DE2530678A1 - Testvorrichtung fuer einen direkten radioimmuntest fuer antigene und antikoerper - Google Patents

Testvorrichtung fuer einen direkten radioimmuntest fuer antigene und antikoerper

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DE2530678A1 DE19752530678 DE2530678A DE2530678A1 DE 2530678 A1 DE2530678 A1 DE 2530678A1 DE 19752530678 DE19752530678 DE 19752530678 DE 2530678 A DE2530678 A DE 2530678A DE 2530678 A1 DE2530678 A1 DE 2530678A1
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Description

Patentanwälte:
Dr. Ing. Waltor Abltz
Dr. Dieter F.-Morf g. Juli 1975
Dr. Hans-Α. Brauns 3146
HQnchen 80, Pienzenauentr. 28
ABBOTT LABORATORIES
North Chicago, 111: 6ΟΟ65, V.St.A.
Testvorrichtung für einen direkten Radioimmuntest
für Antigene und Antikörper
Die Erfindung betrifft eine Diagnosevorrichtung für
einen Radioimmuntest für Antigene und deren Antikörper, insbesondere eine Diagnosevorrichtung für einen direkten Radioimmuntest zum Erkennen von einem mit
Hepatitis verbundenen Antigen oder dessen Antikörper oder Antigenen und Antikörpern.
Obwohl Verfahren zum Erkennen des Vorhandenseins von als Antigen aktiven Makromolekülen, wie intakten Viren, Vixencapsiden Untereinheiten, Bakterien, Membranen, Zellwänden, Hormonen usw. existieren, fehlt ein Verfahren und eine Vorrichtung für einen einfachen,
jedoch empfindlichen Test zum Erkennen des Vorhandenseins dieser Stoffe. Virushepatitis einschließlich der sogenannten Serumhepatitis, die eine relativ verbreitete Krankheit ist, konnte bisher nicht auf einfache Weise durch einen empfindlichen, sowohl spezifischen als auch reproduzierbaren Test nachgewiesen werden,
—. Λ ■_
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•a.
mittels dessen schnell erkannt werden kann, ob das Serum eines Patienten oder eines Spenders mit Hepatitis verbundene Antigene oder Antikörper enthält oder nicht.
Radioiinmuntestverfahren sind in der Vergangenheit für verschiedene Antigen-Antikörper-Stoffe entwickelt worden. Diese Radioimmuntestverfahren, wie z. B. das in Journal of Biochemistry, 1966, Bd. 100, S. 31c und 33 c von Kevin Catt und in Science, Bd. 15'8, S. 1570, 1967, beschriebenen, sind jedoch indirekte Radioimmuntestverfahren, bei denen die vorhandene Antigenmenge der von dem Isotopenindikator emittierten Strahlungsmenge grob proportional ist. Diese Verfahren erfordern die Verwendung von Korrelationstafeln und anderen Hilfsmitteln, die im allgemeinen die Reproduzierbarkeit und Exaktheit der Ergebnisse verschlechtern.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die oben genannten Schwierigkeiten, d. h. der Mangel an Reproduzierbarkeit und Exaktheit, durch Verwendung der vorliegenden Diagnosevorrichtung zusammen mit dem Radioimmuntestverfahren überwunden werden.
Im einzelnen enthält die erfindungsgemäße Diagnosetestvorrichtung ein Behälterbrettchen mit einer Reihe von eingelassenen Behältern zur Aufnahme von Proben, einen Halter, der beschichtete Kügelchen aufnimmt, hält und in die Behälter des Brettchens abgibt, ein Kügelchen-Freigabestück, das über ein Ende des Halters paßt und unter Druck die Kügelchen aus dem Halter freigibt, und eine Kappe, die über das offene Ende des Kügelchen-Freigabestückes paßt.
— 2 —
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Weitere Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen Diagnosetestvorrichtung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den Figuren. Es zeigen
Fig. 1 in einer perspektivischen Ansicht die erfindungsgemäße Testvorrichtung;
Fig. 2 in einer Teil-Schnittansicht von der Seite den Halter und das an einem Ende des Halters angeordnete Kügelchen-Freigabestück, wobei die beschichteten Kügelchen in dem Halter gehalten dargestellt sind, und das Kügelchen-Freigabestück;
Fig. 3 vergrößert in einer Draufsicht und teilweise im- Schnitt das Kügelchen-Freigabestück an dem Ende des Halters;
Fig. 4 in einer Teil-Seitenansicht zusammengebaut den Halter, das Kügelchen-Freigabestück und die Kappe;
Fig. 5 in einer Teil-Schnittansicht die Kappe;
Fig. 6 vergrößert und in einer Seitenansicht das Kügelchen-Freigabestück an dem Ende des Halters, wobei die Freigabe eines beschichteten Kügelchens aus dem Kügelchen-Freigabestück dargestellt ist, und
Fig. 7 in einer Draufsicht das Kügelchen-Freigabestück an dem Halter, wobei die Form des Kügelchen-Freigabestückes dargestellt ist, wenn es zur Freigabe eines beschichteten Kügelchens gedrückt wird.
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Gemäß den Figuren 1 und 4 enthält die erfindungsgemäße Testvorrichtung ein Behälterbrettchen 1, einen Kügelchenhalter 2, ein Kügelchen-Freigabestück 3 und eine Kappe 4/ die über das Kügelchen-Freigabestück paßt. Das Behälterbrettchen 1 besitzt eine Vielzahl von eingelassenen Behältern 5, die Blut- oder Serumproben und beschichtete Kügelchen 7 aufnehmen, die zur Bestimmung des Vorhandenseins von Hepatitis-Antigenen in den Blutoder Serumproben verwendet werden sollen. Die eingelassenen Behälter 5 sind von ausreichender Tiefe und Größe, um ein beschichtetes Kügelchen 7 und eine Blutprobe aufzunehmen. Je nach der Größe des gewünschten Behälterbrettchens 1 kann dieses eine Reihe von eingelassenen Behältern 5 besitzen, deren Anzahl von einigen wenigen sechs bis neun Behältern bis zu fünfzig oder sechzig Behältern reichen kann. Die eingelassenen Behälter 5 können - wie dargestellt - in zueinander parallelen Reihen und in der Weise angeordnet sein, daß das Brettchen 1 auf eine ebene Fläche gestellt werden kann, wenn die beschichteten Kügelchen und die Proben in den einzelnen Behältern 5 abgelegt werden.
Der Kügelchenhalter 2 ist eine hohle Röhre mit einem geschlossenen Ende 9 und einem größeren Durchmesser als die beschichteten Kügelchen oder Bällchen 7, so daß sich diese mit geringem Widerstand durch die Röhre bewegen können. Die beschichteten Kügelchen 7 werden in herkömmlicher Weise durch das dem geschlossenen Ende 9 gegenüberliegenden Ende in die Röhre 2 gegeben. Es werden so viele Kügelchen 7 in die Röhre 2 gegeben, wie darin Platz finden. Die Kügelchen 7 werden auf solche Weise in die Röhre 2 gegeben, daß sie dabei nicht verunreinigt werden. .
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Das Kügelchen-Freigabestück 3 enthält einen Flanschbereich 10, der über ein Ende der Kügelchenhalteröhre 2 paßt. Von dem Flanschende des Kügelchen-Freigabestückes 3 führt ein verengter Bereich 11 weg, der eine schräg geschnittene öffnung 8 besitzt, durch die die beschichteten Kügelchen 7 in die Behälter 5 freigegeben werden. Wie insbesondere in den Figuren 3 und 7 zu sehen ist, befinden sich an dem inneren, umlaufenden Rand der öffnung 8 eine Reihe von Spitzen 6, die die Bewegung der beschichteten Kügelchen 7 durch die öffnung 8 behindern. Die Kügelchen 7 werden von dem Kügelchen-Freigabestück 3 durch die öffnung 8 freigegeben, wenn auf das Stück 3 bei der abgeschrägten öffnung 8 nahe der unteren Spitze 6 Druck ausgeübt wird, wie es in Fig. 6 gezeigt ist. Wenn also eines der beschichteten Kügelchen 7 in einen der eingelassenen Behälter 5 des Behälterbrettehens 1 abgelegt werden soll, wird auf das abgeschrägte Ende 11 des Kügelchen-Freigabestückchens 3 bei der öffnung 8 auf die verlängerte Außenfläche Druck ausgeübt, um ein Kügelchen in einen Behälter 5 fallen zu lassen.
Gemäß Fig. 4 ist eine Kappe 4 vorgesehen, die bündig über das verengte, abgeschrägte Ende 11 des Kügelchen-Freigabestückes 3 paßt. Die Kappe 4 besitzt einen Flanschbereich 13, der über den Flanschbereich 10 des Kügelchen-Freigabestückes 3 paßt. Die Kappe 4 besitzt ein geschlossenes Ende 15, um die Freigabe eines der beschichteten Kügelchen 7 zu verhindern, wenn dies nicht benötigt oder wenn die Vorrichtung nicht verwendet wird.
Das Behälterbrettchen 1 ist vorzugsweise aus einem Kunststoff hergestellt, der haltbar ist und in ein-
— 5 —
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fächer Weise zu den in den Figuren dargestellten Formen geformt werden kann. Die Halteröhre 2, das Kügelchen-Freigabestück 3 und ebenso die Kappe 4 sind vorzugsweise aus einem dauerhaften Kunststoff hergestellt, der transparent sein kann. Abgesehen von der Halteröhre 2 ist es jedoch nicht notwendig, daß diese Teile transparent sind. Die Kügelchen oder Bällchen 7 sollen aus einem Kunststoff hergestellt sein, der in der Blut- oder Serumprobe nicht schwimmt, in das es in den eingelassenen Behältern eingelegt wird. Ein Kunststoff, der sich als zufriedenstellend für die Kügelchen 7 herausgestellt hat, ist Polystyrol.
Die eingelassenen Behälter 5 sind von solcher Form, daß die Kügelchen 7 mit einem Minimum einer Blut- oder Serumprobe bedeckt werden, während sie andererseits groß genug sind, um zu verhindern, daß Luft zwischen dem Kügelchen und dem Behälter eingeschlossen wird. Bei dieser Anordnung kann die Probe mit der Kügelchen-Oberflache in Berührung kommen und ausreichend zwischen dem Kügelchen und dem Behälter schwimmen.
Das Behälterbrettchen 1 kann von jeder gewünschten Größe sein und einige wenige Behälter, z. B. 6 bis 9, oder viele Behälter, z. B. 50 bis 60, besitzen. Die Halteröhre 2 kann eine beliebige Länge besitzen, ist jedoch vorzugsweise ausreichend lang, um mehrere Kügelchen oder so viele Kügelchen wie Behälter 5 in dem Behälterbrettchen 1 sind, aufzunehmen. Das Kügelchen-Freigabestück 3 und die Kappe 4 haben eine entsprechende Größe, um bündig über die Halteröhre 2 bzw. das Kügelchen-Freigabestück 3 zu passen.
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Zur Bildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung müssen die Polystyrolkügelchen 7 entweder mit einem Antigen oder Antikörper beschichtet sein. Eine Lösung von mit Hepatitis verbundenen Antikörpern eines Anti-Australia-Antigens mit einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 Mikrogramm Protein pro Milliliter wird auf etwa 0,005 bis etwa 0,02 molarer Tris-HCl, d. h. 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol -HCl, unter Verwendung eines Anti-Australia-Antigen-Serums hergestellt. Zusammen mit etwa 0,01 % bis etwa 0,05 % Natriumazid puffert die Tris-HCl die Lösung auf einen pH-Wert von etwa 7,1 bis etwa 9,5. Ein Milliliter dieser Lösung von mit Hepatitis verbundenen Antikörpern wird dann durch 6 bis 72 Stunden dauerndes Bebrüten bei Raumtemperatur als Schicht auf die Kügelchen-Oberflächen· aufgebracht. Diese beschichteten Polystyrolkügelchen 7 werden kann mit 0,05 bis etwa 0,02 molarer Tris-HCl bei einem pH-Wert von 6,9 bis 8,4 und etwa 0,01 % bis etwa 0,05 % Natriumazid gewaschen. Nach diesem Wasch- und Spülvorgang können die Testkörper bei 4 0C gelagert werden, bis sie für einen Radioimmuntest benötigt werden.
Zum Bebrüten und Waschen wird vorzugsweise eine 0,01 molare Lösung von Tris-HCl-Hydrochlorid und 0,2 % Natriumazid, gepuffert auf einen pH-Wert von 7,1, verwendet .
Der auf die Oberflächen der Polystyrolkügelchen aufgebrachte überzug der Antikörperlösung ist vorzugsweise eine dünne Schicht. Für den erfindungsgemäßen Test werden keine Standard-Kurven oder -Karten benötigt. Es ist daher in dem überzug keine bestimmte Menge an
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Antigen erforderlich, solange zwei ähnliche Kügelchen verwendet werden.
Obwohl die erfindungsgemäße Diagnosevorrichtung verwendet werden kann, um das Vorhandensein jedes geeigneten Antigens oder seines Antikörpers durch ein einfaches Ja-Nein-Verfahren festzustellen, wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung nun im Hinblick auf das Verfahren zum Erkennen des Vorhandenseins von einem mit Hepatitis verbundenen Antigen beschrieben.
Erfindungsgemäß wird die Kappe 4 von der Halteröhre 2 abgenommen, die die Antikörper-beschichteten Kügelchen 7 enthält, wird das Kügelchen-Freigabestück 3 über dem Behälterbrettchen 1 unmittelbar über einem eingelassenen Behälter 5 gehalten und wird für jede zu untersuchende Probe daraus ein Kügelchen 7 in einen Behälter 5 freigegeben, indem mit dem Zeigefinger auf das vorstehende Äußere des Stückes 3 ein Druck ausgeübt wird. Mit einer Präzisionspipette werden dann auf den Boden der entsprechenden Behälter 5 0,2 ml Serum oder Blut und positive und negative Kontrolllösungen zugegeben. Es ist wichtig, sicherzustellen, daß jedes Antikörper-beschichtete Kügelchen 7 vollständig mit der Serum- oder Blutprobe umgeben ist. Um dies sicherzustellen, soll das Brettchen 1 leicht geklopft werden, um jegliche Luftblasen freizumachen, die in der Serumprobe eingeschlossen sein können. Nachdem die Kügelchen 7 mit den Serumproben in die entsprechenden Behälter 5 des Brettchens 1 gegeben worden sind, wird ein Verschlußdeckel an dem Brettchen 1 angebracht, das dann für zwei Stunden in einem Wasserbad von 45 0C bebrütet wird. Am Ende der zwei Stunden
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wird das Brettchen aus dem Wasserbad genommen und wird der Verschlußdeckel abgenommen.
Unter Verwendung eines halbautomatischen Saug- und Spülsystems, einem automatischen Fördersystem und einer Vakuumquelle wird jeder Behälter 5 und jedes Kügelchen 7 mit insgesamt 5 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser gespült. Dieser Waschvorgang soll ein weiteres Mal wiederholt werden. Nach diesem Waschvorgang werden 0,2 ml von mit Hepatitis verbundenen J-125-Antikörpern (vom Menschen) auf den Boden jedes Behälters 5 gegeben. Es ist wichtig, daß die Antikörper-beschichteten Kügelchen 7 vollständig durch die markierte Antikörperlösung umgeben werden. Wie zuvor wird das Brettchen 1 geklopft, um alle in der Lösung eingefangenen Luftblasen freizugeben. Es wird dann ein neuer Verschlußdeckel auf das Brettchen gesetzt, und das Brettchen wird für eine Stunde in einem Wasserbad von 45 0C bebrütet. Am Ende dieser Zeitspanne wird das Brettchen aus dem Wasserbad genommen und wird der Verschlußdeckel entfernt. Es wird dann die Antikörperlösung aus jedem Behälter 5 abgesaugt und jeder Behälter 5 und jedes Antikörper-beschichtete Kügelchen 7 darin mit insgesamt 5 ml von destilliertem oder deionisiertem Wasser wie zuvor gespült.
Nach dem Spülen werden die Kügelchen 7 aus ihren Behältern in ein entsprechend gekennzeichnetes Zählröhrchen überführt, das sich in einem Gestell ausgerichteter Zählröhrchen befindet. Die Kügelchen 7 werden in die Röhrchen überführt, indem zunächst das Gestell der Röhrchen umgekehrt auf das Behälterbrettchen 1 ausgerichtet wird und dann die Röhrchen fest gegen die Be-
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hälter gedrückt werden. Das Brettchen wird dann zusammen mit den Röhrchen auf den Kopf gestellt, wodurch die Kügelchen 7 in die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen fallen. Die Zählröhrchen werden dann in einen geeigneten Gamma-Szintillationszähler der Behälterbauart gegeben, um die Zählrate zu bestimmen. Die Lage der Kügelchen auf dem Boden der Zählröhrchen ist nicht entscheidend. Obwohl es nicht wesentlich ist, daß die Zählung sofort vorgenommen wird, soll sie so bald wie möglich durchgeführt werden. Alle Kontrollproben und unbekannten Proben müssen zusammengezählt werden. Die Strahlungsmenge wird aufgezeichnet und mit einer Kontrollprobe, die gleichzeitig ausgezählt wurde, verglichen, um die Untergrund-Zählrate zu bestimmen. Die unbekannten Testproben werden hinsichtlich der Zählrate, die über der Untergrundrate liegt, als Antigen-positiv betrachtet, wodurch ein einfacher Ja-Nein-Test geschaffen wird, ohne zu Korrelationstabellen und -kurven Zuflucht zu nehmen.
Obwohl die erfindungsgemäße Testvorrichtung anhand der vorausgehenden Ausführungsform beschrieben wurde, soll die erfindungsgemäße Testvorrichtung im Rahmen der nachfolgenden Ansprüche nicht darauf beschränkt sein.
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Claims (10)

9· JaIi 1975 Pa ten tan s pr üche
1. Testvorrichtung zur Verwendung bei einem direkten Radio- '^ immuntest für Antigene oder Antikörper, gekennzeichnet durch
ein Behälterbrettchen (1) mit einer Mehrzahl von eingelassenen Behältern (5) zur Aufnahme von Proben;
einen Kügelchenhalter (2), der beschichtete Kügelchen (7) aufnimmt und in die Behälter (5) des Behälterbrettchens (1) ablegt, und
ein Kügelchen-Freigabestück (3), das auf ein Ende des Kügelchenhalters (2) paßt und eine öffnung (8) besitzt, durch die Kügelchen (7) freigegeben werden, wenn auf die verlängerte Außenfläche des Kügelchen-Freigabestücks (3) Druck ausgeübt wird.
2. Testvorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Kappe (4), die über die öffnung (8) des Kügelchen-Freigabestückes (3) paßt.
3. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Behälterbrettchen (1) eine Reihe von eingelassenen Behältern (5) besitzt, die in zueinander parallelen Reihen angeordnet sind.
4. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kügelchenhalter (2) eine hohle Röhre mit einem geschlossenen Ende (9) ist, das eine Bewegung der PoIystyrolkügelchen (7) durch die Röhre verhindert.
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3146 -
5. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kügelchen-Freigabestück (3) ein abgeschrägtes, offenes Ende (11) mit einer Reihe von Spitzen (6) besitzt, die auf dem umlaufenden Innenrand der abgeschrägten öffnung im Abstand angeordnet sind.
6. Testvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Kügelchen-Freigabestück (3) einen Flanschbereieh (10) besitzt, der bündig über das eine Ende (11) des Kügelchenhalters paßt.
7. Testvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spitzen (6) des Kügelchen-Freigabestückes (3) eines der beschichteten Kügelchen (7) freigeben, wenn auf die verlängerte Außenfläche des Kügelchen-Freigabestückes bei der öffnung (8) Druck ausgeübt wird.
8. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingelassenen Behälter halbkugelförmig sind.
9. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kügelchen (7) Polystyrolkügelchen sind.
10. Testvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingelassenen Behälter so geformt sind, daß eines der beschichteten Kügelchen (7) mit einem Minimum der Blutprobe bedeckt wird und der Einschluß von Luft-zwischen den Kügelchen (7) und dem Behälter (5) verhindert wird. :
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DE19752530678 1974-07-10 1975-07-09 Testvorrichtung fuer einen direkten radioimmuntest fuer antigene und antikoerper Withdrawn DE2530678B2 (de)

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