DE112019007631T5

DE112019007631T5 - Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben und Verfahren zur Analyse biologischer Proben

Info

Publication number: DE112019007631T5
Application number: DE112019007631.0T
Authority: DE
Inventors: Ayaka Okuno; Michiru Fujioka; Toru Yokoyama
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2022-05-12
Also published as: JPWO2021053713A1; CN114391098A; JP7253066B2; GB2602228B; US20220326179A1; WO2021053713A1; GB2602228A; GB202203365D0

Abstract

Die vorliegende Erfindung zielt auf die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben ab, die eine Erhöhung der Genauigkeit eines Analyseergebnisses, eine Senkung der Reagenzienkosten und eine Verkürzung des Zeitaufwands ermöglicht. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben vergleicht erste Messdaten, die durch Messen einer biologischen Probe erhalten wurden, mit zweiten Messdaten, die durch Messen einer Referenzprobe erhalten wurden, und wenn die Differenz zwischen beiden einen Schwellenwert übersteigt, bestimmt sie, dass es erforderlich ist, die Referenzprobe erneut zu messen und einen Referenzwert neu zu erfassen, bevor die biologische Probe erneut gemessen wird.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von biologischen Proben, die eine biologische Probe durch Elektrophorese analysiert.
Stand der Technik
Eine DNA-Analyse durch Elektrophorese schließt eine Fragmentanalyse, eine Sequenzanalyse usw. ein. Als Fragmentanalyse lassen sich ein persönliches DNA-Gutachten, eine MSI (MicroSatellite Instability)-Analyse, eine MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) usw. anführen. Hier wird ein DNA-Gutachten als Beispiel erläutert, doch das vorliegende Patent betrifft nicht unbedingt eine Erfindung, die auf solche Gutachten spezialisiert ist, und ist auch auf andere Beispiele der Fragmentanalyse anwendbar. Die Verwendung von DNA-Tests durch Analyse des Polymorphismus der Desoxyribonukleinsäure (DNA) für kriminalpolizeiliche Ermittlungen und für die Beurteilung von blutsverwandtschaftlichen Beziehungen usw. ist weit verbreitet. Die DNAs von Organismen derselben Spezies weisen Basensequenzen auf, die sich nahezu gleichen, doch an einigen Stellen weisen sie Basensequenzen auf, die unterschiedlich sind. Die Tatsache, dass es zwischen Individuen eine Verschiedenartigkeit in der Basensequenz der DNA gibt, wird als DNA-Polymorphismus bezeichnet und ist auf genetischer Ebene für die Ausbildung individueller Unterschiede verantwortlich.
Zu den Formen des DNA-Polymorphismus gehören „Short Tandem Repeats“ (STR) bzw. Mikrosatelliten. Es ist bekannt, dass die STR ein charakteristisches Sequenzmuster ist, bei dem sich eine kurze Sequenz von etwa 2 bis 7 Basenlängen mehmals bis mehrere zehnmal wiederholt, wobei deren Wiederholungshäufigkeit je nach Individuum unterschiedlich ist. Die Analyse der Kombination von STR-Wiederholungshäufigkeiten am Locus eines bestimmten Gens wird als STR-Analyse bezeichnet.
Bei DNA-Tests für kriminalpolizeiliche Ermittlungen usw. wird die STR-Analyse verwendet, die sich die Eigenschaft zunutze macht, dass die Kombination von STR-Wiederholungshäufigkeiten von Person zu Person unterschiedlich ist. Da der Unterschied in der STR-Wiederholungshäufigkeit aufgrund des Unterschieds in Allelen (alleles Gen) auftritt, wird die STR-Wiederholungshäufigkeit in einem einzelnen DNA-Marker nachstehend als Allel bezeichnet.
Um eine bestimmte Menge an DNA der als DNA-Marker verwendeten STR-Stelle zu extrahieren, wird eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) durchgeführt. Die PCR ist eine Technik, bei der bestimmte Basensequenzen, Primer-Sequenzen genannt, an beiden Enden der Ziel-DNA bestimmt werden, um dadurch nur ein zwischen den Primer-Sequenzen liegendes DNA-Fragment wiederholt zu amplifizieren und eine Probe mit einer bestimmten Menge an Ziel-DNA zu erhalten.
Die Elektrophorese wird durchgeführt, um die Fragmentlänge des durch PCR erhaltenen Ziel-DNA-Fragments zu messen. Die Elektrophorese ist ein Verfahren zur Auftrennung von DNA-Fragmenten, das sich die Tatsache zunutze macht, dass die Migrationsgeschwindigkeit in einem geladenen Migrationsweg von der Länge des DNA-Fragments abhängig ist und die Migrationsgeschwindigkeit umso niedriger ist, je länger das DNA-Fragment ist. In den letzten Jahren ist die Kapillarelektrophorese, die eine Kapillare als Migrationsweg verwendet, als Elektrophoreseverfahren weit verbreitet geworden.
Bei der Kapillarelektrophorese wird ein dünnes Röhrchen, Kapillare genannt, mit einem Migrationsmedium wie z. B. einem Gel gefüllt, und ein DNA-Fragment einer Probe wird in dieser Kapillare einer Elektrophorese unterzogen. Dann wird die DNA-Fragmentlänge untersucht, indem die Zeit gemessen wird, die von Probe benötigt wird, um die Migration über eine festgelegte Entfernung hinweg (in der Regel von einem Ende der Kapillare zum anderen) zurückzulegen. Jede Probe, das heißt, jedes DNA-Fragment ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, und ein Fluoreszenzsignal der migrierten Probe wird durch einen optischen Detektor am Ende der Kapillare detektiert.
Ein durch PCR amplifiziertes DNA-Fragment einer unbekannten Probe wird während der Elektrophorese mit einem Längenstandard gemischt, der mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff als dem des amplifizierten DNA-Fragments markiert ist. Der Längenstandard ist ein Reagenz, das ein DNA-Fragment einer bekannten Basenlänge enthält und als Index der Basenlänge verwendet wird, um den Unterschied in der Mobilität zwischen Injektionen und im Falle mehrerer Kapillaren zwischen Kapillaren zu korrigieren.
Doch streng genommen sind selbst DNA-Fragmente derselben Basenlänge, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, in ihrer Mobilität unterschiedlich. Daher ist es nicht möglich, die Mobilität von DNA-Fragmenten, die mit verschiedenen Farbstoffen markiert sind, allein mit der Information des Längenstandards genau zu berechnen. Deshalb wird empfohlen, wie ab Seite 28 im Protokoll eines Reagenzienkits der Nicht-Patentliteratur 1 beschrieben, ein Reagenz, Allelleiter genannt, mit einer bestimmten Häufigkeit migrieren zu lassen, um eine genauere Analyse zu ermöglichen. Die Allelleiter ist ein Reagenz, das ein Allel mit hoher Erscheinungshäufigkeit enthält, das mit demselben Fluoreszenzfarbstoff markiert ist wie die unbekannte Probe und zur Bestimmung eines Mobilitätskorrekturkoeffizienten für jeden Farbstoff als Referenzdaten verwendet wird. Der Korrekturkoeffizient wird auf der Basis der Referenzdaten dieser Allelleiter bestimmt, und die Mobilität in den Daten der unbekannten Probe wird korrigiert, um die Basenlänge des DNA-Fragments zu analysieren.
Die folgende Patentliteratur 1 beschreibt eine Technik, die ein Verfahren zur Einstellung/Analyse eines Kapillargel-Arrays betrifft, das die Array-Leistung durch Überwachen des Ergebnisses eines Standardprodukts, das einer Allelleiter entspricht, überwacht, um die Genauigkeit des Ergebnisses zu gewährleisten. In derselben Patentliteratur wird die Genauigkeit der Allelleiter als Referenzdaten durch ein System sichergestellt, das anhand der Migrationsergebnisse des vorherigen Durchlaufs ein Array bestimmt, das für die Migration der Allelleiter geeignet ist.
Liste der Bezugsliteratur
Patentliteratur
PTL 1: US2004/0197925
Nicht-Patentliteratur
NPTL 1: GlobalFiler Express PCR Amplification Kit USER GUIDE (Publication Number 4477672, Revision E)
Kurzfassung der Erfindung
Technisches Problem
Die Mobilität eines DNA-Fragments ändert sich stark in Abhängigkeit von der Temperatur innerhalb einer Vorrichtung, der Temperatur der Umgebung außerhalb der Vorrichtung, dem Druck, dem pH-Wert eines Reagenzes, dem Verschlechterungsgrad des Reagenzes, den Betriebsparametern (Spannung und Temperatur einer Migrationseinheit usw.) und dergleichen. Das Ausmaß der Veränderung der Mobilität des DNA-Fragments variiert abhängig vom Typ des zur Markierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs und von der Basenlänge. Daher variiert die relative Geschwindigkeit zwischen dem Längenstandard und dem DNA-Fragment (das mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff als dem des Längenstandards markiert ist) selbst unterhalb der Injektionshäufigkeit, die auf Seite 28 der Nicht-Patentliteratur 1 angegeben ist, wenn sich diese Bedingungen gegenüber dem Zeitpunkt, an dem die Migration der Allelleiter (Referenzdaten) durchgeführt wurde, geändert haben. Dies kann die Korrektur zwischen Farbstoffen beeinträchtigen und zu fehlerhaften Analyseergebnissen führen. Sonst müssen die Referenzdaten durch Migration der Allelleiter neu erfasst werden, obwohl dies in Wirklichkeit nicht erforderlich ist, wenn die obigen Bedingungen sich selbst bei Überschreiten der auf Seite 28 der Nicht-Patentliteratur 1 angegebenen Injektionshäufigkeit nicht geändert haben. Dies erhöht die Kosten für Reagenzien unnötigerweise und reduziert den Systemdurchsatz aufgrund des erhöhten Zeitaufwands.
In Patentliteratur 1 wählt das System automatisch ein Array, das für die Migration der Allelleiter geeignet ist. Die in dieser Literatur beschriebene Technik zielt jedoch nicht darauf ab, die Migration der Allelleiter durchzuführen, um zu bestimmen, ob die Referenzdaten neu erfasst werden sollten.
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die obigen Probleme ersonnen, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben, die die Erhöhung der Genauigkeit des Analyseergebnisses, eine Senkung der Reagenzienkosten und eine Verkürzung des Zeitaufwands ermöglicht.
Lösung des Problems
Eine Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben gemäß der vorliegenden Erfindung vergleicht erste Messdaten, die durch Messen einer biologischen Probe erhalten wurden, mit zweiten Messdaten, die durch Messen einer Referenzprobe erhalten wurden, und wenn die Differenz zwischen beiden einen Schwellenwert überschreitet, bestimmt sie, dass es erforderlich ist, die Referenzprobe erneut zu messen und einen Referenzwert neu zu erfassen, bevor die biologische Probe erneut gemessen wird.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Da einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben gemäß auf der Basis von Messdaten, die durch tatsächliche Messung einer biologischen Probe erhalten werden, bestimmt wird, ob es erforderlich ist, eine Referenzprobe (zum Beispiel eine Allelleiter) erneut zu messen, wird die Genauigkeit eines Analyseergebnisses erhöht. Ferner ist es möglich, die Reagenzienkosten zu senken und den Durchsatz eines Systems zu erhöhen, indem unnötige Neumessungen der Referenzprobe vermieden werden.
Figurenliste

1 ist eine Konfigurationszeichnung einer Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 gemäß einer ersten Ausführungsform.
2 ist ein Ablaufplan, der einen Betriebsablauf der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 beschreibt.
3A ist ein Beispiel einer Fluoreszenzintensitätswellenform in tatsächlichen Probendaten, die in Schritt S202 erfasst wurden.
3B ist ein Beispiel einer Fluoreszenzintensitätswellenform in Referenzdaten.
4 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von d₃₁ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht.
5 ist ein Beispiel einer Fluoreszenzintensitätswellenform in tatsächlichen Probendaten in einer zweiten Ausführungsform.
6 ist ein Graph, der die Veränderung von d₅₁, d₅₂ und d₅₃ zeigt, wenn die Elektrophorese sechzehnmal in einer 30 °C-Umgebung durchgeführt wird, in welcher Polymere zur Zersetzung neigen.
7 ist ein Graph, der die Veränderung von d₅₄ und d₅₅ zeigt, wenn die Daten in 6 erfasst wurden.
8 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von d₅₅/d₅₄ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht.
9 ist ein Graph, der die Änderung eines Stromwerts veranschaulicht, der bei der Elektrophorese einer Probe in einer Kapillare durch ein zweites Amperemeter 112 gemessen wird.
10 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von I₂ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht.
11 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Temperaturdifferenz außerhalb der Vorrichtung und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht.

Beschreibung von Ausführungsformen
<Erste Ausführungsform>
1 ist eine Konfigurationszeichnung einer Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 ist eine Vorrichtung, die eine biologische Probe durch Elektrophorese misst. Im Folgenden wird ein Beispiel der Messung der Fragmentlänge eines DNA-Moleküls als biologische Probe beschrieben.
Die Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 umfasst eine Detektionseinheit 116, einen Thermostatofen 118, einen Förderer 125, eine Hochspannungsstromversorgung 104, ein erstes Amperemeter 105, ein zweites Amperemeter 112, eine Kapillare 102 und einen Pumpmechanismus 103. Die Detektionseinheit 116 detektiert eine Probe optisch. Der Thermostatofen 118 hält die Kapillare 102 auf eine konstante Temperatur. Der Förderer 125 befördert verschiedene Behälter zu den Kathodenenden der Kapillaren. Die Hochspannungsstromversorgung 104 legt eine Hochspannung an die Kapillare 102 an. Das erste Amperemeter 105 misst einen Strom, der von der Hochspannungsstromversorgung 104 abgegeben wird. Das zweite Amperemeter 112 misst einen Strom, der in einer anodenseitigen Elektrode 111 fließt. Der Pumpmechanismus 103 spritzt ein Polymer in die Kapillare 102 ein.
Die Kapillare 102 umfasst einen Ladekopf 129, die Detektionseinheit 116 und einen Kapillarkopf 133. Wenn die Kapillare 102 beschädigt ist oder in ihrer Qualität nachgelassen hat, ihre Nutzungsdauer abgelaufen ist oder ihre maximale Nutzungshäufigkeit erreicht ist, wird sie durch eine neue Kapillare 102 ersetzt.
Die Kapillare 102 besteht aus einem Glasröhrchen mit einem Innendurchmesser von mehreren zehn bis mehreren hundert Mikrometer und einem Außendurchmesser von mehreren hundert Mikrometer, dessen Oberfläche mit Polyimid beschichtet ist, um seine Festigkeit zu erhöhen. An einem Lichtbestrahlungsabschnitt, der mit Laserlicht bestrahlt wird, ist die Polyimidbeschichtung jedoch entfernt, damit die innere Lichtemission nach außen austreten kann. Das Innere der Kapillare 102 ist mit einem Trennmedium gefüllt, um während der Elektrophorese unterschiedliche Migrationsgeschwindigkeiten zu erhalten. Auch wenn Trennmedien sowohl flüssige als auch nicht-flüssige einschließen, wird in der vorliegenden ersten Ausführungsform ein Flüssigpolymer verwendet.
Die Detektionseinheit 116 ist ein Bereich der Kapillare 102. Wenn die Detektionseinheit 116 mit Anregungslicht von einer Lichtquelle 114 bestrahlt wird, wird von der Probe eine Fluoreszenz (nachstehend als Informationslicht bezeichnet) mit einer probenabhängigen Wellenlänge erzeugt und aus der Kapillare 102 emittiert. Das Informationslicht wird durch ein Beugungsgitter 132 der Wellenlänge nach spektral zerlegt. Ein optischer Detektor 115 detektiert das spektral zerlegte Informationslicht, um dadurch die Probe zu analysieren.
Jedes der Kapillar-Kathodenenden 127 ist über eine aus Metall bestehende Hohlelektrode 126 befestigt, und die Kapillarspitze ragt um etwa 0,5 mm aus der Hohlelektrode 126 heraus. Die für jede Kapillare vorgesehenen Hohlelektroden 126 sind alle integral am Ladekopf 129 befestigt. Alle Hohlelektroden 126 sind mit der auf dem Hauptkörper der Vorrichtung montierten Hochspannungsstromversorgung 104 elektrisch verbunden und dienen als Kathodenelektroden, wenn es z. B. bei der Elektrophorese oder zur Probeneinleitung erforderlich ist, eine Spannung anzulegen.
Die Kapillarenden (andere Enden) auf der Gegenseite der Kapillar-Kathodenenden 127 werden durch den Kapillarkopf 133 gebündelt. Der Kapillarkopf 133 kann auf druckfeste und luftdichte Weise mit einem Block 107 verbunden sein. Die von der Hochspannungsstromversorgung 104 abgegebene Hochspannung wird zwischen dem Ladekopf 129 und dem Kapillarkopf 133 angelegt. Eine Spritze 106 füllt die Kapillare vom anderen Ende her mit einem neuen Polymer auf. Das Nachfüllen des Polymers in die Kapillare wird bei jeder Messung durchgeführt, um die Messleistung zu erhöhen.
Der Pumpmechanismus 103 ist aus der Spritze 106 und einem Mechanismus zur Druckbeaufschlagung der Spritze 106 zusammengesetzt. Der Block 107 ist ein Verbindungselement, um die Spritze 106, die Kapillare 102, einen Anodenpufferbehälter 110 und einen Polymerbehälter 109 miteinander zu verbinden.
Eine optische Detektionseinheit, die das Informationslicht von der Probe detektiert, ist aus der Lichtquelle 114, dem optischen Detektor 115 zur Detektion der Lichtemission in der Detektionseinheit 116 und dem Beugungsgitter 132 konfiguriert. Bei der Detektion einer durch Elektrophorese aufgetrennten Probe in der Kapillare wird die Detektionseinheit 116 für die Kapillare durch die Lichtquelle 114 bestrahlt, die Lichtemission aus der Detektionseinheit 116 wird durch das Beugungsgitter 132 spektral zerlegt, und der optische Detektor 115 detektiert das spektral zerlegte Informationslicht.
Der Thermostatofen 118 ist mit einem wärmeisolierenden Material bedeckt, um sein Inneres auf eine konstante Temperatur zu halten, und ist durch einen Heiz-/Kühlmechanismus 120 temperaturgeregelt. Ein Gebläse 119 lässt die Luft im Thermostatofen 118 umlaufen und wälzt diese um, um die Temperatur der Kapillare 102 einheitlich und konstant zu halten.
Der Förderer 125 umfasst bis zu drei Elektromotoren und einen Linearantrieb und ist auf bis zu drei Achsen in der Vertikalrichtung, Horizontalrichtung und Tiefenrichtung beweglich. Mindestens ein oder mehrere Behälter können auf einen beweglichen Tisch 130 des Förderers 125 platziert werden. Der bewegliche Tisch 130 ist mit einem elektrischen Griff 131 versehen, und ein Benutzer ist in der Lage, jeden Behälter über den Griff 131 zu ergreifen und loszulassen. Dadurch können ein Pufferbehälter 121, ein Reinigungsbehälter 122, ein Abfallflüssigkeitsbehälter 123 und ein Probenbehälter 124 je nach Bedarf zum Kapillar-Kathodenende 127 befördert werden. Nicht benötigte Behälter werden an einem bestimmten Aufbewahrungsort in der Vorrichtung verstaut.
Eine Recheneinheit 200 führt die Verarbeitung der Erfassung des Detektionsergebnisses des Informationslichts vom optischen Detektor 115, seiner Analyse, um eine weiter unten beschriebene Fluoreszenzintensitätswellenform zu erzeugen, und der Berechnung einer Basenlänge einer zu messenden Substanz und dergleichen durch. Details zu der von der Recheneinheit 200 durchgeführten Verarbeitung und zu anderen Komponenten, die in 1 dargestellt sind, werden weiter unten beschrieben. Im Folgenden werden die jeweiligen Elemente, die der Recheneinheit 200 Messergebnisse bereitstellen, zusammengenommen als „Messeinheit“ bezeichnet. Die Recheneinheit 200 kann z.B. aus einer Zentraleinheit (CPU) oder dergleichen konfiguriert sein.
2 ist ein Ablaufplan, der einen Betriebsablauf der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 beschreibt. In Schritt S201 wird die Elektrophorese einer zu analysierenden tatsächlichen Probe durchgeführt. In S202 wird die Fluoreszenzintensität jedes Fluoreszenzfarbstoffs anhand der durch die Elektrophorese erhaltenen spektralen Wellenformdaten berechnet. In S203 wird anhand der Fluoreszenzintensitätswellenform ein Peak detektiert. Dabei kann die Verarbeitung von SizeCall ausgeführt werden. SizeCall ist eine Verarbeitung, die eine Zuordnung (Mapping) zwischen einem erfassten Peak-Zeitpunkt und einer bereits bekannten DNA-Fragmentlänge als Längenstandard durchführt, um dadurch eine Entsprechung zwischen dem Peak-Zeitpunkt und der DNA-Fragmentlänge zu erhalten. In diesem Schritt kann eine weiter unten beschriebene Kalibrierungskurve verwendet werden. In S204 werden Referenzdaten, die durch Elektrophorese einer Allelleiter erhalten wurden, mit der in S202 und S203 erhaltenen Fluoreszenzintensitätswellenform verglichen. In S205 wird auf der Basis des Vergleichsergebnisses in S204 die Genauigkeit der Messdaten in S202 und S203 bestimmt.
3A ist ein Beispiel einer Fluoreszenzintensitätswellenform in den tatsächlichen Probendaten, die in S202 erfasst wurden. Hier wurde als eine Probe eine verwendet, die ein (orange fluoreszenzmarkiertes) Fragment von 80 bp (Basenpaar) als Längenstandard und ein (blau fluoreszenzmarkiertes) Fragment aus X-chromosomalem Amelogenin enthielt, das ein Locus für die Geschlechtsbestimmung ist. In einer Allelleiter, die weiter unten beschrieben wird, sind dieselben Fragmente wie diese beiden enthalten. Jedes Fragment in der Allelleiter dient als „Referenzprobe“, die als Basis für die Quantifizierung einer biologischen Probe in einer tatsächlichen Probe dient. In S204 wird eine Differenz d₃₁ zwischen zwei Peaks erhalten, die auf der Fluoreszenzintensitätswellenform erscheinen.
3B ist ein Beispiel einer Fluoreszenzintensitätswellenform in Referenzdaten. Die Referenzdaten sind Daten, die durch Elektrophorese einer Allelleiter erhalten wurden und eine mit der Probe vergleichbare Fluoreszenzintensitätswellenform beschreiben. Auch in den Referenzdaten kann d₃₁ erfasst sein. Wenn die Mobilität eines DNA-Fragments sich seit dem Zeitpunkt, an dem die Referenzdaten zuvor erfasst wurden, geändert hat, wird angenommen, dass zwischen d₃₁ in den tatsächlichen Probendaten und d₃₁ in den Referenzdaten eine Abweichung auftritt. Daher ist es möglich, die Genauigkeit der tatsächlichen Probendaten zu bestimmen, indem in S204 und S205 geprüft wird, ob die Abweichung in d₃₁ innerhalb eines Schwellenwerts liegt.
Zur Erhöhung der Bestimmungsgenauigkeit in S204 und S205 ist es wünschenswert, d₃₁ möglichst genau zu berechnen. Da der Längenstandard sowohl in der tatsächlichen Probe als auch in der Allelleiter eine Referenzwellenform einer Basenlänge bereitstellt, ist es wünschenswert, diesen als Referenz zu verwenden. Und da das X-chromosomale Fragment geschlechtsunabhängig auftritt, ist es als Referenz geeignet. Daher wird d₃₁ in 3A und 3B anhand dieser berechnet. Dementsprechend können andere Fragment-Peaks verwendet werden, die als Referenz für die Berechnung von d₃₁ geeignet sind.
Da die Fluoreszenzintensitätswellenform einen Peak erreicht, wenn die zu messende Substanz die Detektionseinheit 116 durchläuft, lässt sich d₃₁ als Differenz zwischen den Peak-Zeitpunkten auf der Fluoreszenzintensitätswellenform berechnen. Wenn die Anzahl der Datenrahmen pro Sekunde definiert ist, kann anstelle der Zeit alternativ dazu auch die Anzahl der Datenrahmen verwendet werden. Zusätzlich kann ein geeigneter numerischer Wert verwendet werden, der eine Peak-Position auf der Fluoreszenzintensitätswellenform angeben kann.
4 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von d₃₁ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht. Als zu messende Probe wurde ein X-chromosomales Amelogenin-Fragment verwendet. d₃₁ wurde durch vierzehnmalige Elektrophorese einer tatsächlichen Probe in einer 30°C-Umgebung berechnet, in welcher Polymere sich leicht zersetzen, im Vergleich zur einmaligen Elektrophorese der Allelleiter. Die Zahl der Datenpunkte in 4 entspricht der der Messungen.
Die Fluoreszenzintensitätswellenform an sich ist eine Beschreibung der Lichtintensität, stellt die Länge des DNA-Fragments jedoch nicht direkt dar. Daher ist eine Methode erforderlich, um anhand der Fluoreszenzintensitätswellenform die DNA-Fragmentlänge zu erhalten und die Differenz zwischen der tatsächlichen Probe und der Allelleiter in der in 4 gezeigten Form graphisch darzustellen. Die Methode zum Erhalt der Datenpunkte in 4 wird im Folgenden beschrieben.
Bei der Messung der tatsächlichen Probe ist es durch Referenzieren einer dem Längenstandard entsprechenden Rahmenzeit des Fluoreszenzintensitätswellenform-Peaks möglich, eine Entsprechung (erste Entsprechung) zwischen einem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak einer in der tatsächlichen Probe enthaltenen Substanz (die ein zu messendes Ziel enthält) und einer dem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak entsprechenden Basenlänge zu erhalten. Dies deshalb, weil die Rahmenzeit des Peaks der Mobilität entspricht und eine Entsprechung zwischen der Mobilität und der DNA-Fragmentlänge vorhanden ist. Die Recheneinheit 200 erstellt anhand dieser Entsprechung eine Kalibrierungskurve. Mit anderen Worten, die Kalibrierungskurve beschreibt die Entsprechung zwischen der Rahmenzeit und der Basenlänge. Auch für die Allelleiter wird durch Erfassen einer Entsprechung (zweite Entsprechung) eine Kalibrierungskurve erstellt.
Die Recheneinheit 200 bestimmt anhand des Fluoreszenzintensitätswellenform-Peaks der tatsächlichen Probe und der Kalibrierungskurve die Basenlänge einer zu messenden Substanz (hier ein X-chromosomales Amelogenin-Fragment). Auch bei der Messung derselben Substanz in der Allelleiter bestimmt die Recheneinheit die Basenlänge dementsprechend. Dies ermöglicht die Quantifizierung der DNA-Probe (d. h., die Bestimmung der Basenlänge). Bei ihrer Quantifizierung ist es möglich, eine Standardabweichung (Vertikalachse in 4) zwischen der Basenlänge des Fragments der tatsächlichen Probe im Quantifizierungsergebnis und der Basenlänge des Fragments der Allelleiter zu erhalten.
Zwischen den Basislängen beider Proben kann eine Differenz auftreten. Die Recheneinheit 200 bestimmt außerdem eine Differenz von d₃₁, wenn die Basenlängen sowohl der tatsächlichen Probe als auch der Allelleiter bestimmt werden. Der Graph von 4 kann erstellt werden, indem die Differenz zwischen diesen Basenlängen und die Differenz von d₃₁ als Datenpunkte aufgetragen werden.
Dem in 4 gezeigten Graphen zufolge muss in der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 die Differenz von d₃₁ kleiner oder gleich drei Rahmen sein, damit die Standardabweichung der Basenlänge zwischen dem Messergebnis der tatsächlichen Probe und dem Messergebnis der Allelleiter auf 0,15 bp oder weniger gehalten wird. Wenn die Differenz von d₃₁ zum Beispiel zwei Rahmen oder mehr erreicht, kann die Recheneinheit 200 eine Warnung ausgeben (zum Beispiel eine Meldung auf dem Bildschirm, das Gleiche gilt weiter unten), um zur Erhöhung der Genauigkeit der Daten eine neue Elektrophorese der Allelleiter zu empfehlen. Wenn die Differenz von d₃₁ drei Rahmen oder mehr erreicht, kann die Recheneinheit 200 die tatsächliche Probe sperren, sodass diese nicht gemessen werden kann, bis der Referenzwert (zum Beispiel die Rahmenzeit des Längenstandards oder dergleichen) durch erneute Messung der Allelleiter neu erfasst wurde. Dies ermöglicht dem Benutzer, die Allelleiter an einem geeigneten Zeitpunkt neu zu messen, um die Genauigkeit der Daten zu gewährleisten und die Reagenzienkosten zu senken.
Anstelle der Differenz von d₃₁ kann die Recheneinheit 200 die qualifizierte DNA-Fragmentlänge der tatsächlichen Probe und der Allelleiter vergleichen. Dies deshalb, weil die Bestimmung der DNA-Fragmentlänge stets durch die Kalibrierungskurve erfolgt. In diesem Fall wird die Messeinheit gesperrt, wenn die Standardabweichung der Basenlänge zwischen der tatsächlichen Probe und der Allelleiter größer oder gleich 0,15 bp wird.
<Erste Ausführungsform: Zusammenfassung>
Die Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 gemäß der ersten Ausführungsform vergleicht die Differenz zwischen den ersten Messdaten (tatsächliche Probe) und den zweiten Messdaten (Allelleiter) mit dem Schwellenwert, um zu bestimmen, ob eine erneute Messung der zweiten Probe (Allelleiter) erforderlich ist. Dies ermöglicht es, umweltbedingte Änderungen oder dergleichen in der Mobilität des DNA-Fragments zu erfassen und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen, ob es erforderlich ist, die Referenzdaten neu zu erfassen.
Die Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben (100) gemäß der ersten Ausführungsform erfasst jeweils für die tatsächliche Probe und die Allelleiter den Rahmenzwischenabstand d₃₁ zwischen dem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak des Längenstandards und dem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak der zu messenden Substanz und vergleicht die Differenz von d₃₁ zwischen beiden Messdaten mit dem Schwellenwert. Da der Längenstandard zur Bestimmung der DNA-Fragmentlänge stets eingeschlossen ist, ist er als Basis für die Berechnung der Differenz von d₃₁ geeignet. Das heißt, da die Differenz von d₃₁ genau berechnet werden kann, ist es möglich, mit hoher Genauigkeit zu bestimmen, ob es erforderlich ist, die Referenzdaten neu zu erfassen.
<Zweite Ausführungsform>
In der ersten Ausführungsform wurde der Rahmenabstand zwischen dem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak eines Längenstandards und dem Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak der zu messenden Substanz verwendet. Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschreibt ein Beispiel, in welchem ein Fluoreszenzintensitätswellenform-Peak einer zu messenden Substanz mit den Fluoreszenzintensitätswellenform-Peaks zweier Längenstandards verglichen wird. Dadurch soll die Genauigkeit der Rahmenentfernung erhöht werden. Die Konfiguration der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 entspricht der in der ersten Ausführungsform.
5 ist ein Beispiel der Fluoreszenzintensitätswellenform in tatsächlichen Probendaten in der zweiten Ausführungsform. Im Beispiel von 5 wurden als Längenstandards ein Fragment mit einer Basenlänge von 80 bp und ein Fragment mit einer Basenlänge von 100 bp (jeweils orange fluoreszenzmarkiert) verwendet. Ein Fragment, das einen anderen Peak als die Längenstandards aufweist, ist in 5 als Fragment (gelb fluoreszenzmarkiert) eines Kontrollpeaks dargestellt. Als Kontrollpeak wird ein Peak gewählt, der mit einem anderen Farbstoff als der für den Längenstandard markiert ist und zwischen den beiden Längenstandard-Peaks erscheint.
Die Recheneinheit 200 überwacht Differenzen d₅₄ und d₅₅ in der Datenpunktmenge und vergleicht sie mit einem Schwellenwert. Wie weiter unten beschrieben, kann das Verhältnis d₅₅/d₅₄ (oder d₅₄/d₅₅) zwischen diesen mit dem Schwellenwert verglichen werden, oder die Differenz (oder der Absolutwert der Differenz) zwischen d₅₄ und d₅₅ kann mit dem Schwellenwert verglichen werden. Im Folgenden wird ein Beispiel der Überwachung des Verhältnisses zwischen diesen beschrieben.
6 ist ein Graph, der die Veränderung von d₅₁, d₅₂ und d₅₃ zeigt, wenn die Elektrophorese sechzehnmal in einer 30°C-Umgebung durchgeführt wird, in der ein Polymer leicht zur Zersetzung neigt. Die Horizontalachse zeigt die Zahl der Durchläufe (Injektionsnummer) an. d₅₁ bis d₅₃ entsprechen einer Ablaufzeit vom Startzeitpunkt der Messung bis zum Detektionszeitpunkt jedes Peaks.
7 ist ein Graph, der die Veränderung von d₅₄ und d₅₅ zeigt, wenn die Daten von 6 erfasst werden. Aus 7 geht hervor, dass d₅₄ im Laufe der Zeit abnimmt, wogegen d₅₅ zunimmt. Dies zeigt, dass ein gelb fluoreszenzmarkiertes Fragment schneller migriert als ein orange fluoreszenzmarkiertes Fragment. Die Recheneinheit 200 überwacht den Wert von d₅₅/d₅₄, um diese Abweichung zu detektieren.
8 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von d₅₅/d₅₄ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht. Die Standardabweichung der DNA-Fragmentlänge kann durch eine ähnliche Methode wie die in 4 beschriebene bestimmt werden. Die Recheneinheit 200 kann die Differenz zwischen d₅₅/d₅₄ in einer tatsächlichen Probe und d₅₅/d₅₄ in einer Allelleiter berechnen und die Beziehung zwischen der Differenz und der Standardabweichung der DNA-Fragmentlänge wie in 8 gezeigt graphisch darstellen.
Dem in 8 gezeigten Graphen zufolge muss in der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben (100) die Differenz von d₅₅/d₅₄ kleiner oder gleich etwa 4 % sein, damit die Standardabweichung der Basenlänge zwischen dem Messergebnis der tatsächlichen Probe und dem Messergebnis der Allelleiter auf 0,15 bp oder weniger gehalten wird. Daher kann die Recheneinheit 200 wie bei der ersten Ausführungsform eine Warnung ausgeben, wenn die Differenz von d₅₅/d₅₄ 3,5 % oder mehr erreicht, und die Messeinheit sperren, wenn sie 4,0 % oder mehr erreicht. Dadurch kann die gleiche Wirkung wie in der ersten Ausführungsform erhalten werden.
<Dritte Ausführungsform>
In der obigen Ausführungsform wurde ein Beispiel beschrieben, in welchem in der Probe der Längenstandard-Peak und andere Fragment-Peaks enthalten sind. In einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Beispiel beschrieben, um zu bestimmen, ob es erforderlich ist, die Allelleiter erneut zu messen, ohne das Fragment-Peak des Längenstandards zu verwenden. Die Konfiguration der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 entspricht der in der ersten und zweiten Ausführungsform.
In der dritten Ausführungsform wurde in einer Probe, deren Fluoreszenzintensitätswellenform mehrere Peaks aufwies, eine Basenlänge eines Fragments (rot fluoreszenzmarkiert) mit einem Peak in der Nachbarschaft von 447 bp als Kontrollpeak überwacht. Als Kontrollpeak wurde eines gewählt, das mit einem anderen Farbstoff als der des Längenstandards markiert und im Dektektionsbereich auf der Seite der langen Basen auftritt, wo die Migration leicht gestört wird.
Die Recheneinheit 200 berechnet eine Standardabweichung zwischen einer Basenlänge eines Kontrollpeaks in der tatsächlichen Probe und einer Basenlänge eines Kontrollpeaks in der Allelleiter. Die Methode zur Berechnung der Standardabweichung ist wie die in der ersten Ausführungsform beschriebene. Wenn die Standardabweichung zum Beispiel 0,14 bp oder mehr erreicht, gibt die Recheneinheit 200 eine Warnung aus, um wie bei der ersten Ausführungsform eine erneute Migration der Allelleiter zu empfehlen, und sperrt die Messeinheit, wenn die Standardabweichung 0,15 bp oder mehr erreicht. Dadurch kann eine ähnliche Wirkung wie in der ersten Ausführungsform erreicht werden. Da im Vergleich zur ersten und zweiten Ausführungsform nur wenige Fragment-Peaks zu überwachen sind, ist es möglich, das Verfahren zur Bestimmung, ob eine erneute Messung der Allelleiter erforderlich ist, zu vereinfachen.
Zum Vergleich der Basenlängen verwendet die Recheneinheit 200 die Rahmenzeit und die Kalibrierungskurve, wie in der ersten Ausführungsform beschrieben. Statt die Basenlängen selbst zu vergleichen, ist es daher möglich, eine Kontrollpeak-Zeitdifferenz zwischen der tatsächlichen Probe und der Allelleiter zu verwenden. Man kann sagen, dass diese Methoden im Wesentlichen dieselben Messergebnisse (d. h., die Basenlängen) vergleichen.
<Vierte Ausführungsform>
In der obigen Ausführungsform wurde ein Beispiel erläutert, in welchem anhand der Fluoreszenzintensitätswellenform-Daten der Probe bestimmt wird, ob eine erneute Messung der Allelleiter erforderlich ist. In einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Beispiel beschrieben, in welchem anstelle der Fluoreszenzintensitätswellenform andere Parameter gemessen werden, die die Mobilität eines DNA-Fragments beeinflussen, um dadurch zu bestimmen, ob eine erneute Messung einer Allelleiter erforderlich ist. Die Konfiguration der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 entspricht der in der ersten und zweiten Ausführungsform.
9 ist ein Graph, der die Änderung eines Stromwerts veranschaulicht, der bei der Elektrophorese einer Probe durch das zweite Amperemeter 112 in einer Kapillare gemessen wird. Das zweite Amperemeter 112 misst den in der Kapillare fließenden Strom. Es wird davon ausgegangen, dass der in der Kapillare fließende Strom die Mobilität des DNA-Fragments in der Kapillare beeinflusst. Deshalb wird in 9 ein Stromwert I₁ oder I₂ gemessen, um festzustellen, ob die Mobilität sich seit der letzten Erfassung von Referenzdaten signifikant geändert hat (d. h., ob eine erneute Messung der Allelleiter erforderlich ist).
In 9 ist I₁ der Stromwert zu Beginn der Elektrophorese der Probe in der Kapillare. I₂ ist ein Stromwert unmittelbar vor dem Ende der Elektrophorese. Zum Beispiel kann ein abgeleiteter Wert wie z.B. die Tendenz dieser Stromwerte im Laufe der Zeit usw. verwendet werden. Im Folgenden wird die Verwendung von I₂ beispielhaft beschrieben.
10 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Differenz von I₂ und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht. Die Elektrophorese wurde sechzehnmal in einer 30°C-Umgebung durchgeführt, in welcher ein Polymer dazu neigt, sich zu zersetzen, um dadurch einen Änderungsbetrag zwischen dem ersten I₂ und dem sechzehnten I₂ (der Einfachheit halber als I_{2_var} bezeichnet) zu erfassen. Ferner wird I_{2_var} jeweils in der tatsächlichen Probe und der Allelleiter erfasst, und die Differenz I_{2_var} zwischen der tatsächlichen Probe und der Allelleiter ist in 10 auf der Horizontalachse dargestellt. Die Vertikalachse ist eine DNA-Fragmentlängendifferenz zwischen der tatsächlichen Probe und der Allelleiter, ähnlich wie in der ersten und zweiten Ausführungsform. Jedes Mal, wenn die Differenz I_{2_var} erfasst wurde, wurde ein Datenpunkt in 10 aufgezeichnet.
Dem in 10 gezeigten Graphen zufolge muss in der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 die Differenz von I_{2_var} kleiner als 2,25 µA sein, damit eine Basenlängen-Standardabweichung zwischen einem Messergebnis der tatsächlichen Probe und einem Messergebnis der Allelleiter auf 0,15 bp oder weniger gehalten wird. Daher kann die Recheneinheit 200 wie bei der ersten Ausführungsform einen Alarm ausgeben, wenn die Differenz von I_{2_var} 2,00 µA oder mehr erreicht, und die Messeinheit sperren, wenn sie 2,25 µA oder mehr erreicht. Dadurch kann die gleiche Wirkung wie in der ersten Ausführungsform erreicht werden.
Als Parameter, die die Mobilität des DNA-Fragments beeinflussen, können andere als der durch die Kapillare fließende Stromwert verwendet werden. Als Sensoren zur Messung dieser Parameter sind in 1 zum Beispiel ein vorrichtungsinterner Sensor 140, ein Polymersensor 141, ein Pufferlösungssensor 142 und ein vorrichtungsexterner Sensor 143 beispielhaft dargestellt. Der vorrichtungsinterne Sensor 140 ist ein Sensor zur Erfassung von Umgebungsinformation innerhalb der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100, und der vorrichtungsexterne Sensor 143 ist ein Sensor zur Erfassung von Umgebungsinformation außerhalb der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100. Beispiele für Umgebungsinformation schließen die Temperatur, die Luftfeuchtigkeit, den atmosphärischen Druck usw. ein. Der Polymersensor 141 ist eine Sensorgruppe zur Erfassung von Information über die Qualität eines Polymers, die beispielsweise einen PH-Sensor und einen elektrischen Leitfähigkeitssensor einschließt. In 1 wird ein Beispiel gezeigt, in welchem der Polymersensor 141 im Polymerbehälter 209 installiert ist, die Installation ist jedoch nicht auf diese Position beschränkt. Der Pufferlösungssensor 142 ist eine Sensorgruppe zur Erfassung von Information über die Qualität einer Pufferlösung, die beispielsweise einen Temperatursensor einschließt. In 1 wird ein Beispiel gezeigt, in welchem der Pufferlösungssensor 142 im Anodenpufferbehälter 110 installiert ist, die Installation ist jedoch nicht auf diese Position beschränkt. Zudem kann der Pufferlösungssensor 142 im Pufferbehälter 121 installiert sein. Als Eingabewerte kann Information über Verbrauchsstoffe wie z.B. die Verwendungshäufigkeit des Polymers oder der Pufferlösung, die Zahl der abgelaufenen Tage und die Chargennummer sowie die Verwendungshäufigkeit der Kapillare, die Zahl abgelaufenen Tage und die Chargennummer oder dergleichen verwendet werden.
Die obigen Parameter, welche die Mobilität der DNA beeinflussen, können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Alternativ dazu können die Parameter mit der Überwachung der Rahmenposition jedes Fragments kombiniert sein, wie in den ersten bis dritten Ausführungsformen gezeigt.
<Fünfte Ausführungsform>
In einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Beispiel beschrieben, in welchem als Parameter, der die Mobilität eines DNA-Fragments beeinflusst, eine durch den vorrichtungsexternen Sensor 143 gemessene Umgebungstemperatur gemessen wird. Die Konfiguration der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben 100 entspricht der in der ersten und zweiten Ausführungsform.
11 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen einer Temperaturdifferenz außerhalb der Vorrichtung und einer Standardabweichung einer DNA-Fragmentlänge veranschaulicht. Die Horizontalachse in 11 ist eine Differenz zwischen der Temperatur, die bei der Messung einer tatsächlichen Probe vom vorrichtungsexternen Sensor 143 gemessen wird, und der Temperatur, die bei der Messung einer Allelleiter vom vorrichtungsexternen Sensor 143 gemessen wird. Die Vertikalachse ist eine Standardabweichung der DNA-Fragmentlänge, die für ein Fragment von 470 bp berechnet wurde. Entsprechende Messungen wurden an vier Vorrichtungen zur Analyse biologischer Proben 100 durchgeführt, und die jeweiligen Messergebnisse sind in 11 graphisch dargestellt. Die Elektrophorese der Allelleiter wurde in einer 20 °C-Umgebung durchgeführt, und die tatsächliche Probe wurde jeweils in einer 22 °C-, 28 °C- und 30 °C-Umgebung gemessen.
Dem in 11 gezeigten Graphen zufolge muss in der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben (100) die Temperaturdifferenz zwischen dem Zeitpunkt der Messung der Allelleiter und dem Zeitpunkt der Messung der tatsächlichen Probe kleiner als etwa 10 °C sein, damit die Standardabweichung der Basenlänge des Messergebnisses der tatsächlichen Probe auf 0,15 bp oder weniger gehalten wird. Daher kann das Computergerät 200 wie bei der ersten Ausführungsform eine Warnung ausgeben, wenn die Temperaturdifferenz 8°C oder mehr erreicht, und die Messeinheit sperren, wenn sie 10°C oder mehr erreicht. Dadurch kann die gleiche Wirkung wie in der ersten Ausführungsform erreicht werden.
<Modifikationen der vorliegenden Erfindung>
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die obigen Ausführungsformen beschränkt und schließt verschiedene Modifikationen ein. Zum Beispiel wurden die obigen Ausführungsformen im Detail beschrieben, um die vorliegende Erfindung auf leicht verständliche Weise zu beschreiben, und sind nicht unbedingt auf solche beschränkt, die alle beschriebenen Konfigurationen aufweisen. Ferner kann ein Teil einer Konfiguration einer Ausführungsform durch eine Konfiguration einer anderen Ausführungsform ersetzt werden, und die Konfiguration einer anderen Ausführungsform kann zur Konfiguration einer Ausführungsform hinzugefügt werden. Zudem ist es möglich, für einen Teil der Konfiguration jeder Ausführungsform andere Konfigurationen hinzuzufügen, zu streichen und zu ersetzen.
In den obigen Ausführungsformen kann der Bestimmungsschwellenwert (zum Beispiel der Schwellenwert in S205, der Schwellenwert, der mit der Differenz in der dritten Ausführungsform verglichen wird, usw.) ein vom System festgelegter Wert oder ein vom Benutzer eingestellter Wert sein. Der Schwellenwert kann der Anwendung, dem Typ eines Reagenzes, einem Elektrophorese-Parameter usw. entsprechend individuell eingestellt werden. Der Elektrophorese-Parameter ist ein Parameter, der das Elektrophorese-Verhalten betrifft, wie z. B. eine Migrationstemperatur, eine Migrationsspannung, eine Boosting-Geschwindigkeit oder dergleichen.
In den ersten bis dritten Ausführungsformen kann als Fragment zur Überwachung des Fluoreszenzintensitätswellenform-Peaks ein Fragment verwendet werden, das im Detektionsbereich auf der Seite der kurzen Basenlängen liegt, auf der Seite der langen Basenlängen, und ein Fragment mit mittlerer Basenlänge, einzeln oder in mehrere in Kombination miteinander.
In der zweiten Ausführungsform wurde d₅₅/d₅₄ überwacht, doch auch Werte wie z.B. ein Wert, der durch Subtraktion zweier Abstände von Peak zu Peak erhalten wird, ein Wert, der durch Division eines Abstands von Peak zu Peak durch die Summe der Abstände von Peak zu Peak erhalten wird, usw. können überwacht werden. Ferner können die zu überwachenden Peaks alle mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein oder Fragmente aufweisen, die mit demselben Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Die Anzahl der zu überwachenden Peaks muss nicht unbedingt zwei sein. Zum Beispiel können vier oder mehr Fluoreszenzintensitätswellenform-Peaks überwacht werden. Beispielsweise kann die Zahl der Peaks der Zahl der in einem Reagenzienkit enthaltenen Arten von Fluoreszenzfarben entsprechen, oder eine größere Anzahl von Peaks kann überwacht werden.
In der dritten Ausführungsform kann als zu überwachendes Fragment ein Fragment Detektionsgegenstand sein, dessen Basenlänge die durch das Reagenzienkit leicht gestört wird, oder ein Fragment, dessen Basenlänge weiter auf der Seite der langen Basenlängen, auf der Seite der kurzen Basenlängen und zwischen beiden liegt. Mit Ausnahme des Größenstandards können zwei oder mehr Fragment-Peaks überwacht werden.
In der ersten bis dritten Ausführungsform kann die Rahmenposition des zu überwachenden Fragment-Peaks eine absolute Position eines spezifischen Fragments (entspricht der Ablaufzeit seit dem Start der Messung) oder eine relative Position sein, die durch eine Vielzahl von Fragmenten definiert wird (entspricht der Differenz zwischen einem Peak-Zeitpunkt einer zu messenden Substanz und einem Peak-Zeitpunkt einer anderen Substanz). Die Anzahl der zu überwachenden Fragment-Peaks kann drei oder mehr sein.
In der ersten bis dritten Ausführungsform kann das zu überwachende Fragment zusätzlich zum Längenstandard als probenunabhängiger Peak festgelegt werden. Als Beispiele lassen sich (a) Allel-Peaks, die in allen Proben auftreten, (b) ein Qualitätssensor, der in einem Reagenzienkit zur Bestimmung der Qualität der PCR-Reaktion enthalten ist, und dergleichen anführen. Zudem kann eine Probe vor oder nach der PCR mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden gemischt werden, und deren Peak kann überwacht werden.
In den obigen Ausführungsformen kann als Methode zur Sperrung der Messeinheit jede beliebige Methode verwendet werden, solange sie eine Quantifizierung der Probe unmöglich macht. In Betracht kommen z. B. das Abschalten der Stromversorgung der Lichtquelle, das Abschalten der Stromversorgung für die Elektrophorese, die Einschränkung der Funktionalität der Software für den Betrieb usw. Darüber hinaus kann jede andere geeignete Methode verwendet werden.
In den obigen Ausführungsformen wurde die Allelleiter als Referenzprobe veranschaulicht, die eine Referenz zur Messung der DNA-Fragmentlänge bereitstellt. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Es kann eine andere Referenzprobe als die Allelleiter verwendet werden, solange sie Referenzdaten bereitstellt, die als Basis für die Quantifizierung einer biologischen Probe dienen und mit tatsächlichen Probendaten verglichen werden können.
Auch wenn in den obigen Ausführungsformen als Beispiel einer biologischen Probe beschrieben wird, dass die DNA-Fragmentlänge gemessen wird, ist die vorliegende Erfindung auch auf andere biologische Proben anwendbar. Das heißt, die vorliegende Erfindung ist auf eine biologische Probe anwendbar, die durch Elektrophorese quantifiziert wird, wobei anhand der Differenz zwischen den tatsächlichen Probendaten und den Referenzdaten (dem Messergebnis einer Referenzprobe, die eine Basis für die Quantifizierung bereitstellt) bestimmt wird, ob eine erneute Messung der Referenzprobe erforderlich ist.
In den obigen Ausführungsformen wurde das Beispiel der Überwachung numerischer Werte wie z. B. d₃₁ erläutert, damit die Standardabweichung der DNA-Fragmentlänge z. B. 0,15 bp oder weniger beträgt. Anstelle der Standardabweichung der DNA-Fragmentlänge kann die Differenz zwischen der DNA-Fragmentlänge der tatsächlichen Probe und der DNA-Fragmentlänge der Allelleiter auf kleiner oder gleich einem geeigneten Schwellenwert eingestellt werden. Auch in diesem Fall kann die gleiche Wirkung wie in der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Die zu überwachenden numerischen Werte sind die gleichen wie in den obigen Ausführungsformen.
Bezugszeichenliste

102: Kapillare,
103: Pumpmechanismus,
104: Hochspannungsstromversorgung,
105: erstes Amperemeter,
106: Spritze,
107: Block,
109: Polymerbehälter,
110: Anodenpufferbehälter,
111: anodenseitige Elektrode,
112: zweites Amperemeter,
113: Magnetventil,
114: Lichtquelle,
115: optischer Detektor,
116: Detektionseinheit,
118: Thermostatofen,
119: Gebläse,
120: Heiz-/Kühlmechanismus,
121: Pufferbehälter,
122: Reinigungsbehälter,
123: Flüssigabfallbehälter,
124: Probenbehälter,
125: Förderer,
126: Hohlelektrode,
127: Kapillar-Kathodenende,
129: Ladekopf,
130: Fördertisch,
131: Griff,
132: Beugungsgitter,
133: Kapillarkopf,
140: vorrichtungsinterner Sensor
141: Polymersensor,
142: Pufferlösungssensor,
143: vorrichtungsexterner Sensor
200: Recheneinheit.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2004/0197925 [0011]

Claims

Vorrichtung zur Analyse einer biologischen Probe, die eine biologische Probe durch Elektrophorese analysiert, umfassend: eine Messeinheit, die die biologische Probe während der Elektrophorese einer Probe misst, die die biologische Probe enthält; und eine Recheneinheit, die Messdaten erzeugt, die ein Ergebnis der Messung durch die Messeinheit beschreiben, wobei die Recheneinheit erste Messdaten erzeugt, die ein Messergebnis beschreiben, das während der Elektrophorese einer ersten Probe durch Messen der ersten Probe erhalten wird, die eine biologische Probe enthält, wobei die Recheneinheit zweite Messdaten erzeugt, die ein Messergebnis beschreiben, das während der Elektrophorese einer zweiten Probe durch Messen der zweiten Probe erhalten wird, die eine Referenzprobe enthält, die als Basis für die Quantifizierung der biologischen Probe dient, und wobei die Recheneinheit eine Differenz zwischen den ersten Messdaten und den zweiten Messdaten mit einem Schwellenwert vergleicht, um dadurch zu bestimmen, ob es erforderlich ist, einen Referenzwert zur Quantifizierung der biologischen Probe durch erneute Messung der zweiten Probe neu zu erfassen, bevor die biologische Probe erneut gemessen wird.
Vorrichtung zur Analyse einer biologischen Probe nach Anspruch 1, wobei die Recheneinheit die in der ersten Probe enthaltene biologische Probe anhand von ersten Entsprechungsdaten quantifiziert, die eine erste Entsprechung zwischen einem in den ersten Messdaten beschriebenen ersten Datenwert und einem durch den ersten Datenwert dargestellten Messergebnis beschreiben, wobei die Recheneinheit die in der zweiten Probe enthaltene Referenzprobe anhand von zweiten Entsprechungsdaten quantifiziert, die eine zweite Entsprechung zwischen einem in den zweiten Messdaten beschriebenen zweiten Datenwert und einem durch den zweiten Datenwert dargestellten Messergebnis beschreiben, und wobei die Recheneinheit die Differenz anhand eines Betrags berechnet, um welchen ein Quantifizierungsergebnis der in der ersten Probe enthaltenen biologischen Probe von einem Quantifizierungsergebnis der in der zweiten Probe enthaltenen Referenzprobe abweicht.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei sowohl die erste Probe als auch die zweite Probe eine erste Standardsubstanz enthalten, deren von der Messeinheit erhaltener Messwert bekannt ist, wobei die ersten Messdaten eine erste Fluoreszenzintensitätswellenform beschreiben, die während der Elektrophorese der ersten Probe durch Messen der ersten Probe erhalten wurde, wobei die zweiten Messdaten eine zweite Fluoreszenzintensitätswellenform beschreiben, die während der Elektrophorese der zweiten Probe durch Messen der zweiten Probe erhalten wurde, wobei die Recheneinheit zwischen einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die biologische Probe darstellt, und einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die erste Standardsubstanz darstellt, einen ersten Abstand berechnet, wobei die Recheneinheit zwischen einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die Referenzprobe darstellt, und einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die erste Standardsubstanz darstellt, einen zweiten Abstand berechnet, und wobei die Recheneinheit eine Abstandsdifferenz zwischen dem ersten Abstand und dem zweiten Abstand als Differenz berechnet.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 3, wobei die biologische Probe eine DNA-Probe ist, wobei die zweite Probe eine Allelleiter ist, wobei die erste Standardsubstanz ein Längenstandard mit einer bekannten Länge ist, der als Standardlänge bei der Messung einer DNA-Fragmentlänge dient, und wobei die Recheneinheit anhand der ersten Messdaten eine DNA-Fragmentlänge der biologischen Probe berechnet.
Vorrichtung zur Analyse einer biologischen Probe nach Anspruch 1, wobei die Recheneinheit einen entsprechenden Alarm ausgibt, wenn die Differenz von den Schwellenwert überschreitet.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die Recheneinheit die Verwendung der Messeinheit einschränkt, wenn die Differenz von den Schwellenwert überschreitet, sodass die biologische Probe nicht erneut gemessen werden kann, bis die Recheneinheit den Referenzwert zur Quantifizierung der biologischen Probe durch erneute Messung der zweiten Probe neu erfasst hat.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei sowohl die erste Probe als auch die zweite Probe eine erste und eine zweite Standardsubstanz enthalten, deren durch die Messeinheit erhaltenen Messwerte bekannt sind, wobei die ersten Messdaten eine erste Fluoreszenzintensitätswellenform beschreiben, die während der Elektrophorese der ersten Probe durch Messen der ersten Probe erhalten wurde, wobei die zweiten Messdaten eine zweite Fluoreszenzintensitätswellenform beschreiben, die während der Elektrophorese der zweiten Probe durch Messen der zweiten Probe erhalten wurde, wobei die Recheneinheit zwischen einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die biologische Probe darstellt, und einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die erste Standardsubstanz darstellt, einen ersten Abstand berechnet, und zwischen einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die biologische Probe darstellt, und einer Wellenform, die in der ersten Fluoreszenzintensitätswellenform die zweite Standardsubstanz darstellt, einen zweiten Abstand berechnet, wobei die Recheneinheit zwischen einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die Referenzprobe darstellt, und einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die erste Standardsubstanz darstellt, einen dritten Abstand berechnet, und zwischen einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die Referenzprobe darstellt, und einer Wellenform, die in der zweiten Fluoreszenzintensitätswellenform die zweite Standardsubstanz darstellt, einen vierten Abstand berechnet, und wobei die Recheneinheit als Differenz einen Betrag berechnet, um welchen ein erstes Verhältnis des ersten Abstands zum zweiten Abstand von einem zweiten Verhältnis des dritten Abstands zum vierten Abstand abweicht, indem sie das erste Verhältnis mit dem zweiten Verhältnis vergleicht, oder wobei die Recheneinheit als Differenz einen Betrag berechnet, um welchen eine erste Differenz zwischen dem ersten Abstand und dem zweiten Abstand von einer zweiten Differenz zwischen dem dritten Abstand und dem vierten Abstand abweicht, indem sie die erste Differenz mit der zweiten Differenz vergleicht.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die Recheneinheit ein Ergebnis erfasst, das durch Quantifizieren der in der zweiten Probe enthaltenen biologischen Probe erhalten wird, und eine Standardabweichung des Quantifizierungsergebnisses berechnet, und wobei die Recheneinheit auf der Basis dessen, ob die Standardabweichung einen Schwellenwert oder mehr erreicht, bestimmt, ob es erforderlich ist, einen Referenzwert zur Quantifizierung der biologischen Probe durch erneute Messung der zweiten Probe neu zu erfassen, bevor die biologische Probe erneut gemessen wird.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die Messeinheit als Messergebnis, das durch die ersten Messdaten beschrieben wird, einen ersten Parameter misst, der bei der Elektrophorese der ersten Probe das Messergebnis der ersten Probe beeinflusst, wobei die Messeinheit als Messergebnis, das durch die zweiten Messdaten beschrieben wird, einen zweiten Parameter misst, der bei der Elektrophorese der zweiten Probe das Messergebnis der zweiten Probe beeinflusst, und wobei die Recheneinheit als Differenz einen Betrag berechnet, um welchen der erste Parameter vom zweiten Parameter abweicht, indem sie den ersten Parameter mit dem zweiten Parameter vergleicht.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 9, wobei die Messeinheit als ersten Parameter und zweiten Parameter mindestens eines misst von: einem Stromwert, der bei der Elektrophorese durch eine Probe fließt, mindestens einer Temperatur, einer Luftfeuchtigkeit oder einem atmosphärischen Druck im Inneren der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben, mindestens einer Temperatur, einer Luftfeuchtigkeit oder einem atmosphärischen Druck außerhalb der Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben, einem physikalischen Eigenschaftswert eines Trennmediums, das bei der Messung der Probe mit der Probe zugeführt wird, einem physikalischen Eigenschaftswert einer Pufferlösung, die bei der Messung der Probe mit der Probe zugeführt wird, der Verwendungshäufigkeit des Trennmediums oder der Verwendungshäufigkeit der Pufferlösung, der Anzahl der Tage, die seit dem ersten Tag der Verwendung des Trennmediums abgelaufen sind, oder der Anzahl der Tage, die seit dem ersten Tag der Verwendung der Pufferlösung abgelaufen sind, einer Produktionslosnummer des Trennmediums oder einer Produktionslosnummer der Pufferlösung, der Verwendungshäufigkeit einer Kapillare zum Durchlauf einer Probe bei der Elektrophorese der Probe, der Anzahl der Tage, die seit dem ersten Tag der Verwendung der Kapillare abgelaufen sind, und einer Produktionslosnummer der Kapillare.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die ersten Messdaten einen ersten Wert beschreiben, der die in der ersten Probe enthaltene biologische Probe darstellt, wobei die zweiten Messdaten einen zweiten Wert beschreiben, der die in der zweiten Probe enthaltene Referenzprobe darstellt, und wobei die Recheneinheit als ersten Wert und den zweiten Wert mindestens eines verwendet von: einem Wert, der einen Zeitpunkt darstellt, an dem die Messeinheit die biologische Probe detektiert, einem Wert, der eine Zeitdauer darstellt, die vom Start der Messung durch die Messeinheit bis zur Detektion der biologischen Probe abgelaufen ist, und einem Wert, der eine Zeitdauer darstellt, die von der Detektion einer anderen in einer Probe enthaltenen Substanz als die biologische Probe durch die Messeinheit bis zur Detektion der biologischen Probe durch die Messeinheit abgelaufen ist.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe eine DNA-Probe ist, wobei die Recheneinheit als Messdaten eine Fluoreszenzintensitätswellenform erzeugt, die während der Elektrophorese einer Probe durch Messen der Probe erhalten wird, wobei die Recheneinheit die Differenz berechnet, indem sie zwischen den ersten Messdaten und den zweiten Messdaten erste und zweite Wellenformen in der Fluoreszenzintensitätswellenform vergleicht, und wobei die Recheneinheit als erste Wellenform und die zweite Wellenform mindestens eines verwendet von: einer Peak-Position der Fluoreszenzintensitätswellenform, die von einer fluoreszenzmarkierten Probe erhalten wurde, einem X-chromosomalen Abschnitt in der Fluoreszenzintensitätswellenform, einem Abschnitt in der Fluoreszenzintensitätswellenform, der einem Längenstandard entspricht, dessen durch die Messeinheit erhaltener Messwert bekannt ist, einem Abschnitt in der Fluoreszenzintensitätswellenform, der einem Qualitätssensor entspricht, der einem PCR-Reagenz beigemischt ist, um die Qualität einer PCR-Reaktion zu bestimmen, und einen Abschnitt in der Fluoreszenzintensitätswellenform, der einem fluoreszierenden Oligonukleotid entspricht, das einer Probe als Referenzsubstanz beigemischt ist.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 12, wobei die Messeinheit eine Probe misst, die mit ersten und zweiten Fluoreszenzmarkierungen versehen ist, die sich voneinander unterscheiden, um dadurch die erste und die zweite Wellenform zu erfassen.
Vorrichtung zur Analyse biologischer Proben nach Anspruch 1, wobei die in der ersten Probe enthaltene biologische Probe und die in der zweiten Probe enthaltene Referenzprobe mit einer Fluoreszenzmarkierung derselben Farbe versehen sind.
Verfahren zur Analyse biologischer Proben, das eine biologische Probe durch Elektrophorese analysiert, umfassend: einen Messschritt des Messens der biologischen Probe während der Elektrophorese einer die biologische Probe enthaltenden Probe; und einen Berechnungsschritt des Erzeugens von Messdaten, die ein Messergebnis im Messschritt beschreiben, wobei im Berechnungsschritt erste Messdaten erzeugt werden, die ein Messergebnis beschreiben, das während der Elektrophorese einer ersten Probe durch Messen der ersten Probe erhalten wird, die die biologische Probe enthält, wobei im Berechnungsschritt zweite Messdaten erzeugt werden, die ein Messergebnis beschreiben, das während der Elektrophorese einer zweiten Probe durch Messen der zweiten Probe erhalten wird, die eine Referenzprobe enthält, die als Basis für die Quantifizierung der biologischen Probe dient, und wobei im Berechnungsschritt eine Differenz zwischen den ersten Messdaten und den zweiten Messdaten mit einem Schwellenwert verglichen wird, um dadurch zu bestimmen, ob es erforderlich ist, durch erneute Messung der zweiten Probe einen Referenzwert zur Quantifizierung der biologischen Probe neu zu erfassen, bevor die biologische Probe erneut gemessen wird.