analogausgang des pH-Meters wurde mit einem IO/Tech Analog-Digital-Wandler verbunden, an den der HPIB angeschlossen war, wodurch eine automatische pH-Messung ermöglicht wurde. Messungen des Kontaktruhewinkels wurden mit einem Rame-Hart Kontaktwinkelgoniometer unter Verwenden eines Wassertropfens von 10 µl ausgeführt.
Filmdicken in wäßrigen Lösungen wurden direkt mit einem Interferometermikroskop zur Phasenmessung (PMIM) (Zygo, Inc.) gemessen. Vernetzte Filme wurden auf verdampfte Goldfilme auf Quarzsubstraten gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren aufgetragen und wurden in einen dünnen (ca. 1 mm) Wasserfilm getaucht, der sich unter einem Abdeckgläschen befand. Der pH der Lösung wurde durch Ersatz des Wassers zwischen der Probe und dem Abdeckgläschen durch Wasser, das auf den gewünschten pH-Wert eingestellt war, geändert. Ein Referenzhöhenunterschied zur Kalibrierung wurde durch die Goldfilme bereitgestellt, deren Dicke aus der Frequenzverschiebung der Quarzkristall-Mikrowaage während der Elektronenstrahlverdampfung bestimmt wurde.
In dieser Probe wurde der pH des die QCM bedeckenden Testmilieus, auf denen ein 1:1:1 AA-MMA-DMAEMA-vernetztes ARP immobilisiert war, mit 0,001 N HCl über den pH-Bereich von 9,0 auf 3,0 angesäuert. Filme mit 0,8 µm beziehungsweise 0,4 µm Dicke wurden analysiert. Es wurde gefunden, daß sich die Reihenresonanzfrequenz (fs), die mit dem Verbundresonator in der Rückkopplungsschleife eines Breitbandverstärkers gemessen wurde, und die Frequenzmaximumsleitfähigkeit (fGmax), die durch Impedanzanalyse gemessen wurde, deutlich änderten, wenn der pH der dem Resonator ausgesetzten Flüssigkeit geändert wurde. (Es wird überall angenommen, daß der Unterschied zwischen fs und fGmax vernachlässigbar ist). Als der pH des Mediums allmählich von pH 3,0 erhöht wurde, wurde bei pH = 4,8 eine abrupte Frequenzabnahme beobachtet (Figur 4a und Fig. 4b). Die Größenordnung der Frequenzverschiebung erhöhte sich mit der Polymerfilmdicke und ergab außergewöhnlich große Verschiebungen, die bei einem 0,8 µm dicken Polymerfilm -6000 Hz erreichten. Die Resonanzfrequenz zeigte bei pH = 5,5 eine leichte Zunahme, gefolgt von einer abrupten Zunahme bei pH > 6,1. Die Zunahme im Mittelpunkt des isoelektrischen Bereichs pH = 5,5 war bei dünneren Filmen (0,4 µm) deutlicher, welche auf der Grundlage der Frequenzänderungen auch einen breiteren isoelektrischen Bereich zeigten. Diese Daten legen nachdrücklich nahe, daß die beobachteten Frequenzänderungen mit den Änderungen verwandt waren, welche die Übergänge zwischen der ionischen und isoelektrischen Form des Polymers begleiten. Außerdem entsprechen die Frequenzänderungen bei den 0,4 und 0,8 µm dicken Filmen Massenänderungen von ungefähr 20 µg cm&supmin;² und 90 µg cm&supmin;², was wesentlich größer ist, als die gesamte Flächenmasse (µm/A) dieser Filme nach der Schleuderbeschichtung.

BEISPIEL 5

Piezoelektrische Messung der Ureasaktivität durch ARP-OCM

Die Antwort auf durch die Urease-katalysierte Harnstoffhydrolyse ausgelöste pH-Änderungen wurde in 2 ml einer Pufferlösung gemessen, in welche der mit dem vernetzten Polymer 1 (Figur 3) überzogene Resonator eintauchte. Die Pufferlösung wurde aus 1,48 ml 1,0 mM NaOH, 8 ml 0,2 mM EDTA und 100 ml mit Phosphorsäure auf pH 5,5 eingestelltem entionisiertem Wasser hergestellt. Messungen der pH-Änderungen in Abhängigkeit von der Ureasekonzentration wurden durch Zusetzen bekannter Mengen Ureaselösung (1 mg Urease (Sigma, St. Louis, MO) in 100 ml entionisiertem Wasser) zu der 0,25 M Harnstoff (Fisher Scientific Co., MO) enthaltenden Pufferlösung ausgeführt, während der Resonator in die Lösung eintauchte. Umgekehrt wurde die Abhängigkeit der Antwort vom Harnstoff durch Zusetzen bekannter Mengen Harnstofflösung zu der 0,1 µg/ml Urease enthaltenden Pufferlösung bestimmt.
Die Urease-katalysierte Hamstoffhydrolyse führt zur NH&sub3;-Bildung mit einer entsprechenden pH-Zunahme des Mediums. Wenn dem gemäß Harnstoff einer ureasehaltigen Phosphatpufferlösung (Anfangs-pH = 4,0) zugesetzt wurde, wurde nach kurzer Zeit eine monotone Frequenzabnahme beobachtet, gefolgt von einer montonen Zunahme, bis die ursprüngliche Frequenz erreicht wurde (Figur 5). Die Größe der Frequenzänderung war bei beiden Ästen im wesentlichen identisch. Der Zeitpunkt, an dem die Frequenz das Minimum erreichte, wurde mit abnehmender Ureasekonzentration zu längeren Werten verschoben. Diese Daten stimmen mit der pH-abhängigen Frequenz des Verbundresonators überein: die Urease-katalysierte Hydrolyse erhöht den pH des Mediums, was zur Überführung des Polymer/Analyt-Komplexes in seine isoelektrische Form führt, wo die Frequenz abnimmt. Nachdem der pH den pI überschritten hat, erhöht sich die Frequenz erneut.

BEISPIEL 6

Messung des Mikrobenstoffwechsels durch die ARP-OCM

Das wäßrige Wachstumsmedium (pH = 7,4) für die Mikrobenstoffwechselmessungen enthielt 1,0% Gew./Vol. Proteasepepton Nr. 3 (Difco), 0,1% Rinderextrakt (Bacto), 0,002% Bromkresolpurpur, 0,5% NaCl. Dieses Grundmedium wurde, wo es erforderlich war, mit Kohlehydraten (1% Gew./Vol.) ergänzt und durch eine Corning Sterilisierungsmembran mit 0,2 µm filtriert. Die Antwort des piezoelektrischen Sensors auf den Bakterienstoffwechsel wurde mittels Referenzstämmen untersucht, die von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) erhalten wurden. E. coli (ATCC Zugangsnr. 25922) wurde zuerst über Nacht in einem 3%igen Tryptikase-Sojabrühe-Medium (TSB) bei 37ºC auf eine Dichte von ungefähr 10&sup9; Zellen/ml gezüchtet. Kurz vor Gebrauch wurden die Zellen auf ein Minimalmedium verdünnt, das sich aus 1 auf 20 Teile in keine Kohlenhydrate enthaltender Difco Bacto Purpurbrühe (BPB) zusammensetzt. Die Zelldichte wurde in einem Haemozytometer mittels eines Lichtmikroskops mikroskopisch bestimmt. Portionen der verdünnten Kultur wurden anschließend als Ausgangsimpfmaterial für die Versuche mit dem piezoelektrischen Sensor verwendet. Vier getrennte E. coli-Kulturen (eine Kontrolle und drei Versuche) wurden in TSB-Medium eingeimpft, das entweder Inosit oder eine der drei unterschiedlichen Kohlenhydratergänzungen enthielt. Die Kontrollkultur enthielt Inosit (1% Gew./Vol.) und die drei Versuchskulturen enthielten entweder Lactose, Mannit oder Arabinose in Konzentration von 1% Gew./Vol. Die Zellzahlen in aliquoten Mengen, die der QCM-Wachstumskammer entnommen wurden, wurden durch zuerst Abbrechen des Zellwachstums in der aliquoten Menge durch Zugabe einer 0,1%igen Natriumazidlösung erhalten. Die Proben wurden verwirbelt und in einer Petroff-Hauser-Zählkammer visuell gezählt. In einigen Fällen wurden die Zellkonzentrationen mittels eines Olympus Q2-Bildanalysators, der mit einem Compaq 386/25-Computer ausgerüstet war, automatisch gezählt.
Von der Stoffwechselaktivität der Mikroorganismen wurde beobachtet, daß sie den pH des Wachstumsmediums ändert. Dies geschah vermutlich deshalb, weil Kohlenhydrate in Metaboliten wie etwa Milchsäure, Bemsteinsäure, Essigsäure oder andere saure Moleküle überführt werden. Die Geschwindigkeiten des Zellstoffwechsels wurden mit der überzogenen Seite des Verbundresonators in ein Kohlenhydrate enthaltendes Wachstumsmedium eingetaucht gemessen. Nach einer Induktionszeit (die das Medium benötigt, den pH des oberen Endes des isoelektrischen Bereiches des Polymerfilms zu erreichen), wurde eine anfängliche Verringerung des pH des Mediums beobachtet. Dies entsprach einer allmählichen Frequenzabnahme der QCM, aufgrund der Bildung der isoelektrischen Phase (Figur 6). Eine allmähliche Zunahme der Frequenz bezogen auf die Anfangsfrequenz wurde anschließend beobachtet, als der pH des Mediums durch die isoelektrische Region abnahm. Die Zeit bis zum Frequenzminimum ist der Stoffwechsel- und Wachstumsgeschwindigkeit umgekehrt proportional.

BEISPIEL 7

Messung der Änderungen des Brechungsindex entsprechend einer pH-Verschiebung durch den isoelektrischen Punkt des Polymers

Der Zweck dieses Beispiels ist zu zeigen, daß eine bedeutende Verschiebung des Brechungsindex auftritt, die mit Ausbreitungsänderungen im Zusammenhang steht, die bei einem ARP beobachtet werden, wenn der pH seiner Umgebung durch den isoelektrischen Punkt (pI) des Polymers verschoben wird. Diese Antwort gestattet das Beobachten pH-empfindlicher Änderungen in den Gelen durch Verfahren wie etwa Refraktometer, Modulation der Dämpfungskopp lung zwischen zwei parallelen Wellenleitern oder Phasenverschiebungen in Interferometern vom Mach-Zehnder-Typ.
Ein nominaler 1-1-1 AA-MMA-DMAEMA-Polyampholyt wurde durch isoelektrische Fällung in Wasser durch Einstellen des pH auf den des isoelektrischen Punktes des Polymers gereinigt. Das gefällte Polymer wurde mit auf pH 6,4 gepuffertes Wasser gewaschen, zentrifugiert, dekantiert und anschließend erneut in Ethanol gelöst, das genügend HCl zum Verschieben des pH auf < 4,0 enthielt. Der Feststoffgehalt dieser Lösung (SP) war 0,1075 g Polymer/g Lösung (0,327 mÄq Säure/g Lösung).
Eine 0,1 N Lösung des Xama-7 -Aziridinvernetzers (SX) wurde durch Lösen von 0,712 g Xama-7 (142,3 g/Äq) in 50 ml Aceton hergestellt.
Eine Reihe von 100 mM Phosphatpufferlösungen wurde bei mehreren pH (6,0, 6,5, 7,0, 7,5 und 8,0) hergestellt, wobei der gewählte pH-Bereich den isoelektrischen Punkt der amphoteren Polymermatrix (Handbook of Chemistry and Physics) umspannte.
Vernetzbare Polymerlösungen (C) mit einer theoretischen Vernetzungsdichte von 50 Säureeinheiten/Aziridin wurden durch Mischen von 1,0 ml Ampholytvorratslösung (SP) mit genügend NH&sub4;OH unter Verschieben des pH auf > 10 zum Verhindern einer vorzeitigen Reaktion und anschließend Zusetzen von 0,0653 ml Vernetzerlösung (SX) hergestellt.
Die Polymerlösung wurde anschließend mittels eines 100 Mikron dicken Meßstabes direkt auf die Prismen eines Zeiss-Abbé-Refraktometers aufgetragen und trocknen gelassen. Die Trockendicke war nominal 1 µ. Auf das Abtrocknen folgend wurden die Filme mit einem Fön 5 min schwach erhitzt. Während des Abtrocknens und des nachfolgenden Erhitzens wurde Ammoniak ausgeblasen und das Polymer vernetzte leicht durch die Reaktion von Aziridineinheiten mit Carbonsäureseitengruppen am Polymer.
Der Brechungsindex des getrockneten Polymers war 1,5018, was mit typischen Acrylpolymeren in Übereinstimmung steht. Eine wie zuvor beschrieben hergestellte Phosphatpufferlösung wurde mit dem Polymerfilm in Berührung gebracht und sich äquilibrieren gelassen. Dies wurde von der Messung des Brechungsindex gefolgt. Als die Messungen abgeschlossen waren, konnte das Polymergel durch Einweichen mit konzentriertem Ammoniumhydroxid und Abwischen des zerbrochenen Gels vom Prisma entfernt werden. Dies gestattete, das Prisma erneut für weitere Messungen mit frischen Polymerfilmen zu verwenden. Weiteres Polymer wurde anschließend erneut auf das Prisma gegossen.
Die Messungen des Brechungsindex der sich daraus ergebenden Zusammensetzungen zeigten üblicherweise die Anwesenheit zweier Banden an. Eine entsprach dem Polymergel und die andere dem wäßrigen Medium oberhalb des Polymers. Die Brechungsindexbande für die Wasserzwischenschicht war in allen Fällen gut definiert. Die Polymerbanden waren jedoch nur in Puffern gut definiert, die sich dem isoelelektrischen Bereich des Polymers annäherten. Außerhalb des isoelektrischen Bereiches, einem pH zwischen 7,5 und 5,0, wurden die Gelbanden äußerst diffus bis zu dem Punkt, wo sie nicht mehr unterscheidbar waren, als der pH größer als 7,5 und kleiner als 5,0 war. Die Ergebnisse aus diesen Messungen werden in Tabelle B dargestellt. TABELLE B MESSUNGEN DES BRECHUNGSINDEX AN VERNETZTEN ARPZUSAMMENSETZUNGEN GEGENÜB. DEM pH DES TESTMEDIUMS
Die Messungen zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen dem Brechungsindex der amphoteren Schicht als Antwort auf die pH- Änderung. Von der Polymermatrix kann erwartet werden, daß sie als guter Wellenleiter innerhalb ihres isoelektrischen Bereiches dient, außerhalb dieses Bereiches aber extrem schlecht wird. Die durch den pH ausgelösten Änderungen des Brechungsindex können so zum optischen Überwachen mit dem pH verbundener Änderungen des Zellwachstums, der Enzymreaktionsfähigkeit oder der Antigen- Antikörper-Antwort verwendet werden.

BEISPIEL 8

Messung der Ureaseaktivität durch einen odtischen APR-Sensor

Das folgende Beispiel zeigt, daß die Ureaseaktivität durch Änderungen des Brechungsindex eines auf einen Analyten reagierenden Polymers als optischer Sensor gemessen werden kann.
Die Herstellung eines auf einen Analyten reagierenden Polymers als optischer Sensor für Urease wurde in der folgenden Weise bewerkstelligt. Ein nominales 1-1-1 AA-MMA-DMAEMA-Polyampholytpolymer wurde zuerst durch isoelektrische Fällung in Wasser durch Einstellen des pH auf den des isoelektrischen Punkts (pI 6,4) des Polymers gereinigt. Das gefällte Polymer wurde mit Wasser gewaschen, auf pH 6,4 gepuffert, zentrifugiert, die Waschflüssigkeit wurde dekantiert und das gefällte Polymer wurde anschließend in Ethanol wieder gelöst, das genügend HCl zum Verschieben des pH nach < 4,0 enthielt. Der Feststoffgehalt dieser Lösung war 0,107 g Polymer/g Lösung (0,327 mÄq. Säurepolymergruppen/g Lösung).
Eine Vorratslösung von Xama-7 -Aziridinvernetzer (SX) wurde durch Lösen von 0,712 g Xama-7 (142 g/Aziridinäquivalent) in 50 ml Aceton hergestellt. Die xama-7 -Vorratslösung wurde anschließend mit der Polymerlösung unter Bilden eines 50:1-Gemisches der Polymersäureäquivalente zu den Aziridinäquivalenten gemischt. Nach dem Mischen wurde ein Tropfen konz. Ammoniumhydroxid zum Hemmen der Vernetzung und Stabilisieren der Überzugslösung bis zur späteren Verwendung zugesetzt.
Die Vernetzungsüberzugslösung wurde anschließend unter Verwenden von 20 µl Überzugslösung je Deckgläschen auf Fisher #1 (Kategone # 12-542C) Mikroskopdeckgläschen von 25 x 25 mm aufgetragen. Die Polymerüberzüge wurden anschließend bei Raumtemp. an der Luft getrocknet und anschließend im Vakuumofen 20 min bei 130ºC gehärtet. Die Deckgläschen wurden anschließend vor Gebrauch auf Raumtemperatur gekühlt. Messungen des getrockneten Polymerfilmüberzugs zeigten eine Trockendicke von ca. 0,2 bis 0,6 mm Dicke.
Die Deckgläschen mit vernetztem Polymer wurden anschließend mittels Monobromnaphthalin als Kupplungsflüssigkeit zum optischen Verbinden des Deckgläschens mit dem Refraktometerprisma in einem Carl-Zeiss-Refraktometer Modell 27611 befestigt. Zur Messung der Ureaseaktivität wurde eine harnstoffgepufferte Substratlösung hergestellt, die 0,2 mM EDTA, 100 mg Harnstoff und 1,4 ml in 100 ml gereinigtem Wasser gelöste 0,1 N NaOH enthielt. Vor Gebrauch wurde der pH der Lösung auf pH 5,5 eingestellt. Verschiedene Konzentrationen einer Ureaseenzymvorratslösung (380 µg/ml) des Typs C-3 Langbohnen-Harnstoffamidohydroglase (EC 3.5.1.5) (Sigma, St. Louis, MO) in gereinigtem Wasser wurden mit 1,0 ml Harnstoffsubstratlösung gemischt. Die Reaktionsflüssigkeiten wurden anschließend sofort der Oberfläche des auf einen Analyten reagierenden Polymers als optischer Sensor zugesetzt und Messungen des Brechungsindex mit der Zeit wurden anschließend bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30 min manuell durchgeführt (Figur 8).
Die Messungen des Brechungsindex zeigten die Anwesenheit zweier Interferenzbanden. Eine Bande entsprach der Polymerzwischenschicht und die andere Bande dem wäßrigen Medium über der Oberfläche des auf einen Analyten reagierenden Polymers. Die Wasserbande blieb während der Messung gut definiert, wogegen die dem auf einen Analyten reagierenden Polymer entsprechende Indexbande scharf definiert war, als sich der pH der Lösung seinem isoelektrischen Punkt näherte. Über dem isoelektrischen Punkt (pH < 5 bis > 7,5) hinaus waren die Polymerindexbanden diffus.
Die Urease-katalysierte Harnstoffhydrolyse führt zur Bildung von NH&sub3;, der den pH der Reaktionslösung erhöht. Als dementsprechend das Ureasereaktionsgemisch dem optischen Sensor zugesetzt wurde, änderte sich der Brechungsindex, als der pH der Lösung durch den isoelektrischen Punkt des auf einen Analyten reagierenden Polymers ging. Änderungen des Brechungsindex mit der Zeit werden als Funktiqn wechselnder Ureasekonzentrationen in Figur 8 dargestellt. Weiterhin nahm wie in Tabelle C dargestellt die zum Erreichen des Brechungsindexmaximums erforderliche Zeit umgekehrt mit dem Anteil der dem Reaktionsgemisch zugesetzten Urease ab. TABELLE C KORRELATION DER UREASEKONZ. UND DER ZEIT MIT DEM MAXIMUM DES BRECHUNGSINDEX

BEISPIEL 9

Der Zweck dieses Beispiels war 1) die Bindung eines ARP an Polystyrolplatten, 2) die Bindung eines Antikörpers an das ARP und 3) die Verwendung eines ARP bei der Antigen-Antikörper-Bestimmung zu zeigen.

Teil A) Bestimmung des Mindestgewichts des Polymerüberzugs

Wie in Beispiel 1 gezeigt, wurde das optimale Verhältnis aktiver Säuregruppen zu Aziridinvernetzergruppen zu 20:1 bis 50:1 bestimmt. Dieser Verhältnisbereich spiegelt das Molekulargewicht des Polyampholyts und das Bedürfnis, wenigstens eine Vernetzung je Polymer bereitzustellen wider. Für diese Versuchsreihe wurden die folgenden Reagenzlösungen hergestellt und ein Verhältnis von 20:1 wurde als Standard gewählt.

Testlösung A - Säure/Aziridinkonzentrat 1:1

280 µl 0,1 N Polyampholyt in Methanol/Wasser-Lösung 80:20 (0,0328 g/ml durch isoelektrische Fällung gereinigtes 1-1-1 AA- MMA-DMAEMA) wurden 20 µl 1,405 N Xama-7 in Aceton und 20 µl konzentriertes NH&sub4;OH zugesetzt. (Ammoniumhydroxid wurde in ausreichender Menge zugesetzt, um eine vorzeitige Reaktion des Aziridins mit den Säuregruppen am Polymer zu blockieren.)

Testlösung B - Überzugslösungskonzentrat 20:1

1,9 ml 0,1 N vorstehend verwendeter Polyampholytlösung wurden 0,1 ml Testlösung A zugesetzt. Der Feststoffgehalt dieses Konzentrats war 0,0328 g/ml.
Die Lösungen wurden nach Tabelle D hergestellt. 20-µl-Portionen wurden in 9 Näpfchen/Reihe in eine 96-Näpfchenplatte pipettiert.
Eine unterschiedliche Lösung wurde in jede Reihe gegeben, wobei Reihe G als Kontrolle leer gelassen wurde. Die Spalten 10, 11 und 12 wurden ebenfalls leer gelassen.
Die Proben wurden anschließend bei Raumtemperatur 30 min trocken gefönt und wurden anschließend über Nacht in einen Vakuumofen bei 35ºC gestellt. TABELLE D ÜBERZUGSLÖSUNGEN

Bindungstest

Puffer (pH = 4), der blauen, roten oder grünen anionischen Farbstoff enthielt, wurde in die Näpfchen gegeben. Die Farbstoffe wurden aus wasserlöslichen Farbstoffen ausgewählt, die durch die amphoteren Polymere aufgezogen werden können und die wenigstens eine ionisierbare saure Gruppe wie zum Beispiel -COOH oder -SO&sub3;H besitzen. Derartige Farbstoffe sind in der Technik wohlbekannt und werden zum Beispiel bei Miyazako, US-Patent 3 795 519 und US-Patent 5 107 063 beschrieben. Derartige Farbstoffe schließen zum Beispiel saure Mono-, Tri- und Pentamethinoxonole, Carbound Dicarbocyanine, Merocyanine, Indoleniumverbindungen, Azoverbindungen, Triphenylmethane, Tetrazine und Barbitursäuren ein.
Beispiele schließen Oxonol Yello, Oxonol Red 536, Tetrazine und Acid Violet 520T ein. Wie dem Fachmann wohlbekannt ist, wird ein Farbstoff, dessen Absorption der zu absorbierenden Strahlung entspricht, zur Verwendung in der Hilfsschicht ausgewählt. Puffer und blauer Farbstoff wurden Spalte 1, 2 und 3 zugesetzt. Puffer und roter Farbstoff wurden Spalte 4, 5 und 6 zugesetzt und Puffer und grüner Farbstoff wurden Spalte 71 8 und 9 zugesetzt. Die Polymeroberflächen wurden mit 40 µl Farbstoff/Pufferlösung 30 min eingeweicht und anschließend bei Raumtemperatur mit Leitungswasser gewaschen. Die Haftung des Polymers an den Näpfchen und seine Konzentration wird durch die Anwesenheit von absorbiertem Farbstoff in der Polymerschicht gezeigt. Höhere Polymerkonzentrationen ergaben ein höheres Ansprechen des Farbstoffs. In allen Fällen wurde eine gute Farbstoffbindung in Näpfchen beobachtet, die eine Verdünnung bis zu und einschließlich 100:1 enthielten. Die Verdünnung 20:1 ergab bei allen Farbstoffen das beste Ansprechen und schien den besten Überzug zu ergeben. Deshalb wurde diese Überzugszusammensetzung zu den Antikörperbindungsuntersuchungen ausgewählt.

Teil B) Antikörderbindung

Eine 20:1-Säure-zu-Aziridin-Zusammensetzung mit einem Verdünnungsfaktor von 20:1 (0,00164 g/ml, 0,005 N) wurde für diesen Versuch ausgewählt. Die Standardlösungen wurden wie folgt hergestellt.

Antikörper-Vorratslösung:

Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Gesamtmolekül) wurde von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Eine Vorratslösung des Antikörpers (2 mg/ml) wurde durch Lösen des gesamten Inhalts eines Gläschens (1 mg) in 0,5 ml gereinigtem Wasser hergestellt. Dies lieferte eine Antikörper-Vorratslösung, die 2 mg/ml in einem 0 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,2 enthielt, der 15 mM Natriumchlorid enthielt. Diese wurde in Kombination mit den folgenden Polyampholytpolymeren und Vernetzungsreagenzien zum Herstellen der folgenden Überzugsreagenzien verwendet.

Lösung A - 1:1-Superkonzentrat

280 µl 0,1 N 1-1-1 AA-MMA-DMAEMA-Polyampholyt in Methanol/Wasser 80:20 wurden mit 20 µl NH&sub4;OH und 20 µl 1,405 N Xama-7 -Triaziridin in Aceton vereinigt.

Lösung B - 20:1-Überzugskonzentrat

1,9 ml 0,1 N 1-1-1 AA-MMA-DMAEMA-Polyampholyt in Methanol/Wasser 80:20 wurden mit 20 µl NH&sub4;OH und 0,1 ml Lösung A (Superkonzentrat) vereinigt.

Lösung C - 20:1-20:1-Überzugslösung

0,1 ml (100 µl) der 20:1-Überzugslösung (Lösung B) wurden mit 1,9 ml Methanol verdünnt, das 20 µl NH&sub4;OH enthielt.

Lösung D - 0.14 N Xama-7

0,1 ml der 1,405 N Xama-7 -Vorratslösung wurden in 0,9 ml Aceton gelöst.

Lösung E - Antiköper-Lösung #1

500 µl AK-Vorratslösung wurden mit 20 µl Xama-7 -Lösung D vereinigt.

Lösung E - Antikörper-Lösung #2

1000 µl AK-Vorratslösung wurden mit 20 µl Xama-7 -Lösung D vereinigt.

Überzugsverfahren

Jede zweite Spalte jeder der beiden 96-Näpfchen-Platten wurde mit 20 µl Überzugslösung C überzogen. Die Platten wurden anschließend 30 min mit einem Fön an der Luft getrocknet und anschließend 30 min in einem Vakuumofen bei 50ºC gehärtet. Eine dritte Platte wurde ähnlich überzogen, ausgenommen daß 20 µl Überzugslösungskonzentrat B anstelle von C verwendet wurden, was in jedem Näpfchen einen 20fachen Polymerüberschuß ergab. Jede Platte wurde wie nachstehend in Tabelle E, F und G dargestellt mit Antikörperlösung behandelt. Nach der Behandlung wurden die Platten durch Waschen mit Phosphatpuffer und anschließend mit einem Kaninchen-IgG-Kolorimetrietest untersucht. Die Farbänderungen wurden mittels eines automatischen Thermomax-Kolorimeters von Molecular Devices Corp. (Pab Alto, CA) überwacht. Die Farbreaktionen wurden 10 und 20 min auf die Zugabe der Testreagenzien folgend überwacht.

Platte #1

Spalte 1, 3, 5, 7, 9 und 11 wurden mit Lösung C überzogen und getrocknet. Petrolether wurde wie nachstehend in Tabelle E gestellt in jede Reihe gegeben und jedem Näpfchen wurden 10 µl AK-Antikörper-Vorratslösung zugesetzt. TABELL E

Platte #2

Spalte 1, 3, 5, 7, 9 und 11 wurden mit Lösung C überzogen und getrocknet. Antikörperlösungen wurden direkt in das nachstehend in Tabelle F bezeichnete Näpfchen gegeben. Es wurde kein Petrolether verwendet. Die Antikörperlösung enthielt Aziridin, das man gleichzeitig mit dem Antikörper und mit der Polymerzwischenschicht reagieren ließ.

Test auf Antikörderaktivität

Die Antikörperaktivität in den vorstehend beschriebenen Testnäpfchen wurde durch Ausführen eines Sandwich-Immuntests unter Verwenden eines Kaninchen-IgG-(rIgG)-Testantigens und Anti-r- IgG-alkalische-Phosphatase-Konjugat als Enzymreporterreagenz ausgeführt. Die Reagenzien für diesen Test schlossen ein:

Konjugatvorratsreagenz

- Das Konjugat von Ziege-anti-RIgG (Gesamtmolekül) und alkalischer Phosphatase (Sigma, A-8025) wurde durch Lösen von 5 µl Sigma-Konjugat in 5 ml TRIS-Probenpuffer hergestellt.

Kaninchen-IgG-Antigenvorrat

- Eine Vorratslösung (100 µg/ml) von gereinigtem Kaninchen-IgG (Sigma, N.1-5006) wurde durch Lösen von 0,5 mg in 5 ml PBS hergestellt. In jedem Näpfchen wurden 20 µl Vorrat verwendet.

TRIS-Probenduffer

- Ein Tris-Puffer (50 mM, pH 7,5), Natriumchlorid (75 mM), 0,1% SL-18-Detergenz, 0,1% BSA und Azid (0,02%) wurde hergestellt und bei 4ºC aufbewahrt. Dieser wurde sowohl als Verdünnungsmittel für die Konjugatlösung als auch die Waschflüssigkeit verwendet.
Testverfahren - Die Antikörperaktivität in den Testnäpfchen wurde bestimmt durch:
1) Waschen der Näpfchen mit Tris-Probenpuffer. Jedes Näpfchen wurde gefüllt und sofort eingedampft. Dieses Verfahren wurde 3x wiederholt.
2) 20 µl Kaninchen-IGG-Antigen-Vorratslösung wurden anschließend zugesetzt und die Testlösungen wurden 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Kaninchen-IgG wurde durch Eindampfen entfernt.
3) Jedes Testnäpfchen wurde anschließend drei Mal mit Probenpuffer gewaschen.
4) Jedes Testnäpfchen wurde anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 20 µl Anti-R-IgG-Konjugat-Vorratslösung inkubiert.
Das Konjugatreagenz wurde anschließend entfernt und jedes Näpfchen wurde 4x mit Tris-Probenpuffer gewaschen.
5) BCIP -Phosphatasesubstratlösung (Sigma, St. Louis, MO) (20 µl) wurde anschließend jedem Näpfchen zugesetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbe der Testnäpfchen wurde anschließend abgelesen. TABELLE F

Platte #3

Spalte 1, 3, 5, 7, 9 und 11 wurden mit Lösung B überzogen und getrocknet. Antikörperlösungen wurden direkt in die nachstehend in Tabelle G bezeichneten Näpfchen eingebracht. Es wurde kein Petrolether verwendet. Man ließ die aziridinhaltige Antikörperlösung gleichzeitig mit dem Antikörper und mit der Polymerzwischenschicht reagieren. TABELLE G
Die in Tabelle E, F und G dargestellten Ergebnisse dieser Versuche zeigen eindeutig, daß das Aziridin-vernetzte Polymer fest an die Oberfläche der Polystyrolplatten gebunden wird. Der Antikörper kann dadurch an das Polymer durch Aziridinbindung gebunden werden, daß 1) das Polymer unter Bilden einer gegenüber dem Antikörper reaktionsfähigen Oberfläche zuerst mit Aziridin behandelt wird oder 2) man den Antikörper zuerst mit Aziridin reagieren läßt und diesen Komplex anschließend mit der mit dem Polymer überzogenen Oberfläche reagieren läßt. In jedem Fall behält der Antikörper die Antigenbindungsaktivität bei der Vernetzung und der aktivierte Antikörper bindet nicht an Oberflächen, die nicht zuerst mit dem Polymer behandelt wurden.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend:

a. ein energieumwandelndes, auf einen Analyten reagierendes Polymer mit 1 bis 20 Vernetzungen pro Polymermolekül und ausgewählt aus amphoteren Co- oder Terpolymeren von Acrylsäure, Alkylmethacrylat und N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat mit einem pH-Wert zwischen 5,0 und 8,0, wobei das amphotere Co- oder Terpolymer auf einer Oberfläche immobilisiert ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die darüber hinaus ein Analyt-Rezeptorreagens umfaßt.

3. Verfahren zur Herstellung eines energieumwandelnden, auf einen Analyten reagierenden, auf einer Oberfläche immobilisierten Polymers, umfassend das:

a. Vermischen einer Lösung aus einen Vernetzer und einem energieumwandelnden Polymer, ausgewählt aus amphoteren Co- oder Terpolymeren von Acrylsäure, Alkylmethacrylat und N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat mit einem pH-Wert zwischen 5,0 und 8,0;

b. Auftragen der Lösung von Schritt a. auf eine Oberfläche; und

c. dann das Härten des Polymers bis zu einen Verhältnis von 1 bis 20 Vernetzungen pro energieumwandelndes Polymermolekül.

4. Akustisches Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einem flüssigen Medium, wobei das Verfahren das

a. In-Berührung-Bringen eines akustischen Nachweissystems mit einem Analyten, auf den das auf einen Analyten reagierende, im Nachweissystem enthaltene Polymer der Ansprüche 1 oder 2 reagiert;

b. Messen von Ausbreitungsänderungen im Nachweissystem im Anschluß an Schritt a; und das

c. Korrelieren der in Schritt b gemessenen Ausbreitungsänderungen mit dem Vorhandensein, der Konzentration, der Bildungs- oder Abbau-Geschwindigkeit des Analyten

umfaßt.

5. Optisches Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einem flüssigen Medium, wobei das Verfahren das

a. In-Berührung-Bringen eines optischen Nachweissystems mit einem Analyten, auf den das auf einen Analyten reagierende, im Nachweissystem enthaltene Polymer der Ansprüche 1 oder 2 reagiert;

b. Anschließen des Systems aus Schritt a. an ein Mittel zum Nachweisen von Änderungen bei der Ausbreitung von Licht des auf den Analyten reagierenden Polymers;

c. Messen von Ausbreitungsänderungen im Nachweissystem im Anschluß an Schritt a; und das

d. Korrelieren der in Schritt b gemessenen Ausbreitungsänderungen mit den Vorhandensein, der Konzentration, der Bildungs- oder Abbau-Geschwindigkeit des Analyten

umfaßt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, wobei der Analyt H&spplus; umfaßt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, wobei das auf den Analyten reagierende Polymer ein Analyt-Rezeptorreagens umfaßt.