DE102022100146A1

DE102022100146A1 - Verfahren zur analyse von personalisierten anti-krebs-wirkstoffen in zellkulturen

Info

Publication number: DE102022100146A1
Application number: DE102022100146.6A
Authority: DE
Inventors: Jens Kelm; Peter Steiner; Olivier Mauti
Original assignee: Precomb Therapeutics AG
Current assignee: Precomb Therapeutics AG
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-07-06
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: WO2023131571A1; DE102022100146B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren und Systeme zum Analysieren physiologischer Wirkungen als Reaktion von Zellen wie erhalten, wenn sie einer Wirkstoffverbindung oder Kombinationen davon ausgesetzt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten den besonderen Vorteil, relevantere Ergebnisse in Bezug auf die in-vivo-Situation bereitzustellen, sind zeit- und kosteneffektiv und zur Automatisierung geeignet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren und Systeme zum Analysieren physiologischer Wirkungen als Reaktion von Zellen wie erhalten, wenn sie einer Wirkstoffverbindung oder Kombinationen davon ausgesetzt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten den besonderen Vorteil, relevantere Ergebnisse in Bezug auf die in-vivo-Situation bereitzustellen, sind zeit- und kosteneffektiv und zur Automatisierung geeignet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Wirkstoffe, die sich für therapeutische Zwecke in der Entwicklung befinden, werden im Allgemeinen in einem herkömmlichen Screening-System auf ihre Wirksamkeit gescreent, wobei Wirkstoffe aus einer Bibliothek in einem geeigneten zellbasierten Assay getestet werden. Üblicherweise werden die Lebensfähigkeit der Zellen und/oder die Zytotoxizität des Kandidatenwirkstoffe untersucht. Dieser Ansatz wird oft in einem sogenannten Hochdurchsatz durchgeführt, aber es besteht immer noch ein hohes Risiko, dass Wirkstoffe, die in einem solchen Ansatz als vielversprechend identifiziert wurden, später in den nachfolgenden klinischen Tests enttäuschen. Herkömmlicherweise werden Wirkstoffe von Ärzten empirisch kombiniert und an Patienten getestet.
Trotz aller Bemühungen scheitern 97 % aller Krebsmedikamente, die in klinische Phase-I-Studien eintreten, und können nicht auf den Markt gebracht werden, da vorklinische Arzneimitteltests keine genauen Ergebnisse liefern. Pharmaunternehmen geben 14 Milliarden US-Dollar für potenzielle neue Krebsmedikamente aus, die klinische Studien nicht überstehen.
Nach der oralen Verabreichung von Wirkstoffen erreicht die Plasmakonzentration im Prinzip zum Zeitpunkt T_max einen einzelnen, gut definierten Peak (C_max). Der Wert T ½ definiert die Halbwertszeit des Medikaments, also den Zeitpunkt, an dem die Hälfte des Medikaments aus dem System ausgeschieden ist (siehe 1). In einem zellulären Testsystem mit einer Vielzahl von zu testenden Verbindungen oder Wirkstoffen werden üblicherweise alle Wirkstoffe gleichzeitig auf die Zellen appliziert. Bei Tests in Zellkultur ist der Wirkstoff sofort in maximaler Konzentration verfügbar. Dies spiegelt zwar nicht die Situation in vivo wider, die Situation ist aber zumindest beherrschbar.
Bei Kulturen mit Zellschichten oder 3D-Gewebe- oder Mikrogewebekulturen ist die Situation komplexer. Zum Beispiel beschreiben Wang et al. (in: Wang Y, et al. Modeling Endothelialized Hepatic Tumor Microtissues for Drug Screening. Adv Sci (Weinh). 2020 Sep 21;7(21):2002002. doi: 10.1002/advs.202002002. PMID: 33173735; PMCID: PMC7610277) die Entwicklung eines endothelialisierten 3D-Lebertumor-Mikrogewebemodells, das auf der Fusion von multizellulären Aggregaten menschlicher hepatozellulärer Karzinomzellen und menschlicher Nabelvenen-Endothelzellen basiert, die in porösen Mikrosphären auf Poly(milchco-glykolsäure)-Basis (PLGA-PMs) kokultiviert werden).Im Gegensatz zur konventionellen 2D-Kultur weisen die Zellen innerhalb der PLGA-PMs signifikant höhere Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration gegen Krebsmedikamente, einschließlich Doxorubicin und Cisplatin, auf. Darüber hinaus wurde die Machbarkeit der Co-Kultivierung anderer Zelltypen wie Fibroblasten (L929) und HepG2-Zellen untersucht.
WO 2020/242594A1 beschreibt Verfahren und Vorrichtungen, die vom Patienten stammende Mikroorganosphären (PMOS) formen und züchten, die Zellen enthalten, die von einem Patienten stammen, zum Beispiel aus einer kleinen Patientenbiopsie extrahiert (z. B. für eine schnelle Diagnose zur Therapieführung), aus reseziertem Patientengewebe, einschließlich reseziertem Primärtumor oder Teil eines funktionsgestörten Organs (z. B. für Hochdurchsatz-Screening) und/oder aus bereits etablierten PDMCs, einschließlich von Patienten stammenden Xenotransplantaten (PDX) und Organoiden (z. B. zur Erzeugung von Mikroorganosphären für Hochdurchsatz-Screening), einschließlich personalisierter Therapien. Das Verfahren umfasst das Kombinieren einer dissoziierten Gewebeprobe und eines flüssigen Matrixmaterials, um eine unpolymerisierte Mischung zu bilden; Bilden einer Vielzahl von Tröpfchen der unpolymerisierten Mischung; und Polymerisieren der Tröpfchen, um mehrere von Patienten stammende Mikroorganosphären zu bilden, die jeweils einen Durchmesser zwischen 50 und 500 um, mit zwischen 1 und 200 darin verteilten dissoziierten Zellen, aufweisen.
Kulturen mit Zellschichten oder 3D-Gewebe- oder Mikrogewebekulturen werden üblicherweise verwendet, um die Situation in einem Gewebe in vivo so gut wie möglich nachzuahmen. Nichtsdestotrotz beinhaltet eine Zunahme der physiologischen Relevanz von parallelen in-vitro-Tests mehrerer Wirkstoffe die Herausforderung, sich an die pharmakokinetischen Eigenschaften jedes Wirkstoffs anzupassen, um die Vorhersage des Wirkstoff-Ansprechens weiter zu verbessern. Je mehr Wirkstoffe parallel getestet werden, desto höher ist zudem die Komplexität der individuellen Wirkstoff-Expositionszeit.
Dies bedeutet, dass die Vorhersagbarkeit von Mikrogewebeexperimenten im Frühstadium im Hinblick auf die zukünftige In-vivo-Situation verbessert werden muss, um das Risiko des Versagens von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen zu verringern, die sich in der Präklinik als vielversprechend erwiesen haben.
Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung, neue und verbesserte Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, um den Phänotyp und/oder Genotyp von Zellen zu analysieren, die aus Gewebeproben erhalten werden, wenn diese Zellen Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen ausgesetzt werden, insbesondere um patientenspezifische Behandlungsansätze zu rationalisieren und effektiver zu machen.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein verbessertes Screening von Wirkstoffen oder Kombinationen davon, insbesondere von patientenspezifischen Wirkstoffen oder Kombinationen davon, für therapeutische Zwecke. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Screenen von Wirkstoffen oder Kombinationen, die therapeutisch bei der Behandlung und/oder Vorbeugung und der Verlangsamung des Fortschreitens von Krankheiten, wie neoplastischem oder tumorösem Zellwachstum, bei einem Individuum, das dessen bedarf, verwendet werden können.
In einem ersten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe, indem sie ein Verfahren bereitstellt, insbesondere ein automatisiertes Verfahren, zur Bestimmung der Effektivität mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst a) Bereitstellen mindestens einer Kultur eines 3D-Mikrogewebes, wie beispielsweise eines Mikrotumors, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe, die von einem Patienten stammt, b) Bereitstellen eines zu testenden Wirkstoffes oder einer Kombination oder eines Panels von Wirkstoffen, c) Identifizieren der t½-Zeitspanne(n) für den Wirkstoff oder die Kombination oder das Panel von Wirkstoffen aus Schritt b), e) In Kontakt bringen der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die als die längste(n) t½ Zeitspanne(n) (T_L1) aufweisend identifiziert wurden, wobei das/die Ende(n) dieser Zeitspanne(n) den/die Zeitpunkt(e) für eine Entfernung R des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der zu testenden Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur definiert/definieren, f) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise einer Anordnung von Kulturen, mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, und gegebenenfalls Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, g) im Anschluss an e), Kontaktieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, von denen festgestellt wurde, dass sie (eine) kürzere t½-Zeitspanne(n) (T_L2) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder der Kombination aufweisen, oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, die in Schritt e) zum Zeitpunkt R minus T_L2 getestet werden sollen, h) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit den zu testenden Wirkstoffen oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen, j) Entfernen des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R, und k) Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter des mindestens einen Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen auf die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wie hierin, gegebenenfalls weiter umfassend mindestens eines von d) Vorauswahl oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen gemäß den t½-Zeiträumen, wie in Schritt c) identifiziert; i) Wiederholen der Schritte g) und h) mit mindestens einer Wirkstoff- oder Panelkombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die einen kürzeren t½-Wert oder kürzere t½-Werte (T_L3, T_L4, ...) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder Panel oder der Gruppe der zu testenden Wirkstoffe in den vorherigen Schritten zu den Zeitpunkten R minus T_L3, R minus T_L4 , .... aufweisen, und/oder 1) Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en), und gegebenenfalls ferner umfassend den Schritt des Auswählens des patientenspezifischen Wirkstoffes oder der Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Weiter bevorzugt ist daher ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst a) Bereitstellen mindestens einer Kultur eines 3D-Mikrogewebes, wie beispielsweise eines Mikrotumors, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe, die von einem Patienten stammt, b) Bereitstellen eines zu testenden Wirkstoffes oder einer Kombination oder eines Panels von Wirkstoffen, c) Identifizieren der t½-Zeitspanne(n) für den Wirkstoff oder die Kombination oder das Panel von Wirkstoffen aus Schritt b), d) Vorauswahl oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen gemäß den t½-Zeiträumen, wie in Schritt c) identifiziert, e) In Kontakt bringen der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die als die längste(n) t½ Zeitspanne(n) (T_L1) aufweisend identifiziert wurden, wobei das/die Ende(n) dieser Zeitspanne(n) den/die Zeitpunkt(e) für eine Entfernung R des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der zu testenden Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur definiert/definieren, f) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise einer Anordnung von Kulturen, mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, und gegebenenfalls Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, g) im Anschluss an e), Kontaktieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, von denen festgestellt wurde, dass sie (eine) kürzere t½-Zeitspanne(n) (T_L2) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder der Kombination aufweisen, oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, die in Schritt e) zum Zeitpunkt R minus T_L2 getestet werden sollen, h) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit den zu testenden Wirkstoffen oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen, i) Wiederholen der Schritte g) und h) mit mindestens einer Wirkstoff- oder Panelkombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die einen kürzeren t½-Wert oder kürzere t½-Werte (T_L3, T_L4, ...) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder Panel oder der Gruppe der zu testenden Wirkstoffe in den vorherigen Schritten zu den Zeitpunkten R minus T_L3, R minus T_L4, .... aufweisen, j) Entfernen des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R, und k) Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter des mindestens einen Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen auf die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur, und 1) Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en), und gegebenenfalls ferner umfassend den Schritt des Auswählens des patientenspezifischen Wirkstoffes oder der Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Weiter bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine Kultur eines 3D-Mikrogewebes mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen in der C_max-Konzentration in Kontakt gebracht wird.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung berücksichtigen den pharmakokinetischen Parameter eines Wirkstoffes oder einer Gruppe von Wirkstoffen oder Panel von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, d. h. die Unterschiede in der t_1/2, C_max oder T_max oder die AUC eines Wirkstoffes oder einer Gruppe von Wirkstoffen oder Panel von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, werden beim Screening nach wirksamen Wirkstoffkandidaten und Panels für einen Patienten berücksichtigt. Dies ist von besonderer Bedeutung bei Kombinationen von Wirkstoffen, die dann gemeinsam in einer Mikrogewebekultur auf ihr Verhalten und ihre Wirkung hin getestet werden.
Die Verwendung von 3D-Gewebemodellen ermöglicht längere Testzeiten (7-28 Tage), um die Sicherheit und Wirksamkeit zu bewerten, und ist geeignet, unterschiedliche pharmakokinetische Eigenschaften von Wirkstoffen einzubeziehen. Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, um die Komplexität zu minimieren und die Robustheit des Assays beim Umgang mit individuellen Wirkstoffexpositionszeiten zum parallelen Testen mehrerer Wirkstoffe zu erhöhen. Der Arbeitsablauf ist ferner so konzipiert, dass er vollständig mit automatisierten Liquid-Handling-Prozessen (z. B. in einer Multiwell-Platte) kompatibel ist.
In einem zweiten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe, indem sie ein Verfahren zum Identifizieren von Nebenwirkungen bereitstellt, die mit einer Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen bei einem Patienten verbunden sind, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend den Schritt des Testens und Analysierens des patientenspezifischen Wirkstoffs oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf nachteilige Wirkungen bei dem Patienten.
In einem dritten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Stratifizieren eines Patienten in Bezug auf eine Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend das Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffs oder einer Kombination oder eines Panels oder einer Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en) und eine Stratifizierung des Patienten auf der Grundlage des identifizierten patientenspezifischen Wirkstoffs oder der Kombination oder des Panels oder der Gruppe von Wirkstoffen.
In einem vierten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Überwachen der Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, das Behandeln des Patienten mit mindestens einem patientenspezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert, und Wiederholen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung an einer Probe des behandelten Patienten, und gegebenenfalls Anpassen der Behandlung basierend auf dem/den Ergebnis(en) der Wiederholung.
Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Schritt des Identifizierens und/oder Auswählens die Verwendung zusätzlicher klinischer Parameter umfasst, wie z. B. patientenspezifische Daten und/oder Behandlungshistorie.
In einem fünften Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe, indem sie ein Testsystem bereitstellt, das Mittel zum Durchführen der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, umfassend a) eine Einheit zum Kultivieren eines Arrays von 3D-Mikrogeweben, wie beispielsweise Mikrotumoren, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe, die von dem Patienten stammt, wie bereitgestellt, b) eine Wirkstofftesteinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D-Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen, die gemäß ihrer jeweiligen t½ Zeitspanne(n) (T_L1, und/oder T_L2, T_L3, ...) getestet werden sollen, c) eine erste Analyseeinheit zum Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe oder Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen davon auf die Anordnung der 3D-Mikrogewebe, und d) eine zweite Drogentesteinheit zum Entfernen des zu testenden Wirkstoffs oder Gruppe oder Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R.
Bevorzugt ist das Testsystem gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend mindestens eine Datenbank zum Sammeln und/oder Speichern von Daten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus t½ Zeitdauern, Daten bezüglich der Vorauswahl und/oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen, physiologische Parameter, Daten in Bezug auf die Wirkung(en) der Wirkstoffe oder Kombinationen oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen davon, Daten in Bezug auf Nebenwirkungen, Daten in Bezug auf zusätzliche klinische Parameter, wie z. B. patientenspezifische Daten und/oder Behandlungshistorie, Daten zur Schichtung und/oder Überwachung, und Daten zur Automatisierung des Systems, beispielsweise zur Steuerung mindestens eines Roboters.
In einem sechsten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe, indem sie ein Computerprogramm bereitstellt, das Mittel zum Steuern des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, insbesondere ein Computerprogramm, das Daten für mindestens einen patientenspezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder ein Panel umfasst Gruppe von Wirkstoffen, wie identifiziert und/oder ausgewählt gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei vorzugsweise das Computerprogramm auf dem Testsystem gemäß der vorliegenden Erfindung implementiert ist.
In einem siebten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe durch Bereitstellen der Verwendung des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung oder des Computerprogramms gemäß der vorliegenden Erfindung zum Erzeugen mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffs oder einer Kombination oder eines Panels oder einer Gruppe von Wirkstoffen.
In einem achten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe, indem sie mindestens einen patientenspezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen bereitstellt, die gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert und/oder ausgewählt wurden
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffs oder Wirkstoffkombination oder -panels von Wirkstoffen zur Behandlung eines Patienten bereit.
Kurz gesagt berücksichtigen die Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise den pharmakokinetischen Parameter eines Wirkstoffs oder einer Gruppe von Wirkstoffen oder eines Panels von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, d. h. die Unterschiede in t_1/2, C_max oder T_max oder der AUC eines Wirkstoffs oder einer Gruppe von Wirkstoffen oder eines Panels von Wirkstoffen, die getestet werden sollen werden beim Screening nach wirksamen Wirkstoffkandidaten und Panels für einen Patienten berücksichtigt. Dies ist von besonderer Bedeutung bei Kombinationen von Wirkstoffen, die dann gemeinsam auf ihr Verhalten und ihre Wirkung in einer Mikrogewebekultur getestet werden, weil sie deren Verhalten in vivo viel besser widerspiegelt als herkömmliche Methoden. Es wurde festgestellt, dass dies von besonderer Bedeutung und Bedeutung ist, wenn Ergebnisse zwischen Assay-Ergebnissen verglichen werden, die bei Mäusen gegenüber Menschen erhalten wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst zunächst den Schritt des Bereitstellens mindestens einer Kultur eines 3D-Mikrogewebes, beispielsweise eines Mikrotumors, basierend auf dissoziierten Zellen einer von einem Patienten stammenden Gewebeprobe. Während der Hauptfokus des Verfahrens auf einer patientenspezifischen Analyse liegt, kann auch eine vorher ausgewählte Gruppe von Patienten die Spender für die Zellen sein, die die Quelle für das/die Mikrogewebe/Mikrogewebe bilden, wie beispielsweise Patienten, die als denselben Typ an neoplastischer Erkrankung aufweisend festgestellt oder diagnostiziert wurden.
Dann wird ein Wirkstoff oder eine Kombination von Wirkstoffen oder eine Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, bereitgestellt. Für diesen Wirkstoff oder eine Kombination von Wirkstoffen oder eine Gruppe von Wirkstoffen wird/werden die t½ Zeitspanne(n) identifiziert und/oder bestimmt. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt und der Literatur zu entnehmen. Bevorzugt sind Tests in einem menschlichen Modell. Daher werden in Übereinstimmung mit den bestehenden Richtlinien die Rate (C_max, t_max) und das Ausmaß (AUC) der Adsorption des Wirkstoffes aus einer Testformulierung (vs. Referenzformulierung) unter Verwendung einer Einzeldosisstudie an gesunden freiwilligen Probanden bewertet, gefolgt von einer Messung die Blut-/Plasmakonzentration der Muttersubstanz und aller wichtigen aktiven Metaboliten (falls vorhanden) für einen Zeitraum von ≥ 3 t ½.
t_max steht normalerweise im Zusammenhang mit der Zeitdauer/der Länge von t_1/2, da Wirkstoffe da Medikamente mit kurzen Halbwertszeiten tendenziell schnell ihren Höhepunkt erreichen und eliminiert werden, was häufig eine häufigere Dosierung oder erneute Dosierung erfordert, um einen Wirkstoff innerhalb seines klinisch wirksamen therapeutischen Bereichs zu halten (siehe auch unten).
Zur Bestimmung der Parameter können Blutproben nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 Stunden entnommen werden, optional gefolgt von 10 und 12, 18, 24, 30, 36 und 42 Stunden nach der Verabreichung. Als allgemeine Regel gilt: Je häufiger Proben um den erwarteten Zeitpunkt der maximalen Konzentration genommen werden, desto genauer sind die Werte von t½ (und t_max und C_max). Die obigen Bestimmungen können bei mehreren Personen durchgeführt werden, und Medianwerte können als Parameter bestimmt werden, z.B. zum Gruppieren und Testen.
Es ist bevorzugt, dass die verwendeten Werte unter identischen oder im Wesentlichen identischen Testbedingungen bestimmt werden oder wurden, um eine maximale Vergleichbarkeit und damit Präzision der Ergebnisse zu ermöglichen. Dennoch wird es insbesondere bei komplexeren Panels als ausreichend erachtet, Werte zu verwenden, die aus verschiedenen Assays erhalten wurden, ohne dass die Ergebnisse des Verfahrens unzureichend genau oder unzureichend nützlich werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dann eine optionale Vorauswahl oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen gemäß den t½-Zeiträumen, wie oben identifiziert. Dies kann erfolgen, um die Komplexität des Assays im Falle sehr großer Gruppen von Wirkstoffen zu verringern, indem Wirkstoffe kombiniert werden, die identische oder im Wesentlichen oder ausreichend ähnliche t½-Zeiträume aufweisen, beispielsweise für ein Vorscreening eines Panels.
Die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur wird dann in geeigneter Weise mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen in Kontakt gebracht, von denen festgestellt wurde, dass sie die längste(n) t½-Zeitspanne(n)(T_L1) aufweisen. Das Ende dieser Zeitspanne(n) definiert (definieren) den Zeitpunkt für eine Entfernung R des zu testenden Wirkstoffs oder Panels oder der zu testenden Wirkstoffgruppe aus der Kultur. Tatsächlich definiert R auch das Ende einer Runde aller zu testenden Wirkstoffe oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen. Im Falle mehrerer Runden oder Zyklen von Tests über einen längeren Inkubationszeitraum (siehe Abbildungen und Beispiele wie hierin) kann R als R1, R2, ... Rx definiert werden, wobei X die Anzahl der Runden oder Zyklen für den jeweiligen Satz an Analysen definiert. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, kann das Inkontaktbringen das Einführen einer geeigneten Menge oder Konzentration des Wirkstoffs oder der Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, in das Medium für die Kultur entweder mit dem Medium selbst oder als separate Medikamentenlösung in die Kultur eingeführt umfassen.
Die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise eine Anordnung von Kulturen, wird dann geeigneterweise mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, inkubiert. Üblicherweise werden die Kulturbedingungen aufrechterhalten, während die Wirkstoffe mit dem Mikrogewebe in Kontakt sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dann einen optionalen Schritt des Bestimmens einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur. Die Wirkung kann entweder kurz nach der Zugabe der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon (z. B. innerhalb einer Stunde nach der Zugabe) oder kurz vor der Zugabe zusätzlicher Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon nachgewiesen werden. Dieser Schritt ermöglicht es, die individuelle Wirkung des ersten getesteten Wirkstoffs oder der Kombination von getesteten Wirkstoffen zu bestimmen, bevor es/sie mit dem/den nächsten zu testenden Wirkstoffen) kombiniert wird/werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „mindestens ein physiologischer Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur“ jeden Parameter der Zellen der Kultur und/oder des Mikrogewebes bedeuten, der ausgewählt und geeignet ist, um eine Wirkung der getesteten Wirkstoffe, entweder einzeln oder in Kombination, auf die Zellen oder das Gewebe nachzuweisen. Vorzugsweise ist der Parameter ausgewählt aus einer Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes, Quantifizierung einer internen Reportergenexpression in dem 3D-Mikrogewebe oder den Zellen davon (siehe zum Beispiel Messner CJ, Babrak L, Titolo G, Caj M, Miho E, Suter-Dick L. Single Cell Gene Expression Analysis in a 3D Microtissue Liver Model Reveals Cell Type-Specific Responses to Pro-Fibrotic TGF-ß1 Stimulation. Int J Mol Sci. 2021 Apr 22;22(9):4372. doi: 10.3390/ijms22094372. PMID: 33922101; PMCID: PMC8122664.), Bestimmung des intrazellulären ATP-Gehalts in dem 3D-Mikrogewebe oder den Zellen davon und Bestimmung vorab ausgewählter Biomarker in dem 3D-Mikrogewebe und/oder den Zellen davon (z. B.
Apoptose), wobei vorzugsweise die Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes mindestens einen Parameter umfasst, der aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts ausgewählt ist, und wobei vorzugsweise die Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes die Verwendung einer Bildgebungsvorrichtung umfasst und gegebenenfalls umfassend die Analyse der Wachstumskinetik. Die Parameter können auch gewebebezogene Parameter umfassen, wie der Nachweis von sezernierten/extrazellulären proteinartigen Faktoren (siehe zum Beispiel Otto, L., Wolint, P., Bopp, A. et al. 3D-microtissue derived secretome as a cell-free approach for enhanced mineralization of scaffolds in the chorioallantoic membrane model. Sci Rep 11, 5418 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84123-x), oder Vaskularisierung. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur und hierin beschrieben.
Die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur wird dann geeigneterweise mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen in Kontakt gebracht, von denen festgestellt wurde, dass sie eine kürzere t½-Zeitspanne(n)(T_L2) aufweisen, wenn verglichen mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von in dem Schritt oben zu testenden Wirkstoffen (d.h. T_L1). Die Kontaktierung erfolgt zum Zeitpunkt R minus T_L2.
Die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise eine Anordnung von Kulturen, wird dann geeigneterweise mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, inkubiert. Üblicherweise werden die Kulturbedingungen aufrechterhalten, während die Wirkstoffe mit dem Mikrogewebe in Kontakt sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dann einen zweiten optionalen Schritt des Bestimmens einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur. Der Effekt kann entweder kurz nach der Zugabe der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon (z. B. innerhalb einer Stunde nach der Zugabe) oder kurz vor der Zugabe zusätzlicher Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon nachgewiesen werden. Dieser Schritt ermöglicht die Bestimmung der gemeinsamen Effekt(e) des ersten und zweiten getesteten Wirkstoffs oder der Kombination von Wirkstoffen, bevor es/sie mit dem/den nächsten zu testenden Wirkstoffen) kombiniert werden.
Das Verfahren umfasst dann optional das Wiederholen der Schritte des geeigneten Kontaktierens der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise eines Arrays, mit mindestens einem Wirkstoff oder einer Panel-Kombination oder einer Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, von denen festgestellt wurde, dass sie einen kürzeren t½-Wert oder -Werte (T_L3, T_L4, ..., usw.) verglichen mit dem Wirkstoff oder Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen in den Schritten davor zu den Zeitpunkten R minus T_L3, R minus T_L4, ...., usw., und geeignetes Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise eines Arrays, mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen. Üblicherweise werden die Kulturbedingungen aufrechterhalten, während die Wirkstoffe mit dem Mikrogewebe in Kontakt sind.
Zum Zeitpunkt R (oder R1, R2, R3, ..., usw.) wird/werden der zu testende Wirkstoff oder Panel oder die Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise dem Array, entfernt. Dies erfolgt üblicherweise durch Ersetzen des Mediums durch frisches Medium/Ersatzmedium oder geeignete Puffer, die keinen zu testenden Wirkstoff enthalten. Dennoch ist es je nach gewünschter Analyse und Ergebnissen möglich, die Wirkstoffe zu entfernen, indem das Medium durch frisches Medium/Ersatzmedium oder geeignete Puffer ersetzt wird, die einen neuen Wirkstoff oder Panel oder eine Kombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dann den Schritt des Bestimmens einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur. Die Wirkung kann kurz nach dem Entfernen der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon (z. B. innerhalb einer Stunde nach dem Entfernen) oder kurz vor dem Beginn eines neuen Zyklus, wie oben erwähnt, d. h. der Zugabe neuer Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon, festgestellt werden zu testen innerhalb von R2, R3, . usw. Dieser Schritt ermöglicht die Bestimmung der gemeinsamen Wirkung(en) des getesteten Wirkstoffs oder der Kombination von Wirkstoffen. Die Wirkung(en) des/der Wirkstoff€ zeigen dann die Wirksamkeit mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffs oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten, oder lassen ferner einen direkten Rückschluss auf die Wirksamkeit des mindestens einen, insbesondere personalisierten Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten zu.
Bevorzugt ist dann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend den Schritt des Identifizierens mindestens eines patientenspezifischen (wirksamen) Wirkstoffs oder einer Kombination oder Panels oder Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en) umfasst. Wie oben erwähnt, wurde festgestellt, dass das vorliegende Verfahren patientenspezifische (wirksame) Wirkstoffe oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen mit einer viel höheren In-vivo-Relevanz als herkömmliche Modelle identifiziert. Weiter bevorzugt ist dann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend den Schritt des Auswählens des patientenspezifischen oder einer Kombination oder Panels oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert. Dies stellt hocheffiziente und patientenspezifische (und krankheitsspezifische) Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen bereit, die vorteilhafte Werkzeuge zur Behandlung und Vorbeugung der hierin beschriebenen Krankheiten darstellen.
Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei R (oder R1, R2, ..., usw.) ferner die Zeit bis t_max für den getesteten Wirkstoff oder die Kombination oder das Panel oder die Gruppe von getesteten Wirkstoffen einschließt, d. h. R = t_max + t½. Die Einbeziehung hat den zusätzlichen Vorteil, die tatsächliche Situation in vivo noch besser widerzuspiegeln. Für eine Vergleichbarkeit der ermittelten und verwendeten Werte ist es bevorzugt, entweder die Zeit bis t_max für alle getesteten Wirkstoffe oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen einzubeziehen oder den Wert nicht für alle verwendeten Wirkstoffe/Werte einzubeziehen. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der t_max für einen getesteten Wirkstoff nicht (ohne weiteres) verfügbar ist.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die mindestens eine Kultur eines 3D-Mikrogewebes mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen bei der C_max-Konzentration in Kontakt gebracht wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse mehr oder weniger unabhängig von der (Bio)Verfügbarkeit der Wirkstoffe am Wirkort erzielt werden. Auch hier ist es für eine Vergleichbarkeit der ermittelten und verwendeten Werte bevorzugt, entweder die C_max-Konzentration für alle getesteten Wirkstoffe oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen einzubeziehen oder den Wert nicht für alle verwendeten Wirkstoffe/Werte einzubeziehen. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die C_max-Konzentration für einen getesteten Wirkstoff nicht (ohne weiteres) verfügbar ist.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Identifizieren des/der t½ -Wert(e) für den zu testenden Wirkstoff oder die zu testende Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen das Testen des Wirkstoffes in einem Subjekt oder einer Gruppe von Subjekten umfasst, oder das Identifizieren von t½ aus der Literatur oder einer Datenbank umfasst. Wie oben erwähnt kann/können der/die t½-Zeitraum/Zeiträume identifiziert und/oder bestimmt werden. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt und der Literatur zu entnehmen. Bevorzugt sind Tests in einem menschlichen Modell. Daher werden in Übereinstimmung mit den bestehenden Richtlinien die Geschwindigkeit (C_max, t_max) und das Ausmaß (AUC) der Adsorption des Wirkstoffes aus einer Testformulierung (vs. Referenzformulierung) unter Verwendung einer Einzeldosisstudie an gesunden freiwilligen Probanden bewertet, gefolgt von einer Messung der Blut-/Plasmakonzentration der Muttersubstanz und aller wichtigen aktiven Metaboliten (falls vorhanden) für einen Zeitraum von ≥ 3 t½. t_max steht normalerweise im Zusammenhang mit dem Zeitraum/der Länge von t_1/2, da Wirkstoffe mit kurzen Halbwertszeiten tendenziell schnell ihren Höhepunkt erreichen und schnell eliminiert werden, was häufig eine häufigere Dosierung oder erneute Dosierung erfordert, um einen Wirkstoff innerhalb seines klinisch wirksamen therapeutischen Bereichs zu halten (siehe auch unten). Zur Bestimmung der Parameter können Blutproben nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 Stunden entnommen werden, optional gefolgt von 10 und 12, 18, 24, 30, 36 und 42 Stunden nach der Verabreichung. Als allgemeine Regel gilt: Je häufiger Proben um den erwarteten Zeitpunkt der maximalen Konzentration genommen werden, desto genauer sind die Werte von t½ (und t_max und C_max). Die obigen Bestimmungen können bei mehreren Personen durchgeführt werden, und Medianwerte können als Parameter bestimmt werden, z.B. zum Gruppieren und Testen.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Panel oder die Kombination von Wirkstoffen zumindest teilweise und vorzugsweise vollständig oder im wesentlichen vollständig basierend auf den t_1/2-Werten wie in Schritt c) des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie hier beschrieben identifiziert ausgewählt und/oder erstellt. Dieser Aspekt betrifft die Vorgruppierung von Verbindungen in Fällen, in denen mehrere oder viele Medikamente getestet werden sollen. Die Vorgruppierung reduziert die Komplexität des Assays und kann auch als Pool im ersten „Durchlauf“ des Verfahrens verwendet werden, um Wirkstoffe zu identifizieren, die aussichtsreiche Kandidaten für weitere und detailliertere Analysen sein können.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die zu testenden Wirkstoffe auch als vorgefertigte Wirkstoffmatrix für den Test bereitgestellt werden. Eine solche Matrix kann auf der analysierten Indikation, den verwendeten Zellen und Geweben und/oder der Wirkstoffklasse, d. h. der chemischen Klasse oder einer anderen Klasse von Molekülen (e.g. z. B. Antikörper, Proteine, chemische „kleine“ Moleküle usw.) basieren, oder sogar zwischen registrierten und nicht registrierten oder natürlichen Verbindungen (z. B. in einer Bibliothek) unterscheiden.
Somit ist weiter ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wobei das Inkontaktbringen insbesondere in Schritt e) oder g) eine Exposition gegenüber einem Wirkstoff oder gleichzeitig gegenüber mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen von Wirkstoffen umfasst.
Im Allgemeinen kann das erfindungsgemäße Verfahren über jeden geeigneten Zeitraum durchgeführt werden, der beispielsweise durch die Zellen und Gewebe und/oder die physikalischen Parameter der zu testenden Wirkstoffe kontrolliert oder bestimmt werden, insbesondere die t1/2. Das vorliegende Verfahren sieht vorzugsweise längere Inkubationszeiten vor, und bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die Inkubationszeit zwischen 5 und 50, vorzugsweise zwischen 6 und 35 und am meisten bevorzugt zwischen 7 und 28 Tagen liegt. Die erwähnte Inkubation kann entweder einen einzelnen „Zyklus“ von zu testenden Wirkstoffen bestimmen und optional wiederholt werden oder kann die kombinierte Gesamtinkubationszeit anzeigen.
Die zu testenden Wirkstoff können aus beliebigen geeigneten Wirkstoffen in Abhängigkeit von dem zugrunde liegenden Krankheitsbild und/oder dem zu verwendenden Zell- und Gewebetyp ausgewählt werden. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei die zu testenden Wirkstoffe ausgewählt sind aus Antikrebsmitteln, wie beispielsweise Alkylierungsmitteln, Antimetaboliten, Naturprodukten, Hormonen, Tyrosininhibitoren, chemotherapeutischen Verbindungen, Antikrebs-Antkörpern, insbesondere Gemcitabin, Abraxam, Trametinib, Olaparib, Oxaliplatin, Erlotinib, Erlotinib, 5-FU, Docetaxel und Pemetrexed. Die zu testenden Wirkstoff können ferner ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus zytotoxischen, zytostatischen und/oder chemotherapeutischen Mitteln, zielgerichteten Wirkstoffen, immuntherapeutischen Mitteln und/oder Kombinationen davon. Beispiele für zytotoxische, zytostatische und/oder chemotherapeutische Mittel sind Anastrozol, Azathioprin, Bcg, Bicalutamid, Chloramphenicol, Ciclosporin, Cidofovir, Kohleteer enthaltende Produkte, Colchicin, Danazol, Diethylstilbestrol, Dinoproston, Dithranol enthaltende Produkte, Dutasterid, Estradiol, Exemestan, Finasterid, Flutamid, Ganciclovir, Gonadotropin, Chorion, Goserelin, interferonhaltige Produkte (einschließlich Peg-Interferon), Leflunomid, Letrozol, Leuprorelinacetat, Medroxyprogesteron, Megestrol, Menotropin, Mifepriston, Mycophenolatmofetil, Nafarelin, östrogenhaltige Produkte, Oxytocin (einschließlich Syntocinon und Syntometrin), Podophyllin, Progesteron enthaltende Produkte, Raloxifen, Ribavirin, Sirolimus, Streptozocin, Tacrolimus, Tamoxifen, Testosteron, Thalidomid, Toremifen, Trifluridin, Triptorelin, Valganciclovir und Zidovudin. Zielgerichtete Wirkstoffe sind Wirkstoffe, deren Konzentration in einigen Teilen des Körpers im Vergleich zu anderen ansteigt, wie z. B. Antikörper. Beispiele sind Hirntumore: Bevacizumab, Everolimus; Brustkrebs: Bevacizumab, Everolimus, Lapatinib, Pertuzumab, Trastuzumab und seine Antikörper-Wirkstoff-Konjugate; bei Darmkrebs: Aflibercept, Bevacizumab, Cetuximab, Panitumumab, Regorafenib und Dermatofibrosarcoma protuberans: Imatinib. Immuntherapeutika werden in der Immuntherapie eingesetzt, einer Form der Krebsbehandlung, die die Kraft des körpereigenen Immunsystems nutzt, um Krebs zu verhindern, zu kontrollieren und zu beseitigen. Beispiele sind monoklonale Antikörper zur Behandlung von Krebs, CAR-T-Zelltherapie, Immun-Checkpoint-Inhibitoren zur Behandlung von Krebs, Krebsimpfstoffe, immunmodulierende Medikamente (IMiDs) und Zytokine.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Patient vorzugsweise ein Säugerpatient, insbesondere ein Mensch, und wobei der Patient vorzugsweise an einer neoplastischen Erkrankung oder einem Tumor leidet oder für diese diagnostiziert wird. Folglich sind das Mikrogewebe und/oder die Zellen, wie sie in den Assays der Erfindung verwendet werden, Säugerzellen, insbesondere menschliche Zellen. Die Zellen, wie sie im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind somit üblicherweise autolog für einen bestimmten Patienten, der behandelt werden soll. Nichtsdestotrotz können auch Zellen verwendet werden, die eine Gruppe von Patienten darstellen (z. B. die an einer bestimmten neoplastischen Krankheit oder Gruppe von Krankheiten leiden, wie Lungen- oder Darmkrebs), und es kann auch nützlich sein, Zellen einzubeziehen, die auf erhältlichen Krebszelllinien basieren. Es können auch andere Zellen eingeschlossen werden. Das Hinzufügen oder Entfernen von Zellen hilft bei der Kontrolle der Mikrogewebeumgebung. Besonders bevorzugt ist die Zugabe von Immunzellen, von denen bekannt ist, dass sie mit Tumoren und Zellen im Tumor interagieren und/oder von denen bekannt ist, dass sie in vivo in Tumore eindringen, z.B. sogenannte tumorinfiltrierende Immunzellen. Beispiele sind PBMCs, Lymphozyten, rekombinante T-Zellen und dergleichen. Diese Einstellungen und Strategien sind von besonderem Vorteil für Tests und Assays im Zusammenhang mit der Krebsimmuntherapie und können darüber hinaus die Zugabe anderer Faktoren, wie Cytokine usw., zur Mikrogewebeumgebung beinhalten. Sowohl Zellen als auch Faktoren können auch nach der Bildung des/der Mikrogewebe(s) hinzugefügt werden. Somit umfasst in einer anderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung Schritt a) das Hinzufügen oder Entfernen von Stromazellen, stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen, und/oder wobei in Schritt a) für jedes 3D-Mikrogewebe eine vorbestimmte Anzahl von Zellen bereitgestellt wird, wie zum Beispiel zwischen 500 und 10000 lebensfähige Zellen, und/oder wobei in Schritt a) die 3D-Mikrogewebe in mindestens einem System erzeugt werden, das aus einem Hanging-Drop-System und einem Multiwell-System ausgewählt ist, vorzugsweise umfassend Ultra Low Adherence (ULA)-Wells.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die vom Patienten stammende Gewebeprobe aus einer Unterprobe ausgewählt, die aus einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe und einer Metastasenprobe stammt, und wobei die Gewebeprobe vorzugsweise erhalten wurde durch ein Verfahren, das Kernbiopsie, Tumorresektion, Flüssigbiopsie und/oder Nadelaspiration sowie andere Biopsien, chirurgische Eingriffe und Lavage umfasst. Die Gewebeprobe kann von einem Tumor erhalten werden, ausgewählt aus der Gruppe von bestätigten oder vermuteten neoplastischen oder kanzerösen Geweben, umfassend neoplastisches Lebergewebe, neoplastisches Nierengewebe, neoplastisches Hautgewebe, neoplastisches Prostatagewebe, neoplastisches Brustgewebe, neoplastisches Eierstockgewebe, neoplastisches Hirngewebe, usw., insbesondere aus neoplastischem Lebergewebe, insbesondere aus einem primären oder einem metastatischen Lebertumor.
In einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Schritt a) das Dissoziieren der vom Patienten stammenden Gewebeprobe, umfassend i) gegebenenfalls das physikalische Zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke, die Zellen umfassen, ii) das Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung, umfassend: mindestens ein Enzym, das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu dissoziieren, vorzugsweise mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuklease I und neutraler Protease (Dispase), wodurch ein Überstand erzeugt wird, der dissoziierte Zellen umfasst, und iii) Entfernen des Überstands, der die dissoziierten Zellen umfasst, und geeignetes Sammeln der Zellen. Vorzugsweise werden die Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt, wobei vorzugsweise vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt wird, wobei die Energie des Ultraschalls auf ein geeignetes Niveau eingestellt wird, um eine wesentliche Menge der Zellen davon nicht zu zerstören.
Wie oben erwähnt, kann jeder Parameter der Zellen der Kultur und/oder des Mikrogewebes, der ausgewählt und geeignet ist, um eine Wirkung der getesteten Wirkstoffe entweder einzeln oder in Kombination auf die Zellen oder das Gewebe nachzuweisen verwendet werden. Bevorzugt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Bestimmung des physiologischen Parameters in Schritt f) und/oder k) ausgewählt ist aus Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes, Quantifizierung interner Reportergenexpression in dem 3D-Mikrogewebe, Bestimmung des intrazellulären ATP-Gehalts in dem 3D-Mikrogewebe und Bestimmung von vorgewählten Biomarkern in dem 3D-Mikrogewebe, wobei vorzugsweise die Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes mindestens einen Parameter umfasst, der aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts ausgewählt ist, und wobei vorzugsweise die Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes die Verwendung einer Bildgebungsvorrichtung umfasst und gegebenenfalls ferner die Analyse der Wachstumskinetik umfasst.
In einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird nur ein Bruchteil/Aliquot der Zellen analysiert, und wobei das Verfahren optional das Bereitstellen einer primären Gewebeprobe, das Erhalten einer Unterprobe zusätzlich zu der vom Patienten stammenden Probe und das Unterziehen der Unterprobe mindestens eines von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse umfasst. Dies liefert zusätzliche Informationen für die Gesamtanalyse. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Schritt des Identifizierens und/oder Auswählens die Verwendung zusätzlicher klinischer Parameter umfasst, wie z. B. patientenspezifischer Daten und/oder der Behandlungshistorie.
In noch einem weiteren Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Nebenwirkungen bereit, die mit einer Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen bei einem Patienten verbunden sind, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und weiter umfassend den Schritt des Testens und Analysierens des patientenspezifischen Wirkstoffs oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf nachteilige Wirkungen bei dem Patienten. Eine Nebenwirkung in Form einer unerwünschten Wirkstoffwirkung (ADR) ist eine spürbar schädliche oder unangenehme Reaktion, die aus einem Eingriff im Zusammenhang mit der Anwendung eines medizinischen Produkts (Wirkstoffs) resultiert, was eine Gefährdung durch die zukünftige Verabreichung vorhersagt und eine Vorbeugung oder spezifische Behandlung erfordert, oder Änderung des Dosierungsplans oder Rücknahme des Produkts (siehe zum Beispiel Edwards und Aronson, The Lancet, 356, 1255-1259).
In noch einem weiteren Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Stratifizieren eines Patienten in Bezug auf eine Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen bereit, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend das Identifizieren von mindestens einem patientenspezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen basierend auf dem/den Effekt(en) wie bestimmt und Stratifizieren des Patienten basierend auf dem patientenspezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert, vorzugsweise in verschiedenen Patienten und/oder Behandlungsgruppen.
In noch einem weiteren Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Überwachen der Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen bereit, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, das Behandeln des Patienten mit dem mindestens einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert und Wiederholen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung an einer Probe des behandelten Patienten, und gegebenenfalls Anpassen der Behandlung basierend auf dem/den Ergebnis(en) der Wiederholung.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren mindestens teilweise und vorzugsweise vollständig automatisiert ist und die Verwendung mindestens eines Roboters und/oder einer Computervorrichtung umfasst. Vorzugsweise ist der Arbeitsablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens so ausgelegt, dass er vollständig kompatibel mit automatisierten Liquid-Handling-Prozessen ist.
In noch einem weiteren Aspekt davon stellt die vorliegende Erfindung ein Testsystem bereit, umfassend Mittel zum Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend a) eine Einheit zum Kultivieren eines Arrays von 3D-Mikrogeweben, wie etwa Mikrotumoren, basierend auf dissoziierten Zellen oder einer Gewebeprobe wie bereitgestellt abgeleitet von dem Patienten, b) eine Wirkstofftesteinheit zum in Kontakt bringen der Anordnung der 3D-Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen oder einer Kombination oder einem Panel oder einer Gruppe von Wirkstoffen die gemäß ihrer jeweiligen t½-Zeitspanne(n) (T_L1, und/oder T_L2, T_L3, ...) getestet werden sollen, c) eine erste Analyseeinheit zum Bestimmen einer Wirkung des Wirkstoffs oder Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen davon auf den Array der 3D-Mikrogewebe, und d) eine zweite Wirkstofftesteinheit für das Entfernen des zu testenden Wirkstoffs oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R.
Das Testsystem umfasst somit physikalische Mittel zum geeigneten Durchführen der Schritte des Verfahrens. Vorteilhafterweise besteht das Testsystem aus Einheiten, die dazu ausgelegt sind, bestimmte Schritte des Verfahrens durchzuführen, wie unten erläutert. Vorzugsweise kann das System als Ganzes oder in Teilen (z. B. Einheiten) davon sterilisiert werden und/oder wobei das System Mittel zum Herstellen und/oder Aufrechterhalten steriler Bedingungen umfasst. Beispiele für das Design und Layout von Testsystemen und Einheiten davon sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise in den 2 bis 6 der WO 2021/110799 beschrieben.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testsystems umfassen beispielsweise ferner mindestens einen Inkubations-Timer und/oder mindestens ein Wirkstoffreservoir und/oder eine Gewebeproben-Dissoziationseinheit.
Vorzugsweise umfasst die Gewebeprobendissoziationseinheit mindestens eines von i) einer Pipettiereinheit, ii) einem Enzymreservoir, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Reservoir für Waschlösungen, v) optional einer Ultraschallvorrichtung und vi) eine Zentrifugeneinheit, und/oder wobei die Einheit zum Herstellen eines Arrays von 3D-Mikrogeweben, wie Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen mindestens eines umfasst von i) einer Pipettiereinheit, ii) einer Zellzähleinheit und iii ) eine Handhabungseinrichtung für Mikrotiterplatten, und/oder wobei die Wirkstofftesteinheit mindestens eines umfasst von: i) einer Handhabungseinrichtung für Mikrotiterplatten, ii) einer Pipettiereinheit, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einer Anordnung von Reservoirs umfassend mindestens zwei verschiedene Wirkstoffe oder Kombinationen davon, und iv) eine Inkubatoreinheit, und/oder wobei die erste und/oder zweite Analyseeinheit i) einen Handler für Mikrotiterplatten und/oder ii) ein Bildgebungssystem umfasst, das ein Mikroskop und eine Kamera und gegebenenfalls einen HR-Scanner umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung teilen sich die Gewebeprobendissoziationseinheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D-Mikrogeweben dieselbe Pipettiereinheit und/oder wobei sich die Wirkstofftesteinheit und die erste Analyseeinheit die gleiche Handhabungseinheit für Mikrotiterplatten teilen.
In bevorzugten Ausführungsformen des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Gewebeprobendissoziationseinheit und die Einheit zum Erzeugen eines Arrays von 3D-Mikrogeweben in demselben Gehäuse positioniert und/oder wobei die Wirkstofftesteinheit und die erste Analyseeinheit in demselben Gehäuse positioniert sind, und vorzugsweise wobei die zwei Gehäuse verbunden sind, um ein diskretes System zu bilden, und/oder wobei das System zumindest teilweise vertikal angeordnet ist.
In einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Testsystems wird die Gewebeprobe vor Schritt a) mit Ultraschall, beispielsweise gepulstem Ultraschall, beschallt. Dieser Schritt wird durchgeführt, um eine Hämolyse zu induzieren, wobei die Energie des Ultraschalls auf ein geeignetes Niveau eingestellt wird, ohne eine wesentliche Menge der zu analysierenden Zellen zu zerstören und/oder zu beschädigen, beispielsweise auf etwa 1 MHz, 0,5-5 und vorzugsweise 2 Wcm^-2, d. h. milder als für die Vorbereitung von DNA oder RNA aus einer Zellprobe. Der Hämolyseschritt mit Beschallung dauert optimalerweise etwa fünf Minuten und zielt auf Zellen ab, die nicht in die Gewebeumgebung eingebettet sind.
In einem anderen Aspekt des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das System mindestens eine Ladeöffnung, die ein Ladesystem mit einem Schleusensystem (L) zum sterilen Laden von Materialien oder Verbrauchsmaterialien umfasst, wie sie in dem/den System(en) verwendet werden, und/oder Entladen von Abfällen und/oder Produkten, wie sie in dem/den System(en) erzeugt werden. Das Schleusensystem kann vorzugsweise ferner Mittel zum Sterilisieren der Materialien umfassen, beispielsweise durch UV, und/oder wobei das Schleusensystem ferner Mittel zum Auftauen oder Kühlen/Gefrieren der zu ladenden oder zu entladenden Materialien umfasst. Weiter bevorzugt ist das Verschlusssystem so angepasst, dass es speziell zu einer Transportbox oder einem Transportbehälter passt, wobei die Transportbox oder der Transportbehälter vorzugsweise mindestens eine Öffnung umfasst, die innerhalb des Systems geöffnet und geschlossen werden kann. Die Transportbox oder der Transportbehälter kann mindestens zwei unterschiedliche getrennte Temperaturzonen umfassen, wie beispielsweise Zonen, die auf -20°C, 4°C oder Umgebungstemperatur gehalten werden, und wobei gegebenenfalls die Transportbox oder der Transportbehälter isoliert ist.
In einem anderen Aspekt des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Testsystem ferner mindestens ein Mittel zum Bestimmen physiologischer Parameter, ausgewählt aus Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes, Quantifizierung interner Reportergenexpression in dem 3D-Mikrogewebe, Bestimmung des intrazellulären ATP-Gehalts in dem 3D-Mikrogewebe und Bestimmung vorgewählter Biomarker in dem 3D-Mikrogewebe, wobei vorzugsweise die Mittel zur Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes Mittel für mindestens einen Parameter umfassen, der aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts ausgewählt ist, vorzugsweise bildgebende Geräte und Mittel zur Analyse der Wachstumskinetik. Zusätzlich zu dem, was oben erwähnt wird, kann die Größenbestimmung des 3D-Mikrogewebes die Verwendung eines optischen Verfahrens umfassen, wie z. B. die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung. Besonders nützlich ist die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (HR-SEM).
Für das Verfahren zur Analyse der Wachstumskinetik der Zellen und des Mikrogewebes ist die Wachstumskinetik eine autokatalytische Reaktion, was impliziert, dass die Wachstumsrate direkt proportional zur Zellkonzentration ist. Die Zellkonzentration kann durch direkte und indirekte Methoden gemessen werden, die dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben sind (Zellzählung oder optische Dichte/Turbimetrie).
In einem anderen Aspekt des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Testsystem ferner Mittel zum Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffs oder einer Kombination oder eines Panels oder einer Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der festgestellten Wirkung(en) und optional ferner umfassend Mittel zum Auswählen des patientenspezifischen Wirkstoffs oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, wie identifiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Testsystem mindestens eine Datenbank zum Sammeln und/oder Speichern von Daten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus t½-Zeiträumen, Daten bezüglich der Vorauswahl und/oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen, physiologische Parameter, Daten in Bezug auf die Wirkung(en) der Wirkstoffe oder Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen davon, Daten in Bezug auf Nebenwirkungen, Daten in Bezug auf zusätzliche klinische Parameter, wie z. B. patientenspezifische Daten und/oder Behandlungshistorie, Daten zur Stratifizierung und/oder Überwachung und Daten zur Automatisierung des Systems, beispielsweise zur Steuerung mindestens eines Roboters.
Zusätzliche Daten in der Datenbank können ausgewählt werden aus i) Daten über das molekulare Profil der Gewebeprobe, ii) Ergebnissen einer histologischen Analyse der Gewebeprobe, iii) Ergebnissen einer histochemischen Analyse der Gewebeprobe, iv) Patientenanamnese, z.B. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Überprüfung/Bestimmung von Vitalfunktionen, Anamnese, Rauchgewohnheiten, sportlichen Aktivitäten, Hormonspiegeln, früherer oder aktuellen Medikationen usw., v) Erbinformationen des Patienten und vi) Genominformationen des Patienten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Computerprogramm, das Mittel zum Steuern des Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, insbesondere ein Computerprogramm, das Daten für mindestens ein patientenspezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder ein Panel oder eine Gruppe von identifizierten Wirkstoffen umfasst und/oder ausgewählt gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei vorzugsweise das Computerprogramm auf dem Testsystem gemäß der vorliegenden Erfindung implementiert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung des erfindungsgemäßen Testsystems oder Computerprogramms gemäß der vorliegenden Erfindung zur Generierung mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Kombination oder eines Panels oder einer Gruppe von Wirkstoffen.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann mindestens einen patientenspezifischen Wirkstoff oder eine Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, wie identifiziert und/oder ausgewählt gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Diese Kombination kann ein physischer Satz ausgewählter Wirkstoffe in einem Kit oder einer Kombination sein, die vorzugsweise geeignet sind, um ein Verfahren wie hier offenbart durchzuführen oder zur Verwendung zur Behandlung eines Patienten, insbesondere als patientenspezifische Behandlung, oder ein Satz von Daten, die z.B. ein Panel von patientenspezifischen und wirksamen Wirkstoffen kodiert.
Ein weiterer Aspekt betrifft dann ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen Erkrankung oder einem Tumor leidet oder bei dem eine Diagnose gestellt, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung und den Schritt des geeigneten Behandelns des Patienten mit einem patientenspezifischen, insbesondere personalisierten Wirkstoff oder Wirkstoffkombinationen wie identifiziert.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren eine Empfehlung im Hinblick auf einen geeigneten patienten- oder patientengruppenspezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination bereitstellt, um den Patienten der an einer neoplastischen Erkrankung oder einem Tumor leidet oder bei dem eine Diagnose gestellt wurde effektiver zu behandeln.
Das Verfahren kann ferner ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten hinsichtlich einer Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Wirkstoffkombination berücksichtigen, umfassend das Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens wie oben, und ferner umfassend eine Stratifizierung des Patienten basierend auf dem identifizierten patientenspezifischen Wirkstoff oder der identifizierten Wirkstoffkombination, vorzugsweise in verschiedene Patienten- und/oder Behandlungsgruppen, und/oder ein Verfahren zum Identifizieren von Nebenwirkungen, die mit einer Behandlung mit einem patientenspezifischen Wirkstoff oder einer Wirkstoffkombination zusammenhängen, in einem Patienten, umfassend das Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und ferner umfassend den Schritt des Testens und Analysierens des patientenspezifischen Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination auf nachteilige Wirkungen bei dem Patienten.
Die vorliegende Erfindung analysiert Gewebebiopsieproben eines Patienten oder einer vorausgewählten Gruppe von Patienten, die an einer neoplastischen Erkrankung oder einem Tumor leiden oder für die eine Diagnose gestellt wurde. Diese Proben werden verwendet, um 3D-Mikrogewebe, insbesondere sogenannte „Mikrotumore“, zu erzeugen, die dann zum Testen von effektiven und optimal patientenspezifisch wirksamen therapeutischen Wirkstoffen von Kombinationen von Wirkstoffen für eine Behandlung und/oder Prävention der besagten neoplastischen Erkrankung oder Tumor verwendet werden. Die vorliegenden Verfahren und Systeme ermöglichen eine schnelle Analyse und Suche nach Wirkstoffen und insbesondere Screenings nach Wirkstoffen und Wirkstoffkombinationen, die für den tatsächlichen Patienten und/oder die spezifische Patientengruppe wirksam sind.
Die Verfahren und das System haben außerdem den Vorteil, die tatsächliche Situation in vivo genau nachzuahmen, und die Verwendung von 3D-Gewebemodellen ermöglicht längere Testzeiten (7-28 Tage), um die Sicherheit und Wirksamkeit zu bewerten sowie unterschiedliche pharmakokinetische Eigenschaften von Wirkstoffen zu berücksichtigen. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, um die Komplexität zu minimieren und die Assay-Robustheit beim Umgang mit individuellen Wirkstoffexpositionszeiten zum parallelen Testen mehrerer Wirkstoffe zu erhöhen. Darüber hinaus ermöglichen die Tests das Hinzufügen von Zellen, um eine Mikrotumorumgebung zu schaffen, die mit regulären Screening-Methoden unter Verwendung von einzelzellbasierten Screenings nicht erreicht werden kann. Ferner kann das Verfahren durch die Analyse einer sogenannten Unterprobe zusätzlich zu der vom Patienten stammenden Probe „begleitet“ werden und die Unterprobe mindestens einem von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse unterzogen werden, wie ebenfalls weiter hier erläutert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die korrekte Dosierung von Wirkstoffen einen enormen Einfluss auf die Vergleichbarkeit von Wirkstofftest-Assays hat. Da der Prozess meist in Richtung Maus zu Mensch ausgelegt ist, sind die Blutkonzentrationen der Maus oft nicht vergleichbar mit der Situation beim Menschen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll ein 3D-Mikrogewebe ein in vitro erzeugtes Zellaggregat bezeichnen, das Zellen wie gewünscht umfasst. Folglich soll ein Mikrotumor ein 3D-Mikrogewebe bedeuten, dass zumindest teilweise aus ausgewählten Krebszellen erzeugt wird, die von einer Zelllinie oder einer neoplastischen Probe wie einem Tumor stammen (siehe zum Beispiel Rimann et al., An in vitro osteosarcoma 3D microtissue model for drug development, Volume 189, 10 November 2014, Pages 129-135). Diese beiden Begriffe werden hier austauschbar verwendet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein „Array“ ein Satz separater 3D-Mikrogewebe, die getestebanalysiert werden, wie beispielsweise 3D-Mikrotumore in einer multi-Well Platte. Ein Array besteht aus mindestens 2 oder mehr oder 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr, 12, 48, 96, 128, 384 oder mehr oder sogar 200, 300, 400 oder mehr 3D-Mikrotumore/Mikrogewebe.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei für jedes 3D-Mikrogewebe eine vorgegebene Anzahl von Zellen bereitgestellt wird, beispielsweise etwa 500, etwa 1000, etwa 2000, etwa 5000 oder etwa 10000 Zellen, insbesondere lebensfähige Zellen. Dies kann ferner das geeignete Zählen der Zellen vor der Erzeugung der Mikrogewebe umfassen, vorzugsweise unter Verwendung einer geeigneten automatisierten Zellzähleinheit (z. B. von Logos Biosystems, Südkorea).
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Herstellung der 3D-Mikrogewebe nicht die Verwendung einer solubilisierten Basalmembranpräparation, wie Matrigel®, erfordert. Dies hat den Vorteil, dass das vollständige Verfahren bei Temperaturen über 4°C, wie beispielsweise Raumtemperatur, durchgeführt werden kann. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Erzeugung der 3D-Mikrogewebe die Selbstorganisation der in den dissoziierten Zellen enthaltenen Zellen umfasst.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Erzeugung der 3D-Mikrogewebe eine Reifungszeit von etwa 6 Stunden bis 7 Tagen, vorzugsweise etwa 1 bis 6 Tagen, weiter bevorzugt etwa 2 bis 5 Tagen umfasst. Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die erzeugten 3D-Mikrogewebe eine Größe von etwa 350 µm +/- 100 µm aufweisen. Erwünscht und bevorzugt ist eine Größe, die für eine ordnungsgemäße Analyse geeignet ist, insbesondere für die hier offenbarten optischen Analyseverfahren.
Ein besonders wichtiger Aspekt des Systems und Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Automatisierung, die schnelle und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Bevorzugt ist daher ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei mindestens eine Einheit davon und vorzugsweise im Wesentlichen alle Einheiten davon auf automatisierte Weise funktionieren.
In einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Systems kann das System als Ganzes oder in Teilen davon sterilisiert werden und/oder Mittel zum Herstellen und/oder Aufrechterhalten steriler Bedingungen umfassen, wie sterilisiert durch UV-Bestrahlung, Ozonbehandlung, Bestrahlung, und/oder Sektionen mit laminarer Strömung usw. enthält.
Die Begriffe „der (vorliegenden) Erfindung“, „gemäß der Erfindung“, „nach der Erfindung“ und dergleichen, wie sie hierin verwendet werden, sollen sich auf alle Aspekte und Ausführungsformen der hierin beschriebenen und/oder beanspruchten Erfindung beziehen.
Die Begriffe „ungefähr“ und „ungefähr“ bezeichnen ein Genauigkeitsintervall, von dem der Fachmann verstehen wird, das die technische Wirkung des betreffenden Merkmals noch sichergestellt wird. Der Begriff gibt typischerweise eine Abweichung von dem angegebenen Zahlenwert um ±20 %, ±15 %, ±10 % und beispielsweise ±5 % an. Wie der Durchschnittsfachmann erkennen wird, wird die spezifische derartige Abweichung für einen numerischen Wert für einen gegebenen technischen Effekt von der Natur des technischen Effekts abhängen. Beispielsweise kann ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere solche Abweichung aufweisen als ein künstlicher oder ingenieurtechnischer Effekt. Wie der Durchschnittsfachmann erkennen wird, wird die spezifische derartige Abweichung für einen numerischen Wert für einen gegebenen technischen Effekt von der Natur des technischen Effekts abhängen. Beispielsweise kann ein natürlicher oder biologisch-technischer Effekt im Allgemeinen eine größere solche Abweichung aufweisen als ein künstlicher oder ingenieurtechnischer Effekt. Wo ein unbestimmter oder bestimmter Artikel verwendet wird, wenn auf ein Substantiv im Singular Bezug genommen wird, z.B. „ein“, „eine“ oder „der“, dies schließt einen Plural dieses Substantivs ein, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Probe“ eine klinische Probe, die von einem Patienten erhältlich ist, wie beispielsweise einem Patienten, bei dem eine neoplastische Erkrankung vermutet wird, z. B. ein Tumor/Krebs, oder ein Patient mit einer bestätigten neoplastischen Erkrankung, z. B. ein Tumor/Krebs. Die Probe kann durch jede bekannte Art von Biopsie erhalten werden, z. B. Nadelbiopsie, Flüssigkeitsbiopsie, Kernbiopsie, Tumorresektion, Nadelaspiration, chirurgische Entfernung von festem neoplastischem Gewebe, wie im Stand der Technik bekannt.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Behandlung“ jede Art von therapeutischem Eingriff, einschließlich Heilung einer Krankheit, Linderung einer Krankheit, Verbesserung der Krankheit, Verlangsamung des Fortschreitens einer Krankheit und dergleichen, sowie die Linderung oder Verbesserung oder Unterdrückung von Krankheitssymptomen, wie Schmerzen und dergleichen, insbesondere solche, die mit neoplastischen Erkrankungen/Krebs assoziiert sind.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Prävention“ jede Art von Intervention, die geeignet ist, die Entwicklung einer Krankheit, insbesondere einer neoplastischen Krankheit, zu verhindern, oder die in der Lage ist, die Verschlechterung einer Krankheit oder der Krankheitssymptome zu hemmen oder zu verlangsamen, insbesondere neoplastischer Erkrankungen/Kreb s.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „neoplastisch“ jegliches Wachstum von Gewebe, das die Wachstumskontrolle verloren hat, einschließlich fester oder flüssiger Tumore, Warzen, metastatisches Wachstum usw.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Tumor“ jedes gutartige oder bösartige Gewebe in einem beliebigen gegebenen Organsystem oder Gewebe, zum Beispiel Leber, Niere, Gehirn, Brust, Prostata, Haut, usw.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Mikroplatte“ jede Anordnung mehrerer Kavitäten, die als Reaktionsgefäße oder Kulturgefäße verwendet werden können, beispielsweise 24-Well-Platten, 48-Well-Platten, 96-Well-Platten, 384-Well-Platten usw., wie in bekannt im Stand der Technik. Denkbar ist auch die Verwendung und Anordnung von Einzelgefäßen, die nicht zwingend als Platte angeordnet sein müssen, sondern auch formlos angeordnete Streifen von Einzelgefäßen usw. sein können.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Beschallung“ die Behandlung eines Gewebes oder von Zellen mit Ultraschall, um dadurch die Integrität bestimmter Zielstrukturen, wie z. B. roter Blutkörperchen, in einem als Hämolyse bezeichneten Prozess zu zerstören. Dies ermöglicht die Entfernung von Hämoglobin aus der Gewebeprobe, was die Analyse der gewonnenen Zellen stören kann, insbesondere die optische Analyse von Zellen aufgrund einer Interferenz des Hämoglobins mit dem Nachweismittel. Hämolyse kann auch durch Inkubation von Gewebe in Lösungen mit sehr hoher oder sehr niedriger Osmolalität erreicht werden, die das Platzen oder Schrumpfen der roten Blutkörperchen bewirken, durch Behandlung mit bestimmten hämolytischen Enzymen usw.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Patient“ einen menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten. Der nicht-menschliche Patient kann vorzugsweise ein Säugetier sein, beispielsweise ein Pferd, ein Hund, eine Katze usw., bei dem eine neoplastische Erkrankung/Krebs diagnostiziert wurde oder bei dem ein entsprechender Verdacht besteht.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Wirkstoff” jeden Wirkstoff, jedes kleine Molekül oder biotechnologisch hergestelltes Molekül oder jede Kombination von Molekülen, Nukleinsäurekonstrukt(en), z.B. einen Vektor für die Gentherapie, dessen Wirkung in vitro unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren und Mittel getestet werden soll.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „stratifizieren“ den Prozess, bei dem eine bestimmte Person/ein Patient in eine Gruppe eingeteilt wird, die auf eine bestimmte Weise behandelt werden soll.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „nachteilige Wirkung“ im vorliegenden Kontext jede unerwünschte Nebenwirkung, die damit verbunden ist, dass ein wie hierin definiertes Mikrogewebe einer bestimmten Verbindung oder einem bestimmten Wirkstoff oder einer Kombination davon ausgesetzt wird, und kann unter anderem ein Fördern des Zellwachstums, Resistenzentwicklung gegenüber einem gegebenen Wirkstoff, Expressionsverlust der MHC-Expression, Oberflächenexpression und/oder Sekretion von Faktoren, die das Immunsystem herunterregulieren usw. umfassen, was alles darauf hindeutet, dass die aus der Probe stammenden Zellen weniger beeinträchtigt zu sein scheinen/resistent werden gegenüber der Aussetzung eines bestimmten Wirkstoffs.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die folgenden bevorzugten Punkte. Punkt 1. Verfahren zur Bestimmung der Effektivität mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst a) Bereitstellen mindestens einer Kultur eines 3D-Mikrogewebes, wie beispielsweise eines Mikrotumors, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe, die von einem Patienten stammt, b) Bereitstellen eines zu testenden Wirkstoffes oder einer Kombination oder eines Panels von Wirkstoffen, c) Identifizieren der t½-Zeitspanne(n) für den Wirkstoff oder die Kombination oder das Panel von Wirkstoffen aus Schritt b), e) In Kontakt bringen der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die als die längste(n) t½ Zeitspanne(n) (T_L1) aufweisend identifiziert wurden, wobei das/die Ende(n) dieser Zeitspanne(n) den/die Zeitpunkt(e) für eine Entfernung R des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der zu testenden Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur definiert/definieren, f) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise einer Anordnung von Kulturen, mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, und gegebenenfalls Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, g) im Anschluss an e), Kontaktieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, von denen festgestellt wurde, dass sie (eine) kürzere t½-Zeitspanne(n) (T_L2) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder der Kombination aufweisen, oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, die in Schritt e) zum Zeitpunkt R minus T_L2 getestet werden sollen, h) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit den zu testenden Wirkstoffen oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen, j) Entfernen des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R, und
k) Bestimmen eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter des mindestens einen Wirkstoff oder Panel oder Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen auf die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur.
Bevorzugt ist Punkt 1 wie oben, gegebenenfalls umfassend mindestens eines von d) Vorauswahl oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen gemäß den t½-Zeiträumen, wie in Schritt c) identifiziert, i) Wiederholen der Schritte g) und h) mit mindestens einer Wirkstoff- oder Panelkombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die einen kürzeren t½-Wert oder kürzere t½-Werte (T_L3, T_L4, ...) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder Panel oder der Gruppe der zu testenden Wirkstoffe in den vorherigen Schritten zu den Zeitpunkten R minus T_L3, R minus T_L4, .... aufweisen, und/oder 1) Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en), und gegebenenfalls ferner umfassend den Schritt des Auswählens des patientenspezifischen Wirkstoffes oder der Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Punkt 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei R weiterhin die Zeit zu t_max für den Wirkstoff oder die Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen einschließt, d.h. R = t_max + t½.
Punkt 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei die mindestens eine Kultur eines 3D-Mikrogewebes mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen in der C_max-Konzentration in Kontakt gebracht wird.
Punkt 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, wobei das Identifizieren des/der ½ Werts/e für den Wirkstoff oder Kombination oder Panel von zu testenden Wirkstoffen ein Testen des Wirkstoffs in einem Subjekt oder einer Gruppe an Subjekten umfasst, oder ein Identifizieren des t½ aus der Literatur oder einer Datenbank umfasst.
Punkt 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, wobei das Panel oder Kombination von Wirkstoffen zumindest teilweise basierend auf den t½ Werten wie in Schritt c) identifiziert etabliert wird.
Punkt 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, wobei das in Kontakt bringen in Schritt e) oder g) ein Aussetzen gegenüber einem Wirkstoff oder gleichzeitig gegenüber mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen umfasst.
Punkt 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, wobei die Inkubationszeit zwischen 7 bis 28 Tage ist.
Punkt 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, wobei die zu testenden Wirkstoffe ausgewählt sind aus anti-Krebs Wirkstoffen, wie zum Beispiel alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten, natürlichen Produkten, Hormonen, Tyrosininhibitoren, chemotherapeutischen Verbindungen, anti-Krebs Antikörpern, insbesondere Gemcitabin, Abraxam, Trametinib, Olaparib, Oxaliplatin, Erlotinib, Erlotinib, 5-FU, Docetaxel und Pemetrexed.
Punkt 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, wobei die zu testenden Wirkstoffe als eine vorgefertigte Wirkstoffmatrix dem Test zugeführt werden.
Punkt 10. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 9, wobei der Patient ein Säuger-Patient, insbesondere ein Mensch ist und wobei bevorzugt der Patient leidet an oder diagnostiziert ist für eine neoplastische Erkrankung oder Tumor.
Punkt 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Patienten-abgeleitete Gewebeprobe ausgewählt ist aus einer Unter-Probe abgeleitet von einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe und einer Metastase-Probe und wobei bevorzugt die Gewebeprobe durch ein Verfahren umfassend Kernbiopsie, Tumorresektion, flüssige Biopsie und/oder Nadel-Aspiration erhalten wurde und/oder wobei die Gewebeprobe und/oder die dissoziierten Zellen vor der Erzeugung der 3D Mikrogewebe gefroren und erneut aufgetaut werden.
Punkt 12. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 11, wobei Schritt a) ein Dissoziieren der Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe umfasst, umfassend i) gegebenenfalls, physisch zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke umfassend Zellen, ii) Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung umfassend mindestens ein Enzym das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu Dissoziieren, bevorzugt mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuclease I und neutrale Protease (Dispase), was einen Überstand umfassend dissoziierte Zellen herstellt, und iii) Entfernen des Überstands umfassend die dissoziierten Zellen und geeignetes Sammeln der Zellen.
Punkt 13. Verfahren nach Punkt 12, wobei Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt werden, wobei bevorzugt vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt wird, wobei die Energie des Ultraschalls auf einen geeigneten Spiegel eingestellt wird, um nicht eine wesentliche Menge der Zellen zu zerstören.
Punkt 14. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 13, wobei Schritt a) ein Hinzufügen oder Entfernen von Stromazellen, stromaler Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen umfasst, und/oder worin in Schritt a) für jedes 3D Mikrogewebe eine vorbestimmte Zahl an Zellen zur Verfügung gestellt wird, wie zum Beispiel zwischen 500 und 10000 lebensfähige Zellen und/oder worin in Schritt a) die 3D Mikrogewebe in mindestens einem System ausgewählt aus einem Hanging-Drop-System und einem Multiwell-System, bevorzugt umfassend Ultra Low Adherence (ULA) Wells, erzeugt werden.
Punkt 15. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 14, wobei das Bestimmen der physiologischen Parameter in Schritt f) und/oder k) ausgewählt ist aus einer Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe, Quantifizierung der internen Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe und Bestimmen von ausgewählten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe, wobei bevorzugt die Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe mindestes einen Parameter ausgewählt von Durchmesser, Perimeter, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts umfasst, wobei bevorzugt die Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung umfasst, und gegebenenfalls weiter umfassend die Analyse von Wachstumskinetiken.
Punkt 16. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 15, wobei nur eine Fraktion/ein Aliquot der Zellen analysiert wird und wobei das Verfahren gegebenenfalls zur Verfügung stellen einer primären Gewebeprobe, Erhalten einer Unterprobe zusätzlich zu dem Patienten-abgeleiteten Probe und Unterziehen der Unterprobe von mindestens einem von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse umfasst.
Punkt 17. Verfahren zur Identifizierung von adversen Effekten, die mit einer Behandlung mit einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen in einem Patienten assoziiert sind, umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem der Punkte 1 bis 16, weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren des Patienten-spezifischen Wirkstoffs oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen auf adverse Effekte in dem Patienten.
Punkt 18. Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem der Punkte 1 bis 17, umfassend Identifizieren von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen basierend auf dem/den Effekt(en) wie bestimmt und Stratifizieren des Patienten basierend auf dem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Punkt 19. Verfahren zur Überwachung der Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, Behandeln des Patienten mit dem mindestens einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert und Wiederholen des Verfahrens nach einem der Punkte 1 bis 18 an einer Probe des Patienten wie behandelt und gegebenenfalls Einstellen der Behandlung basierend auf dem/den Ergebnis(sen) des Wiederholens.
Punkt 20. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 19, wobei der Schritt von Identifizieren und/oder Auswählen die Verwendung von zusätzlichen klinischen Parametern, wie zum Beispiel Patienten-spezifischen Daten und/oder der Behandlungsgeschichte einschließt.
Punkt 21. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 20, wobei das Verfahren zumindest teilweise und bevorzugt vollständig automatisiert ist, umfassend die Verwendung von mindestens einem Roboter und/oder Computer-Vorrichtung.
Punkt 22. Testsystem umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Punkte 1 bis 21, umfassend a) eine Einheit zur Kultivierung eines Arrays an 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe abgeleitet von dem Patienten wie zur Verfügung gestellt, b) eine Wirkstoff-Testeinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen oder Kombination oder Panel oder Gruppe an zu testenden Wirkstoffen in Übereinstimmung mit deren jeweiliger t½-Zeitdauer(n) (T_L1, und/oder T_L2, T_L3, ...), c) eine erste Analyseeinheit zum Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und d) eine zweite Wirkstoff-Testeinheit zum Entfernen des Wirkstoffs oder Panel oder Kombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen aus der Kultur zu Zeitpunkt R.
Punkt 23. Testsystem nach Punkt 22, weiter umfassend Mittel zur Identifizierung von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen basierend auf dem/den Effekt(en) wie bestimmt und gegebenenfalls weiter umfassend Mittel zur Auswahl des Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Punkt 24. Testsystem nach Punkt 22 oder 23, weiter umfassend mindestens eine Datenbank zum Sammeln und/oder Speichern von Daten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus t½-Zeitdauern, Daten im Hinblick auf die Vorauswahl und/oder Gruppierung der Kombination oder Panel an Wirkstoffen, physiologischen Parametern, Daten im Hinblick auf den/die Effekt(e) der Wirkstoffe oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen davon, Daten im Hinblick auf adverse Effekte, Daten im Hinblick auf zusätzliche klinische Parameter, wie zum Beispiel Patienten-spezifischen Daten und/oder Behandlungsgeschichte, Daten im Hinblick auf die Stratifizierung und/oder Überwachung, und Daten zur Automatisierung des Systems, zum Beispiel zur Kontrolle von mindestens einem Roboter.
Punkt 25. Testsystem nach einem der Punkte 22 bis 24, weiter umfassend mindestens einen Inkubations-Timer.
Punkt 26. Testsystem nach einem der Punkte 22 bis 25, weiter umfassend mindestens ein Wirkstoffreservoir und/oder eine Gewebeprobe-Zerteilungseinheit.
Punkt 27. Testsystem nach einem der Punkte 22 bis 26, weiter umfassend mindestens ein Mittel zur Bestimmung physiologischer Parameter ausgewählt aus einer Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe, Quantifizierung der internen Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe und Bestimmen von ausgewählten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe, wobei bevorzugt das Mittel zur Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe Mittel für mindestens einem Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Perimeter, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts umfasst, und Mittel für Analyse von Wachstumskinetiken umfasst.
Punkt 28. Computerprogramm, umfassend Mittel zur Kontrolle des Testsystems nach einem der Punkte 22 bis 27, insbesondere ein Computerprogramm umfassend Daten für mindestens einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe an Wirkstoffen wie identifiziert und/oder wie ausgewählt nach einem Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 16, wobei bevorzugt das Computerprogramm auf dem Testsystem nach einem der Punkte 22 bis 27 implementiert ist.
Punkt 29. Verwendung des Testsystems nach einem der Punkte 22 bis 27 oder Computerprogramm nach Punkt 28 zur Erzeugung von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe an Wirkstoffen.
Punkt 30. Mindestens ein Patienten-spezifischer Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert und/oder ausgewählt nach einem Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 16 oder 19.
Die Elemente der Erfindung werden hierin beschrieben. Diese Elemente sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgelistet, es versteht sich jedoch, dass sie auf beliebige Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu schaffen. Die verschieden beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung nur auf die explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränken. Diese Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen stützt und umfasst, die zwei oder mehr der explizit beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder die eine oder mehrere der explizit beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Elemente kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller beschriebenen Elemente in dieser Anmeldung als durch die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung offenbart betrachtet werden, es sei denn, der Kontext gibt etwas anderes vor.

1 zeigt beispielhafte Beziehungen der in vivo-Pharmakokinetik und der daraus resultierenden abgeleiteten in vitro-Behandlungszeit in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, t_1/2 ist die Halbwertszeit des Wirkstoffs, t_max ist die Zeit zwischen der Verabreichung eines Wirkstoffs bis zum Erreichen der maximalen Plasmakonzentration (C_max).
2 veranschaulicht den allgemeinen Arbeitsablauf einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, d. h. die von der Expositionszeit abhängige Wirkstoffzugabe und Inkubation auf Zellen/Gewebe.
3 zeigt die Auswirkungen der Wirkstoffdosierung und unterstreicht die Bedeutung der Integration von pharmakokinetischen Parametern und Dosierungsplänen in einen - in diesem Fall - langfristigen zellbasierten Wirkstoffreaktionstest. Ein Pankreaskrebs-Mikrotumormodell, das aus Panc-1-Krebszellen und NIH3T3-Fibroblasten bestand, wurde entweder mit Gemcitabin oder 5-Fluouracil behandelt. Beide Wirkstoffe wurden entweder einmal für 7 Stunden oder erneut für weitere 7 Stunden mit einer Erholungszeit von 48 Stunden dazwischen verabreicht (vier unabhängige Experimente). Während die erneute Dosierung von Gemcitabin zu einer erhöhten Effizienz führte, verbesserte sich die 5FU-Effizienz nicht.
4 zeigt eine schematische Übersicht einer Wirkstofftestung.
5 zeigt eine schematische Übersicht eines Wirkstofftestschemas mit drei verschiedenen Wirkstoffen.
6 zeigt eine schematische Übersicht eines Wirkstofftestschemas gemäß Tabelle 1 (eine Dosierungsrunde).

BEISPIELE
Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die hierin dargelegte Beschreibung, Figuren und Tabellen veranschaulicht. Solche Beispiele der Verfahren, Verwendungen und anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung sind nur repräsentativ und sollten nicht so verstanden werden, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung auf nur solche repräsentativen Beispiele beschränken. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hierin zitierten Referenzen hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Gewebepräparation und Mikrogewebeerzeugung
Eine von einem menschlichen Krebspatienten erhaltene Gewebebiopsieprobe wurde in ein geeignetes Medium in Form einer Antibiotika-enthaltenden Transportlösung gegeben. Optional kann zur weiteren Verarbeitung eine hypotonische Lösung zugegeben werden.
Das Gewebebiopsie-Probenmaterial wurde bei 4°C versandt. Für eine Gewebebiopsieprobe von 100 mg wurde ein Volumen von 1,5 ml Transportmedium, das die Gewebeprobe umfasste, verwendet.
Zur Hämolyse, um rote Blutkörperchen zu lysieren, wurde die Gewebeprobe dann einer Beschallung unter Verwendung eines handelsüblichen Beschallungsgeräts bei 1 MHz, 2 Wcm^- ² für 5 Minuten unterzogen. Es wurde darauf geachtet, ein Erhitzen der Gewebeprobe zu verhindern, um die Unversehrtheit der Zellen im Wesentlichen aufrechtzuerhalten, während die Temperatur bei 4°C gehalten wurde. Der Hämolyseschritt wurde für 5 Minuten durchgeführt.
Nach der Beschallung wurde das Medium entfernt und durch ein Medium zur Gewebedissoziation ersetzt. Dazu wurden lytische geeignete(s) Enzym(e) (ausgewählt aus Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuklease I und neutraler Protease (Dispase)) in einem geeigneten Puffersystem für vier Zyklen von jeweils 12 Minuten verwendet. Die Anzahl und Länge der Zyklen kann dem Fortschritt der Gewebeverdauung angepasst werden, indem beispielsweise zunächst härtere und danach zunehmend mildere Bedingungen verwendet werden.
Die Gewebedissoziation fand in einem Volumen von 1 ml bei einer Temperatur von 37°C und für 60 Minuten statt.
Dann wurde eine Stopplösung (STOP) (6 ml), die Pferdeserum und solubilisiertes Kollagen enthielt, zu der Lyselösung gegeben, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.
Das Endvolumen dieser Reaktionsmischung betrug 10 ml und die Lösung wurde bei 4°C gehalten. Die so erhaltenen Zellen wurden gewaschen, um Zelltrümmer durch schwerkrafterzwungene Sedimentation von Zellen für 10 Minuten in 2 × 5 ml in Produktionsmedium (DMEM + 10 % FCS) zu entfernen. Anschließend wurden alle großen Gewebetrümmer entfernt, indem 5 ml der Lösung, die die Zellen umfasste, durch einen Filter mit einer Porengröße von 200 µm filtriert wurden und weitere 5 ml Produktionsmedium zugegeben wurden.
Die so erhaltenen Zellen wurden auf eine Mikrotiterplatte übertragen, in diesem Fall eine mit Produktionsmedium vorbeladene 384-Well-Platte, und anschließend bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
Für jede Vertiefung wurden 25 µl der Zellen umfassenden Zellsuspension zu 50 µl Produktionsmedium gegeben, das zuvor in die Vertiefungen der Multiwell-Platte gefüllt wurde. Zusätzlich wurden 25 µl einer Lösung, die unterstützende Zellen umfasste, zu jeder Vertiefung gegeben.
In einer ersten Ausführungsform/Option wurde die so erhaltene Platte direkt in eine sogenannte Profiling Vorrichtung (Unit) zur Gewebereifung (Mikrogewebeerzeugung) überführt.
In einer zweiten Ausführungsform/Option wurde eine separate Gewebereifung innerhalb einer sogenannten Creator Unit durchgeführt. Dies erfordert einen zusätzlichen Inkubator und eine zusätzliche Bildgebungskapazität, wirkt sich jedoch nicht auf den Durchsatz der Profilereinheit aus, die zum Testen anderer Gewebe verwendet werden kann.
Identifizierung der Halbwertszeit der Eliminierung (t½) für die zu testenden Wirkstoffe Die Eliminierungshalbwertszeit oder Wirkstoff-Halbwertszeit t_1/2 betrifft im Allgemeinen die Zeit, die erforderlich ist, damit die Hälfte der verabreichten Wirkstoffdosis aus dem Körper entfernt wird. Für die zu testenden Wirkstoffe, bei denen kein geeignetes t_1/2 aus der Literatur entnommen werden kann, und/oder zum Zweck der Gruppierung oder Bildung von Gruppen von Wirkstoffen, können t_1/2-Werte wie folgt bestimmt werden.
In Übereinstimmung mit den bestehenden Richtlinien werden die Geschwindigkeit (C_max, t_max) und das Ausmaß (AUC) der Resorption des Wirkstoffes aus einer Testformulierung (im Vergleich zur Referenzformulierung) anhand einer Einzeldosisstudie an gesunden freiwilligen Probanden bewertet, gefolgt von einer Blutmessung /Plasmakonzentration der Muttersubstanz und aller wichtigen aktiven Metaboliten (falls vorhanden) für einen Zeitraum von ≥ 3 t ½.
t_max betrifft normalerweise den Zeitraum/die Länge von t ½, da Wirkstoffe mit kurzen Halbwertszeiten tendenziell schnell ihren Höhepunkt erreichen und eliminiert werden, was oft eine häufigere Dosierung oder erneute Dosierung erfordert, um einen Wirkstoff innerhalb seines klinisch wirksamen therapeutischen Bereichs zu halten (siehe auch unten).
Zur Bestimmung der Parameter werden Blutproben nach 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 Stunden entnommen, gegebenenfalls gefolgt von 10 und 12, 18, 24, 30, 36 und 42 Stunden nach Verabreichung. Als allgemeine Regel gilt: Je häufiger Proben um den erwarteten Zeitpunkt der maximalen Konzentration genommen werden, desto genauer sind die Werte von t 1/2 (und t_max und C_max). Die obigen Bestimmungen können bei mehreren Personen durchgeführt werden, und Medianwerte können als Parameter bestimmt werden, z.B. zum Gruppieren (siehe unten) und Testen.
Vorauswahl und/oder Gruppierung der Kombination oder Panel von zu testenden Wirkstoffen
Ein Gruppieren oder eine Vorauswahl von Wirkstoffen kann basierend auf einem oder mehreren der folgenden Parameter erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind:

i) C_max - der Wert, der die maximale verwendete Konzentration definiert,
ii) t_1/2, - Zeit bis ½ des Wirkstoffes durch den Patienten/Zellen beseitigt ist (Halbwertszeit),
iii) Wirkungsdauer [h] (Zeitdauer die ein bestimmter Wirkstoff effektiv ist),
iv) Eliminierungszeit [h] (Zeit, die es für die Konzentration des Wirkstoff im Plasma oder der Gesamtmenge im Körper benötigt, um entfernt zu werden),
v) Fläche unter der Kurve (AUC) [ng*h/ml],
vi) Clearance (CL) [1/h] (entspricht der Rate, mit der ein Wirkstoff aus dem Plasma entfernt wird (mg/min), dividiert durch die Konzentration dieses Wirkstoffs im Plasma (mg/ml)),
vii) Minimale effektive Konzentration (MEC) (minimale Plasmakonzentration eines Wirkstoffs, die erforderlich ist, um eine ausreichende Wirkstoffkonzentration an den Rezeptoren zu erreichen, um die gewünschte pharmakologische Reaktion hervorzurufen, wenn Wirkstoffmoleküle im Plasma im Gleichgewicht mit Wirkstoffmolekülen in den verschiedenen Geweben stehen),
viii) Subtherapeutischer Spiegel (Dosis eines Wirkstoffs, die keine bestimmte therapeutische Wirkung erzielt),
ix) t_max, d.h. Zeit bis C_max erreicht wird.

Wird als bevorzugtes Beispiel die 2-fache Halbwertszeit als Hauptdeterminante für die in vitro Inkubationszeit gewählt, ergibt sich eine Gruppierung (hier: drei Gruppen) ausgewählter Arzneistoffe in der folgenden Tabelle 1:

INN (Name)	t_1/2 [h]	2× t_1/2 [h]	In vitro Expositionszeit [h]	Expositionszeit Gruppe
Erlotinib	24,4	48,8	65	1
Docetaxel	41	82	65	1
Trametinib	4,8	9,6	14	2
Olaparib	11,9	23,8	14	2
Pemetrexed	4,4	8,8	14	2
Fluorouracil	0,3	0,6	0,6	3
Gemcitabine	0,23	0,46	0,6	3

Die Wirkstoffe werden dann basierend auf dem vorgefertigten Wirkstoffpanel in der Reihenfolge ihrer Expositionszeitgruppe aufgetragen/verteilt, um aufeinanderfolgende Inkubationszeiten zu ermöglichen. Die gruppierten Wirkstoffe können aus explorativen und/oder zugelassenen Wirkstoffen bestehen. Vorzugsweise wird die Gruppierung unter Verwendung einer Datenbank für Wirkstoffeigenschaften und eines Computerprogramms zum Erzeugen der Panels gemäß den obigen Parametern durchgeführt. Bevorzugt ist der Parameter t_1/2 oder 2× t_1/2.
Erstes Testen der Wirkstoffe
Für die Charakterisierung (Profiling) der kultivierten Zellen in Gegenwart eines Wirkstoffes oder Kombinationen von Wirkstoffen wurde eine 384-Well-Platte mit gereiften Mikrogeweben vorbeladen (falls nicht in der Vorrichtung gereift, wie oben erwähnt).
Die beladene Platte wurde unter Verwendung einer automatisierten Robotervorrichtung, wie z. B. eines KUKA LBR Med-Leichtbauroboters, in einen Inkubator bewegt. Die Platte wurde in den Inkubator gestellt und weiter zu einer bildgebenden Einheit bewegt. Die Platte mit 384 Vertiefungen wurde dann in einem Lesegerät, beispielsweise einem QC-Imager, 10 Minuten lang bildanalysiert. Die Platte wurde dann zu einer Flüssigkeitshandhabungseinheit/-station bewegt und das Wachstumsmedium wurde ausgetauscht.
Dann wurde der erste zu testende Wirkstoff, die Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder das erste Wirkstoffpanel mit den Mikrogeweben in Kontakt gebracht. Pro Platte mit 384 Vertiefungen waren etwa 30 ml erforderlich. Wirkstoff wurden in Form einer vorgefertigten Wirkstofflösungsmatrix in Medium auf einer separaten Platte mit 384 Vertiefungen bereitgestellt und (jeweils) bei C_max gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht. Die Operation wurde von einem Roboter durchgeführt, der von einer entsprechenden Software gesteuert wurde.
Optional wurde die Platte dann erneut zum Imaging-System bewegt und in einem 384-Well-Platten-HD-Imaging-System für zwischen 10 und 30 Minuten (d. h. 10, 15, 20, 25 oder 30 Minuten, je nach dem) einer Bildgebung unterzogen, in Abhängigkeit von t_1/2 des ersten Wirkstoffes, der Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder des Panels von Wirkstoffen, die getestet werden sollten. Die Platte wurde dann zurück in die Inkubatoreinheit bewegt, und die Mikrogewebezellen wurden für (in diesem Fall) 2 Stunden inkubiert, was R/2 entsprach.
Dann wurde der zweite Wirkstoff, die Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder die Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden soll, mit den Mikrogeweben in Kontakt gebracht. Auch hier waren etwa 30 ml pro 384-Well-Platte notwendig. Wirkstoff wurden in Form einer vorgefertigten Wirkstofflösungsmatrix in Medium auf einer separaten Platte mit 384 Vertiefungen zugeführt und jeweils bei C_max gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht. Die Operation wurde von einem Roboter durchgeführt, der von einer entsprechenden Software gesteuert wurde.
Wieder als Option, wurde die Platte dann wieder zum Bildgebungssystem bewegt und in einem 384-Well-Platten-HD-Bildgebungssystem für zwischen 10 und 30 Minuten (d. h. 10, 15, 20, 25 oder 30 Minuten, je nach dem) einer Bildgebung unterzogen, in Abhängigkeit vom t_1/2 des zweiten Wirkstoffs, der Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder des Panels von zu testenden Wirkstoffen. Die Platte wurde dann zurück in die Inkubatoreinheit bewegt, und die Mikrogewebezellen wurden für (in diesem Fall) 2 Stunden inkubiert, wobei Zeitpunkt R erreicht wurde.
Die getesteten Wirkstoffe werden dann entfernt und die Platte wird dann von der Inkubatoreinheit zu einer Flüssigkeitshandhabungsstation bewegt. Das Medium wurde zweimal in einem Zeitraum von etwa 20 Minuten ausgetauscht, und Medium ohne Wirkstoff wurde hinzugefügt.
Optional wird die Platte zum Bildgebungssystem bewegt und 10 Minuten lang einer QC-Bildgebung unterzogen. Danach wird die Platte wieder in die Inkubatoreinheit verbracht und bis zum Erreichen von 3,5 Tagen inkubiert. Das Medium wurde dann noch zweimal, am Tag 7 und 10,5, ausgetauscht.
In einer Ausführungsform des Testprotokolls wird entweder ein (mindestens ein) erneuter Dosierungsschritt (z. B. an Tag 7) unter Verwendung desselben Wirkstoffs, derselben Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder desselben Panel von Wirkstoffen, die wie oben getestet werden sollen, durchgeführt, oder ein (bei es kann mindestens ein) unterschiedlicher Dosierungsschritt unter Verwendung eines anderen Wirkstoffs, einer anderen Gruppe (Kombination) von Wirkstoffen oder eines Panels von zu testenden Wirkstoffen oder einer Mischung aus denselben oder unterschiedlichen Substanzen kann eingeführt werden.
Am letzten Testtag, hier Tag 14, wird/werden das/die Mikrogewebe einer Analyse unterzogen. Die Platte wird aus der Inkubatoreinheit entfernt und zur Bildgebungseinheit bewegt, wo sie einer HD-Bildgebung unterzogen wird. Als optische Anzeigeoptionen kann die Größe als primäre Anzeige genommen werden und mehrere Parameter können als sekundäre Optionen ausgewählt werden, wie etwa mindestens ein Parameter, ausgewählt aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts.
Die entsprechenden Daten wurden erhoben und für weitere Auswertungen gespeichert. Alle Schritte wurden von einem Roboter durchgeführt, der von einer entsprechenden Software gesteuert wurde.
Zusätzliche Testlayouts mit unterschiedlichen Pharmakokinetiken
In einer anderen Ausführungsform wird ein erster Testwirkstoff mit einer t½ von 6 Stunden einer Mikrogewebekultur in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) am Tag 0 des Assays zugesetzt. Ein zweiter Testwirkstoff mit einer t½ von 3 Stunden wird 3 Stunden später wieder in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Ein dritter Testwirkstoff mit einer t½ von 1,5 Stunden wird 1,5 Stunden später erneut in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Nach einer gemeinsamen Inkubation von 1,5 Stunden erreichten folglich alle getesteten Medikamente gleichzeitig ihre t½ (R).
Die Testbedingungen und die Analyse waren in Übereinstimmung mit dem Obigen, außer dass es keinen Schritt der erneuten Dosierung gab.
In einer anderen Ausführungsform wird ein erster Testwirkstoff mit einer t½ von 8 Stunden einer Mikrogewebekultur in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) am Tag 0 des Assays zugesetzt. Ein zweiter Testwirkstoff mit einer t½ von 4 Stunden wird 4 Stunden später wieder in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Ein dritter Testwirkstoff mit einer t½ von 1,5 Stunden wird 2.5 später erneut in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Nach einer gemeinsamen Inkubation von 1,5 Stunden erreichten folglich alle getesteten Medikamente gleichzeitig ihre t½ (R).
In einem erneuten Dosierungsschritt wird der erste Testwirkstoff mit einer t ½ von 8 Stunden erneut zu der Mikrogewebekultur in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) am Tag 0 des Assays zugegeben. Ein vierter Testwirkstoff mit einer t ½ of 6 von 6 Stunden wird 2 Stunden später wieder in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Der dritte Testwirkstoff mit einer t ½ 1,5 Stunden wird 2,5 Stunden später erneut in einer vorbestimmten Konzentration (C_max) zugegeben. Nach einer gemeinsamen Inkubation von 1,5 Stunden erreichen folglich alle getesteten Medikamente gleichzeitig ihre t ½ (R).
Die Testbedingungen und die Analyse waren in Übereinstimmung mit dem Obigen.
Nachdosierungsbeispiel bei Bauchspeicheldrüsenkrebs
Ein Pankreaskrebs-Mikrotumormodell, bestehend aus Panc-1-Krebszellen und NIH3T3-Fibroblasten, wurde entweder mit Gemcitabin (GEM) und/oder 5-Fluouracil (5-FU) behandelt. Beide Wirkstoffe wurden entweder einmal für 7 Stunden oder erneut für weitere 7 Stunden mit einer Erholungszeit von 48 Stunden dazwischen verabreicht (vier unabhängige Experimente).
Während die erneute Dosierung von Gemcitabin zu einer erhöhten Effizienz führte, verbesserte sich die 5-FU-Effizienz nicht (2).
Beispiel mit mehreren Wirkstoffen

Für dieses Experiment wurde ein Panel von Wirkstoffen vorausgewählt, wie in Tabelle 2 unten gezeigt. Das Behandlungsschema wird in 6 gezeigt. Tabelle 2. Panel von Wirkstoffen wie verwendet für die vorliegenden Beispiele mit Parametern wie identifiziert. Behandlungszeit = R = t_max + t_1/2

Verbindung	Cmax Mensch [ug/ml]	t_max [h]	t_1/2 [h]	Behandlungszeit [h], eq. R
Gemcitabin (GEM)	18,5	---	0,23	0,23
Abraxam (Proteingebundenes Paclitaxel) (ABR)	4,2	---	20,2	20,2
Trametinib (TRA)	0,022	2	4,35	6,35
Olaparib (OLA)	5,8	1,3	11,9	13,2
Oxaliplatin (OXA)	1,2	---	1,86	1,86
Erlotinib (ERL)	2,3	5,5	24,4	29,9
Docetaxel (DOC)	1,5-2,5	---	41	41
Pemetrexed (PEM)	90-150	---	4,4	4,4

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2020/242594 A1 [0006]
WO 2021/110799 [0064]

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Effektivität mindestens eines, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination zur Behandlung eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst a) Bereitstellen mindestens einer Kultur eines 3D-Mikrogewebes, wie beispielsweise eines Mikrotumors, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe, die von einem Patienten stammt, b) Bereitstellen eines zu testenden Wirkstoffes oder einer Kombination oder eines Panels von Wirkstoffen, c) Identifizieren der t½-Zeitspanne(n) für den Wirkstoff oder die Kombination oder das Panel von Wirkstoffen aus Schritt b), d) gegebenenfalls, Vorauswahl oder Gruppierung der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen gemäß den t½-Zeiträumen, wie in Schritt c) identifiziert, e) In Kontakt bringen der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die als die längste(n) t½ Zeitspanne(n) (T_L1) aufweisend identifiziert wurden, wobei das/die Ende(n) dieser Zeitspanne(n) den/die Zeitpunkt(e) für eine Entfernung R des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der zu testenden Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur definiert/definieren, f) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, vorzugsweise einer Anordnung von Kulturen, mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen, die getestet werden sollen, und gegebenenfalls Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur, g) im Anschluss an e), Kontaktieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, von denen festgestellt wurde, dass sie (eine) kürzere t½-Zeitspanne(n) (T_L2) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder der Kombination aufweisen, oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, die in Schritt e) zum Zeitpunkt R minus T_L2 getestet werden sollen, h) Inkubieren der mindestens einen 3D-Mikrogewebekultur mit den zu testenden Wirkstoffen oder Kombinationen oder Panels oder Gruppen von Wirkstoffen, i) gegebenenfalls, Wiederholen der Schritte g) und h) mit mindestens einer Wirkstoff- oder Panelkombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen, die einen kürzeren t½-Wert oder kürzere t½-Werte (T_L3, T_L4, ...) im Vergleich zu dem Wirkstoff oder Panel oder der Gruppe der zu testenden Wirkstoffe in den vorherigen Schritten zu den Zeitpunkten R minus T_L3, R minus T_L4, .... aufweisen, j) Entfernen des zu testenden Wirkstoffes oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen aus der Kultur zum Zeitpunkt R, und k) Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf mindestens einen physiologischen Parameter des mindestens einen Wirkstoffs oder Panels oder der Kombination oder Gruppe von Wirkstoffen auf die mindestens eine 3D-Mikrogewebekultur, und 1) gegebenenfalls, Identifizieren mindestens eines patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Kombination oder Gruppe oder Gruppe von Wirkstoffen auf der Grundlage der ermittelten Wirkung(en), und gegebenenfalls ferner umfassend den Schritt des Auswählens des patientenspezifischen Wirkstoffes oder der Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R weiterhin die Zeit zu t_max für den Wirkstoff oder die Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen einschließt, d.h. R = t_max + t½.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine Kultur eines 3D-Mikrogewebes mit dem Wirkstoff oder der Kombination oder dem Panel oder der Gruppe von Wirkstoffen in der C_max-Konzentration in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Identifizieren des/der ½ Werts/e für den Wirkstoff oder Kombination oder Panel von zu testenden Wirkstoffen ein Testen des Wirkstoffs in einem Subjekt oder einer Gruppe an Subjekten umfasst, oder ein Identifizieren des t½ aus der Literatur oder einer Datenbank umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Panel oder Kombination von Wirkstoffen zumindest teilweise basierend auf den t½ Werten wie in Schritt c) identifiziert etabliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das in Kontakt bringen in Schritt e) oder g) ein Aussetzen gegenüber einem Wirkstoff oder gleichzeitig gegenüber mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Inkubationszeit zwischen 7 bis 28 Tage ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zu testenden Wirkstoffe ausgewählt sind aus anti-Krebs Wirkstoffen, wie zum Beispiel alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten, natürlichen Produkten, Hormonen, Tyrosininhibitoren, chemotherapeutischen Verbindungen, anti-Krebs Antikörpern, insbesondere Gemcitabin, Abraxam, Trametinib, Olaparib, Oxaliplatin, Erlotinib, Erlotinib, 5-FU, Docetaxel und Pemetrexed.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die zu testenden Wirkstoffe als eine vorgefertigte Wirkstoffmatrix dem Test zugeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Patient ein Säuger-Patient, insbesondere ein Mensch ist und wobei bevorzugt der Patient leidet an oder diagnostiziert ist für eine neoplastische Erkrankung oder Tumor.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Patienten-abgeleitete Gewebeprobe ausgewählt ist aus einer Unter-Probe abgeleitet von einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe und einer Metastase-Probe und wobei bevorzugt die Gewebeprobe durch ein Verfahren umfassend Kernbiopsie, Tumorresektion, flüssige Biopsie und/oder Nadel-Aspiration erhalten wurde und/oder wobei die Gewebeprobe und/oder die dissoziierten Zellen vor der Erzeugung der 3D Mikrogewebe gefroren und erneut aufgetaut werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei Schritt a) ein Dissoziieren der Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe umfasst, umfassend i) gegebenenfalls, physisch zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke umfassend Zellen, ii) Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung umfassend mindestens ein Enzym das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu Dissoziieren, bevorzugt mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuclease I und neutrale Protease (Dispase), was einen Überstand umfassend dissoziierte Zellen herstellt, und iii) Entfernen des Überstands umfassend die dissoziierten Zellen und geeignetes Sammeln der Zellen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt werden, wobei bevorzugt vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt wird, wobei die Energie des Ultraschalls auf einen geeigneten Spiegel eingestellt wird, um nicht eine wesentliche Menge der Zellen zu zerstören.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei Schritt a) ein Hinzufügen oder Entfernen stromaler Zellen, stromaler Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen umfasst, und/oder worin in Schritt a) für jedes 3D Mikrogewebe eine vorbestimmte Zahl an Zellen zur Verfügung gestellt wird, wie zum Beispiel zwischen 500 und 10000 lebensfähige Zellen und/oder worin in Schritt a) die 3D Mikrogewebe in mindestens einem System ausgewählt aus einem Hanging-Drop-System und einem Multiwell-System, bevorzugt umfassend Ultra Low Adherence (ULA) Wells, erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Bestimmen der physiologischen Parameter in Schritt f) und/oder k) ausgewählt ist aus einer Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe, Quantifizierung der internen Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe und Bestimmen von ausgewählten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe, wobei bevorzugt die Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe mindestes einen Parameter ausgewählt von Durchmesser, Perimeter, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts umfasst, wobei bevorzugt die Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung umfasst, und gegebenenfalls weiter umfassend die Analyse von Wachstumskinetiken.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei nur eine Fraktion/ein Aliquot der Zellen analysiert wird und wobei das Verfahren gegebenenfalls zur Verfügung stellen einer primären Gewebeprobe, Erhalten einer Unterprobe zusätzlich zu dem Patienten-abgeleiteten Probe und Unterziehen der Unterprobe von mindestens einem von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse umfasst.
Verfahren zur Identifizierung von adversen Effekten, die mit einer Behandlung mit einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen in einem Patienten assoziiert sind, umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren des Patienten-spezifischen Wirkstoffs oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen auf adverse Effekte in dem Patienten.
Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend Identifizieren von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen basierend auf dem/den Effekt(en) wie bestimmt und Stratifizieren des Patienten basierend auf dem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Verfahren zur Überwachung der Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, Behandeln des Patienten mit dem mindestens einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert und Wiederholen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 an einer Probe des Patienten wie behandelt und gegebenenfalls Einstellen der Behandlung basierend auf dem/den Ergebnis(sen) des Wiederholens.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Schritt von Identifizieren und/oder Auswählen die Verwendung von zusätzlichen klinischen Parametern, wie zum Beispiel Patienten-spezifischen Daten und/oder der Behandlungsgeschichte einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das Verfahren zumindest teilweise und bevorzugt vollständig automatisiert ist, umfassend die Verwendung von mindestens einem Roboter und/oder Computer-Vorrichtung.
Testsystem umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21, umfassend a) eine Einheit zur Kultivierung eines Arrays an 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf dissoziierten Zellen einer Gewebeprobe abgeleitet von dem Patienten wie zur Verfügung gestellt, b) eine Wirkstoff-Testeinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen oder Kombination oder Panel oder Gruppe an zu testenden Wirkstoffen in Übereinstimmung mit deren jeweiliger t½-Zeitdauer(n) (T_L1, und/oder T_L2, T_L3, ...), c) eine erste Analyseeinheit zum Bestimmen einer Wirkung der Wirkstoffe oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und d) eine zweite Wirkstoff-Testeinheit zum Entfernen des Wirkstoffs oder Panel oder Kombination oder Gruppe von zu testenden Wirkstoffen aus der Kultur zu Zeitpunkt R.
Testsystem nach Anspruch 22, weiter umfassend Mittel zur Identifizierung von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen basierend auf dem/den Effekt(en) wie bestimmt und gegebenenfalls weiter umfassend Mittel zur Auswahl des Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert.
Testsystem nach Anspruch 22 oder 23, weiter umfassend mindestens eine Datenbank zum Sammeln und/oder Speichern von Daten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus t½-Zeitdauern, Daten im Hinblick auf die Vorauswahl und/oder Gruppierung der Kombination oder Panel an Wirkstoffen, physiologischen Parametern, Daten im Hinblick auf den/die Effekt(e) der Wirkstoffe oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen davon, Daten im Hinblick auf adverse Effekte, Daten im Hinblick auf zusätzliche klinische Parameter, wie zum Beispiel Patienten-spezifischen Daten und/oder Behandlungsgeschichte, Daten im Hinblick auf die Stratifizierung und/oder Überwachung, und Daten zur Automatisierung des Systems, zum Beispiel zur Kontrolle von mindestens einem Roboter.
Testsystem nach einem der Ansprüche 22 bis 24, weiter umfassend mindestens einen Inkubations-Timer.
Testsystem nach einem der Ansprüche 22 bis 25, weiter umfassend mindestens ein Wirkstoffreservoir und/oder eine Gewebeprobe-Zerteilungseinheit.
Testsystem nach einem der Ansprüche 22 bis 26, weiter umfassend mindestens ein Mittel zur Bestimmung physiologischer Parameter ausgewählt aus einer Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe, Quantifizierung der internen Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe und Bestimmen von ausgewählten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe, wobei bevorzugt das Mittel zur Größenbestimmung der 3D Mikrogewebe Mittel für mindestens einem Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Perimeter, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts umfasst, und Mittel für Analyse von Wachstumskinetiken umfasst.
Computerprogramm umfassend Mittel zur Kontrolle des Testsystems nach einem der Ansprüche 22 bis 27, insbesondere ein Computerprogramm umfassend Daten für mindestens einen Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe an Wirkstoffen wie identifiziert und/oder wie ausgewählt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei bevorzugt das Computerprogramm auf dem Testsystem nach einem der Ansprüche 22 bis 27 implementiert ist.
Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 22 bis 27 oder Computerprogramm nach Anspruch 28 zur Erzeugung von mindestens einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe an Wirkstoffen.
Mindestens ein Patienten-spezifischer Wirkstoff oder Kombination oder Panel oder Gruppe von Wirkstoffen wie identifiziert und/oder ausgewählt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder 19.