DE69231664T2

DE69231664T2 - Zyklische dna sequenzierung

Info

Publication number: DE69231664T2
Application number: DE69231664T
Authority: DE
Inventors: W. Fuller
Original assignee: Amersham Pharmacia Biotech Inc
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 1991-09-27
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2001-05-03
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: DE69231664D1; EP0654091A4; ATE198913T1; JPH06510433A; CA2119140A1; WO1993006243A1; ATE239094T1; DE69233041T2; US5674679A; EP1038973A1; EP0654091B1; EP1038973B1; DE69233041D1; US5741640A; US5741676A; EP0654091A1; JP2695045B2; ES2156861T3; AU2573992A

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur DNA-Sequenzierung, worin ein markiertes Nukleotid während eines Kettenabbruch-Verfahrens in ein DNA-Molekül, das in Verlängerung befindlich ist, eingebaut wird.
Die Sequenz von Nukleotidbasen in einem DNA-Molekül kann auf mehreren Wegen bestimmt werden. Das Kettenabbruch-Verfahren beinhaltet im allgemeinen das Synthetisieren von DNA, komplementär zu dem zu sequenzierenden Matrizenstrang, durch Verlängern eines Primers, fähig zur Hybridisierung an einen Abschnitt dieses Matrizenstrangs, mit einer DNA- Polymerase. Während der Synthesereaktion werden Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) eingebaut, wodurch ein DNA-Fragment gebildet wird, bis ein Ketten-Abbruch-Mittel, zum Beispiel ein Didesoxynukleotidtriphosphat (ddNTP) eingebaut wird. Der Einbau eines ddNTP verhindert die weitere DNA-Synthese (ein als Kettenabbruch bezeichnetes Verfahren). Die Größe jedes bei diesem Vorgehen synthetisierten DNA-Fragmentes wird dann durch Gelelektrophorese bestimmt, und diese Information wird verwendet, um die Sequenz der Nukleotide in der ursprünglichen Matrizen-DNA zu ermitteln. Zum Beispiel beschreiben Tabor und Richardson, U.S.-Patent 4 795 699, ein zweistufiges Sequenzierungsverfahren, in dem ein unmarkierter Primer in einem Markierungsschritt markiert und dann in Gegenwart von dNTPs im Überschuß und eines ddNTP in einem Kettenabbruch-Schritt verlängert wird. In dem Markierungsschritt wird eine niedrige Konzentration von dNTPs vorgesehen (wobei eines markiert ist), um ein geringes Ausmaß an Primer-Verlängerung zu erlauben.
In dem Didesoxy-Sequenzierungsverfahren kann der Primer, zum Beispiel mit ³²P, durch ein Verfahren markiert werden, das eine Polynukleotidkinase verwendet. Eine solche Markierung gestattet den Nachweis von verlängerten Primern nach der Gelelektrophorese mittels Autoradiographie des resultierenden Gels. Alternativ dazu kann ein markiertes dNTP während des Verfahrens der DNA-Synthese eingebaut werden, und die Gegenwart von solchen markierten dNTPs durch Autoradiographie oder andere Mittel nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck kann dNTP entweder mit ³²P oder ³&sup5;S radioaktiv markiert werden. In einem anderen Verfahren kann der Primer mit einer oder mehreren fluoreszenten Gruppe(n) für den Nachweis durch Fluoreszenz markiert sein. In noch einem weiteren Verfahren kann das ddNTP markiert sein, zum Beispiel mit einem fluoreszenten Marker.
Beispiele dieser Verfahren werden in den folgenden Veröffentlichungen gegeben:
Murray, 17 Nucleic Acids Research 8889, 1989, beschreibt die Verwendung eines ³²P-markierten Primers. Der Primer wurde durch Verwendung einer Polynukleotidkinase und von gamma-³²P-ATP markiert.
Higuchi und Ochman, 17 Nucleic Acids Research 5865, 1989, beschreiben die Verwendung eines Kinase-markierten Primers für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten, hergestellt durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR). PCR ist ein Verfahren zur Amplifizierung einer gewünschten Nukleinsäure durch Verwendung zweier Primer, welche durch eine DNA- Polymerase verlängert werden, wodurch ein Paar von DNA-Fragmenten hergestellt wird, die komplementär zu der gewünschten Nukleinsäure sind. Diese Fragmente hybridisieren dann unter Bereitstellung der gewünschten DNA. Dieser Vorgang wird 15-30mal wiederholt. Wenn eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird, wird das Verfahren am besten zyklisch wiederholt durch abwechselndes Halten der Temperatur der Reaktion bei einer Temperatur, geeignet für die primerverlängerung (70º-75ºC), dann bei einer Temperatur, geeignet für das Denaturieren (90º-100ºC) zur Trennung der DNA-Fragmente und Bereitstellung einer Matrize für den nächsten Zyklus, und dann bei einer Temperatur, geeignet für das Annealing bzw. Anlagern (42º-55ºC), um Primer an die Matrize zu binden.
Straus und Zagursky, 10 BioTechniques 376, 1991, beschreiben die Verwendung von α-³²P- dATP in einer Sequenzierungsreaktion.
Smith et al., 9 BioTechniques 52, 1990, und Adams-Blakesley, 13 Focus 56, 1991, beschreiben die Sequenzierung von PCR-Produkten unter Verwendung eines markierten Primers. Tsang und Bentley, Nucleic Acids Research (1998) 16, 6238, beschreiben die Verlängerungsmarkierung eines Primers unter Verwendung von 3 der 4 dNTPs, wobei eines der gewählten dNTPs markiert ist.
Khrishnan et al., 19 Nucleic Acid Research 1153, 1991, beschreiben die Verwendung eines markierten Primers zur Segenzierung von Lambda-DNA. Das Verfahren der Kettentermination wird mehrfach wiederholt (oder "gecyclet"), um die Herstellung einer großen Zahl von Produkten zu gestatten. Dieses zyklische Wiederholen ist ähnlich zu einer PCR, da zugelassen wird, daß die Reaktion bei 42º-55ºC voranschreitet, dann bei 95ºC angehalten wird und bei 42º-55ºC erneut gestartet wird (das Verfahren wird als Thermozyklus- Segenzieren bezeichnet). Sobald das Verfahren gestartet ist, muß kein neues Reagens zugesetzt werden. Das zyklische Wiederholen gewährleistet, daß ein großer Anteil des markierten Primers in den Kettenabbruch-Schritten verlängert wird.
Spurgeon und Burke, Abstract 125, Human Genome II, 22. Oktober 1990, beschreiben die Verwendung einer modifizierten Taq-DNA-Polymerase für Thermozyklus-Sequenzieren, worin ein endmarkierter Primer oder ein unmarkierter Primer verwendet wird. Fluoreszent markierte ddNTPs und radioaktive Markierungstechniken wurden ebenfalls angewandt.
Das Thermozyklus-Sequenzieren wird auch in der EP-A 0409078 beschrieben, wobei alle 4 dNTPs, endmarkierte Primer oder unmarkierte Primer und markierte dNTPs oder ddNTPs verwendet werden.
Mead et al., Abstract Nr. 99, Human Genome II, 22. Oktober 1990, beschreiben die Sequenzierung von Lambda-DNA in einer Polymerase-Ketten-basierenden Reaktion unter Verwendung von Radioisotopen und fluoreszenten Markierungen.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung beinhaltet ein neues DNA-Sequenzierungsverfahren, in dem ein unmarkierter Primer in einer auf zyklische Weise durchgeführten Markierungsreaktion verlängert wird. Ein derartiges Verfahren ist gegenüber der bisherigen Anwendung von ³²P- endmarkierten Primern (hergestellt unter Verwendung von Polynukleotidkinase und γ-³²P- ATP) vorteilhaft, weil keine zusätzlichen Reagenzien (z. B. Polynukleotidkinase und γ-³²P- ATP) über die gewöhnlichen Sequenzierungs-Reagenzien hinaus erfordert werden, das Verfahren zur Herstellung von markierten Primern nicht erforderlich ist, und, da die in dem Verfahren verwendete Gerätschaft identisch zu derjenigen ist, welche für Thermozyklus- Sequenzieren verwendet wird, die zwei Verfahren bequem zusammen eingesetzt werden können. Dieses Verfahren ermöglicht die Verwendung von Markierungen, die anderweitig nicht mit Polynukleotidkinase verwendbar sind, wie α-³&sup5;S-dNTPs, fluoreszenten Nukleotiden und Nukleotiden, die mit anderen nützlichen Gruppen, wie Biotin, markiert sind.
Das kritische Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem markierten Nukleotid in einem zyklisch wiederholten Markierungsschritt. Diesem folgt im allgemeinen ein zyklisch wiederholter Terminationsschritt. Das wiederholte zyklische Durchführen bzw. Cycling der mittels Primern eingeleiteten DNA-Synthese führt zur Herstellung von viel mehr neu synthetisierten DNA-Molekülen als zur Sequenzierung verwendeten Molekülen der Matrizen-DNA. So ist, während ein Sequenzieren unter Einsatz gewöhnlicher Mengen von Matrize (0,5-1,0 umol) bei Durchführung nur einer einzigen Runde der replikativen Synthese möglich ist, ein Sequenzieren unter Einsatz von weniger Matrizen-DNA (z. B. 0,05 umol) ohne einen Cycling-Schritt schwierig. Das wiederholte Cycling des Markierungsschrittes unter Einsatz begrenzter Mengen an Matrize erhöht die Menge an Produkt zu einem Ausmaß, das für normale Nachweisverfahren, wie Autoradiographie bei Exposition über Nacht, ausreichend ist.
In dem Verfahren sind höchstens drei der vier erforderlichen dNTPs für eine Sequenzierungsreaktion in dem Markierungsschritt vorhanden, wobei eines oder mehrere von ihnen markiert sind. Dies markiert in effektiver Weise den Primer und begrenzt die Verlängerung auf eine bekannte Länge (d. h. auf eine Länge, bei der das fehlende dNTP für eine weitere Synthese erforderlich ist). In dem Verfahren wird die Reaktion zwischen einer für Kettenverlängerung geeigneten Temperatur und einer für Denaturierung der verlängerten Primer- und Matrizen- Moleküle geeigneten Temperatur im allgemeinen 10- bis 100-mal während einer Zeitdauer von eineinhalb bis sechs Stunden gecyclet. Nach diesem Markierungsschritt wird die Reaktion im allgemeinen in vier Portionen geteilt, und ein passender Ketten-Abbruch-Mix, einschließlich des fehlenden dNTP, wird der Reaktionsmischung zugegeben, und es wird zwischen 10- und 200mal bei angemssenen Temperaturen für Primerverlängerung und Denaturierung gecyclet. In diesem Schritt wird keine zusätzliche DNA-Polymerase erfordert, und die Reaktion kann in 1,5 bis 16 Stunden abgeschlossen werden.
Das Verfahren dieser Erfindung gestattet das Sequenzieren von so wenig wie 0,01 Mikrogramm (0,005 Pikomol) M13-DNA bei einer 18- bis 36-stündigen Exposition für radioaktiv markiertes (³&sup5;S-)Material. Bei doppelsträngigen Plasmiden kann Sequenzinformation aus so wenig wie 0,03 Mikrogramm (0,015 umol) erhalten werden, ohne vorherige Denaturierung der Plasmid-DNA mit Alkali. Darüber hinaus können zuverlässige Sequenzdaten direkt aus einem einzelnen M13-Plaque ohne weiteres Wachstum des Phagen erhalten werden, indem der Plaque einfach in ein Reaktionsgefäß übertragen wird und die passenden Reagenzien zugegeben werden. Darüber hinaus können Sequenzen aus einzelnen Kolonien von Bakterien, enthaltend Plasmide mit dem f1-Replikationsursprung (z. B. pTZ18R oder pUC118) mit einem Helferphagen (M13 KO7), oder sogar bei Plasmiden ohne Helferphagen, erhalten werden.
Da die Erfindung das Sequenzieren kleiner Mengen an Matrize ermöglicht, wird das Erfordernis, Klone aufzuziehen und DNA aus ihnen aufzureinigen, unnötig, und das Risiko, Verunreinigungen zusammen mit der Matrizen-DNA in die Sequenzierungsreaktion einzubringen, wird somit vermindert. Weil die DNA durch dieses Verfahren effektiv endmarkiert wird, besteht darüber hinaus eine geringe systematische Schwankung in der Bandenintensität und keine Neigung bei den Sequenzen, in der Nähe des Bodens einer Autoradiographie eines Sequenziergels blaß zu werden.
Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung das Sequenzieren von Plasmid- und anderen doppelsträngigen DNA-Matrizen ohne vorheriges Denaturieren unter Verwendung von Alkali. Diese Denaturierungsverfahren sind langwierig, da sie eine Stunde oder mehr an fachmännischem Vorgehen für die Denaturierung und die anschließende Fällung erfordern. Somit ermöglicht die Erfindung das Sequenzieren von DNA unter Verwendung existierender Gerätschaften, wobei eine geringe Abwandlung des Vorgehens notwendig ist, um die beanspruchte DNA-Sequenzierungsreaktion durchzuführen.
Daher beinhaltet die Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zum Sequenzieren von DNA, das die folgenden Schritte einschließt: Vorsehen eines Polynukleotidprimers, komplementär zu einer Region der DNA, Vorsehen der zu sequenzierenden DNA und Kontaktieren dieses Primers und der DNA miteinander in Gegenwart einer DNA-Polymerase und zwischen 1 und 3 dNTPs, wobei mindestens eines der dNTPs markiert ist. Der Primer und die DNA werden unter Bedingungen kontaktiert, welche die Verlängerung des Primers durch Addition von einem oder mehreren der dNTPs an das 3'-Ende des Primers ermöglichen, um einen verlängerten Primer zu bilden. Der Primer und die DNA werden dann dissoziiert, oder getrennt, im allgemeinen durch Erwärmen, und die Schritte des Kontaktierens und Trennens werden mehrfach (gewöhnlich 10-200 Mal) wiederholt. Schließlich wird der verlängerte Primer mit der DNA in Gegenwart einer DNA-Polymerase (die im allgemeinen die gleiche Polymerase ist, wie in dem ursprünglichen Markierungsschritt verwendet), allen vier dNTPs und einem Ketten-Abbruch-Mittel kontaktiert.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der DNA-Polymerase um Taq-DNA- Polymerase (z. B. eine Form von Taq-Polymerase, der eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt), eine Form von T7-DNA-Polymerase mit niedriger Exonuklease-Aktivität (siehe Tabor und Richardson, U.S.-Patent Nr. 4 795 699), Klenow, AMV-Reverse Transcriptase, Bst-, Tth- oder Vent-DNA-Polymerase oder exo-freie Formen von derartigen Polymerasen; das dNTP wird mit ³&sup5;S oder einer fluoreszenten, chemilumineszenten oder anderen (welche z. B. als ein Ligand durch indirekten Enzyme-linked Assay nachweisbar sind, z. B. Biotin) Markierung markiert; und an den letztlichen Kontaktierungsschritt in Gegenwart eines Ketten-Abbruch- Mittels schließt sich ein Trennungsschritt an, in dem der verlängerte Primer von der DNA getrennt wird, und diese zwei Schritte werden mehrfach wiederholt (zum Beispiel zwischen 30 und 200 Mal) bis ungefähr 0,1-1,0 Pikomol (vorzugsweise 0,5 umol) an markiertem verlängerten Primer, der durch ein Didesoxynukleotid an seinem 3'-Ende terminiert ist, hergestellt sind.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren eingesetzt, um folgendes zu sequenzieren:
gereinigte M13-DNA (einzelsträngig, ss),
gereinigte Plasmid-DNA (doppelsträngig, ds),
gereinigte Lambda-DNA (ds),
M13-DNA aus einem Plaque oder Flüssigkultur (ss),
Plasmid-DNA aus einer Kolonie oder Flüssigkultur (ds),
Plasmid mit-f1-ori, vorzugsweise infiziert mit Helferphagen, aus einer Kolonie (ss),
PCR-Produkt, z. B. über ein Gel gereinigt (ds),
PCR-Produkt, behandelt mit w/ExoI und Alk.Phos. (ds),
asymmetrisches PCR-Produkt, behandelt mit Alk.Phos. (ss),
gereinigte Cosmid-DNA, und
DNA aus weiteren Quellen, z. B. genomischer Hefe- oder Bakterien-DNA oder anderen Phagen-DNAs.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Patentansprüchen offensichtlich werden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Zuerst werden in Kürze die Zeichnungen beschrieben werden.

Zeichnungen

Die Fig. 1 ist eine diagrammartige Wiedergabe eines DNA-Sequenzierungsverfahrens dieser Erfindung;
Die Fig. 2-7 sind Kopien von Autoradiographien, erhalten aus DNA-Sequenzierungs-Experimenten unter Anwendung einer Vielzahl von Bedingungen, wie nachstehend beschrieben, und
die Fig. 8 ist eine Graphik von Daten aus einem Applied Biosystems-Instrument, welche Ergebnisse eines Sequenzierungs-Experiments zeigt.
Es folgen Beispiele von Verfahren der Erfindung. Diese Beispiele sind für die Erfindung nicht einschränkend, und der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß die in den Reaktionen verwendeten Komponenten ohne weiteres durch im Fachgebiet bekannte äquivalente Reagenzien ersetzt werden können.

Verfahren

Unter Bezugnahme auf die Fig. 1 besteht der erste Schritt in dem Verfahren darin, die Sequenz der Matrize (gewöhnlich Vektor-Sequenz) zu untersuchen und eine Kombination von Primer- und Markierungs-Nukleotiden zu wählen. Der Primer wird nach Standard-Kriterien, die im Fachgebiet gut bekannt sind, ausgewählt, um eine DNA-Synthese nahe der Sequenz von Interesse einzuleiten. Der Primer ist typischerweise ein synthetisches Oligonukleotid von 16- 25 Nukleotidbasen Länge.
Eine Mischung von drei Nukleotiden (von den möglichen vier: dATP, dCTP, dGTP und dTTP) wird wie folgend ausgewählt: Die erste Stelle, an der dAMP downstream vom 3'-Ende des Primers eingebaut werden wird, wird lokalisiert. In ähnlicher Weise werden die ersten Stellen für den Einbau von dGMP, dCMP und dTTP ermittelt. Eine dieser Stellen wird von dem Primer weiter entfernt sein als alle anderen. Das an dieser Stelle erforderliche Nukleotid wird während der Markierungsphase des Protokolls weggelassen (dCTP in der Fig. 1). Eines oder mehrere der verbleibenden drei Nukleotide müssen markiert sein (z. B. α-³²P, α-³&sup5;S oder ein fluoreszentes Molekül). Eine Kombination wird so gewählt, daß mindestens zwei markierte Nukleotide vor der Termination an dem Punkt, wo das fehlende Nukleotid die Verlängerung beendet, eingebaut werden. In der Fig. 1 werden vier dAMP-Nukleotide vor der ersten Stelle, wo dCMP erforderlich sein würde, eingebaut. Daher ist in diesem Beispiel ein markiertes dATP eine gute Wahl.
Eine geeignete Kombination von Primer und Nukleotid-Mix kann gewöhnlich ohne Schwierigkeiten festgestellt werden, allerdings können Vektoren für eine optimale Markierung von Sequenzen spezifisch konstruiert werden. Falls notwendig, kann die Auswahl, welches dNTP aus dem Markierungs-Mix weggelassen werden soll, empirisch mittels Durchführen von Testmarkierungen bestimmt werden.

Beispiel 1: Sequenzierung mit gereinigter M13-DNA oder gereinigter Plasmid-DNA

Die folgenden Komponenten wurden in ein Mikrozentrifugengefäß (0,4 ml) zugesetzt, welches in eine Thermocycler-Maschine eingebracht wurde (z. B. Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler): 0,005 umol oder mehr M13-DNA (z. B. M13mp 18, 0,01 ug) oder 0,03 ug doppelsträngige Plasmid-DNA (z. B. pUC19); 2 ul ΔTAQ-Reaktionspuffer (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, 260 mM Tris-HCl, pH 9,5, 65 mM MgCl&sub2;); 1 ul 3,0 uM dGTP; 1 ul 3,0 uM dTTP; 0,5 ul (5 uCi) von [α-³&sup5;S]dATP (etwa 1200 Ci/mmol); 1 ul -40-Primer (0,5 uM; 0,5 umol/ul 5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'); 2 ul ΔTAQ-DNA- Polymerase 32 U/ul (von United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH, in 20 mM Tris (pH 8,5), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5% TWEEN-20 und 50% Glycerin, 8fach verdünnt in Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM 2- Mercaptoethanol, 0,5% TWEEN-20, 0,5% NP-40)); und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 17,5 ul.
Diese Komponenten wurden gemischt und mit 10 ul leichtem Mineralöl (United States Biochemical Corporation) überschichtet. Das Gefäß wurde in den Thermocycler eingebracht und 30-100 Zyklen (mehr als 60 Zyklen sind unnötig) von 45ºC während 1 Minute bis 70ºC während 0,5 Minuten wurden durchgeführt. (Die Temperaturen können von 55º-70ºC zyklisch wiederholt werden, falls gewünscht, oder es kann sogar eine konstante Temperatur von etwa 62ºC beibehalten werden (abhängig von der Schmelztemperatur des Primers und der Matrize, die sequenziert werden soll). Eine solche isothermische Markierung ist möglich, dauert aber bis zum Schluß so lange (etwa 4-6 Stunden) wie zyklisch wiederholte Temperaturen.) Die Temperaturen können angepasst werden, wenn die Schmelztemperatur von Primer/Matrize signifikant höher oder niedriger ist, aber diese Temperaturen funktionieren für die meisten Primer/ Matrizen gut. Eine Temperatur von 95ºC kann anstelle von 70ºC bei äquivalenten Ergebnissen benutzt werden. Dieser Schritt kann in etwa 3 Minuten pro Zyklus abgeschlossen werden.
Vier Gefäße wurden mit A, C, G und T beschriftet und mit 4 ul des entsprechenden ΔTAQ- Terminations-Mix gefüllt: ddA-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 300 uM ddATP); ddT-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 450 uM ddTTP); ddC-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 225 uM ddCTP); ddG- Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 22,5 uM ddGTP) (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH). Es wird kein weiteres Enzym in die Terminationsgefäße zugegeben. Das aus dem vorherigen Schritt eingetragene Enzym ist ausreichend.
Die gecyclete Markierungsreaktion wurde zu gleichen Teilen auf die vier Terminationsgefäße aufgeteilt (4 ul in jedes Terminationsreaktionsgefäß) und mit 10 ul leichtem Mineralöl überschichtet.
Die vier Gefäße wurden in den Thermocycler eingebracht und 30-200 Zyklen (mehr als 60 Zyklen sind unnötig) wurden von 95ºC während 15 Sekunden, bei 55ºC während 30 Sekunden und 72ºC während 120 Sekunden durchgeführt. Dieser Schritt wurde zweckmäßigerweise über Nacht vervollständigt. Andere Zeiten und Temperaturen sind ebenfalls wirksam.
Sechs ul des Reaktionsgemischs wurden entnommen (unter Vermeidung des Öls), 3 ul Stop- Lösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol-Blau, 0,05% Xylen-Cyanol FF) wurden zugegeben, und es wurde kurz auf 70º-80ºC erhitzt, unmittelbar vor Laden auf ein Sequenziergel. Autoradiographien benötigten eine 18-36 Stunden lange Exposition unter Verwendung von Kodak XAR-5-Film.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 2 wurde die angegebene Menge an gereinigter M13mp18- DNA (je 0,001-0,1 ug in den Spuren E-A) unter Verwendung des -40-Primers und der Nukleotide wie obenstehend beschrieben sequenziert. Der Markierungsschritt wurde 30mal (45ºC bis 95ºC) zyklisch wiederholt und der Terminationsschritt wurde 35mal (95ºC, 55ºC und 72ºC) zyklisch wiederholt. Das Ergebnis in Spur F ist ein Beispiel, bei dem alle vier dNTPs während des zyklisch wiederholten Markierungsschrittes vorhanden waren (jeweils 3 pmol).
Wenn das obenstehende Markierungsverfahren ohne zyklische Wiederholung (unter Verwendung des Standardprotokolls für das TAQuence-Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical Corporation) durchgeführt wird, ergeben 0,1 ug M13mp18-Matrizen-DNA ein Autoradiogramm, worin Banden, welche die ersten 200 Basen von dem Primer aus repräsentieren, abwesend sind. Die Verwendung von weniger DNA ergibt eine noch blassere Sequenz.

Beispiel 2: Direkte Sequenzierung eines M13-Plaques

Ein M13-Plaque (M13mp18) wurde von einer 18-36 Stunden lang inkubierten Platte unter Verwendung einer Pipettenspitze mit großer Öffnung abgenommen. Mehr Phage kann erhalten werden durch Verwenden einer Spitze, bei der die Spitze zurückgeschnitten wurde, um die Öffnung auf einen Durchmesser von etwa 1,5 mm zu vergrößern. Eine kleine Menge von Soft-Agar haftet an der Spitze. Der Soft-Agar wurde mit 2 ul Reaktionspuffer und 10 ul Wasser gut vermischt (wiederholtes Aufsaugen und Herausdrücken der Flüssigkeit in der Pipette). Das Probenröhrchen wurde verschlossen und 10 Minuten lang bei 95º-100ºC erhitzt und rasch abzentrifugiert, um jedwede Kondensation abzusammeln. Dann wurden 12 ul rasch (so daß sich der Agar nicht verfestigt) für eine Sequenzierung entnommen. Dann wurde das in Beispiel 1 dargelegte Verfahren für eine Sequenzierung verwendet.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 4 ist die Sequenz der DNA aus einem einzelnen Plaque von M13mp18, abgenommen aus einem Rasen von JM101, gezeigt. Die DNA wurde aus dem Plaque durch 10 Minuten langes Erhitzen in Sequenzierungspuffer bei 95º-100ºC extrahiert. Die DNA wurde unter Verwendung des -40-Primers und der Nukleotide, wie obenstehend beschrieben, sequenziert. Der Markierungsschritt wurde 99mal zyklisch wiederholt (45ºC bis 95ºC), und der Terminations-Schritt wurde 198mal (95ºC, 55ºC und 72ºC) zyklisch wiederholt.

Beispiel 3: Direkte Sequenzierung einer Kolonie, welche ein Plasmid enthält

Eine einen Klonierungsvektor (z. B. pUC19) enthaltende Kolonie wird aus einer 36 Stunden lang inkubierten Platte ("L-Broth" bzw. L-Nährmedium) unter Verwendung eines sterilen Drahts oder einer sterilen Öse abgenommen, in 2 ul Reaktionspuffer und 10 ul Wasser suspendiert und gut gemischt. Die Kolonie wurde 20 Minuten lang bei 95º-100ºC erhitzt, kurz abzentrifugiert, um den Debris bzw. die Zelltrümmer zu sedimentieren, und 12 ul Flüssigkeit wurden für die Sequenzierung entnommen. Das in Beispiel 1 dargelegte Verfahren wurde dann für das Sequenzieren verwendet.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3 sind Ergebnisse des zyklisch wiederholten Markierungs- Sequenzierens der Plasmid (pUC19)-DNA gezeigt. Die angegebene Menge von gereinigter pUC19-DNA (0,01-3 ug) wurde unter Verwendung des -40-Primers und von Nukleotiden, wie obenstehend beschrieben, sequenziert. Der Markierungsschritt wurde 85mal zyklisch wiederholt (45ºC bis 95ºC), und der Terminations-Schritt wurde 198mal zyklisch wiederholt (95ºC, 55ºC und 72ºC).

Beispiel 4: Direkte Sequenzierung einer Kolonie, enthaltend ein Plasmid und infiziert mit Helfer-Phage

Die Infektion einer ein Plasmid mit dem f1-Ursprung enthaltenden Zelle mit einem Helferphagen führt zur Herstellung großer Mengen von phagenartigen Partikeln, enthaltend einen Strang der Plasmid-DNA. (Der hergestellte Strang wird von der Orientierung des f1- Ursprungs bestimmt). Diese werden aus der Zelle sezerniert. Helferphagen-Partikel werden auch in geringerer Menge hergestellt (aufgrund einer Veränderung in dem Helferphagen- Ursprung), aber diese werden mit den verwendeten Primern nicht sequenziert. Somit ist bei Infektion einer Kolonie mit Helferphagen mehr Plasmid-DNA (aber nur ein Strang) für die Sequenzierung verfügbar. Eine Plasmidsequenzierung aus einer einzelnen Kolonie ist marginal, wahrscheinlich weil es schwierig ist, routinemäßig ausreichend Matrizen-DNA zu erhalten. Die Infektion mit einem Helferphagen erzeugt mehr Matrize, was eine Sequenzierung möglich macht.
Der Wirtsstamm JM101 wurde mit einem Plasmidvektor (pTZ18U; Mead et al., 13 Nucleic Acid Research 1103, 1985) transformiert, welcher den Replikationsursprung aus dem Bakteriophagen f1 enthält. Nach Inkubieren der kompetenten Zellen mit dem Plasmid bei 0ºC (45 Minuten) und 42ºC (2 Minuten) wurden die Zellen in L-Broth verdünnt und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. M13-Helferphage M13K07 (Vierra und Messing, 153 Meth. Enz. 3, 1987; 10 ul von 10¹&sup0; pfu/ml) wurde zugesetzt und die Inkubation 20 Minuten lang bei 37ºC fortgesetzt. Transformanten wurden dann auf Ampicillin und Kanamycin enthaltendem Medien ausplattiert. Nach 18-36 Stunden langer Inkubation wurde eine einzelne Kolonie abgenommen.
Eine Kolonie aus einer 18-36 Stunden lang inkubierten Platte wurde unter Verwendung von sterilem Draht oder einer sterilen Öse abgenommen, in 2 ul Reaktionspuffer und 10 ul Wasser suspendiert und gut gemischt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 95º-100ºC erwärmt; alternativ dazu wurde sie bei 37ºC erwärmt, 30 Minuten lang, kurz zentrifugiert, und der Überstand wurde 10 Minuten lang bei 95º-100ºC inkubiert. Der Überstand wurde dann kurz zentrifugiert, um den Debris zu sedimentieren, und 12 ul wurden für eine Sequenzierung, wie obenstehend, entnommen.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 5 ist die Sequenz von DNA aus einer Einzelkolonie von JM101, enthaltend pTZ18U, infiziert mit M13K07, gezeigt. Die DNA wurde aus der Kolonie durch Erhitzen in Sequenzierungspuffer bei 95º-100ºC während 10 Minuten extrahiert. Die DNA wurde unter Verwendung des -40-Primers und von Nukleotiden, wie obenstehend beschrieben, sequenziert. Der Markierungsschritt wurde 99mal (45ºC bis 95ºC) zyklisch wiederholt, und der Terminations-Schritt wurde 198mal zyklisch wiederholt (95ºC, 55ºC und 72ºC).

Beispiel 5: Sequenzierung von aus Bakteriophage Lambda extrahierter DNA

Gereinigte DNA aus dem Bakteriophagen Lambda (1 ug in 5 ul H&sub2;O) wurde mit 1 ul (0,5 pmol) Primer (SEQ. ID. Nr. 1 : 5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC; entsprechend den Basen 7630-7606 in dem Bakteriophagen Lambda), 2 ul ΔTAQ-Puffer, 1 ul 3 uM dGTP, 1 ul 3 uM dTTP, 0,5 ul α-³&sup5;S dCTP (1200 Ci/mmol, 10 uCi/ul) und verdünnter ΔTAQ- DNA-Polymerase (2 ul 4 U/ul) und 5 ul H&sub2;O, bei einem Gesamtvolumen von 17,5 ul, gemischt. Diese Mischung wurde in dem DNA-Thermocycler 60 Sekunden lang bei 50ºC, dann 30 Sekunden lang bei 90ºC während 99 Zyklen inkubiert. Unter Verwendung dieses Gemischs von Nukleotiden wurde der Primer um 7 Basen mit der Sequenz (SEQ. ID. Nr. 2: TCCCGTT, wobei die C's markiert waren) verlängert.
Die Mischung wurde dann in vier Teile aufgeteilt, wobei ein Teil mit 4 ul ddGTP-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 22,5 uM ddGTP), ein zweiter mit 4 ul ddATP-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 300 uM ddATP), der dritte mit 4 ul ddTTP-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 450 uM ddTTP) und der vierte mit 4 ul ddCTP-Terminations-Mix (je 15 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 225 uM ddCTP) vereinigt wurde. Die Mischungen wurden mit 10 ul Mineralöl überschichtet und die Gefäße verschlossen. Diese vier Gefäße wurden dann in den Thermocycler eingebracht und 198 Zyklen bei 95ºC, 15 Sekunden, 55ºC, 30 Sekunden, und 72ºC, 120 Sekunden, untezogen.
Nach Vervollständigung der Zyklen über Nacht wurden 6 ul der wäßrigen Phase aus jedem Gefäß entnommen und 3 ul Stop-Lösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol-Blau, 0,05% Xylen-Cyanol FF) dazugegeben. Die Mischungen wurden 2 Minuten lang auf 75ºC erhitzt und auf das Sequenzierungsgel aufgetragen. Die Sequenzierung erforderte lediglich 1-2 ug (0,03-0,05 umol).
Unter Bezugnahme auf die Fig. 6 ist die Sequenz von DNA aus der Bakteriophage-Lambda- DNA unter Anwendung eines Protokolls mit zyklisch wiederholtem Markierungsschritt gezeigt. 0,5-5 ug Lambda-DNA wurden verwendet, wie in der Figur angegeben. Die gezeigte Autoradiographie ist das Ergebnis einer 60 Stunden langen Exposition.

Beispiel 6: Sequenzierung von durch eine Polymerase-Kettenreaktion hergestellter DNA

Nach Vervollständigung einer Polymerase-Kettenreaktion enthält die Reaktionsmischung noch überschüssigen Primer, dNTPs und nicht-spezifisch amplifizierte einzelsträngige DNAs.
Diese werden von dem gewünschten doppelsträngigen Produkt typischerweise durch Präzipitation, Gel-Aufreinigung oder eine andere physikalische Technik entfernt. Diese Verfahren sind gewöhnlich zeitaufwendig und erfordern manuelle Manipulationen für Zentrifugationen oder Gelelektrophorese. Ich habe festgestellt, daß die unerwünschte einzelsträngige DNA und Primer durch kurze Inkubation mit Exonuklease I entfernt werden können. In ähnlicher Weise können die überschüssigen dNTPs (welche den Markierungsabschnitt des Sequenzierungsverfahrens stören würden) durch gleichzeitige Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt werden. Beide Enzyme können durch kurzes Erwärmen inaktiviert werden. Anschließend kann das PCR-Produkt unter Verwendung der in Beispiel 1 dargelegten Verfahren sequenziert werden.
Spezifisch wurde eine PCR, wie im Perkin-Elmer Cetus-GENEAMP-Kit dargelegt, unter Verwendung von 200 uM dNTPs, 100 umol jeden Primers, 1 ng Matrizen-DNA und Puffer in einem Gesamtvolumen von 100 ul durchgeführt. Bei der Matrizen-DNA handelte es sich um pT7L-21 (ein Klon eines modifizierten Tetrahymena-Ribozyms in pUC 18; Zaug et al., 27 Biochemistry 8924-8931, 1988), und die Primer waren -40-Universal-Sequenzierungsprimer (SEQ. ID. Nr. 3 : 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC) und reverser Sequenzierungsprimer (SEQ. ID. Nr. 4 : 5'-TTCACACAGGAAACAG). Diese Primer ergeben ein Produkt von 518 Nukleotiden Länge. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde unter Verwendung von 30 Zyklen von 94ºC während 1 Minute, 37ºC während 1 Minute und 72ºC während 2 Minuten durchgeführt.
Ein Aliquot (10 ul) der PCR-Mischung wurde entnommen. Exonuklease I (USB-Produkt Nr. 70013; 1 ul von 10 U/ul) und alkalische Phosphatase aus Krabben (USB-Produkt Nr. 70092, 1 ul von 1 U/ul) wurden zugesetzt. Diese Mischung wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von 15 Minuten langem Hitzeinaktivieren bei 70ºC. Diese Mischung wurde auf 200-2000 ul mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) verdünnt, und 10 ul wurden für Zyklus-Sequenzierung gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 unter Verwendung des -40-Primers eingesetzt. Kontrollexperimente, in welchen die Behandlungen entweder mit Exonuklease I oder Krabben-alkalischer Phosphatase weggelassen wurden, versagten darin, gute Sequenzdaten bereitzustellen.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 7 ist die DNA-Sequenz des Produktes einer Polymerase- Kettenreaktion unter Verwendung eines Protokolls mit einem zyklisch wiederholten Markierungsschritt gezeigt. Der Markierungsschritt wurde 65mal (45ºC bis 70ºC) zyklisch wiederholt, und der Terminationsschritt wurde 198mal (95ºC, 55ºC und 72ºC) zyklisch wiederholt. Aliquots der PCR-Reaktionsmischung wurden mit Exonuklease I (Spuren A und C) und/oder Krabben-alkalischer Phosphatase (Spuren B und C) behandelt, wie obenstehend beschrieben, oder waren unbehandelt (Spur D). Die Enzyme wurden dann hitzeinaktiviert und die DNA 20fach verdünnt. Dies wurde als Matrize eingesetzt (10 ul), wobei -40-Primer und Nukleotide wie obenstehend beschrieben verwendet wurden. Eine Vorbehandlung mit beidem, sowohl Exonuklease als auch alkalischer Phosphatase, ergibt die beste Sequenz (C).

Beispiel 7: Zyklus-Sequenzierung mit Fluorescein-markiertem dUTP und Fluoreszenz- Nachweis

In diesem Beispiel wird die radioaktive Markierung durch nicht-radioaktives Fluoresceinmarkiertes Nukleotid (Fluorescein-dUTP, Bochringer Mannheim Biochemicals) ersetzt. Zyklus-Sequenzierungen wurden entweder unter Verwendung von einzelsträngiger M13- DNA oder doppelsträngiger pUC18-Plasmid-DNA als Matrize durchgeführt. Der zyklisch wiederholte Markierungsschritt wurde unter Verwendung des universellen (-40) Sequenzierungsprimers in Gegenwart von dATP, dGTP und Fluorescein-dUTP durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden auf ein Sequenzierungs-Elektrophoresegel aufgetragen, welches in einem ABI-Modell 373A-DNA-Sequenzierungsinstrument montiert war, das Sequenzierungsprodukae durch Fluoreszenz nachweist.
Für dem zyklisch wiederholten Markierungsschritt wurden 0,05 umol (oder mehr) M13-DNA (0,125 ug) oder 0,36 ug doppelsträngige Plasmid-DNA (pUC18), 2 ul ΔTaq-Reaktionspuffer (260 mM Tris-HCl (pH 9,5), 65 mM MgCl&sub2;), 3 ul Fluorescein-dUTP-Markierungs-Mix (10 uM Fluorescein-dUTP, 1 uM dGTP, 1 uM dATP), 1 ul "-40"-Primer (0,5 uM, 0,5 umol/ul, 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'), 2 ul ΔTaq-DNA-Polymerase (8 U/ul) (in 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% TWEEN-20, 0,5% NP-40) und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 18 ul in einem 0,5 ml großen Mikrozentrifugengefäß vereinigt, gut vermischt und mit 15 ul leichtem Mineralöl überschichtet. Das Gefäß wurde in den Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Co.) eingebracht und 30-50 Zyklen von 95ºC während 15 Sekunden und 60ºC während 30 Sekunden unterzogen.
Diese Kombination von Markierungsreaktion-Komponenten ermöglichte den Einbau eines Maximums von 3 Fluorescein-dUTP-Molekülen pro annealtem Primer, da dCTP bei dem Polymerisationsgemisch fehlte, wie nachstehend veranschaulicht:
Vor dem Markierungsschritt
Primer
... GTTTTCCCAGTCACGAC
... CAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTG...
Matrize
Nach dem Markierungsschritt
Primer
... GTTTTCCCAGTCACGACGUUGUAAAA (U = Fluorescein-dUMP)
... CAAAAGGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTG...
Matrize
Im Anschluß an die Markierungszyklen wurden vier Gefäße mit A, C, G und T gekennzeichnet und mit 4 ul des entsprechenden ΔTaq-Terminationsgemischs gefüllt. Dann wurde die zyklisch wiederholte Markierungsreaktion zu gleichen Teilen auf die vier Terminationsgefäße aufgeteilt (3,5 ul in jedes Terminationsreaktionsgefäß) und mit 15 ul leichtem Mineralöl überschichtet.
Die vier Gefäße wurden in den Thermocycler gebracht und 30-50 Zyklen wurden von 95ºC während 30 Sekunden, bei 60ºC während 60 Sekunden und 72ºC während 60 Sekunden durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugeben von 4 ul Stop-Lösung (95% Formamid, 20 mM EDTA) zu den bereits unter Mineralöl befindlichen Terminationsreaktionen gestoppt. Diese Proben wurden kurz bei 75º-80ºC erhitzt, unmittelbar vor dem Laden auf ein Sequenzierungsgel. Die Proben (5 ul) wurden in vier benachbarten Spuren (entsprechend zu einer der vier Terminationsreaktionen ddA, ddC, ddG und ddT) auf ein 6%iges Acrylamid, 7 M Harnstoff-Sequenzierungsgel geladen. Die Elektrophorese der Sequenzierungs-Reaktionsprodukte wurde unter Verwendung des Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzierinstruments über Nacht 16 Stunden lang bei 35 Watt konstanter Leistung durchgeführt. Ein hochempfindlicher Fluoreszenzdetektor, positioniert neben dem Boden des Gels detektiert die fluoreszenten Banden von DNA, wenn sie während der Elektrophorese vorüberwandern. Die Fluoreszenzintensität auf jeder Spur wurde erfaßt, wobei die begleitende ABI-Computer-Software unter Verwendung des für Fluorescein-Nachweis optimalen Filterkanals verwendet wurde. Diese Software wurde ebenfalls verwendet, um die Daten zu normieren, wobei die Grundlinien-Drift subtrahiert wurde.
Die Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Sequenzierung von M13mp18-DNA, wobei die Ergebnisse gezeigt sind, welche die Region von 175-217 Basen vom 5'-Ende des Primers aus abdecken. In der Tafel A sind die Rohdaten aus vier benachbarten Spuren gezeigt: eine ddG- Reaktion, eine ddC-Reaktion, eine ddA-Reaktion und eine ddT-Reaktion. Die untere Tafel B zeigt dieselben Ergebnisse nach Software-Analyse, welche die Hintergrund-Drift entfernt und die mittleren Peak-Höhen normiert. Die bekannte Sequenz der Matrizen-DNA in dieser Region ist über den Peaks dargestellt. Ein manueller Vergleich der Graphik und der Sequenz ergibt, daß das Verfahren die Sequenz von allen außer einer oder zwei der Basen in dieser Region korrekt anzeigte.

Beispiel 8: Sequenzierung von asymmetrischen PCR-Produkten durch Vorbehandlung mit alkalischer Phosphatase

Normalerweise wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit gleichen Konzentrationen von zwei Primern durchgeführt, was zur geometrischen Amplifikation der Sequenz zwischen ihren Annealing-Stellen führt. Im Prinzip kann jeder Zyklus die Menge an Produkt-DNA in der Reaktionsmischung verdoppeln. Die Produkte von solchen "symmetrischen" PCR- Reaktionen sind lineare doppelsträngige DNA-Moleküle. Manchmal werden Primer bei ungleichen Konzentrationen, mit einem Konzentrationsverhältnis von 10 : 1 bis 500 : 1, zu der Amplifikationsreaktion zugesetzt. Solche "asymmetrischen" PCR-Reaktionen verhalten sich während der ersten paar Zyklen normal, wodurch eine geometrisch anwachsende Menge von doppelsträngiger Produkt-DNA erzeugt wird. Schließlich ist der Vorrat des Primers mit der niedrigeren Konzentration erschöpft. Von diesem Punkt an ist bei weiteren Amplifikationszyklen lediglich ein einziger Primer verfügbar, so daß sie nur einen Strang an Produkt-DNA herstellen. Die Konzentration dieses einzelsträngigen Produkts steigt linear mit weiteren Zyklen an. Somit bestehen die Reaktionsprodukte aus einer relativ geringen Menge einer doppelsträngigen linearen DNA und einer größeren Konzentration von einzelsträngiger linearer DNA. Diese einzelsträngige DNA kann als Matrize für DNA-Sequenzierung verwendet werden.
Gyllensten und Erlich, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7652 (1988), beschreiben ein Verfahren für die Sequenzierung der einzelsträngigen Produkte von asymmetrischer PCR. Das Verfahren erfordert die Verwendung eines Ultrafilters in einer Zentrifuge, gefolgt von Trocknung der konzentrierten DNA. Dieses Verfahren benötigt mehrere Stunden zur Vervollständigung, und die Verwendung des Filters macht es kostspielig. Andere (Brow, S. 189 in. "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, 1990) haben die Anwendung von Alkoholfällung zur Reinigung der DNA vor dem Sequenzieren beschrieben. Wiederum benötigt dieses Verfahren einige Stunden zu seinem Abschluß. Sie schlagen eine Alternative vor, welche keine DNA-Reinigung erfordert, aber welche die Verwendung von markiertem Primer und von verringerten Konzentrationen an dNTPs in dem PCR-Verfahren erfordert. Die Markierung des Primers ist ein zusätzlicher zeitaufwendiger und kostspieliger Schritt, insbesondere wenn nur einige wenige Sequenzen ausgeführt werden.
Die Reinigung, oder andere Schritte, ist erforderlich, weil die für die PCR verwendeten dNTPs das Sequenzierungsverfahren stören. Der Anmelder hat festgestellt, daß diese dNTPs viel schneller, einfacher und kostengünstiger durch die Zugabe einer kleinen Menge von hitzelabiler alkalischer Phosphatase entfernt werden können. Bevorzugte alkalische Phosphatasen schließen die alkalische Phosphatase aus Krabben (United States Biochemical Corporation) und alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, welche gegenüber einer Erwärmung von 60-70ºC empfindlich sind, ein.
Die PCR wurde in 100 ul Volumen unter Verwendung von 50 umol eines Primers und 1 umol des zweiten Primers (Primerverhältnis 50 : 1) in dem Puffer, der in dem GeneAmp-Kit (Perkin Elmer Cetus Corp.) geliefert wird, mit 2,5 Units AmpliTaq-Taq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die dNTPs wurden zu einer Konzentration von 0,2 mM zugegeben. Die Matrize wurde durch einen einzelnen M13-Plaque geliefert, der ein Insert von ungefähr 1 Kb Größe enthielt. Der Phage wurde aus dem Plaque in 100 ul von 10 mM mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, eluiert und 5 ul wurden in der PCR verwendet. Das Gefäß wurde in den Thermocycler eingebracht und 50 Zyklen von 95ºC, 1 Minute; 55ºC, 1 Minute; und 72ºC, 2 Minuten, unterzogen.
Im Anschluß an die Amplifizierung wurde ein Aliquot (10 ul) entnommen und 2 Units alkalische Phosphatase wurden zugesetzt. Diese Mischung wurde 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und dann wurde die Phosphatase durch 10 Minuten lange Inkubation bei 70ºC inaktiviert.
Im Anschluß an diese Behandlung wurde ein Aliquot von 7 ul entnommen und sequenziert, wobei die normalen Verfahrensweisen für das Sequenase-DNA-Sequenzierungs-Kit Version 2.0 (United States Biochemical Corporation) angewandt wurden. Die Sequenzen waren von hervorragender Qualität bei Vorbehandlung mit der alkalischen Phosphatase, aber unbrauchbar ohne alkalische Phosphatase. Dieses Verfahren wird rasch abgeschlossen, wobei nur einfache Pipettierschritte erforderlich sind, die leicht von automatisierten Robotern durchgeführt werden können. Die Reagenzien sind ohne weiteres erhältlich und kostengünstig. In ähnlicher Weise sind Hochqualitäts-Sequenzen unter Verwendung von amplifizierter humaner genomischer DNA mit mehreren Primern erhalten worden.
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der nachfolgenden Patentansprüche.

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Carl W. Fuller
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: DNA-ZYKLUS-SEQUENZIERUNG
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: Lyon & Lyon
(B) STRASSE: 611 West Sixth Street
(C) STADT: Los Angeles
(D) STAAT: California
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 90017
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: 3,5" Diskette, 1,44 MB Speicherplatz
(B) COMPUTER: IBM-Kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: IBM P.C. DOS (Version 5.0)
(D) SOFTWARE: WordPerfect (Version 5.1)
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGS-DATEN:
frühere Anmeldungen insgesamt, einschließlich nachstehend beschriebener Anmeldung: 1
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/767137
(B) ANMELDUNGSDATUM: 9/27/91
(viii) PATENTANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Warburg, Richard J.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32 327
(C) REFERENZ/AKTEN-NUMMER: 199/131
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: (213) 489-1600
(B) TELEFAX: (213) 955-0440
(C) TELEX: 67-3510

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 1:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 25
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 1:
GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 25

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 2:

TCCCGTT 7

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:

GTTTTCCCAG TCACGAC 17

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 4:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 16
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:
TTCACACAGG AAACAG 16

Claims

1. Verfahren zum Sequenzieren von DNA, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Kontaktieren eines Polynukleotidprimers, komplementär zu einer Region der DNA, und der zu sequenzierenden DNA, miteinander in Gegenwart einer DNA- Polymerase, und zwischen einem und drei dNTPs, wobei mindestens ein dNTP markiert ist, um die Verlängerung des Primers durch die Addition von einem oder mehreren der dNTPs an dem Primer zu ermöglichen, um einen verlängerten Primer zu bilden;

b) Dissoziieren des Primers von der DNA,

c) Mehrfaches Wiederholen der Schritte a) und b), und

d) Kontaktieren des verlängerten Primers mit der DNA in Gegenwart einer DNA- Polymerase, vier dNTPs und einem Ketten-Abbruch-Mittel.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Polymerase Taq-DNA-Polymerase ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Polymerase ΔTaq-DNA-Polymerase ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Polymerase aus T7-DNA-Polymerase mit einer niedrigen Exonuklease-Aktivität, Klenow, AMV-Reversetranscriptase, Bst-DNA- Polymerase, Tth-DNA-Polymerase, Vent-Polymerase, exo-freier Vent-Polymerase und exo-freiem Klenow gewählt ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Markierung ³&sup5;S ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Markierung eine fluoreszente Markierung ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Markierung eine chemilumineszente Markierung ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Markierung ein Ligand ist, der durch ein indirekter Enzym-linked Assay nachweisbar ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Mehrfache sich auf 10 bis 200 beläuft.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Verfahren ferner nach dem Schritt d) einen weiteren Schritt e) des Abtrennens des verlängerten Primers von der DNA umfasst.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem die Schritte d) und e) zum zweiten Male mehrfach wiederholt werden.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem das Mehrfache des zweiten Males sich auf 10 bis 200 beläuft.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die DNA M13-DNA ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die DNA Plasmid-DNA ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die DNA einen f1-Ursprung umfasst.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die DNA Lambda-DNA ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die DNA durch Amplifikation hergestellt wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem die Amplifikation durch PCR herbeigeführt wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches ferner die Herstellung der DNA zur Sequenzierung durch ein Verfahren umfasst, umfassend folgende Schritte:

(i) Amplifizierung der DNA,

(ii) Kontaktieren der Produkte des Amplifizierungsschrittes mit alkalischer Phosphatase, um jegliche überschüssigen dNTPs zu dephosphorylieren, und

(iii) Inaktivieren der alkalischen Phosphatase durch Erhitzen.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem nach dem Amplifizierungsschritt Exonuklease I zusätzlich angewandt wird, um jegliche amplifizierte einzelsträngige DNA und Primer abzubauen, gefolgt von einer Inaktivierung durch Erhitzung.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder Anspruch 20, wobei in dem Amplifizierungsschritt die DNA durch eine Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wird.