EP1527344A2 - Verfahren und kit zur durchf hrung funktioneller tests an biologischen zellen, die an ein array von fängermolekülen immobilisiert werden - Google Patents

Verfahren und kit zur durchf hrung funktioneller tests an biologischen zellen, die an ein array von fängermolekülen immobilisiert werden

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Publication number
EP1527344A2
EP1527344A2 EP03792191A EP03792191A EP1527344A2 EP 1527344 A2 EP1527344 A2 EP 1527344A2 EP 03792191 A EP03792191 A EP 03792191A EP 03792191 A EP03792191 A EP 03792191A EP 1527344 A2 EP1527344 A2 EP 1527344A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
test cells
array
cells
capture molecules
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03792191A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hugo Hämmerle
Thomas Joos
Markus Templin
Hansjürgen VOLKMER
Kerstin Ragnitz
Susanne Stumpf
Cornelia Kuschel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Original Assignee
NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut filed Critical NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Publication of EP1527344A2 publication Critical patent/EP1527344A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for carrying out functional tests on biological cells, in which an array of measuring points is used, with at least one capture molecule or binding partner for the biological cells to be tested being immobilized at each measuring point.
  • functional test means, for example, but not exclusively or in a restrictive manner, such experiments, tests or measurements in which certain properties or features of the cells or the change in these properties or features as a function of a treatment the cells and / or the type of capture molecules and / or the addition of substances are recorded or evaluated.
  • the treatment of the cells is e.g. radiation with high-energy radiation, such as is used in radiotherapy.
  • the addition of substances includes e.g. in the context of pharmaceutical screening, the administration of pharmaceutical preparations whose effect on the cells is examined, for example, in the course of a dose-finding study, or the addition of antibodies which are screened against cell surface receptors.
  • the choice of the type of capture molecules affects e.g. Components of extracellular matrix molecules for simulating the natural microenvironment of the cells in order to test their reaction in vitro to radiation, stimulation by ligands and / or added pharmaceuticals under conditions of the natural microenvironment.
  • biological cells to be tested include, for example, but not exclusively or in a restrictive manner, primary animal, in particular human cells, plant or bacterial cells, cell lines, genetically modified cells, cells made of biopsy material, healthy un-degenerate cells, in particular tumor cells , Cells from peripheral blood etc. understood. These cells are referred to below as test cells.
  • the "properties and characteristics" of the test cells include, but are not limited to, their proliferation ability, their viability, the pattern of their cell surface molecules, their ability to exchange signals or to interact with other cells, a possible pathological condition, a genetic degeneration, their genetic profile, their expression profile, their ability to bind to certain substances.
  • Carrier plates with arrays which are suitable for carrying out such methods and examples of such functional tests can be found, for example, in WO 02/02226 by the applicant or WO 00/39580.
  • the carrier plates are usually Glass or plastic platelets which have a functionalized, for example aldehyde-activated surface, on which capture molecules or binding partners for the test cells are immobilized at mutually separated measuring points. The surface between the measuring points is blocked to prevent non-specific binding of test cells or other substances.
  • the measuring points have a diameter of 200 to 800 ⁇ m and a center distance of, for example, 500 ⁇ m, so that 100 measuring points can be accommodated on an area of 1 x 1 cm.
  • different capture molecules are immobilized on the measuring points.
  • a solution with test cells is then placed on the carrier plate, which is then incubated for a certain period of time before the test cells that are not immobilized on capture molecules are washed off again.
  • the bound test cells are then recorded optically in a spatially resolved manner in order to determine to which capture molecules the test cells have bound.
  • the optical detection can take place, for example, using bright field microscopy or fluorescence measurements, but other measurement principles can also be used, as described, for example, in WO 02/02226 or WO 00/39580.
  • This publication describes a method in which more than 50 CD antigens are detected on leukocytes.
  • an array of different, at different Measuring points immobilized antibodies against the respective CD antigens are used, to which a suspension of test cells is placed, the test cells only binding to those measuring points at which antibodies are immobilized, for which they express the corresponding CD antigens.
  • the bound test cells are recorded optically with spatial resolution.
  • the resulting pattern of measuring points occupied with test cells represents the patient's phenotype from which the test cells originate.
  • the antibody array covers a total of 60 measuring points on an area of 0.72 cm x 0.4 cm, to which 5nl antibody solution was added.
  • the diameter of a measuring point is approx. 400 ⁇ m.
  • 100 ⁇ l of a cell suspension with a concentration of 10 7 test cells / ml were added to the array. The authors report that around 600 test cells were bound at this concentration per measuring point, while around 100 test cells are bound at 10 ⁇ test cells / ml.
  • the present invention has for its object to provide a method of the type mentioned, in which the reliability and reproducibility between the measurement results of measurement points in an array and in different arrays is so great that a reliable comparison of the measurement results and the creation a reliable gradation of the measurement results is possible.
  • this object is achieved on the one hand by a method for carrying out functional tests on test cells, with the steps:
  • step b) contacting the mixture from step b) with the array so that test cells and reference particles can bind to each measuring point
  • the inventors of the present application have recognized that the reproducibility and reliability of the measurement results depend on the varying size of the measurement points and the lack of homogeneity of the immobilized capture molecules, and that the use of the reference particles makes it possible to influence the different sizes of the surfaces of the Calculate measuring points and other inhomogeneities, for example in the local concentration of the capture molecules, from the measurement results.
  • the inventors are therefore not taking the path that is actually available on the basis of the inventors' findings to minimize the variability by means of more complex production processes which lead to more uniform areas of the measuring points and a uniform local concentration of the capture molecules, but instead use reference particles.
  • the number of test cells bound per measuring point and thus the respective measuring signal in the known methods according to the knowledge of the inventors of the present application depends not only on the binding properties between the test cells and the capture molecules but also on the density of the capture molecules per measurement point the size of the area of the measuring points and the homogeneity of the concentration of the capture molecules.
  • the quotient of the measurement signal for the test cells and the measurement signal for the reference particles at a specific measurement point can be taken as a measure for the binding of the test cells to the capture molecules of this measurement point.
  • the measurement signal for the reference particles is, so to speak, a measure of the number of capture molecules in a measurement point.
  • bound test cells of interest are understood to mean test cells that have deposited from the suspension on measuring points and adhere there.
  • the ratio of bound test cells to bound reference particles then serves to compare the adhesion behavior of the test cells to different capture molecules to be able to.
  • test cells of interest are, for example, all bonded test cells in the context of adhesion tests, the apoptosis rate, viability, the ability to bind to antibodies, exchange signals, etc. in the context of other functional tests.
  • Artificial spheres for example latex spheres, can be used as reference particles, which carry surface molecules that enable a binding to the catcher molecules that is comparable to that of the surface cells of the test cells. These balls are inexpensive and easy to manufacture and can be stored for a long time; they are known from other applications in the prior art and have a size that can correspond to that of the test cells.
  • Another advantage of the Ku geln is that their binding behavior to the capture molecules is not influenced by subsequently added substances or, for example, radioactive or UV radiation, so that after mixing and, if necessary, immobilizing test cells and spheres, the influence of this measure on the test cells and, for example, theirs Binding or apoptosis rate can be tracked without affecting the binding of the balls, so that the reference is retained.
  • biological reference cells as reference particles which can be distinguished from the test cells in terms of measurement technology, preferably optically, but which bind to capture molecules like the test cells.
  • the reference cells can be untreated test cells, which can be distinguished by measurement technology from the test cells to be examined and treated before mixing.
  • test cells and the reference particles are preferably mixed with one another in a ratio of 1: 1, so that they are the same. Probability to hit the catcher molecules.
  • the test cells can be distinguished from the reference particles by measurement technology, preferably optically, in that the test cells are labeled with a marker other than the reference particles, preferably a fluorescent marker or a genetic marker. It is advantageous here that the array can be read out with two different excitation waves and / or emission filters, with successively or simultaneously spatially resolved optical signals being recorded, from which the ratio of the test cell of interest to the reference particle can then be calculated.
  • test cells can also be labeled instead of or different from the test cells.
  • a genetic marker such as a reporter gene such as GFP (green fluorescent protein).
  • GFP green fluorescent protein
  • test cells can be distinguished from the reference particles by measurement technology in that the test cells are provided with a different radioactive marker than the reference particles.
  • radioactive and optical markings together, that is to say test cells and reference cells, to radioactively and optically mark, or to use them in a mixed manner, for example to optically mark the test cells and the reference particles radioactively.
  • the reference cells are preferably genetically different from the test cells in such a way that they do not, or are known to react differently to substances and / or radiation whose effect on the test cells is to be investigated.
  • the advantage here is that after the test and reference cells have been mixed, this mixture can be treated in the manner indicated without impairing the binding to the capture molecules or other properties of the reference cells examined in the course of the functional tests.
  • radiation can, for example, lead to a certain percentage of the test cells being killed or its binding properties to the catcher molecules being changed such that it binds poorly or better to the catcher molecules, the binding of the reference cells to the catcher molecules remains unchanged and is therefore a measure of the number of capture molecules per measuring point.
  • test cells and reference cells are also possible to divide a mixture of test cells and reference cells into two arrays and to irradiate only one array after or during the incubation or to bring it into contact with a test substance.
  • the untreated array then serves as a reference for the effect on test cells and on reference cells.
  • Two or more types of reference particles can also be mixed with the test cells, the different types of reference particles being distinguishable from one another and from the test cells, for example by three different "colors". It is thus possible to use so-called “beads” as the first type of reference particles, which are not influenced by the treatment and serve as a reference between different arrays, and as second type of reference particles to use reference cells that are used to calculate the variation within an array.
  • a reference measuring point can be provided on each array, to which only reference particles bind. This can be used as a reference between different arrays, the reference measuring point being isolated from the other measuring points, so that only reference particles are applied to it.
  • the object on which the invention is based is achieved by a method for carrying out functional tests on test cells, with the steps:
  • the inventors of the present application have recognized that the uneven deposition of test cells on the measuring points, as can be seen from the publication by Belov et al., Loc. Cit., Is not solely due to the inhomogeneity of the measuring points, but also due to the fact that the Test cells in the suspension are not distributed homogeneously, but preferentially deposit at certain points on the array. However, this means that the local number of test cells on the array is not the same everywhere. In other words, for example, despite a strong bond between test cells and capture molecules, a weaker measurement signal can result for a specific measuring point than for a measuring point at which the binding is weaker because the local concentration of the test cells is lower than at the first measuring point the second measurement point.
  • the distribution of a (logical) measurement point over a number of measurement areas at different locations in the array averages the statistical probability of adhesion for different measurement points, that is to say averaged over the assigned measurement areas. If the individual measuring surfaces become so small that, in the statistical sense, it is no longer possible for a sufficient number of test cells to bind in order to generate a reliable measurement signal, the reference particles and measures discussed in detail above can also be used here, which leads to a synergistic effect.
  • a specific ratio between the area (F) of a measuring point and the number (N) of test cells in the suspension is required, which depends on the adhesive area (H) of the respective cells and is selected as follows:
  • either the area F of a measurement point is chosen larger or several measurement areas are combined to form a logical measurement point with a total area F. Under these conditions, almost all test cells can bind from the overhang without interfering with each other.
  • This choice of the ratio between the number and type of test cells and the size of the surface of a measuring point, which determines the adhesive surface is in itself new and inventive and, together with one or both of the above-mentioned measures, namely the reference particles and / or the distributed measuring surfaces, leads to one synergistic effect.
  • the above ratio should be applied to the sum of the test cells and reference particles present in the suspension as follows:
  • NT and HT denote the number and the adhesive surface of the test cells and NR and HR the number and adhesive surface of the reference particles and a is a factor of 0.5, preferably approximately 1.0.
  • the amount of test cells and possibly reference particles in the suspension / mixture to be applied to the array must be selected in such a way, according to the knowledge of the inventors of the present application, that the above ratio is maintained in order to To achieve a situation in which almost all test cells / reference particles can bind to a measuring point, so that there is a competition between the measuring points around the cells.
  • This ratio is advantageous, for example, if a few cells are available, as in tumor biopsies, or if the "homing" of stem cells is to be investigated.
  • a preference of the test cells for certain catcher molecules can only be determined quantitatively in the low numbers of test cells used according to the invention. This also applies if a subpopulation is to be examined separately in mixed cell populations.
  • the inventors of the present application were able to show that with larger amounts of test cells they also bind to substrates for which they have no proven preference.
  • the array is moved after contacting with the suspension / mixture, i.e. during the incubation with the test cells and possibly the reference particles, for example on a vibrator or a cradle or by means of a pump, for example via microfluidic flow to reduce the local concentration differences in the test cells and possibly reference particles.
  • new test cells or reference particles are also repeatedly brought to the measurement points, so that a larger number of them have the chance to bind to capture molecules.
  • shaking surprisingly increases the number of bound test cells and possibly reference particles, as the inventors of the present application were able to show.
  • this measure is also new and inventive in itself, but is preferably used together with one or more of the above-mentioned measures.
  • the array is either applied to a carrier plate, as is the case in WO 00/39580 and WO 02/02226 mentioned at the outset, or that it is a logical array of individual balls which are loaded with capture molecules and in the usual way, for example can be distinguished from one another by color markings.
  • a measuring point then corresponds to either one sphere or several spheres, each of which represents a measuring surface in the above sense.
  • balls are used as an array, in the simplest case they are added to the solution / mixture and incubated, for example on a shaker, with gentle agitation.
  • test cells are subjected to a treatment before or after contacting the array, which treatment is selected from the group: irradiation with high-energy radiation, for example UV light or radioactive radiation, contact with test substances such as pharmaceutical active ingredients, etc.
  • high-energy radiation for example UV light or radioactive radiation
  • test substances such as pharmaceutical active ingredients, etc.
  • Different capture molecules are immobilized at the measuring points, which are preferably selected from the group: protein such as, for example, components of extracellular matrix proteins, receptors.
  • Ligands poly-lysine, peptides from laminin sequences, Control peptides, peptidomimetics, antibodies, lectins, antigens, allergens.
  • the invention further relates to a kit with an array of mutually separate measuring points, at which capture molecules are immobilized, to which test cells can bind, and with reference particles, which bind to the capture molecules.
  • the reference particles are preferably the reference particles described in more detail above, with further capture molecules preferably being immobilized at the measuring points, which are preferably selected from the group: protein such as, for example, components of extracellular matrix proteins, receptors.
  • protein such as, for example, components of extracellular matrix proteins, receptors.
  • the array is either applied to a carrier plate or it is a logical array of individual balls that are loaded with catcher molecules, further preferably at least one measuring point with its associated catcher molecules being divided over several measuring surfaces in the array, which are located at different locations in the array are arranged.
  • FIG. 1 shows a schematic example of an array of measuring points arranged on a carrier plate, the measuring points being distributed over different measuring surfaces;
  • FIG. 2 shows a schematic side view of the carrier plate from FIG. 1;
  • Fig. 5 is a diagram showing the binding of test cells to different capture molecules depending on the shows the number of cells used in the applied suspension.
  • Fig. 6 is a diagram showing the settlement of a measurement area depending on the number of cells used in the applied suspension with and without movement.
  • Example I Carrier plate with an array of measuring points
  • 10 denotes a rectangular support plate made of glass or plastic, on which some measuring surfaces 11 are arranged in an array, to which biological cells, not shown in FIG. 1 - hereinafter: test cells - or reference particles can bind. Areas 12 of the carrier plate 10 are provided between the measuring surfaces 11, to which test cells and reference particles cannot bind.
  • the measuring surfaces have a diameter of 500 ⁇ m and an edge distance of 250 ⁇ m, so that there is a center distance of 750 ⁇ m. In this way, 96 measuring surfaces 11 can be accommodated on a carrier plate 10 with an edge length of 6 mm ⁇ 9 mm.
  • the carrier plate can be designed as the base plate of a cell culture vessel.
  • the carrier plate 10 bears on the section 17 a functionalized surface 18 on which capture molecules 19, 21, 22 are immobilized in the measuring points 11.
  • the catcher molecules 19, 21, 22 generally differ from measuring surface 11 to measuring surface 11, it being possible for different measuring surfaces 11 to be combined to form a logical measuring point.
  • the measuring surfaces 11 of a logical measuring point carry identical catcher molecules 19, 21 or 22 and are statistically distributed over the carrier plate 10.
  • Test cells 23 can bind to the catcher molecules 19, 21 and 22, and their binding behavior to the catcher molecules 19, 21, 22 or their reaction to co-stimulation by catcher molecules 19 and test substances or to a treatment such as radiation should be examined.
  • the functionalized surface 18 is blocked by molecules 24, so that the test cells 23 can only be bound in the area of the measurement areas 11.
  • a reference particle is indicated at 25 in FIG. 2, which binds to the capture molecules 22.
  • Biological cells or plastic spheres are suitable as reference particles 25, which carry molecules on their surface with which they bind to the capture molecules 19, 21, 22.
  • the reference particles 25 are provided as an internal reference in order to be able to calculate out fluctuations in the size of the measurement areas 11 or the number of capture molecules in the measurement area both within an array and between different arrays.
  • Example 1 of the aforementioned WO describes how such a carrier plate 10 with measuring surfaces 11 can be produced 02/02226, the disclosure of which is hereby expressly incorporated by reference.
  • Example II Incubation of a Mixture of Test Cells and Reference Cells on an Array with Measuring Points Distributed on Different Measuring Surfaces
  • test and reference cells are marked with different membrane dyes.
  • Hu AO SMC or GLZ are used as test cells, which are labeled with the Vibrant Dil Red Fluorescent Cell Linker Kit (V22885Y MoBiTec) according to the manufacturer's instructions.
  • PC12 serve as reference cells, which are marked with the Vibrant DiO Green Fluorescent Cell Linker Kit (V22886Y MoBiTec) according to the manufacturer's instructions.
  • both cell types were stained blue with the Vibrant Cell Labeling Solution DAPI.
  • FIG. 3 shows, by way of example, for a measuring point with laminin from the human placenta as a capture molecule, that both test cells (GLZ) and reference cells (PC 12) bind to the measuring point, but the reference cells in a significantly smaller number than the test cells. It can be seen that the measuring point is evenly populated with capture molecules.
  • FIG. 3A shows a bright field measurement for both cells
  • FIG. 3B shows a fluorescence image of the measuring point with a blue filter for test and reference cells after DAPI staining
  • FIG. 3C shows a fluorescence image with a red filter that is permeable to the emission of the test cells
  • FIG. 3D shows one Corresponding image with a green filter permeable to the emission of the reference cells.
  • the total number and percentage of the bound cells is given as an example for some measuring points, each with laminin (human placenta) as a capture molecule for a mixed suspension of test and reference cells, 100,000 cells of each type being found for PC12 with GLZ an array was given and for PC12 with hu AO SMC 35,000 cells of each type.
  • test cells glioma cell line GLZ
  • reference cells neurovascular cell line PC12
  • test cells smooth muscle cells huAO SMC
  • reference cells neurovascular cell line PC12
  • the ratio between the two respective cell types is approximately constant if the ratio F> N x H is maintained, regardless of the number of cells per measurement area and regardless of whether the two cell types compete for a capture molecule. This makes it possible to use reference cells to calculate the variation between measuring points.
  • the percentage or the ratio between bound test and reference cells is therefore a more reliable measure of the binding of the test cells to the individual measuring points than the absolute number of bound test cells.
  • Example III Incubation with and without shaking
  • Test cells were in a concentration of 0.5 to 50 x 10 s cells / ml on measuring surfaces of the area 280,000 ⁇ m 2 with different capture molecules, namely collagen I, collagen II and collagen III, incubated for 4 h each, the carrier plates being shaken during the incubation in one case and left to rest in the other case. For shaking, the carrier plate was moved manually at intervals of 10 min to mix the cell suspension over the arrays.
  • the upper line shows the binding to collagen I, the middle one the binding to collagen II and the lower one the binding to collagen III. Incubation without shaking is shown on the left for A, C and E and incubation with shaking on the right for ⁇ B, D and E.
  • FIG. 5 shows the number of cells per measuring surface as a function of the number of cells used and the binding of the test cells to the three capture molecules mentioned in FIG. 5.
  • FIG. 6 shows the number of cells per measuring surface as a function of the number of cells used and the binding to the laminin substrate and the influence of the substrate movement.
  • the shaking ensures that a measuring area is populated with cells at most.
  • a "saturation" of the measuring surfaces already occurs at a concentration of 20 x 10 5 cells / ml, which can be seen from the fact that the number of bound cells does not increase any further from this concentration.
  • concentrations that is to say with a lower number of cells per measurement point, there is virtually no binding to thrombospondin, but rather that almost all cells bind to laminin or collagen I. This is also to be expected, because PC12 binds to thrombospondin considerably less than to the other capture molecules. Only through a high number of cells in the supernatant, the effect of competition is weakened and the cells' also bind to thrombospondin.
  • Example IV Determination of the sensitivity of cells in their natural microenvironment
  • An example of how the method according to the invention can be used is the investigation of how tumor and normal tissues react to radiation or the addition of toxic substances, depending on their natural microenvironment. It is known that cells whose radiation sensitivity is tested in a cell culture without the addition of extracellular matrix components (ECM) are more radiation-sensitive than parallel cultures which have been cultivated on ECM. This means that the composition of the extracellular matrix is of crucial importance for the cell-specific reactivity of both tumor and normal tissue. Furthermore, the combination effect of radiation and chemotherapy can be further optimized in the natural microenvironment.
  • ECM extracellular matrix components
  • test cells are placed in a mixed suspension with reference cells on an array of different capture molecules and the number of bound test cells as well of the bound reference cells is determined and from this the normalized number of test cells per measuring point is calculated.
  • the test cells are then treated with staurospondin and incubated. After a certain incubation period, the number of dead test cells per measurement point is determined and the apoptosis rate is determined from this number and from the normalized number determined before the incubation.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen mit folgenden Schritten beschrieben: a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, b) Erstellen einer Mischung aus den Testzellen und aus Referenzpartikeln, die das Vermögen haben, an die Fängermoleküle zu binden, und die von den Testzellen unterscheidbar sind, c) Kontaktieren der Mischung aus Schritt b) mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen und Referenzpartikel binden können, und d) Bestimmen des Verhältnisses von interessierenden gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln für zumindest einige der Messpunkte. Bei einem weiteren Verfahren ist zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind. Das Array wird bei einem anderen Verfahren nach dem Kontaktieren mit den Testzellen und ggf. den Referenzpartikeln bewegt.

Description

Verfahren und Kit zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie einen Kit zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen, bei dem ein Array von Messpunkten eingesetzt wird, wobei an jedem Messpunkt zumindest ein Fängermolekül oder Bindungspartner für die zu testenden biologischen Zellen immobilisiert ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter "funktionel- len Test" bspw. , aber nicht abschließend oder beschränkend, solche Experimente, Tests oder Messungen verstanden, bei denen bestimmte Eigenschaften oder Merkmale der Zellen oder die Änderung dieser Eigenschaften oder Merkmale in Abhängigkeit von einer Behandlung der Zellen und/oder der Art der Fängermoleküle und/oder der Zugabe von Substanzen erfasst oder bewertet werden.
Die Behandlung der Zellen ist z.B. eine Bestrahlung mit einer energiereichen Strahlung, wie sie in der Radiotherapie eingesetzt wird. Die Zugabe von Substanzen umfasst z.B. im Rahmen von Pharmascreening die Gabe von pharmazeutischen Präparaten, deren Auswirkung auf die Zellen bspw. im Rahmen einer Dosisfin- dungsStudie untersucht wird, oder die Zugabe von Antikörpern, die gegen Zeiloberflächenrezeptoren gescreent werden. Die Wahl der Art der Fängermoleküle betrifft z.B. Komponenten extrazellulärer Matrixmoleküle zur Simulation der natürlichen Mikroum- gebung der Zellen, um in vitro ihre Reaktion auf Bestrahlung, Stimulation durch Liganden und/oder zugegebene Pharmaka unter Bedingungen der natürlichen Mikroumgebung zu testen.
Unter "zu testenden biologischen Zellen" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bspw., aber nicht abschließend oder beschränkend, primäre tierische, insbesondere humane Zellen, pflanzliche oder bakterielle Zellen, Zelllinien, genetisch veränderte Zellen, Zellen aus Biopsiematerial, gesunde unentartete Zellen, insbesondere Tumorzellen, Zellen aus dem periphe- ren Blut etc. verstanden. Diese Zellen werden im weiteren als Testzellen bezeichnet. Zu den "Eigenschaften und Merkmalen" der Testzellen zählen bspw. , aber nicht abschließend oder beschränkend, ihr Prolife- rationsvermögen, ihre Viabilität, das Muster ihrer Zelloberflä- chenmoleküle, ihr Vermögen zum Signalaustausch oder zur Interaktion mit anderen Zellen, ein möglicher pathologischer Zustand, eine genetische Entartung, ihr genetisches Profil, ihr Expressionsprofil, ihr Vermögen, an bestimmte Substanzen zu binden.
Diese Verfahren werden mit Arrays von Messpunkten durchgeführt, um mit wenigen Zellen parallel unterschiedliche Funktionen von Zellen auslesen zu können. Ein Vorteil derartiger Arrays besteht darin, dass im Gegensatz zu Mikrotiterplatten für alle Messpunkte gleiche Umgebungsbedingungen vorherrschen.
Trägerplatten mit Arrays, die zur Durchführung solcher Verfahren geeignet sind, sowie Beispiel für solche funktionellen Tests finden sich bspw. in der WO 02/02226 der Anmelderin oder der WO 00/39580.
Die Trägerplatten sind i.d.R. Glas- oder Kunststoffplättchen, die eine funktionalisierte, bspw. aldehydaktivierte Oberfläche aufweisen, auf der an voneinander abgegrenzten Messpunkten Fängermoleküle oder Bindungspartner für die Testzellen immobilisiert sind. Zwischen den Messpunkten ist die Oberfläche geblockt, um unspezifische Bindung von Testzellen oder sonstigen Substanzen zu verhindern.
Die Messpunkte haben einen Durchmesser von 200 bis 800 um und einen Mittenabstand von bspw. 500 μm, so dass sich auf einer Fläche von 1 x 1 cm 100 Messpunkte unterbringen lassen. Auf den Messpunkten werden bspw. unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert. Auf die Trägerplatte wird dann eine Lösung mit Testzellen gegeben, die dann für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert wird, bevor die nicht an Fängermolekülen immobilisierten Testzellen wieder abgewaschen werden. Die gebundenen Testzellen werden dann optisch ortsaufgelöst erfasst, um zu bestimmen, an welche Fängermoleküle die Testzellen gebunden haben. Die optische Erfassung kann bspw. über Hellfeldmikroskopie oder Fluoreszenzmessungen erfolgen, es sind aber auch andere Messprinzipien einsetzbar, wie sie bspw. in der WO 02/02226 oder der WO 00/39580 beschrieben sind.
Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung durchgeführte Messungen mit derartigen Trägerplatten haben nun ergeben, dass die MessSignale zwischen verschiedenen Messpunkten innerhalb einer Trägerplatte und zwischen Messpunkten verschiedener Trägerplatten stark schwanken, obwohl die Fängermoleküle, die Testzellen und der Versuchsansatz identisch waren. Diese Variabilität zwischen den Messpunkten auf einer Trägerplatte und zwischen verschiedenen Trägerplatten führt dazu, dass die Messergebnisse häufig nicht hinreichend zuverlässig miteinander verglichen werden können.
Diese Problematik ist auch aus der Veröffentlichung Belov et al.: "Immunophenotyping of Leuke ias Using a Cluster of Differentiation Antibody Microarray", in Cancer Research (2001) 61, 4483-4489 zu entnehmen.
in dieser Veröffentlichung ist ein Verfahren beschrieben, bei dem mehr als 50 CD-Antigene auf Leukozyten nachgewiesen werden. Dazu wird ein Array von verschiedenen, an unterschiedlichen Messpunkten immobilisierten Antikörpern gegen die jeweiligen CD-Antigene verwendet, auf das eine Suspension von Testzellen gegeben wird, wobei die Testzellen nur an solche Messpunkte binden, an denen Antikörper immobilisiert sind, für die sie die entsprechenden CD-Antigene exprimieren. Die gebundenen Testzellen werden optisch ortsaufgelöst erfasst. Das sich ergebende Muster von mit Testzellen besetzten Messpunkten repräsentiert den Imπuinphänotyp des Patienten, aus dem die Testzellen stammen.
Das Antikörperarray umfasst auf einer Fläche von 0,72 cm x 0,4 cm insgesamt 60 Messpunkte, auf die jeweils 5nl Antiköper- lösung gegeben wurde. Der Durchmesser eines Messpunktes beträgt ca. 400 μm. Auf das Array wurden 100 μl einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 107 Testzellen/ml gegeben. Die Autoren berichten, dass bei dieser Konzentration pro Messpunkt etwa 600 Testzellen gebunden wurden, während bei 10δ Testzellen/ml ca. 100 Testzellen gebunden werden.
Mit anderen Worten, nur ca. 0,1 bis 1 %o der in der Suspension befindlichen Testzellen können auch an die Messpunkte binden. Bei einem so geringen Anteil an tatsächlich bindenden Testzellen besteht nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung jedoch das Problem, dass die Messergebnisse aus statistischen Gründen nicht zuverlässig genug sind, insbesondere wenn die Messergebisse für verschiedene Messpunkte nicht nur qualitativ, wie bei der Typisierung des Immunphänotyps in der genannten Veröffentlichung, sondern auch quantitativ verglichen werden sollen, wie bei den eingangs erwähnten funktionellen Tests. Das Problem wird noch gravierender, wenn wenige Zellen zur Verfügung stehen, also nicht 107 Zellen/ml sondern bspw. nur 105 Zellen/ml, wie dies bei vielen Versuchsansätzen der Fall ist.
Auffällig an den in dieser Veröffentlichung gezeigten Fluoreszenzaufnahmen von Versuchsergebnissen ist darüber hinaus, dass die Messpunkte in der Größe stark variieren und z.T. sehr ungleichmäßig mit Testzellen besetzt sind. Nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung führt das in dieser Veröffentlichung beschriebene Verfahren wegen dieser Schwankungen aber zu einer Verfälschung der Messergebnisse, so dass die eingangs erwähnten funktionalen Tests nicht mit hinreichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden können.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art bereitzustellen, bei dem die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zwischen den Messergebnissen von Messpunkten in einem Array und in verschiedenen Arrays so groß ist, dass ein zuverlässiger Vergleich der Messergebnisse und die Erstellung einer zuverlässigen Abstufung der Messergebnisse möglich ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe einerseits gelöst durch ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können,
b) Erstellen einer Mischung aus den Testzellen und aus Referenzpartikeln, die das Vermögen haben, an die Fängermole- küle zu binden, und die von den Testzellen unterscheidbar sind,
c) Kontaktieren der Mischung aus Schritt b) mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen und Referenzpartikel binden können, und
d) Bestimmen des Verhältnisses von interessierenden gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln für zumindest einige der Messpunkte.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, dass die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Messergebnisse von der variierenden Größe der Messpunkte sowie der mangelnden Homogenität der immobilisierten Fängermoleküle abhängt, und dass es durch die Verwendung der Referenzpartikel möglich wird, die Einflüsse der unterschiedlichen Größen der Flächen der Messpunkte sowie andere Inhomogenitäten bspw. in der lokalen Konzentration der Fängermoleküle aus den Messergebnissen herauszurechnen. Die Erfinder gehen damit gerade nicht den sich aufgrund der Erkenntnisse der Erfinder eigentlich anbietenden Weg, die Variabilität durch aufwendigere Herstellungsverfahren zu minimieren, die zu einheitlicheren Flächen der Messpunkte sowie gleichmäßiger lokaler Konzentration der Fängermoleküle führen, sondern verwenden Referenzpartikel. Die Zahl der pro Messpunkt gebundenen Testzellen und damit das jeweilige Messsignal hängt bei den bekannten Verfahren nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung also mit anderen Worten nicht nur von den Bindungseigenschaften zwischen den Testzellen und den Fängermolekülen sondern auch von der Dichte der Fängermoleküle pro Messpunkt, von der Größe der Fläche der Messpunkte und von der Homogenität der Konzentration der Fängermoleküle ab.
Die vorhandene Variabilität in der Größe der Flächen der Messpunkten und die Inhomogenität der aufgebrachten Fängermoleküle ermöglicht es wegen der Referenzpartikel jetzt dennoch, eine Abstufung in der Bindung der Testzellen an die verschiedenen Fängermoleküle mit hinreichender Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu bestimmen.
Der Quotient aus dem Messsignal für die Testzellen und dem Messsignal für die Referenzpartikel an einem bestimmten Messpunkt kann als Maß für die Bindung der Testzellen an die Fängermoleküle dieses Messpunktes genommen werden. Das Messsignal für die Referenzpartikel ist nämlich sozusagen ein Maß für die Anzahl der Fängermoleküle in einem Messpunkt.
Unter "interessierenden gebundenen Testzellen" werden in diesem Zusammenhang einmal Testzellen verstanden, die sich aus der Suspension auf Messpunkten abgelagert haben und dort adhärie- ren. Das Verhältnis von gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln dient dann dazu, das Adhäsionsverhalten der Testzellen an unterschiedliche Fängermoleküle miteinander vergleichen zu können. Andererseits ist es auch möglich, die Apoptoserate oder die Viabilität von Testzellen zu untersuchen, die nach Adhäsion auf den Fängermolekülen unter Zugabe bestimmter Substanzen oder unter einer Behandlung bspw. durch Bestrahlung inkubiert werden. Nach der Inkubation werden dann die noch vitalen oder die absterbenden bzw. abgestorben Testzellen erfasst und für jeden Messpunkt mittels der Zahl der gebundenen Referenzpartikel normiert, so dass z.B. der Einfluss unterschiedlicher Fängermoleküle auf die Apoptoserate ermittelt werden kann.
Außer der Adhäsion oder der Apoptoserate können auf diese Weise im Rahmen funktioneller Tests auch andere Eigenschaften der Testzellen oder Veränderungen dieser Eigenschaften untersucht werden. Wichtig ist dabei, dass die Anzahl der "interessierenden" Testzellen auf einem Messpunkt durch die Anzahl der ebenfalls gebundene Referenzzellen sozusagen normiert wird und damit mit der Anzahl der interessierenden Testzellen auf anderen Messpunkten vergleichbar ist. Die interessierenden Testzellen sind bspw. im Rahmen von Adhäsionsuntersuchengen alle gebundenen Testzellen, im Rahmen anderer funktioneller Tests die Apoptoserate, die Viabilität, das Vermögen, an Antikörper zu binden, Signale auszutauschen etc.
Als Referenzpartikel können dabei künstliche Kugeln (beads), bspw. Latexkugeln verwendet werden, die Oberflächenmoleküle tragen, die eine vergleichbare Bindung an die Fängermoleküle ermöglichen wie die Oberflächenmoleküle der Testzellen. Diese Kugeln lassen sich preiswert und einfach herstellen und können für lange Zeit gelagert werden; sie sind aus anderen Anwendungen im Stand der Technik bekannt und haben eine Größe, die der der Testzellen entsprechen kann. Ein weiterer Vorteil der Ku- geln besteht darin, dass ihr Bindungsverhalten an die Fängermoleküle nicht durch nachträglich zugegebene Substanzen oder bspw. radioaktive oder UV-Bestrahlung beeinflusst wird, so dass nach dem Mischen und ggf. Immobilisieren von Testzellen und Kugeln der Einfluss dieser Maßnahme auf die Testzellen und bspw. deren Bindung oder Apoptoserate verfolgt werden kann, ohne dass die Bindung der Kugeln dadurch beeinflusst wird, so dass die Referenz erhalten bleibt. •
Andererseits ist es auch möglich, als Referenzpartikel biologische Referenzzellen zu nehmen, die messtechnisch, vorzugsweise optisch von den Testzellen unterscheidbar sind, aber wie die Testzellen an Fängermoleküle binden. Die Referenzzellen können dabei unbehandelte Testzellen sein, die messtechnisch von den zu untersuchenden und vor dem Mischen behandelten Testzellen unterscheidbar sind.
Es ist aber auch vorgesehen, dass sowohl künstliche Kugeln als auch biologische Referenzzellen in den Referenzpartikeln vorhanden sind. Dies ermöglicht es, mehrere Parameter über sozusagen interne Referenzen zu korrigieren.
Vorzugsweise werden die Testzellen und die Referenzpartikel im Verhältnis 1:1 miteinander gemischt, so dass sie mit gleicher. Wahrscheinlichkeit auf die Fängermoleküle treffen.
In einem Ausführungsbeispiel sind die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch, vorzugsweise optisch unterscheidbar, dass die Testzellen mit einem anderen Marker, vorzugsweise einem Fluoreszenzmarker oder einem genetischen Marker markiert sind als die Referenzpartikel. Hier ist von Vorteil, dass das Array mit zwei verschiedenen Anregungswellen und/oder Emissionsfiltern ausgelesen werden kann, wobei nacheinander oder zeitgleich ortsaufgelöste optische Signale erfasst werden, aus denen das Verhältnis von interessierenden Testzelle zu Referenzpartikel dann berechnet werden kann .
Es ist auch möglich, die Testzellen mit einem genetischen Marker wie bspw. einem Reportergen wie GFP (green fluorescent protein) zu markieren. Wenn die Referenzpartikel Referenzzellen sind, können auch die Referenzzellen statt der oder unterschiedlich zu den Testzellen genetisch markiert sein.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel sind die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch unterscheidbar, dass die Testzellen mit einem anderen radioaktiven Marker versehen sind als die Referenzpartikel.
Es ist auch vorgesehen, sowohl radioaktive als auch optische Markierungen zusammen, also Testzellen und Referenzzellen radioaktiv und optisch zu markieren, oder gemischt zu verwenden, also bspw. die Testzellen optisch und die Referenzpartikel radioaktiv zu markieren.
Die Referenzzellen sind vorzugsweise genetisch derart von den Testzellen verschieden, dass sie auf Substanzen und/oder Bestrahlungen, deren Wirkung auf die Testzellen untersucht werden soll, nicht oder bekannt anders reagieren. Hier ist von Vorteil, dass nach dem Mischen der Test- und Referenzzellen diese Mischung in der angegebenen Weise behandelt werden kann, ohne dass die Bindung an die Fängermoleküle oder sonstigen im Rahmen der funktionellen Tests untersuchte Eigenschaften der Referenzzellen mit beeinträchtigt werden. Mit anderen Worten, während die Bestrahlung bspw. dazu führen kann, dass ein bestimmter Prozentsatz der Testzellen abgetötet wird oder seine Bindungseigenschaften an die Fangermolekule so verändert, dass er schlechter oder besser an die Fängermoleküle bindet, bleibt die Bindung der Referenzzellen an die Fängermoleküle unverändert und ist damit ein Maß für die Anzahl der Fängermoleküle je Messpunkt.
Es ist andererseits auch möglich, eine Mischung aus Testzellen und Referenzzellen auf zwei Arrays aufzuteilen und nur das eine Array nach oder während der Inkubation zu bestrahlen oder mit einer Testsubstanz in Kontakt zu bringen. Das unbehandelte Array dient dann als Referenz für die Wirkung auf Testzellen und auf Referenzzellen.
Dabei ist es auch möglich, die Referenzzellen unbehandelt zu lassen und erst nach der Behandlung der Testzellen mit diesen zu mischen.
Es können auch zwei oder mehr Arten von Referenzpartikel mit den Testzellen gemischt werden, wobei die verschiedenen Arten von Referenzpartikeln voneinander und von den Testzellen unterscheidbar sind, z.B. durch drei verschiedene "Farben". So ist es möglich, als erste Art von Referenzpartikeln sog. "beads" zu verwenden, die durch die Behandlung nicht beeinflusst werden und als Referenz zwischen verschiedenen Arrays dienen, und als zweite Art von Referenzpartikeln Referenzzellen zu verwenden, die dazu dienen, die Variation innerhalb eines Arrays herauszurechnen.
Alternativ oder zusätzlich kann auf jedem Array ein Referenz- Messpunkt vorgesehen sein, an den nur Referenzpartikel binden. Dies kann als Referenz zwischen verschiedenen Arrays verwendet werden, wobei der Referenzmesspunkt von den anderen Messpunkten isoliert ist, so dass auf ihn nur Referenzpartikel aufgetragen werden.
Erfindungsgemäß wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe andererseits gelöst durch ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Test ellen binden können, wobei ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind,
b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können,
c) ortsaufgelöstes Erfassen von die Anzahl der interessierenden Testzellen an den Messflächen repräsentierenden Messdaten , d) Errechnen eines Messwertes für zumindest einen Messpunkt aus den Messdaten der ihm zugeordneten Messflächen.
Auch diese Weise wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe vollkommen löst.
Die Erfinder der Vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, dass die ungleichmäßige Ablagerung von Testzellen auf den Messpunkten, wie sie aus der Veröffentlichung von Belov et al., a.a.O., ersichtlich ist, nicht ausschließlich auf die Inhomogenität der Messpunkte sonder auch darauf zurückzuführen ist, dass die Testzellen in der Suspension nicht homogen verteilt sind, sondern sich an bestimmten Stellen auf dem Array bevorzugt ablagern. Dies führt aber dazu, dass die lokale Anzahl der Testzellen auf dem Array nicht überall gleich ist. Mit anderen Worten kann sich also bspw. trotz einer starken Bindung zwischen Testzellen und Fängermolekülen für einen bestimmten Messpunkt ein schwächeres Messsignal ergeben als für einen Messpunkt, an dem die Bindung schwächer ist, weil an dem ersten Messpunkt die lokale Konzentration der Testzellen geringer ist als an dem zweiten Messpunkt.
Durch die Verteilung eines (logischen) Messpunktes auf mehrere Messflächen an verschiedenen Stellen im Array wird nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung die statistische Wahrscheinlichkeit der Anhaftung für verschiedene Messpunkte, also über die zugeordneten Messflächen gemittelt, jedoch gleich hoch. Wenn die einzelnen Messflächen dabei so klein werden, dass nicht mehr im statistischen Sinne ausreichend viele Testzellen binden können, um ein verlässliches Messsignal zu erzeugen, so können auch hier die oben ausführlich diskutierten Referenzpartikel und Maßnahmen eingesetzt werden, was zu einem synergistischen Effekt führt.
Im Idealfall werden bezogen ' auf die Zahl der Testzellen in der Suspension so große Flächen für einen Messpunkt realisiert, dass zumindest mehr als 50%, im Idealfall nahezu 100% der Testzellen aus dem Überstand auf den Messpunkten binden können. Hierzu ist erfindungsgemäß ein bestimmtes Verhältnis zwischen der Fläche (F) eines Messpunktes und der Anzahl (N) der Testzellen in der Suspension erforderlich, das von der Haftfläche (H) der jeweiligen Zellen abhängt und wie folgt gewählt ist:
F ≥ a x N x H ; a = 0 .5 , vorzugsweise ca . 1 . 0
Unter Haftfläche wird hier die Größe der Fläche verstanden, mit der sich eine Zelle auf das Substrat auflegt. Bei Bakterien sind dies typischer Weise H = 1 μm2 und bei tierischen Zellen H > 100 μm2. Auf einer Messfläche von F = 800 μm2 können sich damit ca. 800 Bakterien oder 8 tierische Zellen ablagern, so dass in diesem Fall (F = 800 μm2) in der auf das Array aufgegebenen Suspension höchstens N = 800 Bakterien oder N = 8 tierische Zellen enthalten sein sollten.
Um ein höheres Messsignal zu erhalten, wird erfindungsgemäß entweder die Fläche F eines Messpunktes größer gewählt oder mehrere Messflächen werden zu einem logischen Messpunkt mit einer Gesamtfläche F zusammengefasst . Unter diesen Bedingungen können nahezu alle Testzellen aus dem Überstanden binden ohne sich gegenseitig zu beeinträchtigen. Auch diese Wahl des Verhältnisses zwischen Anzahl und die Haftfläche bestimmender Art der Testzellen und Größe der Fläche eines Messpunktes ist für sich genommen neu und erfinderisch und führt zusammen mit einer oder beiden der oben genannten Maßnahmen, nämlich den Referenzpartikeln und/oder den verteilten Messflächen zu einem synergistischen Effekt. Bei der Verwendung von Referenzpartikeln ist das obige Verhältnis auf die Summe der in der Suspension vorhandenen Testzellen und Referenzpartikel wie folgt anzuwenden:
F > a x (NT x HT + NR x HR)
wobei NT und HT die Anzahl und die Haftfläche der Testzellen sowie NR und HR die Anzahl und Haftfläche der Referenzpartikel bezeichnen und a ein Faktor von 0.5, vorzugsweise ca. 1.0 ist.
Für ein gegebenes Array mit bekannten Flächen der Messpunkte muss also nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Menge von Testzellen und ggf. Referenzpartikeln in der auf das Array zu gebenden Suspension/Mischung so gewählt werden, dass das obige Verhältnis eingehalten wird, um zu einer Situation zu gelangen, bei der nahezu alle Testzellen/Referenzpartikel an einen Messpunkt binden können, so dass eine Kompe- tition zwischen den Messpunkten um die Zellen besteht. Dadurch sind quantitative Auswertungen möglich, die bei höherer Anzahl von Testzellen verfälscht würden. Dieses Verhältnis ist z.B. vorteilhaft, wenn wenige Zellen zur Verfügung stehen, wie bei Tumorbiopsien, oder wenn das "homing" von Stammzellen untersucht werden soll. Nur in den erfindungsgemäß verwendeten niedrigen Anzahlen der Testzellen lässt sich eine Präferenz der Testzellen für bestimmte Fängermoleküle quantitativ ermitteln. Dies gilt auch, wenn bei gemischten Zellpopulationen eine Subpopulation getrennt untersucht werden soll.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass bei größeren Mengen von Testzellen diese auch auf Substrate binden, für die sie keine ausgewiesene Präferenz haben.
Allgemein ist es noch bevorzugt, wenn das Array nach dem Kontaktieren mit der Suspension/Mischung, also während der Inkubation mit den Testzellen und ggf. den Referenzpartikeln bewegt wird, bspw. auf einem Rüttler oder einer Wiege oder mittels einer Pumpe bspw. über mikrofluidischen Durchfluß, um die lokalen Konzentrationsunterschiede bei den Testzellen und ggf. Referenzpartikeln zu verringern. Durch das Bewegen werden ferner immer wieder neue Testzellen oder Referenzpartikel zu den Messpunkten geführt, so dass eine größere Anzahl von ihnen die Chance erhält, an Fängermoleküle zu binden. Im Gegensatz zu Proteinarrays, wo das Massenwirkungsgesetz gilt und dieses Rütteln nur begrenzt Vorteile bringen würde, erhöht das Rütteln die Zahl der gebundenen Testzellen und ggf. Referenzpartikel erstaunlicher Weise erheblich, wie die Erfinder der vorliegenden Anmeldung zeigen konnten. Vor diesem Hintergrund ist bei einem eingangs genannten Verfahren auch diese Maßnahme für sich genommen neu und erfinderisch, sie wird jedoch bevorzugt zusammen mit einer oder mehreren der oben genannten Maßnahmen angewendet.
Insgesamt ist es möglich, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, wie es in den eingangs erwähnten WO 00/39580 und WO 02/02226 der Fall ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind und in der üblichen Weise z.B. durch Farbmarkierungen voneinander unterschieden werden können. Ein Messpunkt entspricht dann entweder einer Kugel oder mehreren Kugeln, die jeweils im obigen Sinne eine Messfläche darstellen.
Wenn Kugeln (beads) als Array verwendet werden, werden sie im einfachsten Fall in die Lösung/Mischung gegeben und unter leichter Agitation bspw. auf einem Rüttler inkubiert.
Die Testzellen werden in bestimmten Anwendungen vor oder nach dem Kontaktieren mit dem Array einer Behandlung unterzogen werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe: Bestrahlen mit energiereicher Strahlung, bspw. UV-Licht oder radioaktive Strahlung, Kontaktieren mit Testsubstanzen wie bspw. pharmazeutischen Wirkstoffen, anderen Zellen, Chemotherapeutika, Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Antikörper, Lektine und andere Biopolymere.
An den Messpunkten sind unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antige- ne, Allergene.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit mit einem Array aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen Fängermoleküle immobilisiert sind, an die Testzellen binden können, und mit Referenzpartikeln, die an die Fängermoleküle binden.
Die Referenzpartikel sind dabei vorzugsweise die oben näher beschriebenen Referenzpartikel, wobei weiter vorzugsweise an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene, Nukleinsäuren, Nukleotide.
Das Array ist dabei entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht oder es ist ein logisches Array aus einzelnen Kugeln, die mit Fängermolekülen beladen sind, wobei weiter vorzugsweise zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung sowie aus den beigefügten Figuren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegeben Kombination sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein schematisches Beispiel für ein auf einer Trägerplatte angeordnetes Array aus Messpunkten, wobei die Messpunkte auf verschiedene Messflächen verteilt sind;
Fig. 2 eine schematische Seitenansicht der Trägerplatte aus Fig. 1;
Fig. 3 Aufnahmen von an einen Messpunkt des Arrays aus Fig. 1 gebundenen Testzellen und Referenzzellen, wobei A) die Hellfeldaufnahme für Testzellen und Referenzzellen, B) eine Fluoreszenzaufnahme für die Testzellen und die Referenzzellen, C) eine Fluoreszenzaufnahme für die Testzellen und D) eine Fluoreszenzaufnahme für die Referenzzellen ist;
Fig. 4 verschiedene Fluoreszenzaufnahmen, die die Bindung von Testzellen an verschiedene Messpunkte zeigt, die bei der Inkubation nicht bewegt (A, C und E) und bewegt (B, D und F) wurden;
Fig. 5 ein Diagramm, das die Bindung von Testzellen an verschiedene Fängermoleküle in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl in der aufgebrachten Suspension zeigt; und
Fig. 6 ein Diagramm, das die Besiedlung einer Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl in der aufgebrachten Suspension mit und ohne Bewegung zeigt.
Beispiel I: Trägerplatte mit einem Array aus Messpunkten
In Fig. 1 ist mit 10 eine rechteckige Trägerplatte aus Glas oder Kunststoff bezeichnet, auf der hier beispielhaft einige Messflächen 11 in einem Array angeordnet sind, an denen in Fig. 1 nicht dargestellte biologische Zellen — im folgenden: Testzellen — oder Referenzpartikel binden können. Zwischen den Messflächen 11 sind Bereiche 12 der Trägerplatte 10 vorgesehen, an die Testzellen und Referenzpartikel nicht binden können.
Die Messflächen haben einen Durchmesser von 500 μm und einen Randabstand von 250 μm, so dass sich ein Mittenabstand von 750 μm ergibt. Auf diese Weise sind auf einer Trägerplatte 10 mit einer Kantenlänge von 6 mm x 9 mm 96 Messflächen 11 unterzubringen.
Wie in der prinzipiellen Seitenansicht der Fig. 2 zu sehen ist, kann die Trägerplatte als Bodenplatte eines Zellkulturgefäßes ausgebildet sein. Die Trägerplatte 10 trägt auf dem Abschnitt 17 eine funktionalisierte Oberfläche 18, an der in den Messpunkten 11 Fängermoleküle 19, 21 ,22 immobilisiert sind. Die Fängermoleküle 19, 21, 22 unterscheiden sich in der Regel von Messfläche 11 zu Messfläche 11, wobei verschiedene Messflächen 11 zu einem logischen Messpunkt zusammengefasst werden können. Die Messflächen 11 eines logischen Messpunktes tragen identische Fängermoleküle 19, 21 oder 22 und sind statistisch über die Trägerplatte 10 verteilt.
An die Fangermolekule 19, 21 und 22 können Testzellen 23 binden, deren Bindungsverhalten an die Fängermoleküle 19, 21, 22 oder deren Reaktion auf eine Co-Stimulierung durch Fängermoleküle 19 und Testsubstanzen bzw. auf eine Behandlung wie bspw. eine Bestrahlung untersucht werden soll .
In den Bereichen 12 zwischen den Messflächen 11 ist die funktionalisierte Oberfläche 18 durch Moleküle 24 geblockt, so dass die Testzellen 23 nur im Bereich der Messflächen 11 gebunden werden können.
In Fig. 2 ist bei 25 ein Referenzpartikel angedeutet, der an die Fängermoleküle 22 bindet. Als Referenzpartikel 25 kommen Biologische Zellen oder aber Kunststoff-Kugeln in Betracht, die auf ihrer Oberfläche Moleküle tragen, mit denen sie an die Fängermoleküle 19, 21, 22 binden. Die Referenzpartikel 25 sind als interne Referenz vorgesehen, um Schwankungen in der Größe der Messflächen 11 oder der Anzahl der Fängermoleküle in der Messfläche sowohl innerhalb eines Array als auch zwischen verschiedenen Arrays herausrechnen zu können.
Wie eine derartige Trägerplatte 10 mit Messflächen 11 hergestellt werden kann, ist im Beispiel 1 der oben genannten WO 02/02226 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Beispiel II: Inkubieren einer Mischung aus Testzellen und Referenzzellen auf einem Array mit Messpunkten, die auf verschiedene Messflächen verteilt sind
Test- und Referenzzellen werden für diesen Versuch mit verschiedene Membranfarbstoffen markiert.
Als Testzellen dienen hu AO SMC bzw. GLZ, die mit dem Vibrant Dil Red Fluorescent Cell Linker Kit (V22885Y MoBiTec) nach den Vorschriften des Herstellers markiert werden.
Als Referenzzellen dienen PC12, die mit dem Vibrant DiO Green Fluorescent Cell Linker Kit (V22886Y MoBiTec) nach den Vorschriften des Herstellers markiert werden.
Zur Darstellung von Test- und Referenzzellen in einer Aufnahme wurden beide Zellarten mit der Vibrant Cell Labeling Solution DAPI blau gefärbt.
In den Messflächen wurden als Fängermoleküle verschiedene Matrixproteine immobilisiert.
Die Test- und Referenzzellen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, die Mischung auf die Trägerplatte mit dem Array gegeben, und die Trägerplatte dann für 4 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert . In Fig. 3 ist beispielhaft für einen Messpunkt mit Laminin aus der humanen Plazenta als Fängermolekül gezeigt, dass sich sowohl Testzellen (GLZ) als auch Referenzzellen (PC 12) an den Messpunkt binden, die Referenzzellen jedoch in deutlich geringerer Anzahl als die Testzellen. Es ist zu erkennen, dass der Messpunkt gleichmäßig mit Fängermolekülen besetzt ist.
Fig. 3A zeigt eine Hellfeldaύfnähme für beide Zellärt, Fig. 3B eine Fluoreszenzaufnahme des Messpunktes mit einem Blaufilter für Test- und Referenzzellen nach DAPI-Färbung , Fig.3C eine Fluoreszenzaufnahme mit einem für die Emission der Testzellen durchlässigen Rotfilter, und Fig. 3D eine entsprechende Aufnahme mit einem für die Emission der Referenzzellen durchlässigen Grünfilter.
In der nachstehenden Tabelle ist beispielhaft für einige Messpunkte jeweils mit Laminin (human placenta) als Fängermolekül für eine Mischsuspension von Test- und Referenzzellen die Gesamtzahl und der Prozentsatz der jeweils gebundenen Zellen angegeben, wobei für PC12 mit GLZ jeweils 100 000 Zellen von jeder Art auf ein Array gegeben wurden und für PC12 mit hu AO SMC jeweils von jedem Typ 35 000 Zellen.
Besiedelung von Laminin Meßflächen durch Testzellen (Gliomzell- linie GLZ) und Referenzzellen (neuronale Zelllinie PC12)
Besiedelung von Laminin Meßflächen durch Testzellen (Glatte Muskelzellen huAO SMC) und Referenzzellen (neuronale Zelllinie PC12)
Tabelle: Adhäsion von Test — und Referenzzellen; angegeben ist die Anzahl der pro Meßpunkt gebundenen Zellen sowie der jeweilige relative Anteil an der besiedelten Fläche Obwohl zwischen einzelnen Messpunkten extreme Abweichungen in der Anzahl der gebundenen Zellen besteht, ist der Prozentsatz der gebundenen Testzellen im Rahmen der für biologische Messungen üblichen Schwankungsbreite etwa konstant. Während bspw. am Messpunkt 1 nur 53 und am Messpunkt 4 sogar 569 Zellen insgesamt gebundene haben, waren jeweils 64% bzw. 75% der gebundenen Zellen Testzellen (GLZ). Auch für die Messpunkte 2 und 3 lag das Verhältnis mit 70% bzw. 75% in diesem Bereich.
Dieses konstante Verhältnis wird zwar dadurch verändert, dass PC 12 im Vergleich mit GLZ schlechter an die Fängermoleküle bindet als im Vergleich mit hu AO SMC, es bleibt jedoch auch hier mit 9% bis 17% hinreichend konstant.
Mit anderen Worten, das Verhältnis zwischen den beiden jeweiligen Zelltypen ist bei Einhaltung des Verhältnisses F > N x H unabhängig von der Zellzahl pro Messfläche und unabhängig davon, ob die beiden Zellarten um ein Fängermolekül konkurrieren, etwa konstant. Damit ist es möglich, durch Verwendung von Referenzzellen die Variation zwischen Messpunkten herauszurechnen.
Der Prozentsatz oder auch das Verhältnis zwischen gebundenen Test- und Referenzzellen ist damit ein verlässlicheres Maß für die Bindung der Testzellen an den einzelnen Messpunkten als die absolute Zahl der gebundenen Testzellen.
Beispiel III: Inkubation mit und ohne Rütteln
Testzellen (PC 12) wurden in einer Konzentration von 0,5 bis 50 x 10s Zellen/ml auf Messflächen der Fläche 280 000 μm2 mit verschiedenen Fängermolekülen, nämlich Collagen I, Collagen II und Collagen III, für jeweils 4 h inkubiert, wobei die Trägerplatten während der Inkubation in einem Fall gerüttelt und im anderen Fall in Ruhe stehen gelassen wurden. Zum Rütteln wurde die Trägerplatte in Intervallen von 10 min zur Durchmischung der Zellsuspension über den Arrays manuell bewegt.
In Fig. 4 zeigt die obere Zeile die Bindung an Collagen I, die mittlere die Bindung an Collagen II und die untere die Bindung an Collagen III. Links ist bei A, C, und E jeweils die Inkubation ohne und rechts bei^B, D und E die Inkubation mit Rütteln gezeigt.
Aus den Aufnahmen ist zu erkennen, dass das Rütteln zu einer deutlich erhöhten und auch deutlich gleichmäßigeren Bindung der Testzellen an die Fängermoleküle führt.
Fig. 5 zeigt die Zellzahl pro Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl und die Bindung der Testzellen an die drei in der Fig. 5 genannten Fängermoleküle.
Fig. 6 zeigt die Zellzahl pro Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl und die Bindung an das Substrat Laminin sowie den Einfluss der Substratbewegung.
Es ist zu erkennen, dass durch das Rütteln dafür gesorgt wird, dass eine Messfläche maximal mit Zellen besiedelt wird. Eine "Sättigung" der Messflächen tritt schon bei einer Konzentration von 20 x 105 Zellen/ml ein, was daran zu erkennen ist, dass ab dieser Konzentration die Zahl der gebundenen Zellen quasi nicht weiter zunimmt . Weiter ist in den linken Ästen der Kurven zu erkennen, dass bei niedrigen Konzentrationen, also bei geringerer Anzahl von Zellen pro Messpunkt quasi keine Bindung an Thrombospondin erfolgt, sondern dass nahezu alle Zellen an Laminin oder Kollagen I binden. Dies ist so auch zu erwarten, denn PC12 bindet erheblich schwächer an Thrombospondin als an die anderen Fängermoleküle. Erst durch eine hohe Anzahl von Zellen im Überstand wird die Wirkung der Kompetition abgeschwächt und die Zellen' binden auch an Thrombospondin.
Beispiel IV: Bestimmung der Sensitivität von Zellen in ihrer natürlichen Mikroumgebung
Ein Beispiel dafür, wie das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden kann, ist die Untersuchung, wie Tumor- und Normalgewebe in Abhängigkeit von ihrer natürlichen Mikroumgebung auf Bestrahlung oder die Zugabe von toxischen Substanzen reagieren. Es ist bekannt, dass Zellen, deren Strahlensensitivität in einer Zellkultur ohne Zugabe von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) getestet wird, strahlensensitiver sind als Parallelkulturen, die auf ECM kultiviert wurden. Dies bedeutet, dass der Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix für die zellspezifische Reaktivität sowohl von Tumor- als auch von Normalgewebe eine entscheidende Bedeutung zukommt. Ferner lässt sich weiter die Kombinationswirkung von Strahlen- und Chemotherapie in der natürlichen Mikroumgebung optimieren.
Diese Versuche werden durchgeführt, indem die ECM als Fängermoleküle eingesetzt werden. Die Testzellen werden in Mischsuspension mit Referenzzellen auf ein Array aus verschiedenen Fängermolekülen gegeben und die Anzahl der gebundene Testzellen sowie der gebundenen Referenzzellen bestimmt und daraus die normierte Anzahl der Testzellen pro Messpunkt berechnet. Die Testzellen werden dann mit Staurospondin behandelt und inkubiert. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Anzahl der abgestorbenen Testzellen pro Messpunkt bestimmt und aus dieser Anzahl sowie der vor der Inkubation bestimmten normierten Anzahl die Apoptoserate ermittelt .
Versuche mit Staurosporin-induzierter Apoptose bei PC12-Zellen zeigten, dass diese Zellen durch Kollagen IV und Laminin, also ihre natürlichen Substrate, deutlich besser vor den schädigenden Wirkungen des Staurosporin geschützt werden als durch PLL (Poly L Lysin), das wahrscheinlich keine schützende Wirkung besitzt. Die Apoptoserate von Testzellen auf Lamin war nach Staurospondin-Behandlung um einen Faktor 4 erhöht während Testzellen, die auf PLL wuchsen, eine Erhöhung um einen Faktor 15 aufwiesen. Dieser Unterschied war nur durch die Verwendung der Referenzzellen zu bestimmen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle, immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können,
b) Erstellen einer Mischung aus den Testzellen und aus Referenzpartikeln, die das Vermögen haben, an die Fängermoleküle zu binden, und die von den Testzellen unterscheidbar sind,
c) Kontaktieren der Mischung aus Schritt b) mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen und Referenzpartikel binden können, und
d) Bestimmen des Verhältnisses von interessierenden gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln für zumindest einige der Messpunkte.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt b) Testzellen und Referenzpartikel im Verhältnis 1:1 gemischt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel künstliche Kugeln (beads), bspw. Latexkugeln umfassen, die Oberflächenmoleküle tragen, die eine vergleichbare Bindung an die Fängermoleküle ermöglichen wie die Oberflächenmoleküle der Testzellen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel biologische Referenzzellen umfassen, die messtechnisch, vorzugsweise optisch von den Testzellen unterscheidbar sind, aber wie die Testzellen an Fängermoleküle binden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, .dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzzellen vorzugsweise genetisch derart von den Testzellen verschieden sind, dass sie auf Substanzen und/oder Bestrahlungen, deren Wirkung auf die Testzellen untersucht werden soll, nicht oder bekannt anders reagieren als die Testzellen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch optisch unterscheidbar sind, dass die Testzellen mit einem anderen Marker, vorzugsweise einem Fluoreszenzmarker oder einem genetischen Marker markiert sind als die Referenzpartikel.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch unterscheidbar sind, dass die Testzellen mit einem anderen radioaktiven Marker versehen sind als die Referenzpartikel.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für den zumindest einen Messpunkt jeweils ein Messwert für die Testzellen und die Referenzpartikel aus Messwerten berechnet wird, die für die zugeordneten Messflächen bestimmt werden.
10. .Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Fläche F eines Messpunktes und der Anzahl NT der Testzellen und der Anzahl NR Referenzpartikel in der Mischung ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche HT der Testzellen und der Haftfläche HR der Referenzpartikel abhängt und wie folgt gewählt ist:
F > a x (NT x HT + NR x HR), a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0
11. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, wobei zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind,
b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, c) ortsaufgelöstes Erfassen von die Anzahl der interessierenden Testzellen an den Messflächen repräsentierenden Messdaten,
d) Errechnen eines Messwertes für zumindest einen Messpunkt aus den Messdaten der ihm zugeordneten Messflächen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen F, der Summe der Messflächen eines Messpunkte und N, der Anzahl der Testzellen in der Suspension ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche H der Testzellen abhängt und wie folgt gewählt ist:
F ≥ a xN x H, a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0.
13. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, und
b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, wobei zwischen der Fläche F eines Messpunktes und der Anzahl N der Testzellen in der Suspension ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche H der Testzellen abhängt und wie folgt gewählt ist: F ≥ a x N x H, a = 0 .5 , vorzugsweise ca . 1 . 0 .
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Array nach dem Kontaktieren mit den Testzellen und ggf. den Referenzpartikeln bewegt wird, bspw. auf einem Rüttler oder einer Wiege.
15. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzeilen, mit den Schritten:
a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, und
b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, und
c) Inkubieren des Arrays mit der Suspension, wobei das Array bewegt wird, vorzugsweise auf einem Rüttler o- der auf einer Wiege.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen vor oder nach dem Kontaktieren mit dem Array einer Behandlung unterzogen werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe: Bestrahlen mit e- nergiereicher Strahlung, bspw. UV-Licht oder radioaktive Strahlung, Kontaktieren mit Testsubstanzen wie bspw. pharmazeutischen Wirkstoffen, anderen Zellen, Chemotherapeuti- ka, Komponenten extrazellulärer Mätrixproteine, Antikörper, Lektine oder andere Biopolymere.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene.
19. Kit mit einem Array aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen Fängermoleküle immobilisiert sind, an die Testzellen binden können, und mit Referenzpartikeln, die an die Fängermoleküle binden.
20. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel die Referenzpartikel aus einem der Ansprüche 3 bis 7 sind.
21. Kit nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Mat- rixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene.
22. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind.
23. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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